摘要
1978年首次识别后,犬细小病毒(CPV)已被全世界公认为犬人口健康的主要威胁。 这ssDNA病毒的特点是高替代率随着时间的推移和一些遗传和表型变异出现。 总的来说,三个主要抗原变异的定义建立了基于特定氨基酸标记位于一个精确的衣壳的位置。 然而,几个小变异和不一致的检测观察抗原之间的分类和发展史对这个方案的可靠性提出质疑。 同时,CPV异质性对微分中毒性变异的假设,虽然没有健壮的和一致的提供了示范。 本研究拒绝抗原变异的概念,试图评估CPV应变之间的关系发展史,重建使用整个VP2基因编码中包含的信息,和一些临床和hemato-biochemical参数,评估从34 CPV感染狗入学。 通过使用不同的统计方法,本研究的结果显示病毒发展史和主机之间的关联参数由于免疫系统,凝固,急性期反应,更普遍的是,动物的整体反应。 特别是,一个强大的和重要的系统发育信号证明中性粒细胞计数和白细胞。 因此,尽管样本量有限,病毒发展史和疾病严重程度之间的关系已经首次观察到,这表明CPV毒性是一种遗传特性。 可能存在的演化支不同毒性再次突显出密集的相关性研究流行病学监测和CPV进化为了更好地理解致病因素,他们的流行病学和开发适当的对策。
介绍
食肉动物protoparvovirus 1是一个物种在属内吗Protoparvovirus在家庭中科的包括几个病毒的流行病学相关野生和家养的食肉动物1。 犬细小病毒(CPV)是一种最相关和研究这一组的成员,因为其同伴动物的临床意义。 像其他食肉动物细小病毒,它的特点是一个相对简单的,单链,负的线性DNA基因组约5.12 kb,,两个主要的开放阅读框(orf)翻译4蛋白质通过可变剪接2,3.。 第一个ORF编码非结构性蛋白质NS1 NS2,参与病毒复制,而第二个ORF编码病毒衣壳组成VP1和VP2。 额外的蛋白质(VP3) VP2乳沟由宿主蛋白酶后产生4。
它的起源后,可能由于新宿主适应猫科parvovirus-like野生食肉动物5狗,CPV迅速在全球范围的传播6,7,导致严重的疾病暴发和高死亡率8。 自从CPV完全依赖于宿主细胞机械、病毒复制需要积极增殖细胞。 这个特性在很大程度上解释了病毒细胞趋向性和发病机理。 事实上,CPV承认肠隐窝和淋巴器官为主要组织目标9。 因此,最常见的临床特点是呕吐和腹泻与厌食症,抑郁和发烧。 通过胃肠道液和蛋白质的损失会导致严重脱水和低血容量性休克。 胃肠道症状都伴随着严重的免疫抑制,表现为淋巴细胞减少和作最终细小,,加上肠道屏障的破坏,促进细菌的通道和/或木糖醇的血液10。 败血症、内毒素、系统性炎症、凝血障碍和脓毒性休克因此通常出现在CPV受感染动物和大大加剧疾病严重程度和杀伤力11,12,13。
此外,CPV感染和复制的myocardiocytes幼崽从免疫天真bitch(婊子),通常导致致命的心肌炎。 然而,高人口免疫力由于广泛的免疫接种方案,大大减少了这个标志的发病率14。
像其他ssDNA病毒,CPV显示进化速率高,导致一个显著的变化在核苷酸和氨基酸水平15。 事实上,最初的CPV (CPV-2)是迅速取代了世界各地的新抗原变异CPV-2a和CPV-2b出来,分别在1979年和1984年16。 最近,一个“主要”抗原变异,CPV-2c,已被确认和证明广泛分布5,17,18。 CPV异质性导致了猜测的微分免疫学和毒性菌株之间的功能。 然而,迄今为止,除了零星的报告,没有研究一贯表明抗原变异与致病性/毒性5,19,20.,21。
当前的CPV亚种级别分类主要是基于特定的氨基酸残基的存在在特定VP2的位置5,22。 然而,这种方法已经导致了新变种的建议除了上述主要的,复杂的CPV术语及其流行病学的理解。 此外,更广泛的分析证明了有限的一致性将某些氨基酸的位置与毒性23这些表型标记之间的不协调和系统经常被报道18。 因此,关注特定氨基酸位置不能反映实际的压力之间的关系,阻碍的识别一个特定病毒演化支和病理之间的联系/毒性特性。
本研究试图解决这个问题通过使用不同的统计方法来评估CPV应变之间的关系发展史——重建使用整个VP2基因-和一个广泛的数据库的记忆的,临床和hemato-biochemical参数。
结果
动物和病毒人口特征
14个女性和20名男性,34科目参加这项研究1)的可用性提供一个完整的临床记录,2)一个完整的、高质量的VP2序列。 动物是正确接种CPV的一半,而剩下的没有完成标准接种协议或未接种疫苗。 在接种疫苗的狗,11.7%(2的17)死亡比例为29.4%(5个17)未接种疫苗的动物。 然而,疫苗接种之间没有发现显著关联状态和死亡(p = 0.398)。 同样,没有检测到协会动物性别和死亡之间发生(p = 1)。 更详细的描述,包括主体特性提供了补充表1。
获得的VP2核苷酸序列显示平均0.5%的原始遗传距离(间隔0 - 1.31%)和氨基酸的平均生距离0.5%(间隔0 - 2.1%)。 采样菌株是代表所有主要抗原变异(CPV-2 (n = 1), CPV-2a (n = 23), CPV-2b (n = 7)和CPV-2c (n = 3)基于VP2氨基酸残基87年和426年(补充图1)。 氨基酸的频率提供了每个VP2位置补充图。2。
Phylogenesis-trait协会
第一主成分轴的车牌提取解释13.16%的底层的可变性。 虽然似乎可以适度值,该第一组件显著优于其他的解释“全球”变异性沿着树,因此选择了以下分析。
PC1加载评估显示,更高的贡献全球主要轴变量归结于:免疫系统的功能(如中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞等),凝固(例如肺动脉栓塞和纤维蛋白原),组织和肝酶(如血清AST活性、ALT、LDH),急性期反应的标记(APP)(如α和β球蛋白结合珠蛋白,白蛋白/球蛋白比值(A / G))和更普遍,代谢紊乱的标志(如血浆乳酸、皮质醇/肌酸、胆固醇和甘油三酸酯水平)(图1)。
全球第一个组件的载荷。 为解释从容,只有标签变量与载荷的高75百分位显示(蓝色虚线)。
Abouheif测试执行的变量主要是导致全球第一轴演示了一个重要的系统发育的信号:α2球蛋白,β2球蛋白,单核细胞,中性粒细胞,a / G,血清AST、血清结合珠蛋白、血清甘油三酯和WBC(表1和无花果。2)。 然而,在控制了错误发现率(罗斯福)只有中性粒细胞和白细胞仍然显著。 没有统计协会观察树拓扑结构和分类变量之间像动物性别、接种疫苗和疾病状态的结果。
Barplot报告的标准化值hemato-biochemical参数证明与病毒相关拓扑(左插入)。 死者的酒吧虽然不是狗是红色正确接种动物用红色突出显示标签。 标签的参数统计学意义在控制了错误发现率(罗斯福)标记为红色。
没有统计协会观察树拓扑结构和分类变量之间像动物性别、接种疫苗和疾病状态的结果。 轨迹,轨迹AMOVA结果表明,核苷酸频率在303年职位,375年,537年、1509年和1701年为每个变量定义的组之间也有明显的差异。 然而,所有的核苷酸变异识别代码同义突变和氨基酸之间的差异观察组织考虑的变量。
讨论
感染的临床开发是一个非常复杂的现象涉及的错综复杂的网络交互在不同的条件下,传统上分为环境、host-related pathogen-related24。 其中,病原体毒力显然决定疾病中起着重要作用的结果。 几个病毒物种,非常不同的病理效应和临床体征已经关联到特定的隔离。 不同于更复杂的有机体,表型特征,包括毒性,几乎完全是由基因决定的微生物病原体,特别是在病毒。 因此,从共同祖先形式的继承,因此系统聚类,可以预期。 这些协会一直在猜测CPV,不同的抗原变异之间的毒性已经猜测19。
这些协会一直在猜测CPV,不同的抗原变异之间的毒性已经猜测19。 Spibey等。20.建议的发生在动物感染CPV-2c更严重的临床症状。 然而,这些结果与先前的报道21。 例如,月球等。 (2008)19证明的致病性更高CPV-2a相比CPV-2b台湾菌株。 有趣的是,这两个CPV-2a菌株没有显示相关的毒性差异,支持一个实际的抗原变异的毒性。 然而,重要的是要注意,在氨基酸水平的两个测试CPV-2a菌株(分类基于残留426只)不同within-variant(4)氨基酸差异比CPV-2a和CPV-2b菌株之间(2氨基酸差异)19。 因此,一个合适的病毒集群和临床结果之间的联系很难建立。 更普遍的是,越来越多的证据证明一个分类的限制和不一致基于表型标记18。
因此,本研究旨在调查clinical-pathological数据的分布(如病毒感染的结果)在种系发生树为了研究CPV genetics-virulence协会因此继承。
车牌提取结果表明,大约13%的数据变化可以解释为首次全球组件,反映出相关倾向的临床特征与系统结构。 虽然整体可变性解释这个轴看起来很低,必须要强调的一点是,执行分析躺在隐式的假设与病毒特征考虑临床结果。 实际的场景显然是更复杂的和其他环境影响和宿主因素,以及其他未被发现的病毒的存在和共病的疾病,不能占在目前的研究中。 因此,的证据不可忽视临床遗传参数和病毒之间的模式,尽管这不可避免的“噪音”,强调观察结果的相关性。
值得注意的是,全球第一个组件的评价载荷证明显示的变量关系病毒发展史参与CPV发病机制和相关的系统性疾病,导致多器官或失败。 更正式的统计分析证实了这些结果,突出的存在显著的种系发生信号的几个变量,可以在全球范围内由于宿主反应和疾病严重程度(表作为标记1)。 然而,必须要强调的一点是,只占罗斯福之后,中性粒细胞和白细胞仍然显著。 因此,降低免疫系统细胞计数是一个频繁的CPV感染的标志,因为myelopoietic细胞的破坏和一些作者相关的较低的白细胞计数预后不良12,25,26。 在一定风险的错误是不可否认的,其余的参数(表1),他们仍然值得一提,因为不同的统计方法的一致性和生物合理性。
凝血系统和因子浓度变化(如纤维蛋白原)一直在记录CPV-infected动物27,可能是因为系统性炎症导致凝血酶生成由组织因子,downregulation生理抗凝机制,抑制纤维蛋白溶解28,29,30.。 hyperfibrinogenemia也可能导致pro-coagulative状态。
除了纤维蛋白原外,其他蛋白质含量是确定与病毒有关的遗传特性,尤其是α2和β2球蛋白组件,包括元素参与了急性期反应(即急性期蛋白质; 应用程序),结合珠蛋白、血浆铜蓝蛋白和c反应蛋白。 因此,类似与观察病毒拓扑依赖白蛋白浓度(消极的应用)和a / G比值。 这些证据尤其暗示,因为应用程序开发是一个早熟的许多病理刺激反应31,包括传染性病原体,导致放大和系统性炎症的影响。 应用浓度与疾病严重程度证明了几个疾病,包括CPV感染31,32。 特别,高血清CRP水平与死亡率呈正相关33,34。
最后,几个改变hemato-biochemical参数归结于肝或肾痛苦或代谢和酸碱紊乱的变化影响了全球第一组件,虽然并不总是显著的相关性。 尽管这些差异可能没有直接CPV造成的,他们可以被视为一个反映血容量减少,震惊和低灌注。 脂类代谢的变化也与病毒发展史。 先前的研究表明,脂蛋白在脓毒症中发挥核心作用,绑定和中和细菌脂多糖,胆固醇和甘油三酯水平与人类患者脓毒症的死亡率有关35,36。 类似的协会也证明狗parvoviral肠炎37。
所有检测参数,除了少数例外,几乎不能被直接CPV的效果在一个特定的目标,和似乎代表更实际地动物的整体反应。
不幸的是,有限的样本大小和初步探索的需要征收大量的变量之间的权衡I和II型错误,阻碍和复杂的识别病毒基因型之间的联系和主机上的特定表型的影响,中性粒细胞和白细胞最明显的例外。
然而,作为一个整体,这些结果表明某种病毒发展史和疾病严重程度之间的关系,表明CPV毒性是一种遗传性状,源自一个祖先的菌株,可以描述后代集群。
很令人惊讶的是,这些证据并不反映相应的聚类的死亡事件在种系发生树(图2)。 有可能的是,许多病毒性因素可能影响疾病的结果。 在别人,必须强调,在临床和hemato-biochemical参数收集承认,设定一个基准尽可能标准,以下治疗方法调制个案根据动物临床情况和业主经济约束和同情。 而不可避免的从实用的角度来看,这肯定选择复杂的解释病毒遗传特性和临床结果之间的关系。
AMOVA分析证明存在hemato-biochemical核苷酸位置可能与变更有关的参数。 缺乏相应的氨基酸替换可以建议一个角色影响病毒基因组本身的生物学特性(如二级结构、密码子偏好等)38或链接的位置与其他非同义突变基因区域(即非结构性蛋白质)。
不幸的是,由于小样本大小困难招收高动物数量准确和标准化hemato-biochemical概要文件相关和可靠的病毒研究的基因数据的统计能力有限,阻碍检测潜在的协会。
更大规模的研究基于标准的协议和分享相关的信息在不同的研究小组肯定会提供更一致的确认CPV系统之间的联系和毒性,提高学习能力和探索一个更广泛的病毒遗传异质性。
尽管有这些限制,目前的研究表明,第一次的存在之间的关联CPV基因簇和疾病严重程度,突出的inheritableness这个特性。 可能存在的演化支不同毒性强调再一次密集的相关性研究流行病学监测和CPV进化为了更好地理解致病因素,他们的流行病学和安排适当的对策。
材料和方法
动物
档案收集血清样本2008 - 2015年期间来自34个狗,自然感染CPV,被包括在研究中。 样本来自圣马可兽医诊所(意大利帕多瓦)常规临床活动和“后验”根据临床选择评价记录。 特别是存储血清进行了进一步分析,如果相应的动物显示出典型的犬parvoviral肠炎的迹象和CPV具体实时PCR证实了诊断18。 只有动物经历急性和最近发作的腹泻被认为是。 限制其他并发疾病和病毒的影响,研究中受试者包括只有在没有以前的和不相关的临床状况报告和血液和/或粪便样品测试呈阴性反应的其他常见肠道病毒、细菌和寄生虫病原体。
在承认,记忆的数据已经获得和体检。 天内血液样本被收集和分析调查几个血液和生化参数的完整列表(附录中提供了研究变量)。 所有的动物已经接受标准支持性疗法,直到复苏或死亡。 由于急性疾病本质,负面的结果(即死亡)时归因于CPV感染住院20天内发生。 变化从标准疗法存在由于特定动物临床条件(CPV感染课程和伴随疾病)和所有者的依从性。 所有考虑分析和医疗程序的上下文中进行常规诊断和临床活动和实验治疗或额外的分析是在研究过程中实现的。 因此,没有伦理批准要求使用标本收集的诊断目的。
CPV VP2描述和系统发育分析
归档血清样本存储在−20°C从收集处理。 二百毫升水中提取血清使用NucleoSpin®血液提取工具包(MACHEREY-NAGEL)和完整的VP2地区放大与热科学™Phusion™热起动II高保真DNA聚合酶工具包(生命技术公司,卡尔斯巴德,加利福尼亚州)与引物VP-F 5-TTGGCGTTACTCACAAAGACGTGC-3和VP-R 5-ACCAACCACCCACACCATAACAAC-3,佩雷斯所描述的等。39。 放大和特异性的乐队都验证了SYBR安全彩色琼脂糖凝胶电泳。 PCR产物纯化酶方法使用应用生物系统公司™清扫™PCR纯化试剂盒(生命技术公司,卡尔斯巴德,加利福尼亚州)制造商的指示和桑格测序后使用4重叠引物对像Tucciarone所描述的那样等。 (2018)18。
获得的质量色谱图直观地评估使用FinchTV(2004 - 2006年Geospiza Inc)和共识序列生产使用ChromasPro (ChromasPro 1.5版本; Technelysium企业有限公司,南布里斯班,澳大利亚;http://technelysium.com.au/wp/chromaspro/)。
最后,使用TranslatorX密码子层次的序列是一致的40和该地区相应的完整的VP2修剪。 足够的系统发育信息的存在被使用IQ-Tree映射分析可能性评估41。 最大似然系统发育树使用PhyML重建42选择替代模型的最低使用Jmodeltest Akaike信息标准(AIC)计算43。 分支的支持是执行1000年计算的引导复制。
临床数据和系统发生之间的联系
临床和hemato-biochemical连续变量匹配系统树建议使用phylobase R库44。
因为大量的可能相关的变量,全面开展了初步调查,用以确定那些可能与系统结构。 一般来说,系统自相关据说发生时由一组分类单元的值对于一个给定的生物特征并不独立于发展史。 这个non-independence可以积极(即比预期更高的相似性相关类群的机会,导致所谓的“全球结构”)或负面(更高的相关类群的不同,导致局部结构)45。 因为我们的目的是调查相关的毒性特性的存在,一个特定的焦点是全球结构的分析。
这个目的,系统主成分分析(车牌提取使用adephylo进行集中和缩放变量46,选择系统发育与Abouheif距离矩阵计算的方法。 这种方法允许总结的几个特点在较低数量的变量(即主成分; PC)表现出全局或局部结构。 PCA特征值进行评估量化的方差和每个电脑系统表达的相关性。 第一个全球组件被选中和载荷分别检查来评估每个特征导致了电脑。 变量与加载值的四分位数越高(即最贡献变量)被选中作进一步分析。 系统信号的存在是单独评估为每个这些变量计算Abouheif Cmean使用phyloSignal包47,48。 获得的统计显著性指数评估相比零假设分布(即缺乏系统的信号)获得1000年执行重复的随机测试标签。 由于样本数量有限,统计显著性水平设置为p < 0.1。 多个比较占使用Benjamini-Hochberg过程控制错误发现率(罗斯福)(Benjamini和业务,1995)。
定量之间的关系特征和树拓扑计算不同测试统计数据使用蝙蝠:吝啬分数(PI),协会指数(AI)和MC的大小49。 占系统发育uncertainness,贝叶斯马尔可夫链蒙特卡罗(密度)方法实现。 一千一百万代MrBayes50分析进行CPV对齐抽样模型参数和系统发育树每5000代,因此获得树后验分布(丢弃后第一个20%的树木老化)。 上述统计数据计算在这些树,获得他们的后验分布。 观察到的值(μ0 b)值被选为结局。 零假设下的分布(即没有trait-phylogenesis协会)是通过随机化不重复tip-trait协会一千次每棵树的后验分布。 每个随机数据集被用来计算统计数据中位数(μ零),形成零分布。 这个分布是用来实现假定值通过计算模拟值的比例比观察到的一个极端。
轨迹,轨迹AMOVA分析
轨迹,轨迹分子方差分析(AMOVA)进行使用Arlequin v3.5的程序51。 为每个选定的变量,个体在两组分类基于符号(正面或负面)的标准化值。 然后,每个核苷酸每个位置的平均频率和组进行比较。 位置呈现Fct值(组)中固定指数大于0.05被认为是重要的。