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人天冬酰胺合成酶的高分辨率晶体结构有助于分析抑制剂的结合和选择性

摘要

人天冬酰胺合成酶(ASNS)在结直肠癌和乳腺癌中的表达可能是通过改变细胞内L-天门冬氨酸水平来促进大肠癌和乳腺癌的转移和肿瘤细胞侵袭性的。因此，人类ASNS正在成为一种善意癌症治疗的药物靶点。我们发现，在HCT-116细胞裂解液中，在10μM浓度下，一种对人ASNS具有纳米分子亲和力的慢起效紧密结合抑制剂具有良好的选择性，几乎没有非靶点结合。人类ASNS的高分辨率(1.85)晶体结构使我们能够识别合成酶结构域中的一簇带负电荷的侧链，它在抑制剂结合中起着关键作用。将此结构与进化相关的AMP形成酶的结构进行比较，可以了解分子间的相互作用，从而产生所观察到的结合选择性。我们的发现证明了开发第二代人ASNS抑制剂作为发现抗转移药物的先导化合物的可行性。

导言

天冬酰胺合成酶(Asns)催化细胞内L-天冬酰胺的ATP依赖生物合成L-天冬氨酸L谷氨酰胺作氮源1..最近的几项发现为天冬酰胺生物合成与人类疾病之间的联系提供了证据，从而提高了深入研究人类ASNS的紧迫性。首先，天冬酰胺合成酶缺乏症(Asd)是一种罕见的人类神经系统疾病。2..目前还不清楚这些asd相关的变化如何影响酶的催化活性和稳定性，尽管患有asd的儿童出现了小头症、癫痫样发作和智力残疾。3..第二，沉默ASNS基因对小鼠肉瘤细胞增殖的抑制作用。4由致癌形式产生的克拉斯5,6..第三,L-天冬酰胺对急性淋巴细胞白血病的生长和维持有重要作用。7，和乳房8肺9，以及抗去势的前列腺10癌症。最后，改变外生L-天冬氨酸水平影响肿瘤细胞的侵袭性，人ASNS的强制表达促进了两种结直肠转移的进展。11和乳腺癌12不确定的机制。所有这些观察都强烈地表明，人asns是一个真正的药物靶点，而有效的小分子asns抑制剂将在预防转移方面具有重要的临床应用价值。11,12，也许在癌症化疗中更广泛。13..事实上，有人认为改变人体内天冬酰胺可用性的药物可能有助于用突变型的肉瘤来治疗肉瘤。RAS4..获得能够穿透细胞的高特异性、小分子的asns抑制剂将改变靶向ASNS作为治疗顽固性癌症的新策略的可行性。

然而，对人的ASNS具有纳米分子亲和力的化合物的识别已经被证明是非常困难的。唯一报道的筛选研究未能确定具有亚微摩尔结合和/或高选择性的小分子对人的asns。14，可能是因为缺乏有关酶的机械和结构信息。因此，本小组的早期工作阐明了谷氨酰胺依赖的天冬酰胺合成酶(As-B)的动力学和催化机制。15,16由AsnB基因大肠杆菌17..这些研究表明，β-天冬氨酰-AMP中间体及其随后与氨反应的过渡态在催化过程中都受到该酶的紧密结合。1A)16..虽然β-天冬氨酰-AMP中间体的非反应性类似物确实是亚微摩尔的asns抑制剂。18，功能化的甲基硫基肟类化合物1和2(无花果)1B)，它模拟氨攻击活化酯的关键过渡态。19,20，是否在动力学测试中表现出对酶具有纳米分子亲和力的慢起效抑制剂？21,22..非常重要的是，ASNS抑制剂1(无花果)1B)对肉瘤细胞生长的负面影响类似于用siRNA敲除法降低ASNS表达的方式。4..此外，该化合物为1：1的非对映异构体混合物1A和1B(无花果)1B)，对耐天冬酰胺酶的molt-4白血病细胞有细胞毒性，尽管只在微摩尔浓度下。21..不幸的是，尽管ASNS抑制剂1它可能具有抗癌的特性，其不良的生物利用度降低了它在癌症和转移动物模型研究中的应用价值。21..然而，这种细胞毒性的ASNS抑制剂可以作为药物发现的起点。我们现在报告ASNS抑制剂在多大程度上1据我们所知，参与HCT-116细胞裂解物的非目标结合，以及人类ASNS的第一个高分辨率X射线晶体结构。我们的研究为ASNS抑制剂特异性的分子基础提供了深入的理解。1并为今后产生第二代小分子ASNS抑制剂提供了坚实的基础，提高了生物利用度，降低了化学复杂性。

结果

ASNS抑制剂1在HCT-116裂解物中的结合特异性

我们让KiNativTM化学蛋白质组分析实验23，使用化学反应探针3(无花果)1)24，在hct-116(atcc ccl-247)细胞裂解物中评估asns抑制剂的亲和力。1用于替代靶点，特别是激酶和非激酶ATP酶。该细胞系可在异种移植模型中转移，并已应用于结肠癌增殖的研究。25..此外，转录组谱显示ASNS在HCT-116细胞中的表达量相对较高(附图)。1)。最近的工作表明了天冬酰胺生物合成在结直肠癌细胞增殖和转移中的重要性，为该细胞系的癌症相关性提供了额外的支持。11..基于临床相关的抗肿瘤药物血浆浓度26，我们培育了探针分子3用hct-116细胞裂解物(10μM)或不含asns抑制剂1..从这些反应混合物中得到的胰蛋白酶肽的MS/MS片段和序列分析表明，ASNS抑制剂1抑制探针能力3在10μM浓度的HCT-116裂解液中，酰化Lys-466的侧链(位于人ASNS的ATP结合位点)达到62%(如图所示)。2)。即使这个值低于预期，考虑到ASNS抑制剂1是一种慢起抑制剂27纳米分子K的体外研究i*(参考文献)21ASNS中活性位点赖氨酸的酰基化受到最大程度的抑制，所有的ATP酶都存在于细胞裂解物中。ASNS抑制剂对ATP结合位点的占据作用1当然，随着时间的推移，初始Ei复合物与Ei*复合物的异构化速率也会随着时间的变化而变化。28..细胞裂解液的复杂环境使体外异构化速率常数难以量化，但我们注意到在10μmasns抑制剂的存在下，15 min后，人asns的活性下降了约3倍。1在我们的体外测定条件下21..此外，ASNS抑制剂的作用能力也有可能。1与酶合成酶位点的结合受到细胞裂解物中ATP浓度的负面影响。21..重要的是，只有反应探针对赖氨酸酰化有一定的抑制作用。3观察到少量的非靶标酶，包括烟酸-核苷酸腺苷酰转移酶。29，以及精氨酸琥珀酸合成酶(ASS 1)30..另外，ASNS抑制剂的相互作用也很弱。1两个ABC转运体的ATP结合位点。另一方面，10μM ASNS抑制剂1不抑制磷酸腺苷酰转移酶ATP结合位点的赖氨酸酰化。31、GMP合成酶32，以及谷氨酰-tRNA合成酶。33即使这些酶也能将ATP转化为AMP和无机焦磷酸(MgPP)，但仍有很大的影响。i)在催化转换过程中(如图所示)。2和补充数据1)。虽然结构相似的化合物2(无花果)1B)绑定到大肠杆菌氨依赖性天冬酰胺合成酶34，与细菌氨基酰基trna合成酶有关。35，我们的化学蛋白组分析显示ASNS抑制剂1在10μM浓度的HCT-116细胞裂解物中，仅与赖氨酸tRNA合成酶作用较弱，不与丝氨酸或天冬酰基tRNA合成酶结合。2和补充数据1)。ASNS抑制剂1也与ump-cmp激酶1(CMP K 1)结合。36而激酶MVK、CMP K 2和AK 1的表达量较小。努力理顺CMP K 1与ASNS抑制剂的相互作用1，假设绑定发生在激酶的ATP结合位点，我们使用手动对接方法获得1A基于双歧杆菌同源酶X射线晶体结构的CMP K 1配合物37绑定到ADP(附图)2)。虽然这个模型表明1A和1B可能与激酶相互作用(见补充资料)，任何对它们的结合能学和分子间相互作用的深入理解都不在本文的范围之内。鉴于(I)化学蛋白组探针3可以针对几乎全部的人类激酶38，和(Ii)细胞一般表达约40%的人体运动体。39该抑制剂在10μM浓度下具有较高的选择性.因此，这一发现支持了第二代具有更类似药物化学结构的特殊asns抑制剂的观点。40是可以发展的。

当hct-116裂解物在100μmasns抑制剂存在下进行化学蛋白组学分析时，情况发生了一些变化。1(无花果)2和补充数据1)。例如，探针的酰化3被抑制超过50%的29种蛋白质(图)。2)，且对CMP K 1、烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶和ABC转运蛋白的抑制作用增加了2~3倍。此外，还观察到与赖氨酸、tRNA合成酶和其他蛋白激酶的非靶点结合量呈剂量依赖性增加。出乎意料的是，hasns抑制剂对lys-466酰化的抑制作用仅增加了72%。1以100μM浓度存在。2)。虽然它可能反映了由于抑制剂相互作用程度的增加，结合动力学的变化，但很难解释这种相对较小的增加。1溶解液中的其他蛋白质。另外，因为混合了1A和1B在分析中，与ASNS结合的微小变化可能反映出其中一种非对映异构体对酶的亲和力要低得多，如下所述。最后，研究了ASNS抑制剂的亲和力。1对于ASS 1和剪接异构体2，在这些条件下，P 43686的亚型明显减少(图2)。2)。鉴于观察的原因尚不清楚，我们评估了asns抑制剂的作用。1用体外动力学方法与人ASS 1结合。重组ASS 1在Sf9细胞(表达系统，LLC)中表达，采用TEQC方法优化蛋白的产生，用金属亲和层析法进行纯化(见补充资料)。在10μM ASNS抑制剂存在和不存在的情况下与底物共同孵育酶1(见补充资料)仅在MgPP的基础上表现出较弱的抑制作用。i编队(附图)3)。ASS 1活性进一步下降，但未被阻断。1在100μM浓度下出现。因此，有可能在细胞内发生弱的与ASS 1的非目标相互作用。

人ASNS的分子结构

以确定ASNS抑制剂结合选择性的分子基础。1并为进一步通过简化的分子支架来鉴定有效的选择性ASNS抑制剂提供了坚实的基础，我们用X射线结晶学在1.85h分辨率下测定了人ASNS的高分辨率晶体结构(图1.85)。3)。到目前为止，只有依赖谷氨酰胺的asns的结构由AsnB基因大肠杆菌据报道41..所有的努力，以获得晶体的这种和其他细菌asns同系物与小分子，但不是AMP已经失败了。42..此外，动力学研究表明，ASNS抑制剂的能力存在差异。2(无花果)1)与人ASNS和As-B结合21,43..对于我们的结晶实验，多毫克的高活性，重组，c-终止His。10经标记，人ASNS在Sf9细胞中表达。44使用TEQC方法(见补充资料)45..该酶最初用金属亲和层析法纯化，然后去除c端his。10-TEV蛋白酶S219P变异体经酶切标记46..得到无标记的ASNS样品，然后与DON(6-重氮-5-氧)反应。L-去甲亮氨酸)47 4(无花果)1A)修饰ASNS谷氨酰胺酶活性位点中Cys-1的活性硫氰酸盐(Cys-1)。48..质谱分析表明，经过DON修饰的人ASNS是一种同质蛋白，蛋白质中的其他半胱氨酸残基没有共价修饰(补充图)。4;补充说明1)。质谱测定还表明，重组酶的N端蛋氨酸残基已得到正确处理。在此基础上，确定了一种DON修饰酶的单晶体条件(补充图).5)，衍射到1.85的分辨率(表)1和补充图。6)。用分子置换法解决了人ASNS的结构问题。49使用As-B41作为搜索模型。两个DON修饰的人ASNS分子以头对头二聚体的形式存在于不对称单元中，其中两个单体通过一个可能在结晶过程中形成的二硫键连接(图1)。3A)。从细菌同源性来看，人类ASNS由两个结构域组成(图1)。3B)。C-末端(残基203-560)合成酶结构域的残基(41.6%)比N-端(残基1-202)谷氨酰胺酶结构域(33.9%)的保守性高。7)。人反义核酸的N端结构域具有典型的N端亲核α/β/α拓扑结构。50，如GMP合成酶51，谷氨酰胺-PRPP氨基转移酶52..在人类酶中存在一个顺式脯氨酸(Pro-60)，其结构与细菌同系物As-B的结构相同。在每种单体中，DON修饰的Cys-1侧链的电子密度都是明显的。3C)。还明确定义了一个氢键网络，该网络由保守残基arg-48、val-52、asn-74、gly-75、glu-76和Asp-96组成，在生成氨的水解反应中起到底物识别和硫代酯稳定的作用。53..该基板结合袋位于这两个结构域的界面上，并且位于C端结构域中一个绝对保守的谷氨酸残基(Glu-414)的5奥里(图1)。三维空间)。经蛋白质和配体修饰后，两个链上N端和C端结构域界面的单个12σ峰仍保留在口袋中。该遗址被Tyr-78、Arg-416、Arg-245和Val-417包围，峰值被指定为氯化物阴离子(图1)。3B)。这一发现在人类ASNS中的重要作用尚未确定，但已知植物天冬酰胺合成酶是由氯化物激活的。54..对于基于结构的抑制剂发现来说，由16个α螺旋和5个β链组成的C末端结构域的合成酶位点得到了很好的解决(图1)。3B)。我们还观察到了与该区域结晶缓冲液中的一个结合HEPES分子相一致的密度，氢键与Asp-334侧链和网络中的水分子的氢键也涉及到保守的残基Asp-400和Arg-403(见图)。4A，b)。人ASNS和As-B合成酶活性位点中的残基高度保守(附图)。7酶的细菌形式中的Val-272和Met-333被Ile-287和Ile-347取代。人类和细菌结构的叠加证实了这两个合成酶活性位点几乎是相同的(如图所示)。4C和补充图。8)。然而，Arg-403侧链采用不同的构象，可能是因为合成酶位点中不存在AMP。人类ASNS和As-B(补充图)也观察到了连接这两个活性位点的分子内隧道中有趣的结构差异。9).

表1.结晶学数据的收集和细化统计

全尺寸表

天冬酰胺合成酶缺乏症(ASD)连锁变异体

掌握人类ASNS的晶体结构，提供了一个在天冬酰胺合成酶缺乏症(ASD)患者中确定的15个残基突变位置的机会(图一)。5)2..这些突变点中有三个位于N端区域，尽管其中只有arg-48侧链的位置使得它可以直接与L谷氨酰胺底物在谷氨酰胺酶活性部位。因此，在这个位置上替代其他氨基酸可能会影响到导致氨形成的步骤。其余的站点主要位于C端域，可分为四组(补充表)。1)。然而，这些残余物中似乎没有一个与L-天冬氨酸或ATP在合成酶活性部位。因此，这些突变如何发挥其生物学效应尚不清楚，尽管这些突变可能包括由于动力学性质的变化而改变的催化活性。55，增加ASNS变异体的周转率或热稳定性，或ASNS与细胞内其他蛋白质的相互作用。根据ASNS结构，我们合成了t336i和f361v的asns变体，并通过测定mgpp测定了它们的谷氨酰胺依赖活性(相对于wt酶的活性)。i生产(见补充资料)。第四类残基ThR-336的突变(补充表)1)，在所有王国中高度保守(附图)。7)，因为它位于C-末端合成酶活性位点的表面。同样，第二类残余物Phe-361(补充表)1)，因为它位于C-末端区域的内部，距离氯化物结合位点7.2。此外，Phe-361在哺乳动物天冬酰胺合成酶中是保守的，但在谷氨酰胺依赖性植物和细菌ASNS同系物中被亮氨酸所取代。7)。虽然谷氨酰胺依赖合成酶的活性在T336I的ASNS变体中几乎被取消，但是用valine替代Phe-361会使ASNS的活性比WT酶提高两倍(补充图)。10)。PHE-366侧链的收缩可能会影响酶C端区的结构填料或氯离子的结合。

这些发现支持了这样的观点，即一些与ASD相关的改变可能会扰乱天冬酰胺相关的代谢。ASNS在神经发育中的明显参与意味着临床上有用的抗转移的ASNS抑制剂不能跨越血脑屏障，也不能局限于成人使用。相反，能够跨越血脑屏障的ASNS抑制剂可能在治疗ASNS变异体引起的具有增强催化活性的ASD相关神经疾病方面具有临床应用价值。

抑制剂与人ASNS结合的计算研究

动力学测量表明1与ATP(第一种在导致天冬氨酸形成的途径中结合的底物)相竞争，并能与经过don修饰的人asns结合。21..这两个观察结果都与ASNS抑制剂的观点一致。1结合在酶的合成酶活性位点内(如图所示)。4)。然而，广泛的结晶试验未能产生与DON修饰或WT人类ASNS结合的抑制剂的晶体。功能化磺胺肟类化合物的水解稳定性56但是，1HNMR谱1在结晶缓冲液中保持19天不变。考虑到1A和1B不能用柱色谱分离，我们对与之结合的人的ASNS模型进行了计算研究。1A或1B其中Cys-1作为未经修饰的氨基酸而存在。6A)。在这些计算中，人类asns结构中缺失的循环，以及位于c端尾部的残馀534-546，都是使用Modeller构建的。57和奇米拉58用离散优化的蛋白质能量协议对这些区域的构象特性进行了验证。59..因此，在这个模型中，只有最后14个残基(547-560)是不存在的。补充资料)。然后我们定位了MgPPi在ASNS合成酶位点上有一个保守的焦磷酸结合环。60与进化相关酶gmp合成酶的X射线晶体结构相同51..MgPPi包含在模型结构中，因为它是在周转期发布的最后一个产品。16因此，当氨与β-天门冬氨酸-AMP中间体反应时，该酶中就存在.硅对接61用于β-天冬氨酰-AMP的定位。1A)和每一位先驱者1A和1B进入MgPPi/ASNS复合体。得到的三个模型配合物随后被放置在一盒水分子中，并进行分子动力学(MD)模拟(100 Ns)(见补充资料).

在平衡的β-天门冬氨酸-AMP/mgpp中，观察到了β-天门冬氨酸-AMP与该酶之间广泛的非共价相互作用。i/ASNS复合体(附图)。11A)。例如，这种反应中间体的磷酸盐部分与Lys-466的侧链形成静电相互作用，Lys-466是一种保守的残基(附图)。7)这对于As-B的催化活性是必不可少的。62..此外，核糖环氢键上的2‘-OH基团位于Ser-362侧链上，这与dATP不是该酶的底物这一事实是一致的。在中间体的另一端，α-氨基的β-天门冬氨酸-AMP与Asp-367的侧链形成盐桥，α-羧酸与Glu-364通过桥联水分子相互作用。据我们所知，这些残基以前都没有通过定点诱变而改变，尽管两者都在已知的天冬酰胺合成酶中保守(补充图)。7)。类似于β-天门冬氨酸-AMP/mgpp的相互作用。i在模型的MD轨迹中发现了ASNS复合物。1A/MgPPi/ASNS和1B/MgPPi/ASNS复合物。对于未来的抑制剂发现努力来说，重要的是，两种抑制剂的正电荷氨基1A和1B优先绑定在由Glu-364，Asp-367和Asp-400的侧链定义的口袋中。5C)。蛋白质/配体氢键也在它们之间形成。1A或1BSer-362、Gly-363和Ile-287。此外，结合水分子被预测将介导功能化的甲基硫基肟与Asp-261、Asp-294、Gly-363和Gly-364(补充图)之间的相互作用。11).

自由能扰动(FEP/REST 2)计算63,64(见补充资料)估计了功能化甲硫基肟之间的自由能差。1A和1B人ASNS合成酶活性位点(ΔG)蛋白)和水中(Δ)G水)。在热力学循环中使用这些值(如图所示)。5B)65给出了−10.2kJ mol的估计值−1用于(Δ)G蔑视 (1A)−ΔG蔑视(1B)(见补充资料)，意思是非对映异构体1B对ASNS的亲和力至少是ASNS的60倍1A在25°C时，这一差值与基于动力学数据的定性参数的期望值一致。21,22.

带负电荷的簇是结合选择性的基础。

我们试图通过研究位点特异性突变对asns抑制剂能力的影响来测试这些计算模型。1与人类ASNS结合。根据计算模型中所观察到的分子间相互作用，选择了两组位点特异性突变。1A/MgPPi/ASNS(图1.6C)及1b/MgPPi/ASNS复合物(图1.6d)。因此，去除Glu-364侧链被认为会削弱非对映异构体的结合。1B对非对映异构体影响较小或不起作用的酶1A..假设1B对酶有更大的亲和力，FEP的计算表明，这种酶的混合物1A和1B预期不会抑制具有纳米分子亲和力的Glu-364 ASNS变异体。同样，去除带负电荷的Asp-367侧链，预计会降低1A而不是1B，意味着嵌合混合物1A和1B与Asp-367 ASNS变异体孵育时，抑制程度相同。

用丙氨酸(E364 A)或谷氨酰胺(E364Q)代替Glu-364，用丙氨酸(D367A)或天冬酰胺(D367N)代替Asp-367。动态监测MgPPi形成21,22表明E364A、E364Q和D367AASNS变体在pH8.0时不起作用L-天冬氨酸、ATP和氯化铵为氮源。努力表征ASNS抑制剂的亲和力1对于三种不活跃的asns变体，采用等温量热法是不成功的，这可能是由于asns抑制剂作用速度慢所致。1来自E*I综合体21..然而，这些数据揭示了Glu-364在结合和/或催化方面的重要性，正如根据计算模型所预测的那样。此外，在pH8.0的条件下，d367nasns变异体的氨依赖活性较wt酶降低。L-天冬氨酸、ATP和氯化铵(附图)。12)。当与1μM ASNS抑制剂孵育时，D367N ASNS变异体也受到抑制。1尽管MgPPi在这种条件下，在较短的反应时间内可刺激产物的产生。此外，D367N ASNS变异体的抑制作用比该抑制剂消除WT酶氨依赖活性的时间长一倍(补充图)。12)。尽管如此，200秒后D367N ASNS变异体仍表现出慢起抑制作用，这可能意味着去除负电荷比WT酶降低了初始ASNS/抑制剂复合物的异构化速率。改变的抑制动力学支持了我们的预测1B由于其与Glu-364侧链的相互作用，对合成酶位点具有较高的亲和力。

基于结构的ASNS抑制剂选择性研究

在许多原核和真核酶中，人asns的合成酶结构域与类似的AMP形成区有着进化上的联系。60..作为试图了解化学蛋白质组分析中观察到的结合选择性模式的一部分(如图所示)。2在其他蛋白质结构中，我们发现了128个与合成酶结构域(残基222-533)具有显著相似结构的AMP形成结构域。http://ekhidna2.biocenter.helsinki.fi/dali/)66(补充数据)2)。然而，在128个结构邻居中，只有48个存在于人类蛋白质组中，而其中10个蛋白质的晶体结构仅被沉积(补充数据)。2)。几乎所有这些酶都使用atp，或结构相似的辅助因素sam和nod。+，作为底物，配以尿卟啉原-Ⅲ合酶。67是个有趣的例外。重要的是，转录组表达研究表明，这48个蛋白质中有47个可能存在于HCT-116细胞裂解物中(补充图)。1，我们在化学蛋白质组分析中从其中10个蛋白质中分离出了多肽(补充数据)。1)。机理考虑表明ASNS抑制剂1可能表现出与谷氨酰胺依赖的NAD的非靶点结合。+合成酶68、GMP合成酶32,51，精氨酸琥珀酸合成酶69，和FMN腺苷酰转移酶(NMAT1)70..支持这一观点的事实是，这些人类酶具有与asns合成酶结构最相似的AMP形成结构域(补充数据)。2)。在这些酶中，如上文所述，ASNS抑制剂1在100μM浓度下与ASS 1的非目标结合(补充图)。3)，但没有证据表明这种相互作用是与hct-116细胞裂解物中的gmp合成酶发生的(补充数据)。1)。谷氨酰胺依赖型NAD ATP结合位点的胰蛋白酶肽+然而，即使这两种蛋白都是根据转录组数据表达的，在化学蛋白质组谱分析中，合成酶和FMN腺苷酰转移酶仍未被观察到(补充图)。1)。因此，ASNS抑制剂在多大程度上1与这两种蛋白质的相互作用被这些化学蛋白组分析所解决。

为了将我们的发现建立在结构的基础上，我们将我们的保守的pp-循环基元覆盖起来。1B/MgPPi/ASNS模型复合物及人ASS 1和GMP合成酶的X射线晶体结构(图1)。7A)。即使不对残渣侧链进行广泛的重新定位，这些叠加的结构也提供了活性位点的相似性和差异的定性图像，这可能是ASNS抑制剂的结合选择性的基础。1..这三种酶都有一个与MgPP结合的共同的循环基序。i在腺嘌呤化中间体形成过程中释放。7A)并与ASNS抑制剂的AMP部分进行非常相似的分子间相互作用。1B(无花果)7b)。抑制剂结合亲和力的差异似乎与带负电荷的侧链簇有关。4C)在asns合成酶结构域(Glu-364、Asp-367和Glu-368)中，它们与asns抑制剂中存在的质子化氨基结合。1在计算模型的基础上(图1)。7C)。在精氨酸琥珀酸合成酶的活性位点中，这个带负电的口袋是不存在的。7D)和GMP合成酶。7E)。这些数据表明，gu-364、Asp-367和glu-368的残基决定了asns抑制剂的选择性。1人类ASNS。如果是这样的话，如果要实现结合特异性，第二代ASNS抑制剂必须与这个带负电的口袋保持关键的静电相互作用。此外，考虑到催化活性需要保守残基Glu-364，似乎不太可能在ASNS合成酶活性部位出现抗性突变。

讨论

本工作建立了获得ASNS抑制剂的可行性，该抑制剂在细胞内存在具有与ASNS具有同源催化结构域的其他ATP利用酶的低、亚微摩尔浓度时具有相当的选择性。通过获取人类asns的X射线结构，再加上化学蛋白组分析，我们还可以在asns合成酶结构域(glu-364、asp-367和glu-368)中识别出一簇带负电荷的侧链，在确定asns抑制剂的结合选择性方面起着关键作用。1..这些结果将有助于新的小分子asns抑制剂的发现，这些抑制剂可用于(I)探讨L-在转移过程中产生天冬酰胺，以及(Ii)在动物实验中作为控制转移和/或肿瘤生长的药物。

方法

化学合成

磺胺肟基缓蚀剂合成方法的详细介绍1已在其他地方出版21.

ASNS抑制剂1的核磁共振稳定性研究

将含200 mm NaCl(540 L)的100 mm HEPES缓冲液加入10 mm Tris-HCl缓冲液中，加入pH8，加入100 mm NaCl(420 L)，用蒸馏水(120 L)稀释混合液。这个缓冲溶液的别名(480毫升)然后与50毫米的ASNS抑制剂混合。1溶解于水中(20L)，所得溶液与溶解在D中的5.5mm二甲基丙二酸二甲酯的密封毛细管一起转移到核磁共振管中。2O(60升)。最终抑制剂浓度1是1.8毫米。1然后在avance-III HD 500 MHz谱仪上记录了19天的HNMR谱。采用梯度激励造型抑制水信号。71..抑制剂产生的峰无变化1即使样品是在室温下储存的，也是在这段时间内观察到的。

化学蛋白质组学分析

脱硫比碘-三磷酸腺苷-酰基磷酸探针3(ATP探针)如前所述合成24..HCT-116细胞微丸在水解缓冲液(50 mm HEPES钠，pH7.5，含150 mM NaCl，0.1%(v/v)Triton X-100和磷酸酶抑制剂[Cocktail II AG科学#P-1518]中溶解。然后用Eppendorf 5424 R微型离心机在16，200台微型离心机中对样品进行离心。xG在4℃下培养15 min，取上清液作探针标记。磺胺肟基缓蚀剂5微升1将二甲基亚砜(DMSO)中的100×原液一式两份加入到4 45μL的裂解液中。对照组加DMSO(5L)。孵育15 min后，在每个样品中加入5 0L 10倍ATP探针水溶液，最终测得探针浓度为5M，并与探针共孵育10 min。样品是按照标准程序为质谱分析准备的。38..用6M尿素、10 mm二硫苏糖醇(DTT)、40 mm碘化乙酰胺(37°C，30 min)、烷基化(40 mm碘乙酰胺，37°C，30 min)，凝胶过滤(BioradEconomo-Pac 10G)，制备10 mm碳酸氢铵，含2 M尿素和5 mm蛋氨酸。用胰蛋白酶(0.015 mg mL)消化脱盐蛋白混合物。−1)在37°C下反应1小时，用12.5μL高容量链霉亲和素树脂(热科学)捕获脱硫生物素化肽。捕获的多肽被广泛清洗，用50%(v/v)Ch的35-μL洗涤从链霉亲和素珠中洗脱探针标记的肽。3室温下含0.1%(v/v)三氟乙酸(TFA)的氯化萘/水混合物。然后用热ltq velos离子阱质谱仪和Agilent 1100系列微高效液相色谱系统对样品进行分析。72..对于信号的提取和定量，通常根据四种离子的存在、强度和与参考MS/MS光谱的相关性来选择。然后，将每次运行中产生的色谱峰进行整合，并将综合峰面积用于确定相对于对照样品的抑制率值(补充数据)。1).

ASNS抑制剂1与UMP-CMP激酶1的相互作用

考虑到化学蛋白组学分析显示ASNS抑制剂1与人CMP K 1结合36，它与人asns的合成酶结构域有完全不同的折叠，我们建立了ASNS抑制剂的模型。1可能与激酶相互作用，合理地假设结合发生在ATP结合位点内.不幸的是，人cmp k 1的X射线晶体结构缺乏结合配体。73，因此我们将asns抑制剂叠加在一起。1A同源酶活性位点ATP结合的研究盘盘37的初始模型。1A/CMP K 1综合体(附图)。2)。初步的MD模拟表明，如果Adenosyl基团1A与溶剂结合的ATP结合位点，则抑制剂的质子化氨基更倾向于在水环境中溶解。这些计算还表明，磺胺肟分子与蛋白质之间没有特定的相互作用。因此，我们推测1A和1B可以绑定到CMP K 1。需要进行更多的研究，这些研究超出了本文的范围，以确定asns抑制剂的确切用途。1受CMP K 1的约束。

重组人ASNS和T336I、F361V、E364A、E364Q、D367A和D367N ASNS变异体的表达和纯化

含烟草蚀刻病毒蛋白酶(TEV)的人ASNS开放阅读框(ORF)74位点(ENLYFQS)后面跟着一个C端10-组氨酸标记(His)10)进行密码子优化、合成和亚克隆到生态pUC 57载体的rv位点由GenScript(Piscataway，NJ)提供给pUC 57-BamHI-hASNS-TEV-His10-印地语矢量(补充数据)3)。这个BAM嗨-欣然后将该载体中的diii dna片段亚克隆到pfl载体中的相同位点中。75，产生pfl-hasns-tev-is10载体(PYT 1215)，然后用于产生一种表达C-末端his的重组杆状病毒。10-按照公布的协议标记人类ASNS45..为了进行大规模表达，冻存库被产生并储存在液氮中.Sf9细胞来源于表达系统(Davis，CA)，在ESF 921培养基(表达系统)中，在摇瓶中保持在27°C。用TEQC法优化人ASNS在Sf9细胞中的表达45..Sf9细胞(1.5×10)的1L培养6细胞mL−1)用表达重组人ASNS的杆状病毒(MOI=4.0)感染，然后在27℃下孵育96h，离心后冷冻于N液中。2..将得到的球团置于80°C的−中，在含有500 mm NaCl的50 mm Tris-HCl缓冲液中溶解，pH值为8.0。细胞裂解和离心后，上清液装入gge Histrap HP柱(GE Healthcare)5 mL，在50 mm Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中预平衡，用ktAprime+fpc(Ge Healthcare)和C-末端his-his预平衡。10用50 mM Tris-HCl、500 mm咪唑、500 mM NaCl、pH8.0的缓冲液梯度(0~100%)洗脱重组人ASNS。用SDS-PAGE和组合法对含人ASNS的组分进行了确证。用PD-10柱(GE Healthcare)将所得溶液交换成含有10 mm Tris-HCl缓冲液(pH 8.0，含100 mm NaCl)的缓冲液。质谱法对AS纯化的完整蛋白进行了确证，经过正确处理后，已对全长酶进行了纯化.对结晶学来说，C-终端HIS10-利用TEV蛋白酶的S219P变体(25：1摩尔比His)去除标记。10-标记人ASNS：TeV蛋白酶)，在4°C条件下于25 mm Tris-HCl缓冲液中透析，pH8.0，含250 mm NaCl和5 mm DTT。然后，样品再次流过镍柱，除去未解的他。10-用pd-10柱(GE Healthcare)将标记的hasns和蛋白酶交换成10 mm Tris-HCl缓冲液，pH8.0，在酶浓缩到6mg mL之前，含有100 mmNaCl。−1.

以类似的方式，优化密码子的dna(补充数据)3)含有编码T336I、F361V、E364A、E164Q、D367A和D367N ASNS变异体的含有TEV蛋白酶位点的突变。74后面跟着一个C端10组氨酸标记(他的10)被合成并引入pfl-hasns-tev-is。10由GenScript(Piscataway，NJ)给出载体pYT 1678(T336I)、pYT 1690(F361V)、pYT 1668(E364A)、pYT 1667(E364Q)、pYT 1670(D367A)和pYT1669(D367N)。然后，这些转移载体被用于生成杆状病毒，使每个人类ASNS变异体的表达和纯化遵循上述对无标记野生型酶的相同协议。

重组人精氨酸琥珀酸合成酶(ASS 1)的表达及纯化

含N端HIS的人驴开放阅读框架(ORF)10标记后有一个3C蛋白酶76对站点进行了密码子优化、合成和亚克隆，并将其克隆到生态房车pUC 57载体的位点，由GenScript(美国NJ，Piscataway)提供pUC 57-BamHI-Hass-印地语III质粒(补充数据)3)。这个BAM嗨-Hin然后将每个载体的diii DNA片段亚克隆到pkl-10 his-3C载体上的相同位点中。77给出PKL-10 His-3C-Hass(PYT 1704)转移载体。利用该转移载体产生杆状病毒后，重组N末端标记的WT人ASS 1在Sf9昆虫细胞中表达，表达方式与上述相同。将含有重组酶的细胞悬浮在50 mm磷酸钠缓冲液中，pH7.5，含300 mm NaCl，10 mm咪唑，5mm2-巯基乙醇，0.01%NP-40和1x蛋白酶抑制剂鸡尾酒(PI)。细胞在4°C下裂解30 min后，在4°C下离心35，000 rpm，离心45 min，上清液与His-SelectNi亲和树脂(Sigma)在4°C下孵育1h，用不含PI的裂解缓冲液洗涤树脂，除去未结合物质。重组人ASS 1可以用不含500 mM咪唑的PI裂解缓冲液洗脱。洗脱组分(Vivaspin，10000 mW)浓缩至约1mL，在4°C下于50 mm HEPES缓冲液(pH7.5，含30 0mM NaCl，10%(v/v)甘油，2mm DTT)下透析。在4°C条件下，在pH7.5的50 mm HEPES缓冲液中，加入30 0mm NaCl、10%(v/v)甘油和2mm TCEP，对样品进行透析。最终浓度为0.4mg mL的样品−1，然后存放在−80°C。

人ASS 1的动力学表征

通过测定无机焦磷酸酯(MgPP)的含量，测定重组人ASS 1的活性。i)采用酶联连续法(焦磷酸试剂P 7275，Sigma-Aldrich)78..在这些实验中，检测混合物中含有0.5毫米ATP，0.2毫米L-天冬氨酸盐，ASS 1(4μg)，焦磷酸试剂(350μL)，2毫米氯化钾溶解在100 mm Tris-HCl缓冲液中，pH7.5，含5mm MgCl2ASNS抑制剂1(1：1非对映异构体混合物)1A和1B)0μM，10μM或100μM浓度(1mL总体积)。在37°C下，通过添加L-瓜氨酸，最终浓度为0.2毫米，用瓦里安·卡里50紫外可见光谱仪(Agilent Technologies)(附图)在340 nm处分光度法监测NADH消耗量。3)。所有动力学检测一式三份。将吸光度单位转换成MgPP的标准曲线i浓度是用已知的MgPP量来构建的。i溶解于100 mm Tris-HCl缓冲液中，pH7.5，含5mm MgCl20.2毫米L-门冬氨酸，0.2毫米L-瓜氨酸和2毫米氯化钾。标准曲线不受100μM ASNS抑制剂的影响。1.

人ASNS的结晶与结构溶液

在结晶前，重组人ASNS(140μL为6 mg mL)。−1在pH8.0的10 mm Tris-HCl缓冲液中，加入20 mM的6-重氮-5-氧-L-去甲亮氨酸(DON)(20μL)在室温下孵育45 min，得到DON修饰的酶(附图)。4)79..将20 mm焦磷酸钠(20μL)加入到DON修饰的人ASNS中，制成原液。采用1：1蛋白质与储油液的比例，在九头蛇II+1结晶机器人上进行了自动坐滴结晶试验。在含0.2M NaCl，0.1M HEPES缓冲液，pH7.5和12%(w/v)PEG 8000(ProPlex HT-96，分子维数)的条件下，在17°C下生长一个单晶(附图)。5)。这种晶体在5周后被收获，在由结晶条件组成的低温保护剂中用液氮进行闪蒸冷却，外加25%(w/v)的乙二醇。衍射数据采集在钻石光源线I04在100 K，使用波长为0.9795奥阿。利用X2管线的三维模块对数据进行处理。80表明晶体属于P2空间群1单位单元格尺寸为a=64.7a，b=83.52，c=110.29。在相位器中进行了分子替换。81，来自CCP4i82包装，使用谷氨酰胺依赖性天冬酰胺合成酶大肠杆菌(PDB：1 CT9)41作为搜索模型。初始模型的改进是用REFMAC 5迭代的方式进行的(参考文献5)。83)与库特的人工重建相结合84..得到的模型包含2个DON修饰的分子，每个不对称单位人ASNS，551个水分子和2个HEPES分子，被改进为1.85Au分辨率(补充图)。6)。MolProbity服务器85用Ramachandran图证明一个残基(Phe-399)是两个链上的Ramachandran异常值。As-B中的同源残基也是一个离群点，这表明酶的这一区域存在着一种不寻常的骨架结构。所有其他残余物都在Ramachandran地块的有利区域或允许范围内。坐标已存放在蛋白质数据库中，登录号为6GQ3。

ASD连接人ASNS变异体的动力学表征

用EnzChek法测定了T336i和F361V ASD连接的ASNS变异体的比活性。TM焦磷酸盐分析(分子探针)简单地说，在含有150 mmNaCl、10 mmMgCl的反应混合物中添加0.1μM酶可引发反应。2，1毫米DTT，10毫米L-谷氨酰胺，10毫米L-天冬氨酸，5毫米ATP，0.2毫米MESG，1 U mL−1嘌呤核苷磷酸化酶，0.03U mL−137°C的无机焦磷酸酶在100 mm EPPS缓冲液中的pH值为8.0。通过使用瓦里安·卡里50紫外可见光谱仪(Agilent Technologies)测量360 nm处的吸收变化，对活性进行了监测。用标准MgPP确定了一条标准曲线。i在含150 mm NaCl、10 mm MgCl的100 mm Epps缓冲溶液(pH 8.0)中稀释的溶液2，1毫米DTT，10毫米L-谷氨酰胺，10毫米L-天冬氨酸，5毫米ATP，0.2毫米MESG，1 U mL−1嘌呤核苷磷酸化酶，0.03U mL−1无机焦磷酸酶在37°C时，每种变异体的活性百分比与WT人ASNS(补充图)的百分比进行归一化。10).

人ASNS及其与β-天冬氨酰-AMP中间体及其与功能化甲硫基肟1a和1b配合物的分子动力学模拟

利用DON修饰人ASNS的X射线晶体坐标，建立酶的初始模型，用于模拟酶/抑制剂复合物。使用Modeller构建了缺失残余物段和侧链。57和Chimera GUI58..利用离散优化蛋白质能(DOPE)协议对这些区域的构象特性进行了验证。59..在X射线晶体结构中引入的所有氨基酸残基都进行了几何优化，所有其他原子都被限制在它们的晶体坐标上。在使用琥珀软件套件进一步完善之前，该模型按照标准协议被最小化，以消除坏的接触。86..因此，该配合物在TIP3P的截断八面体盒(98×98×98)中得到解。87水分子与八钠+离子。分配ff14SB力场后88在限制非氢原子(500 Kcal Mol)位置的同时，系统的能量被最小化。−1Å−2)。抑制力常数随后减小(10千卡摩尔)。−1Å−2)，系统在周期边界条件下在NVE系综中缓慢加热到300 K，并在2.4ns的周期内平衡。在这些模拟中，对没有参与氢键的氢原子施加了限制。89算法。在这些平衡模拟中，系统的温度由Langevin恒温器控制。90..最终平衡是在NPT组合(300 K和1 atm)中进行的，时间为15 ns。所有的MD模拟都采用了非键合的截止时间为12个小时.

然后将此结构用作对1A/MgPPi/ASNS，1B/MgPPi/asns和β-天门冬氨酸-AMP/MgPPi/ASNS配合物通过将合适的配体插入合成酶活性位点。配体的初始位置是通过我们在其他地方描述的程序来选择的。21，将无机焦磷酸置于sgxd环上方，与gmp合成酶(pdb：1 gpm)的x射线晶体结构中观察到的方向相同。51..这三种结构和游离酶都被放置在一个由显式TIP3P水分子组成的正交盒中。选择盒的大小，使每个维与任何蛋白质原子之间有一个10的缓冲距离。这四个模型系统被能量最小化，直到梯度阈值为25千卡摩尔。−1 Å−1达到了平衡，然后在300 K使用一系列短期MD模拟。然后，在温度为300 K，压力为1 atm的条件下，使用Desmond对所建立的模型进行了100 ns的md模拟。91OPLS-2005全原子力场软件包92..在这些模拟中，氢原子受到了抖动算法的约束。89，并利用粒子网格Ewald计算了远距离静电能。93为短程库仑相互作用，短程截止为12奥巴。结构在20 ps间隔的轨道取样(每次模拟5000帧)，用标准方法进行分析。

自由能扰动(FEP/REST 2)对1a和1b相对结合亲合性的估计

FEP/REST 2计算63,64,94对功能化的甲基硫基肟分子之间的自由能差进行了估算。1A和1B在人类ASNS合成酶活性位点内使用Desmond中实现的算法38中的原子描述和软件包1A和1BOPLS-2005全原子力场39..因此，优化的模型1A/MgPPi/ASNS复合物被放置在一个正交盒(从任何蛋白质原子的每个维度的缓冲距离12)中的显式TIP3P水分子，有足够的Na。+用来中和系统电荷的离子。在12个λ值(1.0、0.92、0.83、0.75、0.67、0.58、0.42、0.33、0.25、0.17、0.08、0.0)中，用100 ns MD模拟实现了对配体中硫原子构型的改变，选择了配体的重原子(除腺苷基原子外)进行强化采样，如其他部分所述。63,64,94..这些计算给出了Δ的估计G蛋白−10±2.1kJ mol−1基于Bennett接受率95..按照类似的协议，对fep/rest 2进行了计算，以估计功能化的甲基磺胺肟之间的自由能差。1A (λ=0)和1B (λ=1)在一盒显式TIP3P水分子中溶解时。在后一组计算中，1A的模型中存在的内容是相同的。1A/MgPPi/ASNS复合体。这些计算给出了Δ的估计G水的−值为0.20±0.17 kJ mol。−1..因此，这两种配体的结合自由能的差异估计为−10.2kJ mol。−1，基于标准的热力学循环(图1)。5B)。因此，可以编写以下表达式：

什么时候R=8.314 J摩尔−1 K−1和T=298.15 K，此值为.

用定点诱变检验计算模型的预测

用MgPP法测定了WT人ASNS和4种ASNS变体(E364A、E364Q、D367A和D367N)的活性。iEnzChek连续法生产TM焦磷酸盐分析(分子探针)，详见96..在这些实验中，检测混合物中含有0.5毫米ATP，5毫米L-天冬氨酸0.01 U mL−1核苷磷酸化酶，3×10−4U mL−1无机磷酸酶和100毫米NH4Cl溶于100 mm EPPS缓冲液中，pH8.0，含10 mm MgCl20μM或1μM ASNS抑制剂1(按1：1的比例混合1A和1B)(总体积1mL)。在25°C下，加入重组人ASNS(4μg)，在30 0nm处分光度法测定2-氨基-6-巯基-7-甲基嘌呤的生成。所有动力学检测一式三份。在D367N ASNS变异体的研究中采用了相同的检测条件。L-天冬氨酸在终浓度为50 mm时出现，加入重组酶(40μg)可引发反应。将吸光度单位转换成MgPP的标准曲线i浓度是用已知的MgPP量来构建的。i溶于50 mM Epps缓冲液中，pH8.0，含50 mm L-天冬氨酸，200 mm NaCl和2mm TCEP。标准曲线不受10μmasns抑制剂存在的影响。1.

一般注记

在以下实验过程中使用的所有缓冲液的pH值都是通过添加AQ来调节的。HCL或AQ。NaOH。

统计与重现性

化学蛋白组谱测量中的初步统计分析是用学生来确定抑制的意义t-测试。的所有数据点1抑制反应性探针修饰ATP结合位点3在超过35%的范围内，如果p < 0.04. Control CVs are calculated using the expression [(control std. deviation)/(average control signal)] * 100%. Estimates of the errors in the free energy calculations are based on the Bennett acceptance ratio. Values for percentage activities or steady-state kinetic parameters are calculated (mean ± standard deviation) from triplicate measurements.

报告摘要

有关研究设计的进一步资料，可参阅自然研究报告摘要链接到这篇文章。

数据可用性

重组，don修饰的人asns的原子坐标和结构因子已被存放在蛋白质数据库中，具有登录号。6GQ3..的计算模型的坐标。1A/MgPPi/ASNS，1B/MgPPi/asns和β-天门冬氨酸-AMP/MgPPi/ASNS复合物、MD模拟轨迹和自由能计算的I/O文件以及蛋白质净化和动力学分析的原始数据可向Nigel Richards教授(RichardsN 14@carDiff.ac.uk)索取。为获得本研究中使用的ASNS变体所需的质粒和其他试剂的请求应发送给高木裕一郎教授(ytakagi@iu.edu)。化学蛋白组分析实验的原始数据可通过与Tyzoon Nomanbhoy博士联系获得(tyzoonn@ACTIVX.com)。