摘要
在先前的工作中,我们表明,E2F转录因子抑制转移的损失。 这里我们解决这种表型和识别机制E2F监管协调肿瘤细胞基因转移。 转录组分析E2F1基因敲除肿瘤中发现了一个角色E2F1的主监管机构一套pro-metastatic基因,而且还发现E2F1在肺转移和未知目标基因的作用。 高表达这些基因之一,Fgf13,与早期人类乳腺癌转移相关的临床数据。 这些数据导致假设Fgf13对乳腺癌转移至关重要,这upregulation Fgf13可能部分解释E2F1促进乳腺癌转移。 为了测试这个假说我们通过CRISPR切除Fgf13。 删除的Fgf13 MMTV-PyMT乳腺癌细胞系减少肺部的殖民尾静脉注射。 此外,Fgf13减少的损失在体外细胞迁移,表明Fgf13可能是至关重要的肿瘤细胞逃避原发肿瘤,在远端网站。 这项工作的意义是双重的:我们都发现了基因功能的E2F1调节转移,我们已经确定了新的pro-metastatic Fgf13 E2F1的目标基因的功能。
介绍
乳腺癌转移性疾病进展与不良预后有关,只有22%的患者存活5年1。 结果,有一个关键的需要了解调节转移的分子机制。 高通量转录组分析在理解方面发挥了关键作用改变肿瘤细胞的转录程序各个步骤中转移。 重复选择倾向于瀑特异的细胞转移2,3.,4导致发现的转录签名每个转移网站独有的转录组变化特征5。 其他研究也结合临床观察和基因表达分析生成转移相关基因表达,预测进展6,7,8。 最后,基因表达分析被用来识别基因转移然后在乳腺癌的转基因小鼠模型进行验证9,10,11,12。
乳腺癌转移的最佳模型的特征之一是MMTV-PyMT系统的表达多瘤病毒中间T抗原表达的控制下鼠乳腺瘤病毒启动子/增强子13。 中间T抗原的表达结果在关键信号通路包括Ras激活,PI3K / AKT PLC-γ。 这些转基因小鼠快速开发多病灶的乳腺肿瘤发生和发展肺转移在端点外显率近100%。 我们最近的工作强调了相似的MMTV-PyMT肿瘤对人类乳腺癌和识别之间共享基因表达改变小鼠模型和人类疾病14。 一个例子是我们的观察,E2F通路签名高架MMTV-PyMT模型中,我们最终验证E2F1的角色,E2F3, E2F3使用小鼠模型在肿瘤进展11,14。 E2F转录因子是正规的参与G1 / S过渡,最终促进(E2F1-3a)或抑制(E2F3b-8)细胞周期进程15,16,17。 在这项研究中,我们扩展这个主题来展示角色e2f activator类的肿瘤恶化独立于他们的角色在细胞周期进程。
杂交MMTV-PyMT E2F1老鼠老鼠为空18,E2F219和E2F320.导致乳腺发育,改变肿瘤延迟,组织学和血管化11,21。 除了,或者作为一个效果,E2F1的作用,E2F2在这些肿瘤表型,E2F1和E2F2删除降低转移能力伴随着减少循环肿瘤细胞。 这导致了假设E2F转录因子调节肿瘤细胞内在基因表达程序转移发展的关键。
鉴于E2F转录因子已经演示了将成千上万的个人目标基因22,我们试图描述E2F1基因表达谱−−/MMTV-PyMT肿瘤。 我们假设这种方法允许我们识别E2F1-mediated转录程序有助于转移。 这将使我们能够确定E2F1目标基因以前涉及乳腺癌转移但也允许识别小说转移司机的基因。 符合这一点,我们已经确定了一套E2F1目标基因已被先前与乳腺癌转移,这表明E2F1可能是乳腺癌转移的主监管机构。 此外,这个分析也发现了一个新角色目标E2F1基因纤维母细胞生长因子13 (Fgf13)在乳腺癌转移。
结果
基因组的比较E2FWT / WT和E2F−−/肿瘤
确定全球基因表达对E2F丧失,我们分析了从E2F MMTV-PyMT肿瘤WT / WT,E2F1−−/,E2F2−−/,E2F3+ /−背景Affymetrix微阵列。 发现使用一个无监督分类方法23,我们调查了在各种肿瘤基因表达的关系。 我们使用1000次迭代的数据重采样测量的频率在2 - 10 co-clustering集群。 检查潜在的类使用经验累积分布函数(CDF)显示,最大限度的提供了四个集群(图。1)。 这表明这群肿瘤可分为4不同的集群,并添加额外的集群将没有统计上显著的价值23。 测量每个集群内样本之间的相关性,我们使用轮廓宽度24(无花果。1 b)。 轮廓宽度表明相关性最强的是出现在集群1。 此外,我们注意到,大多数的样品有很大的相似之处其他样品在其分配的集群。 重采样样本co-clustering整个迭代也见图。1 c(见蓝白色的热图,白色显示0% co-clustering深蓝色100%聚类)。 总的来说,这一分析表明这些肿瘤的关系是最好的描述了四个集群。
共识集群揭示MMTV-PyMT E2F淘汰赛的主要基因表达类肿瘤。 (一个)无监督类发现MMTV-PyMT (GSE 104397)的肿瘤基因表达数据的经验累积分布函数23。 x轴显示一致指数是衡量样本聚类在一起(1.0 0.0样品,从来没有聚集在一起,样本总是聚集在一起)。 在y轴上显示提供价值。 这提供了一种衡量集群的稳定性。 因此,这个情节措施数量的集群(的颜色),提供最大CDF实验组的(稳定的分类)的样本模糊(并不总是聚集在一起)。 (B)一个轮廓的宽度24分析基于四个集群识别措施相关的样本在每个集群(轮廓宽度越大,相关性越高的一个给定的示例集群中的其他样品; 每个酒吧代表一个示例)。 (C)共识集群基于这四个选择集群(如确定一个)。 共识执行聚类使用1000次迭代和90%物品(样品)的重采样。 系统树图的顶部显示的关系saples基因表达谱的基础上。 以下系统树图,颜色编码框逐条列记集群标签和整合这些面板b所示下,黑人酒吧提供样本注释基因型和肿瘤组织学根据样本位置在上面的系统树图和下面的热图。 接下来,蓝色的热图显示了示例和集群关系超过90%的1000次迭代重采样和集群分类。 最黑暗的蓝色表明co-clustered样本100%的时间,白色表示样本没有聚集在一起。 对于中间值的样本,co-clustering的百分比与集群外的其他样本。 例如,最左边样品在集群2中,有时集群与集群3除以样本重采样迭代的一小部分。 另外,集群4示例集群与集群3样本迭代重采样和重聚簇的一小部分。 最后,热图显示了每个样本的基因表达谱(一点列=样品,行操作=基因)。 基因被命令使用质心连杆。 表达水平显示根据颜色条的右边的热图。 (整个分析)数据预处理:看方法。
更详细地检查这些集群(无花果。1 c),我们观察到基因表达模式与肿瘤组织学和基因型。 例如,集群1主要与鳞状上皮肿瘤组织学(紫色)。 microacinar和乳头状肿瘤似乎独立的基因型; 与大多数E2F1−−/肿瘤受命于集群2,E2F2−−/和E2F3+ /−肿瘤在集群3和4,E2F WT肿瘤出现在每个集群。 作为一个额外的分析,我们还使用了监督的方法使用一个发表基因为内在小鼠乳腺肿瘤分类设置25。 为定心偏差调整26和,使之能够准确解释这种内在的分析,我们结合数据集与发表的数据9,27,28利用贝叶斯因子回归模型29(BFRM)正确的批处理效果。 这个内在分析分离肿瘤从MMTV-PyMT模型在不同的集群(图。S1A)和分离肿瘤根据组织学和基因型(图。印地)。 与之前的工作相一致30.鳞状上皮肿瘤显示,官腔基因表达特性(无花果。印地,我)。 MMTV-PyMT E2F1−−/从其他MMTV-PyMT肿瘤和肿瘤集群分别显示一些基因的高表达腔的集群(图。印地二世)。 正如预期的那样,我们没有发现证据claudin低肿瘤在任何MMTV-PyMT肿瘤(无花果。第四印地)。 我们没有观察到不同的集群基因扩散对于E2F状态(图。印地三世)。 然而,我们观察了不同肿瘤组织学亚型。 观察值扩散特征基因的表达31microacinar和鳞状上皮肿瘤显示,高表达,而乳头状肿瘤中表达有显著降低(p < 0.01 vs microacinar乳头状或乳头状和鳞状; 无花果。S2A)。 在协议中,肿瘤生长速度数据的回顾性分析,表明乳头状肿瘤进展缓慢(天直到2000毫米3.比microacinar或鳞状上皮肿瘤(图)。开通)。 综上所述,这些数据展示独特的肿瘤组织学特性和肿瘤基因型; 与E2F1−−/其他MMTV-PyMT肿瘤肿瘤表现出关键分子差异。
为了测试这些E2F1基因表达差异−−/肿瘤与差异主要细胞信号通路的激活,我们利用二元回归方法32预测途径激活整个MMTV-PyMT肿瘤。 这显示E2F1−−/肿瘤高E2F4活动(无花果。2)和p53(无花果。2 b)通路和低的活动路径之前与转移; 的RhoA33,Src34和表皮生长因子受体35信号通路(图2汉英分别)。 最后,使用单一样本基因集富集分析(ssGSEA),我们发现E2F1−−/肿瘤标志的表达有显著降低缺氧36签名(图。2 f); 一个过程也与转移相关37。
基因表达特征揭示途径激活差异与E2F1的损失。 (一个)使用二元回归方法14,32的概率明显高于预测E2F4活动揭示E2F4途径激活E2F1 KO肿瘤相比E2F WT肿瘤(p = 0.04)。 (B)使用二元回归方法14,32预测p53的概率明显高于活动揭示了p53通路激活在E2F1 KO肿瘤相比E2F WT肿瘤(p = 0.04)。 (C)使用二元回归方法14,32预测RhoA活动揭示了一个重要的减少可能RhoA途径激活E2F1 KO肿瘤相比E2F WT肿瘤(p = 0.001)。 (D)使用二元回归方法14,32预测Src活动揭示了一个减少可能的Src途径激活E2F1 KO肿瘤相比E2F WT肿瘤(p = 0.05)。 (E)使用二元回归方法14,32预测Egfr活动揭示了一个重要的减少可能的Egfr通路激活在E2F1 KO肿瘤相比E2F WT肿瘤(p = 0.02)。 (F)使用单一样本基因集富集36,73标志的分析表达缺氧反应签名显示了一个得分显著降低浓缩E2F1 KO肿瘤相比E2F WT肿瘤(p = 0.01)。
测试E2F1之间的显著差异的基因调节−−/和E2FWT / WT肿瘤我们使用监督分析38。 因为我们假设E2F1在调节中的作用转移目标基因的转录激活,我们特别感兴趣的226个基因在E2F1显著下调−−/肿瘤。 许多基因的低表达E2F1 KO肿瘤与缺氧有关响应(补充文件1)。
开始描述这些基因的转移潜力,我们使用卡普兰Meier临床分析和内在带注释的人类乳腺癌的基因表达数据39。 目标识别E2F1基因,我们使用ChIPBase40。 98年的226个不同的调控基因,E2F1目标(补充文件1)。 从这些,我们致力于基因高表达在肿瘤与下降时间内所有乳腺癌远处转移以及与个人内在肿瘤的亚型。 我们确定了55个基因pro-metastatic预测(没有不和谐的预测在不同亚型)(补充文件1); 其中34展示E2F1结合位点22。 使用确切概率法,我们观察到的分布直接E2F1目标更高的基因整合与人类乳腺癌转移的预测比基因(p = 0.001)不整合或不是人类乳腺癌转移的预测。 这表明E2F1目标基因改变在这些肿瘤与人类乳腺癌转移潜力,强调E2F1可能是乳腺癌转移的主监管机构因为它控制多个pro-metastatic基因的表达。
上述55个基因与人类乳腺癌转移相关检查文献中识别的分子变化已经证明调节乳腺癌转移在活的有机体内。 图中所示。S3,Vegfa41,Hbegf42,Hspb143,Flt144,L1cam45,Plaur46的表达有显著降低(p < 0.05)在E2F1吗−−/肿瘤和以前所有调节乳腺癌转移在活的有机体内。 此外,有基因表达E2F1明显较低−−/被证明有肿瘤在体外入侵或迁移沙土荒漠等功能47,Tead148,Coro1C49,Lama550,Tgm251,Fgf 752(p < 0.05,无花果。S4)。 综上所述,这表明E2F1−−/肿瘤低表达的基因和通路促进乳腺癌转移。
测试额外的基因转移函数
因为我们发现一些途径和E2F1基因改变−−/之前确认为肿瘤的转移司机的基因,我们试图找出小说监管者的转移在E2F1基因表达下调−−/肿瘤。 候选基因进行进一步的测试优先的选择调节基因以前从未被证实乳腺癌转移,E2F目标基因,与下降时间跨几个人类乳腺癌远处转移的乳腺癌亚型。 有了这个管道,我们确定微分表达式纤维母细胞生长因子13 (Fgf13)。 如无花果所示。3,表达E2F1显著降低1.4倍−−/肿瘤(q = 0.01, p = 0.02)。 500个基点的分析序列上游的转录起始点(TSS)显示七E2F绑定图案在人类十鼠标这个基因序列。 Fgf13明显的高表达与更快出现远处转移所有乳腺癌病例(无花果。3 b所有Er +肿瘤),但不显著(图3 c)。 然而,它能显著加速时间在ER -肿瘤远处转移(无花果。3 d)。 观察内在亚型,Fgf13与腔的一个肿瘤的转移无关(无花果。3 e)。 然而,在腔的B,官腔,Fgf表达her - 2丰富肿瘤早期发生转移的预测(图13。3 f-h分别)。
Fgf 13的表达E2F1基因敲除肿瘤,与人类乳腺癌转移。 (一个)箱线图RMA-normalized值集中表达水平的Fgf13 MMTV-PyMT肿瘤显示了显著减少的表达E2F1 KO肿瘤(p = 0.002,山姆:q = 0.01, 1.4折变化)。 (B)kaplan meier分析无远处转移生存在人类乳腺癌的数据集39表明高表达Fgf13与加速转移进展(HR = 1.59, logrank p = 2 e−05)。 (C)kaplan meier分析无远处转移生存在人类乳腺癌的数据集39表明高表达Fgf13相关(但不是统计学意义)和加速出现转移性乳腺癌雌激素受体(ER)积极的进展。 (D)kaplan meier分析无远处转移生存在人类乳腺癌的数据集39表明高表达Fgf13与加速转移进展er阴性乳腺癌发病(HR = 2.27, logrank p = 0.0075)。 (E)kaplan meier分析无远处转移生存在人类乳腺癌的数据集39表明高表达Fgf13相关(但不是统计学意义)和加速腔的一个乳腺癌的转移进展。 (F)kaplan meier分析无远处转移生存在人类乳腺癌的数据集39表明高表达Fgf13与加速乳腺癌转移进展在腔的B (HR = 1.94, logrank p = 2 e−04)。 (G)kaplan meier分析无远处转移生存在人类乳腺癌的数据集39表明高表达Fgf13与加速转移进展官腔乳腺癌发病(HR = 1.89, logrank p = 0.034)。 (H)kaplan meier分析无远处转移生存在人类乳腺癌的数据集39表明高表达Fgf13与加速转移进展Her2-enriched乳腺癌发病(HR = 2.79, logrank p = 0.026)。
为了测试这个基因转移行为,我们利用一个PyMT-derived细胞系(PyMT 419细胞)53定期和CRISPR(集群空间短回文重复)方法来创建Fgf13淘汰赛细胞。 数字4显示了一个示例的序列跟踪Fgf13淘汰赛行控制。 免疫印迹分析证实,Fgf13蛋白质含量是影响CRISPR基因编辑(图。4 b)。 此外,我们转导基因敲除行向量恢复Fgf13和证实搪性Fgf13免疫印迹(图。4 b)。
序列跟踪和对齐CRISPR-mediated Fgf13淘汰赛。 (一个)序列跟踪Fgf13 WT 13淘汰赛克隆细胞和Fgf 2 h5。 (B)免疫印迹分析Fgf13 WT细胞,Fgf13敲除细胞,Fgf13添加细胞。
我们选择评估殖民能力通过尾静脉注射。 在此设置50000个细胞被注入到尾静脉和肺部殖民检查21天后。 在老鼠身上接收控制细胞,健壮的转移性肺的殖民观察(图。5)。 此外,转移性肿瘤被发现偶尔在鼠标在其他网站。 急剧丧失Fgf13有限的能力在肺肿瘤细胞形成的殖民地(无花果。5 b)和(图的Fgf13恢复殖民的表达能力。5度)。 数量有显著减少小鼠的肺部病变存在接收Fgf13−−/细胞(图。5 d)。 总之,这些结果表明,Fgf13调节乳腺癌肺殖民,转移的关键一步。
Fgf13功能转移性肺的殖民。 (一个)代表的形象从小鼠肺部接收419控制细胞通过尾静脉注入了强劲的转移性肺的殖民。 (B)肺鼠标接收Fgf13淘汰赛克隆3 h1表明损失Fgf13受损的肺部肿瘤细胞殖民。 (C)肺鼠标接收Fgf13 addback(克隆3 h1)表明,恢复Fgf13允许对肺部肿瘤细胞殖民。 量化FGF13 KO和addback克隆相比MMTV-PyMT 419细胞株控制细胞(黑条)显示显著减少小鼠转移到肺部接收或FGF13(绿酒吧)淘汰赛细胞(未配对t检验,p < 0.05; 由野生型控制每个克隆相比)。
调查Fgf13函数
协方差预测Fgf13函数,我们检查了Fgf13网络使用基本MMTV-PyMT WGCNA分析E2F野生型肿瘤(补充文件238),识别探针对应35与Fgf13紧密关联的基因表达(gs阈值= 0.6,p < 0.0005)。 MSigDB透露了一个重要的协会与签名上调基因相对于导管癌浸润性导管癌原位(补充文件3.,假定值= 1.02 e−4,富兰克林·德兰诺·罗斯福核反应能量e = 3.97−2)。 我们也有兴趣注意与Rac1细胞运动性通路(补充文件2,假定值= 5.38 e-7,富兰克林·德兰诺·罗斯福核反应能量e = 1.29#3)。 这种关联的关键是强大的协方差Rac1 (gs = 0.60), chimerin GTPase激活蛋白1 (Chn1, g = 0.60),和Wasf1(徒下游Rac1调节细胞骨架,g = 0.61)。 匹配这个协会,Fgf13 KEGG通路的一部分肌动蛋白细胞骨架的监管。 测试这些变化是否存在交互的网络和Rb-E2F1 E2F1的路径改变−−/Fgf13之间的关系,说明肿瘤细胞骨架和运动基因,通路E2F1预测低活动−−/肿瘤(图。6)。 WGCNA确定额外的基因与细胞骨架监管功能等β微管蛋白6 (Tubb6)和microtubule-associated蛋白质1 b (Mtap1B)。 此外,鉴于Fgf13发表在神经细胞分化中的作用54,我们要注意这是另一个突出的主题感兴趣在Fgf13 metagene(表1)。 在测试中这些基因与人类乳腺癌转移作为协会的签名活动,我们发现这些基因的高表达明显与更短的时间在乳腺癌肿瘤远处转移(无花果。6B)。
WGCNA MMTV-PyMT肿瘤的分析预测Fgf13功能细胞的能动性与伤口愈合试验确认。 (一个13)字符串交互网络Fgf协方差较低的基因和细胞信号通路网络E2F1的活动−−/肿瘤揭示基因与基因协会的意义得分大于0.60显示FGF13许多FGF13 metagene演示了扶少团团员,包括基因功能在细胞运动性(Rac1, Wasf1 Chn1)。 此外,这些协方差与Ras基因网络,表皮生长因子受体,RhoA, Src, Rb, E2F1和β-连环蛋白通路。 (B协方差)卡普兰Meier分析Fgf 13基因网络签名显示这些基因与早期人类乳腺癌转移显著相关。 (C)划痕试验照片受损419控制细胞的迁移能力,FGF13 KO细胞,FGF13再添加细胞。 (D)量化伤口关闭在419年18个小时控制细胞,FGF13 KO细胞,FGF13再添加细胞。
测试函数可能在细胞活性,我们评估的迁徙能力MMTV-PyMT控制细胞和Fgf13 KO细胞划痕试验(无花果。6摄氏度)。 而控制细胞能够关闭划痕在18个小时,Fgf13 KO克隆了一个显著的缺陷在细胞迁移。 Fgf13恢复迁徙能力的表达,这些细胞,闭着伤口近18个小时(图。6 d)。 这些数据证实了生物信息学预测Fgf13功能在细胞迁移和为殖民缺陷提供了一个可能的解释与Fgf13损失有关。
讨论
利用转录组的方法,我们调查的机制e2f调节乳腺癌转移11。 在这里我们使用生物信息学分析比较全球E2F之间的基因表达差异WT / WTMMTV-PyMT肿瘤和E2F1−−/MMTV-PyMT肿瘤。 我们证明损失E2F1导致减少活动的几个关键信号通路之前证明监管转移(无花果。2)。 许多在E2F1基因表达下调−−/肿瘤与更快的发展为转移性疾病在人类临床数据与基因表达对缺氧的反应显著相关(补充文件1)。
大多数与缺氧相关的基因也直接E2F1目标基因。 缺氧被描述为一个主调节器的转移基因表达改变的结果带来的缺氧反应37。 这些基因表达的变化使肿瘤细胞进展在转移级联通过多个检查点。 这包括促进血管增生,上皮间充质转变,肿瘤细胞入侵,细胞外基质的重塑,并增加细胞迁移37,55,56,57。 缺氧也上调基因促进肿瘤细胞内渗,生存的血液,溢出和殖民遥远的器官37。 符合流程与缺氧反应,我们以前观察到血管生成缺陷和减少循环肿瘤细胞显示为转移性细胞内渗缺陷或不能拒绝女性11。 我们之前的工作表明,这些血管缺陷显著减少主要的血管生成相关信号分子,Vegfa。 本研究扩展了这一发现,增加了越来越多的研究表明E2F1作为血管生成的关键调节器18,58,59,60; 建议E2F1调节许多基因在缺氧反应计划潜在的肿瘤脉管系统协调发展。
除了缺氧反应,E2F1−−/之前已经显著降低基因的表达与肿瘤转移。在体外研究已经证明,沙土荒漠47,Tead148,Coro1C49,Lama550,Tgm251和Fgf 752参与肿瘤细胞的细胞迁移和入侵特征。 这些基因的表达参与入侵表型可能提供额外的机械的信息来解释我们之前发现E2F1−−/肿瘤可能入侵/内渗问题表示了循环肿瘤细胞的减少11。
本文提供的数据还演示了一个角色在殖民Fgf13远端站点的转移。 Fgf13是nonsecretory FGF的蛋白质家族54我们表明,肿瘤细胞失去Fgf13阻塞肺部的殖民尾静脉注射。 为了调查这一块转移能力的机制,我们发现,基因Fgf13使用WGCNA一起变动。 在这些基因中,我们指出几个基因与细胞运动性与FGF13交互网络。 这使我们预测FGF13可能在细胞迁移功能。 我们证实了这种预测使用划痕试验,Fgf13淘汰赛克隆了受损的细胞迁移。 有趣的是,Fgf13神经元发展的作用也凸显其作用在细胞迁移详细Fgf13诱导微管稳定的机制54。 在Fgf13协变量网络,我们也观察到许多基因与神经元微管稳定和发展(表一致1)。 本协议之间的两项研究可能建议保存细胞迁移的机制在肿瘤细胞和神经元。 此外,从我们的研究和吴等。54预测的可能功能转移Fgf13可能归因于一个函数通过稳定微管在细胞迁移。
作为一个整体,这项研究表明,与E2F1损失相关的转移性缺陷可能是由于无法正常启动基因表达对缺氧的反应。 重要的是,许多在E2F1基因表达下调−−/肿瘤与缺氧反应一直显示为监管者乳腺癌转移。 我们发现E2F1基因Fgf13肺殖民的关键目标,可能通过细胞迁移机制; 可能提供一种E2F1调节细胞迁移。 总的来说,本研究进一步初始特征E2F1的监管转移通过确定转移相关基因表达E2F1反应损失。
方法
RNA和微阵列
准备的RNA样本flash冻结肿瘤是使用试剂盒RNeasy工具包roto-stator同质化。 RNA从17 Myc诱导肿瘤是提交给密歇根州立大学基因组基因表达分析的核心设施使用鼠标430 2.0 Affymetrix数组。
基因表达分析
原始强度。 玻璃纸文件处理和RMA规范化使用Affymetrix表达式控制台。 基因表达数据下的基因表达综合沉积在加入GSE104397数量。 无监督类发现是通过使用集群+共识23。 对于类的发现,我们绘制Affymetrix探测他们的基因符号使用平台表沉积在基因表达综合(GPL8321)。 由于多个探测单个基因的存在,我们倒塌的重复基因意味着每个样本中表达。 这种方法减少了我们的数据集的22690调查12847个基因符号。 接下来,我们集中在样本基因表达值中值数据集。 最后,我们筛选基因使用标准差大于0.5的要求。 这导致了1303个基因用于聚类类发现和共识。 我们使用1000次迭代和90%物品(样品)重采样来评估2 - 10潜在集群(组织/类)。 共识累积分布函数(CDF)情节也使用共识集群+生成23。 轮廓宽度24是用来评估的有效性每个集群使用R包“集群”61。 根据先前的研究途径激活是预测14,32,62。 单样本基因集富集分析为特点36基因集使用ssGSEAProjection模块Broad研究所的基因模式63。 意义的微阵列分析38是用来比较E2FWT / WT和E2F1−−/肿瘤在褶皱的变化分析。 直接使用ChIP-base E2F1目标基因被确定40和数据从先前ChIP-seq实验22。 使用使用KMPLOT.com查询生成kaplan - meier情节人类乳腺癌表现和临床资料64。 重大发现了与先前建立的基因集重叠使用分子特征数据库36。 交互网络组装使用www.string-db.org65。 加权关联网络分析是根据公布的协议实现66和使用基因意义分数阈值0.6选择基因进行进一步分析。
细胞培养
MMTV-PyMT 419细胞的礼物斯图尔特出售博士和伊恩Guessand以前描述的53。 所有肿瘤细胞培养在杜尔贝科修改鹰的媒介,NaHCO3 3.7 g / L, 3.5 g / L d -葡萄糖,胰岛素5 ug /毫升、氢化可的松1 ug /毫升、5 ng / mL Egf, 35 ug BPE /毫升、50微克/毫升庆大霉素,1 x抗生素/抗真菌的,10%胎牛血清。 媒体将pH值为7.4。
CRISPR
Fgf13序列是来自UCSC基因组浏览器67。 引导序列被提交预测外显子(只使用那些常见的所有Fgf13亚型)序列使用CRISPR设计工具:http://crispr.mit.edu/。 寡核苷酸序列指导装配设计通过添加“G”之后,“中国商飞”导游5′末端的序列。 互补DNA的指南,添加“CAAA”5′末端。 寡核苷酸序列如下:
Fgf13 5′: CACCGTCAGCAGCAATCCGGCCGA
Fgf13 3′: AAACTCGGCCGGATTGCTGCTGACC
DNA寡核苷酸对指导装配序列被命令从集成技术https://www.idtdna.com/site。 寡核苷酸被稀释到100在水的浓度。 向前退火的寡核苷酸5 uL和5 uL的反向益生元在10 uL孵化2 x退火缓冲区(10毫米三羟甲基氨基甲烷、液pH值7.5 - -8.0,50 mM氯化钠,1毫米EDTA)在95摄氏度4分钟,然后冷却到室温。 退火的寡核苷酸插入PX458向量Addgene (# 48138)。 确认克隆的引导序列是利用Sanger测序完成的。
PyMT转染419细胞根据先前描述的协议68。 选择克隆,GFP阳性细胞分为96孔板使用荧光激活细胞分类。 淘汰赛PCR克隆筛选的放大与PAM ~ 300 bp扩增子序列集中位于PCR产物。 PCR产品解决3%的琼脂糖凝胶,提取QIAquick凝胶萃取设备,提交sanger测序。
PCR扩增引物:
Fgf13 5′, 5′-TGTTCTAACTTCCAGAAAGGCATA-3′
Fgf13 3′, 5′-CAGTGGTTTGGGCAGAAAAT-3′
的嵌套引物测序,序列后使用。
Fgf13 5′, 5′-CACACCCATATAAGTATTGACTTTCA-3′
击倒,再添加经免疫印迹根据发布的方法28。 对于西方的污点,我们使用了多克隆抗体Fgf13(表达载体PA527302)和beta-actin我们使用单克隆抗体(# 4970)细胞信号传导等。 的Fgf13 ORF购买从GenScript pcDNA3.1向量和随后被消化和EcoRI XhoI克隆pLXSN EcoRI和XhoI网站的。 逆转录病毒包装在hek - 293 gpg如前所述(90)。 短暂,汇合的10厘米盘hek - 293 gpg细胞转染和5µg pLXSN-mADM pLXSN-mFGF13和病毒包含媒体随后被收获。 Subconfluent 10厘米板块(~ 20%融合)的419个细胞被感染1毫升non-concentrated病毒上清液和感染细胞与300µg /毫升G418被选中。
在体外化验
测量细胞迁移,伤口愈合化验进行的2 ug /毫升丝裂霉素C使用标准的方法69。 显微照片拍摄在0小时,18个小时。
在活的有机体内化验
动物协议用于这项研究被密歇根州立大学IACUC委员会批准,按照国家和机构的准则进行。 所有的老鼠FVB背景。 小鼠尾静脉注射,MMTV-Cre控制被用来避免免疫反应中T抗原70,71,72。 控制每个淘汰赛克隆细胞和50000细胞通过尾静脉注射到血液中。 21天之后,小鼠安乐死。 肺被切除)染色法检测转移。 计算的意义,未配对t graphpad棱镜完成。