空间环境导致与视觉和RNA调控途径相关的基因表达的变化。
空间环境引起了基因表达的广泛变化，其中最突出的是眼通路和RNA加工的变化。作为NASA第九次啮齿动物研究实验(RR-9)的一部分，20只老鼠在国际空间站呆了35天。另有20只老鼠被安置在地球上，与地面控制组飞行时所用的硬件相同。对16只小鼠(n=8/组)进行RNA测序。利用DESeq 2在航天和地面控制组之间鉴定了600个差异表达基因(Degs)。11调整后的p值阈值为0.01。表1)。根据DEGS的表达值对DEG进行分级聚类，以确定哪些小鼠具有相似的DEG表达谱。小鼠按其纳入地面控制组或太空飞行组进行聚在一起。与地面控制相比，航天组有286个上调基因和314个下调基因。1A).
图1DEG在航天和控制小鼠之间的聚类和功能。(A)利用调整后的p值阈值0.1，对航天和对照小鼠之间的600 DEG进行分级聚类。与地面对照组相比，航天组有286个上调基因和314个下调基因；(B)丰富的基因本体论(GO)生物过程类别的DEGS。将WebGestalt的亲和性传播选项应用于所选择的有代表性的显示类别；(C)从Reactome数据库中丰富DES之间的网络；(D)受哺乳动物表型本体DEGS影响的丰富表型；(B)–d)过度表达的类别与眼部功能有关(GO类别：“视觉知觉”、“对光刺激的反应”、“光刺激的感觉知觉”、“照相机式眼的视网膜发育”、“光传导级联的失活、恢复和调节”；表现型：视网膜、棒和锥的电生理学、形态学和变性)、各种RNA加工、剪接和代谢功能(GO分为：‘RNA加工’、‘rRNA加工’、‘mRNA加工’、‘RNA剪接’，通过酯交换反应、‘mRNA剪接’、‘rRNA代谢过程’、‘ncRNA代谢过程’、‘mRNA代谢过程’和‘RNA运输’，以及对空间光的物理压力的直接反应(GO：‘对非生物刺激的反应’，‘对辐射的反应’，‘细胞对压力的反应’)。
利用WebGestalt对DEG进行了基因本体论(GO)、通路和表型范畴的过度表达分析(ORA)。12..从这一分析中，发现46种GO、5种途径和14种表型类型，错误发现率(FDR)小于0.05(图1)。1B-D、Sup.表2)。被过度表达的类别包括与眼部功能相关的类别(GO类别：“视觉知觉”、“对光刺激的反应”、“光刺激的感觉知觉”、“照相机式眼睛中的视网膜发育”、“光转导级联”、“光传导级联”失活、恢复和调节；表现型：视网膜、棒和锥的电生理学、形态学和变性)、各种RNA加工、剪接和代谢功能(GO分为：‘RNA加工’、‘rRNA加工’、‘mRNA加工’、‘RNA剪接’，通过酯交换反应、‘mRNA剪接’、‘rRNA代谢过程’、‘ncRNA代谢过程’、‘mRNA代谢过程’和‘RNA运输’，以及对空间光的物理压力的直接反应(GO：‘对非生物刺激的反应’，‘对辐射的反应’，‘细胞对压力的反应’)。
有些基因有很高的差异表达，但不包括在任何GO类别，途径，或表现型基因清单从Ora(Sup)。无花果。1). DRD 4空间飞行组差异表达基因最显著(调整p值：4.31E-51；对数2倍变化：0.812)。DRD 4是控制哺乳动物视网膜昼夜节律的多巴胺受体13..同样，组织1h2bc在Ora的任何类别中均未发现，但在航天组中被上调(调整后的p值：1.66E-09；对数2倍变化：0.526)。组织1h2bc曾经被证明在老化的视网膜中被上调14..这些基因共同支持先前的研究，表明太空飞行扰乱了昼夜节律，是一种潜在的衰老模型。15,16.
视网膜色素变性相关基因在空间环境中有差异表达。
我们试图确定太空飞行样本中是否有任何DEG在常见视网膜疾病中也有差异表达。我们列出了以下视网膜疾病的相关基因：视网膜色素变性、糖尿病视网膜病变、年龄相关性黄斑变性和视网膜脱离。人类疾病相关基因列表是使用DisGeNET数据库发现的。17..DisGeNET数据库中的基因通过基因-疾病关联评分(GDA)进行筛选.分析中只包括GDA大于0.2的基因。这包括专家管理和动物模型数据库中的疾病相关基因，但将疾病相关基因排除在推理和文本挖掘数据库之外。疾病相关基因使用小鼠基因组信息学数据库转换成小鼠正射体。18..未超过DESeq 2平均计数阈值(即调整后的p值等于‘NA’)的基因被从分析中筛选出来。
DisGeNet数据库中有75个与视网膜色素变性相关的基因，14个与糖尿病视网膜病变相关的基因，8个与年龄相关的黄斑变性相关基因，5个与视网膜脱离相关的基因(Sup)。表3)。大多数疾病相关基因都是单一视网膜疾病所特有的，除了ABCA 4, 恩纳特1, Casp3，和Crb1两种疾病各有一种(图1)。2A)。在多个疾病中共享的疾病相关基因中，没有一个在太空飞行中有差异表达。
图2视网膜疾病相关基因表达。(A)显示DisGeNet上每种疾病的基因数目的打乱图。与每组不同的基因位于前四列。集合间共有的基因位于最后三列；(B)Log2-疾病相关基因的变化值。基因从左到右按调整后的p值排列。条形图的颜色由调整后的p值的大小来表示.调整后的p值将根据其数量级进行进一步注释。根据调整后的p值，视网膜色素变性图显示了前20位最重要的基因。所有其他疾病都显示了它们所有的相关基因。
在与视网膜色素变性相关的75个基因中，12个基因在太空飞行中有差异表达(SAG、BC 027072/Pcare、Guca1b、Rbp 3、Ahi1、Guca1a、Prpf 8、Rp1、Gucy2e、Cacna2d4、Pde6b、DHDDS)检查的四种视网膜疾病中的大多数。糖尿病视网膜病变有一个疾病相关基因，在太空飞行中差异表达。HIF1a)。与年龄相关的黄斑变性和视网膜脱离相关基因在太空飞行中没有差异表达(图一)。2B).
差异表达转录因子提示航天改变染色质组织
在图中有报道。1A对其豹蛋白进行筛选，寻找差异表达的转录因子(DETFs)。19..在600个DEG中，29个是DETF。根据DETF的表达值对其进行层次聚类。根据它们被纳入地面控制或太空飞行组，老鼠聚集在一起(如图所示)。3A)。其中8项DETF是视网膜和眼睛其他结构的发育和维持所必需的：马福, 岛1, 阿特夫5, KDM6B, Hmgb 3, PROX 1, CASZ 1和HIF1a20,21,22,23,24,25,26,27..特别感兴趣的是Cazs 1和HIF1a. Cazs 1是一种异染色质调节剂，它以剪接变异的特定方式起作用。24和HIF1a在慢性缺氧样应激模型中，失活可显著减轻感受器的退化。25.
图3转录因子聚类及其在航天和对照小鼠中的作用。(A(2)航天与地面控制小鼠之间29个DETFs的分级聚类；(B)丰富的基因本体论(GO)生物过程类别的DETFs。
对DETF进行了基因本体(GO)术语的过度表示分析(ORA)。47个GO类别，FDR<0.05(Sup)。表4)。应用WebGestalt的亲和传播滤波器，找到了代表所有GO富集结果的GO项的减少数。我们发现与DNA转录相关的GO类(‘正转录调控’，dna模板化，‘负转录调控，dna模板’)的丰富，进一步肯定了这些基因作为转录因子的作用。此外，还有与染色质组织有关的丰富的GO类，包括组蛋白修饰的调控、组蛋白赖氨酸去甲基化、组蛋白H3K9三甲基化的负调控。3B)。这些GO分类中的基因包括KDM4A、Kdm4b和KDM6B，这是已知的赖氨酸甲基化的调节因子。KDM4A和Kdm4b是H3K9me2/ME3的调节剂吗？28，是本构异染色质的调节因子，是本构异染色质存在的指示剂。KDM6B是H3K27me2/ME3的调整器。28主要负责基因表达的沉默。
空间环境降低视网膜组织厚度，增加氧化应激和锥体光感受器损伤。
微计算机断层扫描(MicroCT)图像的产生，以表征全球的眼睛形态和测量厚度的视网膜和周围组织的地面控制和航天小鼠(图一)。4A)。太空飞行期间，视网膜总厚度、视网膜色素上皮(RPE)和脉络膜层厚度明显减少(P<0.05)。4B)。此外，在太空飞行小鼠中还发现脉络膜变形和皱褶(如图所示)。4C).
图4太空飞行减少了眼睛的多层厚度。(A)地面控制鼠标的矢状视图。从上至下，视网膜(0.077 mm)，视网膜色素层(0.038 mm)，脉络膜(0.041 mm)，巩膜(0.059 mm)；(B)空间飞行组和对照组视网膜层、RPE层和脉络膜层的平均厚度用MicroCT测量。每组平均5个视网膜计数。数值表示为平均厚度+标准误差(SEM)。扫描电镜的平均值是用误差条标记的。空间飞行组的横截面厚度明显低于地面对照组(p<0.05)。(C)对照组和航天小鼠视网膜横断面。GCL：神经节细胞层；INL：内核层；ONL：外核层；IS：内段；OS：外段；RPE：色素上皮层。
用花生凝集素(PNA)免疫荧光染色，观察圆锥光感受器的情况。PNA是圆锥光感受器的特异性标记物。锥光感受器在太空飞行中显示出退化的迹象(图一)。5A)。我们的定量评估(图1.5B在太空飞行小鼠中，球果密度呈强烈下降趋势(950计数/毫米)。2)与地面控制组相比，其平均计数为1199次/毫米。2(P=0.06)。
图5太空飞行会导致感受器降解和氧化应激。(a)免疫荧光染色PNA，锥体光感受器(绿色)的标志，和HNE，氧化应激的标志(红色)，在光感受器层。细胞核用DAPI(蓝色)染色，标度棒=50 mm。(B)PNA阳性锥光感受器的细胞密度；(C)视网膜层HNE(红色)的免疫荧光染色。标尺=50m；(D)杆锥感光层HNE标记的荧光强度(箭头)；(E)HNE标记物穿过视网膜的荧光强度；(F)Go类别“氧化应激所致细胞死亡负调控”下DEGS的对数2倍变化；(B,D,E)每组平均5个视网膜计数。数值表示为平均密度±扫描电镜。航天组与地面对照组比较的显着性值分别为‘*’(p<0.05)，‘*’(p<0.01)，‘T’(空间飞行组与地面对照组之间的强趋势差异，p=0.06)。
用抗4-羟色胺(4-hne)抗体评价脂质过氧化的发生，作为视网膜氧化损伤的指标。与地面对照组相比，空间飞行后视锥光感受器、视网膜内核层(INL)和神经节细胞层(GCL)4-HNE染色增强。5C)。如图所示。5D与地面对照组相比，空间飞行组光感受器锥内反映HNE内源水平的荧光强度剖面也显著增加(p<0.05)。空间飞行组视网膜GCL/INL的HNE标记荧光强度也显著增加(P<0.01)。5E)。我们的rna-seq实验确定了三个步骤-Pde8a，HIF1a，HGF-这是“氧化应激诱导的细胞死亡负调控”的GO生物过程类别的一部分(GO：1903202)(图)。5F). Pde8a是磷酸二酯酶家族的一员。磷酸二酯酶特异性成员抑制已被证明可以减轻不同组织中的氧化应激。29,30,31,32. HIF1a可以保护线粒体免受氧化应激的影响。33，但在活性氧存在的情况下，该基因的作用被证明是高度相关的。34. HGF激活一种抗氧化信号通路，最终导致一氧化氮水平的增加和该分子调节的抗氧化酶的活性。35,36..加在一起，Pde8a以及下调HIF1a和HGF与视网膜氧化应激增加有关。
