Zika病毒NS1抗体与来自正常健康泰国人的选定血清样品中的中和抗体之间的高度相关性
尽管蚊子传播Zika病毒广泛存在(ZIKV) /东南亚,报告病例的数量仍然很低。 一种可能性是,在东南亚居民免疫保护,尽管任何此类保护的性质尚不清楚。 本研究试图探讨抗体的存在指向ZIKV NS1蛋白在选定的样本子集群血清样本特征从正常,健康的泰国人,先前ZIKV中和抗体的存在特征,DENV 1 - 4, JEV。 由于分子量之间的相似之处黄病毒E和NS1蛋白,免疫印迹系统成立的NS1抗原不变性,使检测的二聚体形式的NS1,明显清晰的迁移位置E和NS1蛋白单体。 结果表明,ZIKV NS1蛋白抗体只发现在样本ZIKV中和抗体(27/30)样品,和没有样本(0/30)ZIKV蚀斑减少中和试验(PRNT)90< 20显示anti-ZIKV NS1抗体的证据。 高相关性的存在ZIKV NS1抗体和ZIKV PRNT表明免疫保护ZIKV感染在泰国起源于接触ZIKV之前,而不是通过交叉中和。
黄病毒包膜病毒有一个大约11-kb积极意义单链RNA基因组包含一个开放阅读框编码三种结构蛋白(C、人口、难民和移民事务局和E)和7非结构性蛋白质(NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B和NS5)1。 大量的蚊子传播人类致病性病毒的成员黄病毒属包括登革病毒(DENV),乙型脑炎病毒(JEV),黄热病病毒,西尼罗河病毒、圣路易斯脑炎病毒和Zika病毒(ZIKV)。
ZIKV第一次被孤立于1947年从一个前哨猕猴Zika森林,乌干达,随后被隔绝伊蚊非洲蚊子第二年2。 第二个ZIKV血统,一个亚洲血统,被发现埃及伊蚊蚊子在马来西亚在1966年3.。 尽管ZIKV明显广泛分布在非洲和亚洲只有少数的人类感染病例被报道在2007年之前(如他处4)。 亚洲血统ZIKV法属波利尼西亚在密克罗尼西亚,2007年又出现在2013年的病毒随后传播到世界各地的许多国家。 然而,ZIKV引入之后,许多国家流行爆发,东南亚已经相当一些情况下(如他处5)。 明确证据表明ZIKV早在2006年以来流传在泰国6,但只有大约2000例ZIKF已报告在这段时间里,大部分被报道在过去的2年7。
我们在最近的一项研究表明,一个高比例的正常健康的泰国人有ZIKV中和抗体,这中和ZIKV显然不出现交叉中和从之前DENV感染8。 中和时通过抗体识别病毒粒子和屏蔽附件或膜融合9,虽然提高了对结构蛋白是主要的抗原抗体反应感染,抗体也对黄病毒NS1蛋白生成10。
NS1是一种非结构性之间高度保守的黄病毒的糖蛋白。 它的分子量范围从46-55 kDa取决于糖基化状态11。 这种蛋白质是最初翻译作为病毒多蛋白的一部分,并从多元蛋白质产生解理NS1单体在ER腔N-linked糖基化。 NS1形式为ER-lumen和细胞器膜有关11,但此外膜结合NS1被运送到质膜或者融合与trans-Golgi网络经历成熟和修改,从感染细胞释放可溶性六聚体12。 NS1可以检测病人血清13,14,15,已应用于DENV的诊断16和ZIKV17感染。 尽管NS1的功能还有待充分阐明,证据表明,病毒复制所需的NS1二聚体是在表面和分泌NS1蛋白是高度相关的免疫原性和免疫入侵和发病机制的发挥重要作用在病毒感染与宿主免疫系统交互11。
进一步了解泰国人对于ZIKV感染的免疫状况,本研究试图探讨ZIKV NS1的存在抗体血清样本中正常健康的泰国人,以前广泛ZIKV的存在与否,DENV和JEV中和抗体8。 使用固体基质蛋白免疫印迹体系,anti-NS1蛋白抗体进行调查在30个样本没有ZIKV中和,与高水平和30个样本(蚀斑减少中和试验(PRNT)90ZIKV中和≥20)。 因为良好的文档记录的证据cross-neutralizing抗体生成的黄病毒感染18,我们选择样本,要么没有anti-ZIKV NS1抗体(即PRNT90< 20)或一个高度PRNT(即PRNT健壮的值90≥20)。 这意味着人类血清的稀释20倍将输入病毒减少90%或更高。 相比之下,许多作者使用价值PRNT50≥10(10倍稀释血清中和50%的输入病毒)定义中和抗体的存在19,20.,21。 DENV表明,然而,世界卫生组织标准的值PRNT90≥20允许足够的歧视特定的中和与交叉中和22。 值得注意的是,在我们的研究中anti-ZIKV NS1抗体只发现样本中有高水平(PRNT90≥20) ZIKV的中和抗体,抗体和anti-ZIKV NS1缺席样本中没有ZIKV中和抗体。
这项研究是通过Mahidol大学中央机构审查委员会(数量:- COA不。 MU-CIRB 2017/067.2404)和按照道德标准进行制定1964年的赫尔辛基宣言及其后来的修正案。 血清样本由60血清样本来自健康的泰国人,通过广告分子生物科学研究所的招募,泰国Mahidol大学书面知情同意和特点后,中和抗体DENV 1 - 4, JEV和ZIKV如前所述8。 两个额外的控制样本(一个诊断ZIKV积极和五黄天真的),再如前所述8被纳入本研究。 从以前的队列六十血清样本选择8由30个样本ZIKV中和抗体是阴性(ZIKV PRNT90< 20)和30个样本阳性ZIKV中和抗体(ZIKV PRNT90≥20)。
小仓鼠肾细胞(BHK-21; 写明ATCC猫没有。 CCL-10)被播种到10厘米3.菜在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM; Gibco表达载体,卡尔斯巴德,CA)补充热灭活胎牛血清(10%的边后卫; Gibco,英杰公司)和100单位/毫升的青霉素和链霉素(Gibco,英杰公司)。 细胞生长在37°C公司为5%2一夜之间。 融合性的细胞感染ZIKV(应变SV0010/15) JEV(应变Beijing-1) DENV 1(16007株),DENV 2(16681株),DENV 3(16562株)和DENV 4(1036株)。 感染细胞维持Opti-MEM减少血清培养基(Gibco,英杰公司)在37°C公司为5%2。 BHK-21细胞培养病毒免费Opti-MEM被用作负控制(模拟)。 JEV上层清液收集在24小时后感染(h.p.i),而DENV ZIKV上层清液收集在48 h.p.i。
上层清液从病毒感染或模拟感染和5 x非还在装货染料(0.3 Tris-HCl pH值6.8,5% SDS、50%甘油、0.015%溴酚蓝),煮熟或不煮之前通过10% SDS-polyacrylamide凝胶电泳分离的蛋白质。 蛋白质转移到0.2μm硝化纤维素膜(通用电气医疗集团生命科学,芝加哥,Il)与5%的脱脂牛奶膜被封锁1 x TBS含有0.5%渐变为30分钟。 NS1蛋白表达的验证,膜被孵化的兔多克隆抗体anti-ZIKV NS1 (GTX133307 GeneTex Inc .,欧文,CA),一只兔子多克隆anti-ZIKV包膜蛋白抗体(GTX133326 GeneTex Inc .),兔多克隆anti-DENV 2 NS1抗体(pa5 - 27885热费希尔科学、罗克福德,IL),一锅特定anti-flavivirus包膜蛋白单克隆抗体(纯化从杂种细胞HB11223)在一夜之间5%的脱脂牛奶或适当的人类血清稀释5%脱脂奶1 h。 多余的初级抗体或人类血清被膜随后被孵化和适当的二次抗体,即要么与合共轭山羊anti-rabbit免疫球蛋白(31460年,热费希尔科学),一个合共轭山羊anti-mouse免疫球蛋白(A5278,西格玛奥德里奇,圣路易斯,密苏里州)或合共轭山羊反人类免疫球蛋白(62 - 8420年,热费希尔科学)1 h。 Immunochemiluminescent信号是由使用Luminata福特西部合衬底(默克公司,达姆施塔特,德国)和x射线胶片。
检测NS1抗体的存在在选定的血清和正常健康的泰国人与已知ZIKV PRNT状态,建立了西方免疫印迹体系利用BHK-21感染细胞的上清液,和特异性。 结果(图。1)表明,显然ZIKV E和NS1蛋白检测,但这两个迁移在大约相同的分子量(约50 kDa)。 人类血清显示只有一个乐队在变性样本,但两个乐队non-denatured样本中一览无遗,与较低的乐队可能代表E和NS1蛋白,而上层乐队标志着NS1二聚体的位置。 因此anti-NS1抗体可以专门检测到上层的存在(二聚的)NS1乐队。
免疫反应性ZIKV NS1和信封(E)的蛋白质。 上层清液收集从模拟(M)和(Z) BHK-21 ZIKV感染细胞。 通过sds - page在分离蛋白质变性(煮)或本地(不是煮)条件和转移到硝化纤维膜。 探讨了膜(一个)一个anti-ZIKV NS1多克隆抗体,(B)一个anti-ZIKV E多克隆抗体,(C)人类ZIKV阳性血清。
确认特异性的免疫印迹,上层清液从BHK-21细胞感染ZIKV JEV或DENV 1 - 4,与上层清液从模拟获得感染的细胞再次遭到电泳的分离和转移到固体基质支持孵化前pan-flavivirus E蛋白抗体,anti-DENV 2 NS1抗体,一个anti-ZIKV NS1 anti-ZIKV E抗体或抗体。 结果(图。2)表明,E蛋白抗原存在于病毒感染的所有车道(无花果。2),检测到一个pan-specific anti-flavivirus E蛋白抗体。 我们注意到一个乐队在大约75 kDa DENV 3抗原巷(无花果。2)的性质还不清楚。 抗体DENV - 2 NS1蛋白没有交叉反应与其他NS1蛋白(无花果。2 b),同样一个anti-ZIKV NS1蛋白抗体显示没有交叉反应与其他NS1蛋白(无花果。二维)。
描述的信封(E)和NS1蛋白。 上层清液收集从模拟(M)和黄病毒(ZIKV (Z), JEV (J)和DENV 1 - 4 (D1-D4))感染BHK-21细胞。 蛋白质sds - page分离的原生的条件下,转移到硝化纤维膜。 探讨了膜(一个)单克隆抗体HB112, (B2)anti-DENV NS1多克隆抗体(C)一个anti-ZIKV E多克隆抗体和(D)一个anti-ZIKV NS1多克隆抗体。
我们下一个评估该系统的能力在两人血清抗体检测特定NS1控制样本。 其他地方的报道8这些包括积极控制血清ZIKV感染的诊断案例(PRNT90ZIKV: 1280; JEV: 640; DENV 1: 160; DENV 2: 320; DENV 3: 160; DENV 4: 160)和消极的控制从黄病毒血清天真的捐赠(PRNT90ZIKV、JEV DENV 1 - 4所有< 20)。 结果(图。3.与PRNT)显示关闭协议数据8。 进一步确认特异性4黄天真的样品(PRNT90ZIKV、JEV DENV 1 - 4所有< 20)也筛选(补充无花果S57- - - - - -S60和补充表1)。 NS1抗体(就是明证二聚体的检测)被发现ZIKV DENV 1 - 4,阳性对照血清样本,并没有免疫反应性的负控制样本。 有趣的是没有观察到JEV NS1抗体JEV积极控制样本(图。3),尽管血清显示PRNT90= 6408。 然而,泰国也有国家JEV疫苗接种运动,于1990年被引进,和疫苗最初引入国家常规免疫接种时间表是一个灭活老鼠大脑疫苗24,因此,鉴于供体的年龄(22岁)血清中和抗体的存在显示是一致的,但没有NS1抗体。 根据该有完整PRNT数据和免疫印迹的数据之间的相关性,表明这是一个合适的系统调查ZIKV NS1人类血清抗体的存在。
描述的信封(E)和黄病毒NS1蛋白抗体阳性和阴性血清的控制。 上层清液收集从模拟(M)和黄病毒(ZIKV (Z), JEV (J)和DENV 1 - 4 (D1-D4))感染BHK-21细胞。 蛋白质是由sds - page分离在当地条件下,转移到硝酸纤维素。 探讨了膜(一个控制从一个已知的人类血清ZIKV感染的情况下,和(B控制人类血清黄天真。 PRNT90值之前报道8。
确定抗体的存在ZIKV NS1蛋白在泰国血清样本,井群60特征样本使用。 的PRNT90数据为ZIKV、JEV DENV 1 - 4曾被报导过8。 60个样本由30个样本ZIKV中和抗体是阴性(ZIKV PRNT90< 20)和30个样本阳性ZIKV中和抗体(ZIKV PRNT90≥20)。 所有血清筛选针对抗原的面板(ZIKV, JEV和DENV 1 - 4)与一个适当的负控制(上层清液从模拟感染细胞)。 人类血清的稀释用于免疫印迹是单独优化/过滤器。 过滤器上得分NS1二聚体带的存在表明NS1抗体的存在。 ZIKV PRNT结果90负(< 20)样本如表所示1免疫印迹,代表图所示。4PRNT,结果90积极的(≥20)如表所示2,代表墨迹图所示。5。 所有免疫印迹补充数据和表文件所示。
代表的免疫印迹ZIKV中和抗体阴性血清(ZIKV PRNT < 20)。 上层清液收集从模拟(M)和黄病毒(ZIKV (Z), JEV (J)和DENV 1 - 4 (D1-D4))感染BHK-21细胞。 蛋白质是由sds - page分离在当地条件下,转移到硝化纤维膜。 探讨了膜与ZIKV中和抗体阴性血清(ZIKV PRNT < 20)。 面板显示血清样本S6的免疫印迹,而面板B所示血清样本S60的免疫印迹。 星号(*)标记NS1二聚体的位置。 PRNT90值之前报道8。 一个额外的28免疫印迹可以补充材料文件中找到。
代表免疫印迹从ZIKV中和抗体阳性血清(ZIKV PRNT≥20)。 上层清液收集从模拟(M)和黄病毒(ZIKV (Z), JEV (J)和DENV 1 - 4 (D1-D4))感染BHK-21细胞。 蛋白质sds - page分离的自然条件下,转移到硝化纤维膜。 膜是探测ZIKV中和抗体阳性血清(ZIKV PRNT≥20)。 面板显示了immunoplot S41血清样本,而面板B所示样品血清S100免疫印迹。 星号(*)标记NS1二聚体的位置。 PRNT90值之前报道8。 一个额外的28免疫印迹可以补充材料文件中找到。
最值得注意的是,没有看到ZIKV NS1抗体筛选样品的阴性ZIKV中和抗体(ZIKV PRNT90< 20)。 这是一个100% PRNT数据和免疫印迹数据之间的一致性。 ZIKV NS1抗体检测在21日的30(70%)血清样本阳性(ZIKV PRNT90≥20)ZIKV中和抗体。 因此,ZIKV NS1抗体的存在与ZIKV中和抗体的存在高度相关(P< 0.00001; 表格3.)。 JEV显示最低的协会,anti-JEV NS1抗体的只有9/27的样品以积极JEV PRNT (JEV PRNT90≥20),尽管协会仍具有统计学意义(P< 0.01; 表格3.)。 整体DENV PRNT数据之间的一致性和NS1抗体差异很大(表的数据3.)最有可能反映之间的交叉反应性抗体针对DENV NS1蛋白密切相关。
已知Zika病毒广泛分布在东南亚,与最近的报告感染在泰国等东南亚国家25、越南26和缅甸27,但没有大规模ZIKF的暴发。 其他国家这种情况形成鲜明对比,在引入ZIKV随后大流行疫情28。
在东南亚的历史循环ZIKV仍不清楚。 虽然早期血清学研究表明ZIKV在东南亚的发行量在1950年代和1960年代早期29,30.,31,32,最近的一些数据的可靠性受到质疑7。 然而,ZIKV的隔离埃及伊蚊蚊子在马来西亚3.明确地方ZIKV在1960年代中期在东南亚。 在东南亚的持续循环ZIKV可以从最近的一份报告推测ZIKV孤立的泰国标本拍摄于2006年6和2007年Yap ZIKF爆发状态、密克罗尼西亚33这是一个亚洲血统ZIKV所致。 三年后的2010年ZIKV中检测出病人在柬埔寨34在泰国和回顾性分析确定ZIKV感染病例发生在2012年35。 同年一例ZIKF在菲律宾被确认36。 因此,分散ZIKV感染病例已报告在东南亚十多年了。 的重大问题是因此为什么ZIKV导致东南亚案例太少,而导致大流行疫情时介绍给其他国家和地区。 目前的主流理论包括变化改变遗传性或致病性的病毒37,或者一定程度的免疫保护出现在东南亚的人口8。
在泰国至少4蚊子传播黄病毒传播,即DENV38,JEV39,ZIKV35和Tembusu病毒(TMUV)40。 虽然这一病毒通常被认为是一个特定鸟类黄病毒41、高水平的人类血清转化在鸭已报告在中国产业工人42和这种病毒可能在泰国至今未识别的作用。 这些病毒的抗体反应可以高度交叉反应性18,使血清诊断血清学的使用43。
在我们最近的研究利用血清样本135正常健康的泰国人,我们表明,中和抗体ZIKV存在水平被认为是保护(PRNT50≥10)在70%的样本,而高水平的中和抗体(PRNT90≥20)被发现在近四分之一的样品检查8。 重要的是,没有发现协会之间的中和抗体的存在黄病毒和ZIKV中和抗体的存在8。 这是符合的一项研究显示交叉保护ZIKV邮寄anti-DENV抗体一般由6个月减少感染44。 相结合,这些研究表明,感染有显著的更高层次的ZIKV在泰国比以前一直公认的,事实上这最近得到证实45。
为了进一步探讨这个问题,本研究试图寻找抗体NS1在同一血清样本以前描述的中和抗体ZIKV, JEV和DENV 1到48。 因为这两个黄病毒E蛋白和NS1蛋白分子量相似(大约50和46-50 kDa)我们采用固体矩阵免疫印迹体系被煮沸或不变性的蛋白质二硫化物桥减少,和寻找NS1二聚物的存在。 值得注意的是,ZIKV NS1抗体只发现在样本ZIKV中和抗体。 没有反应ZIKV NS1样本中发现没有ZIKV中和抗体。 这个结果显示了anti-DENV NS1之间缺乏交叉反应性抗体和ZIKV NS1,有明确的证据DENV NS1蛋白抗体多数的血清样本检测。
ZIKV抗体识别ZIKV二聚体NS1抗原的抗体是由单体和二聚体的任何特定的形式。 虽然不是用来区分这些抗体,四个患者样本(S39、S89 S99,算是; 补充文件1)反应只有二聚体,没有任何证据表明他与单体的交互说明抗体能够识别二聚体,或可能的六聚体NS1可能形成一个响应ZIKV感染的一部分。 同样,在9例anti-ZIKV NS1抗体被认为没有证据表明,尽管ZIKV PRNT90滴度≥20。 这些案件可能表明来自另一个黄病毒的交叉反应,并给予相对明显缺乏ZIKV之间的交叉反应和DENV / JEV看到这里,他们可能表明另一种未被发现的循环黄病毒。
的特异性测试用于本研究进一步证实了JEV PRNT浓度之间的相关性很低,anti-JEV NS1抗体的存在。 如上所述,泰国推出了JEV疫苗接种运动在1990年代使用灭活老鼠大脑纯化病毒24。 灭活病毒疫苗,结构蛋白免疫反应将只是因为没有活跃复制(因此没有NS1蛋白的生产)。 然而,有趣的是一些样品做展示JEV NS1特定抗体的存在,支持的持续循环JEV在泰国被报道39。 然而,有两个样品的anti-JEV NS1 JEV中和抗体抗体是阴性,可能指示另一个无法识别的循环黄病毒。
而研究表明,免疫应答flaviviral感染可以持续数十年46的时间长度,NS1蛋白的抗体可以探索发现感染后仍然不佳。 一项研究表明,anti-DENV NS1抗体可以检测到至少在感染后3年47,而另一项研究中表明,期间血清转化为JEV seroreversion NS1抗体在亚临床感染人类的4.2年48。 鉴于本研究观察血清样本正常健康的泰国人,它表明anti-ZIKV抗体可能大大延长时间他们可以检测到。
总的来说,这项研究显示anti-Zika病毒抗体的存在在正常健康的泰国血清样本。 明显,anti-ZIKV NS1抗体被发现只有在血清样本能够中和ZIKV (PRNT90≥20),这表明这些抗体出现自然感染的结果,而不是通过交叉反应。 在我们最初的研究中,近25%的样本有ZIKV PRNT90≥208再一次支持,大大增强ZIKV在泰国的传播比以前认为。 这可能发生由于80%的传播在人类无症状49,以及轻微的症状情况下被掩盖了大量的登革热病例发生在泰国每年38。 比较研究其他国家在东南亚国家可能进一步温和ZIKV在东南亚的传播。
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