摘要
在癌症,尽管各种趋化因子pro-tumorigenic行动CXCL16仍有争议的影响。 本研究的目的是调查的分子特征CXCL16-expressing乳头状甲状腺癌(ptc)。 在ptc CXCL16表达明显高于良性或正常甲状腺组织。 对ptc TCGA的数据集,高CXCL16基因表达与M2巨噬细胞和angiogenesis-related和穷人包括更高的TNM分期和预后因素BRAFV600E突变。 包括ptc高3基因的表达面板CXCL16,AHNAK2,THBS2显示贫穷recurrence-free生存比低表达组。 接下来,shCXCL16引入BHP10-3SCp细胞内源性CXCL16耗尽,然后,这些细胞被皮下注射无胸腺的老鼠。 肿瘤从BHP10-3SCpshCXCL16表现出延迟肿瘤生长与降低ERG的数量+内皮细胞和F4/80+巨噬细胞从BHP10-3SCp比控制。 CXCL16-related基因包括AHNAK2和THBS2从BHP10-3SCp肿瘤中表达下调吗shCXCL16从BHP10-3SCp相比控制。 总之,高CXCL16表达式与巨噬细胞在PTC -侵略性angiogenesis-related基因和表型。 针对CXCL16也许是个不错的治疗策略,先进的甲状腺癌。
介绍
肿瘤微环境由异构的细胞群,包括肿瘤细胞、成纤维细胞、内皮细胞以及各种免疫细胞。 良好,肿瘤细胞之间的双向的相互作用及其附近基质细胞主要是由各种细胞因子或生长因子以旁分泌的方式,从而影响肿瘤的生长和转移1,2。
趋化因子趋化细胞因子,最初是已知的角色在白细胞招募炎症相关的人体病理生理学3.。 招募白细胞趋化因子及其受体的相互作用在肿瘤微环境导致炎症2,3.,4。 在大约50人的趋化因子,趋化因子(C-X-C主题)16 (CXCL16)是一个相对较大的趋化因子配体由254个氨基酸和已被确认与趋化因子受体CXCR6绑定。 不像其他的趋化因子,不仅CXCL16表示为一种膜结合分子也是一种可溶性趋化因子5。 CXCL16是由巨噬细胞和树突细胞和调节免疫细胞趋化作用到CXCL16-enriched环境6,7,8,9。 然而,文献关于CXCL16在人类癌症中的作用是互相矛盾的。 CXCL16的表达和/或CXCR6已被证明与贫穷prognosis-related呈正相关因素,如更高的TNM分期和淋巴结转移在人类癌症包括前列腺癌、乳腺癌、肺癌和甲状腺癌6,7,8。 然而,几项研究已经报道相互矛盾的结果10,11,12这表明还需要进一步的机械的研究来阐明这个问题。 最近,一些实验研究表明,CXCL16主导性等基质细胞分泌的成纤维细胞和骨髓细胞13,14并支持肿瘤细胞迁移和入侵9,15。
甲状腺癌是最常见的内分泌肿瘤发生率增加16。 尽管大多数分化型甲状腺癌患者有很好的临床预后,其中3 - 5%以上经历复发或转移性疾病17。 手术和放射性碘(RAI)治疗是一个长期治疗这些患者的首选。 然而,大约10%的复发或转移性疾病是耐火材料RAI,预后不良。 目前,酪氨酸激酶抑制剂包括lenvatinib和索拉非尼可供这些病人,但他们的生存利益是有限的在11日和8个月,分别18,19。 因此,发展新的治疗目标是急需的。 事实上,大量的证据表明,一些趋化因子如CXCL8玩pro-tumorigenic角色和可能是一个有效的治疗目标4。
本研究的目的是调查的分子特征CXCL16-expressing乳头状甲状腺癌(ptc),探索针对CXCL16在ptc的治疗潜力。 在这里,我们研究了CXCL16表达式PTC的RNA序列数据集和派生的面板3基因预测PTC预后。 针对的治疗潜力CXCL16探索使用小鼠异位肿瘤模型在活的有机体内。
结果
增强CXCL16表达在甲状腺癌组织中与良性腺瘤或正常甲状腺组织
比较CXCL16的表达式在各种甲状腺组织,使用anti-CXCL16抗体进行免疫组织化学染色的组织微阵列由21个正常甲状腺组织,148年40良性腺瘤,ptc(列车自动控制系统)。 蛋白质的表达CXCL16相比显著增加在ptc的良性腺瘤(P < 0.001)或正常甲状腺组织(P < 0.001,无花果。1)。 此外,核糖核酸测序数据的分析SNUH队列,包含81个正常甲状腺组织,77年的25甲状腺腺瘤,ptc显示CXCL16相比显著调节在ptc正常甲状腺组织或良性腺瘤(P < 0.001,无花果。1 b)。 此外,类似的发现在癌症基因组图谱(TCGA)数据集包括50正常甲状腺组织和492 ptc(列车自动控制系统)。CXCL16相比显著调节在ptc正常甲状腺组织(P < 0.001,无花果。1 c)。 的受体的表达CXCR6 CXCL16,以前在PTC组织9。 这是癌症和基质细胞表达PTC肿瘤微环境。 在这里,我们CXCR6表情正常和PTC组织之间进行比较。 免疫组织化学染色显示,表达水平之间的类似正常甲状腺上皮细胞和癌细胞PTC(图。1 d)。 此外,CXCR6也同样表达了在正常甲状腺组织和ptc的RNA序列数据SNUH队列(无花果。1 e)。
CXCL16表达式在各种甲状腺组织:(一个CXCL16)免疫组织化学染色。 CXCL16代表图像和量化+细胞每核面积(%)在正常甲状腺组织,良性腺瘤和ptc。 (B)mRNA的表达CXCL16在正常甲状腺组织、腺瘤和ptc SNUH数据集。 (C)mRNA的表达CXCL16在正常甲状腺组织和ptc TCGA的数据集。 (D)免疫组织化学染色CXCR6在正常甲状腺组织和ptc。 (E)mRNA的表达CXCR6在正常甲状腺组织和ptc SNUH数据集。
更高的CXCL16 mRNA表达是人类PTC与不良预后相关因素
调查CXCL16表达ptc(列车自动控制系统)的临床病理的特点,我们进一步分析了TCGA的数据集。 总共有492 ptc分为CXCL16低和CXCL16高基于中值组CXCL16表达式的值,然后比较两组之间的临床病理的特点(表1)。 的CXCL16高组表现出咄咄逼人的病理表型,包括tall-cell变体,extrathyroidal扩展,淋巴结转移、TNM分期和高,相比之下,CXCL16低组(P < 0.001; 表格1)。 的CXCL16高组显示更高的频率BRAFV600E变异CXCL16相比低集团(63.3%比31.2%,P < 0.001; 表格1)。 此外,CXCL16表达式显示显著负相关BRAFV600E-拉分数(BRS) (r =−0.772, P < 0.001),表明在CXCL16肿瘤高集团有BRAFV600E例如转录形象。 综上所述,可怜CXCL16的高表达与临床病理的预后因素。
更高的mRNA的表达CXCL16与M2巨噬细胞——在人类PTC和angiogenesis-related基因
进一步探索CXCL16的分子特征高组,我们分析了120个基因包括55平方米macrophage-related基因和65 angiogenesis-related基因20.,因为增强M2巨噬细胞浸润,增加肿瘤的血管生成是行之有效的贡献者在ptc攻击性21,22。 总共有120个基因筛选,26 CXCL16之间的差异表达基因低和CXCL16高组(无花果。2)。 (度)的差异表达基因分析显示,11平方米macrophage-related基因和12 angiogenesis-related基因显著调节,和1平方米macrophage-related基因(RIMBP2)和2 angiogenesis-related基因(PGF和表皮生长因子CXCL16)明显下调高集团与CXCL16相比低集团(无花果。2和补充表S1)。 此外,单一样本基因集富集分析(ssGSEA)表明,M2巨噬细胞基因签名包括68个基因(图。2 b)和angiogenesis-related基因签名包括65个基因(图。2摄氏度CXCL16中高度表达高集团与CXCL16相比低组,分别。 路径分析表明,ERK评分(P < 0.001; 无花果。二维),PI3K / AKT (P = 0.03; 无花果。2 e)和MAPK (P = 0.03; 无花果。2 f)pathway-related基因CXCL16 ssGSEA明显调节高集团与CXCL16相比低组。
更高的CXCL16表达式与M2巨噬细胞和angiogenesis-related相关基因,在人类PTC TCGA的组织数据集:(一个)的热图分析BRAFV600E-拉分数(BRS), M2巨噬细胞,根据angiogenesis-related基因表达式CXCL16表达式; (B)M2-macrophage; (C)血管生成; (D)ERK通路; (E)PI3K / AKT通路; (F)MAPK通路CXCL16签名高和CXCL16低组相比,使用单一样本基因集富集分析。
CXCL16和相关基因预测recurrence-free PTC的生存
因为高的表达CXCL16本身没有明显与癌症的复发(表相关联1和无花果。3),然后我们做了一个预测基因小组相结合CXCL16和它相关的度。 有趣的是,3基因的组合,CXCL16,AHNAK2,THBS2显示,预测复发的一个重要价值(无花果。3 b)。 3基因的高表达,CXCL16,AHNAK2,THBS2与别人相比,显示短recurrence-free生存(P = 0.047)。 此外,添加其他包括第四基因C1QC,TYMP,PLAU,MMP9,CYTIP,或ADAM8基因面板强化其预测价值。 数字3 c使用4等位基因面板显示了代表kaplan meier曲线。 ptc的高表达CXCL16,AHNAK2,有彩虹,PLAU基因显示短recurrence-free生存比其他人(P = 0.019)。
高的表达CXCL16,AHNAK2,THBS2与不良预后有关人类TCGA ptc(列车自动控制系统)的数据集。 kaplan meier recurrence-free的生存曲线CXCL16单独或结合相关基因。 (一个)CXCL16; (B)CXCL16,AHNAK2,THBS2; (C)CXCL16,AHNAK2,THBS2,PLAU。
治疗效果的阻塞CXCL16 PTC肿瘤在活的有机体内
调查阻挠CXCL16先进的甲状腺癌的治疗潜力,进行了动物实验用小鼠异位肿瘤异种移植模型。 首先,shCXCL16转导为两个甲状腺癌症细胞系,BHP10-3SCp来回,导致内源性CXCL16的遗传损耗。 ELISA试验表明,分泌CXCL16浓度降低的条件培养基BHP10-3SCpshCXCL16来回shCXCL16细胞BHP10-3SCp相比67%和96%控制来回控制细胞,分别为(补充图。S1A,B)。 细胞的异常BHP10-3SCp明显下降了79.2%shCXCL16细胞和来回的57.4%shCXCL16细胞在72 h的控制细胞相比,分别(补充图。就是S1C D)。 异位肿瘤模型表明,从BHP10-3SCp肿瘤shCXCL16细胞表现出显著延迟肿瘤增生10天从BHP10-3SCp 30相比控制细胞(图。4)。 免疫组织化学染色显示,不仅CXCL16+而且尔格+内皮细胞和F4/80+巨噬细胞在肿瘤显著降低BHP10-3SCpshCXCL16细胞与BHP10-3SCp相比控制细胞(图。4 b)。
阻塞CXCL16使用shCXCL16 ptc的肿瘤生长在异种移植小鼠模型。 (一个)BHP10-3SCpshCXCL16或BHP10-3Sp控制细胞在裸鼠皮下移植每组(n = 7 ~ 9)。 从BHP10-3SCp代表图像和肿瘤生长曲线shCXCL16和BHP10-3Sp控制细胞(比例尺= 1厘米); (B)包含IHC染色anti-CXCL16、anti-ERG anti-F4/80异种移植的抗体(一个)执行。 代表图像(放大、x400)和CXCL16百分比+,ERG+,F4/80+细胞; (C)的mRNA表达M2巨噬细胞在异种移植和angiogenesis-related基因; (D)来回shCXCL16或摇来摇去控制细胞在裸鼠皮下移植在每组(n = 8)。 肿瘤生长曲线从摇来摇去shCXCL16来回控制细胞。 *与对照组相比P < 0.05。
来验证是否CXCL16之间的度低和CXCL16高组织TCGA数据集被CXCL16直接调制,从BHP10-3SCp异位肿瘤的总rna控制和BHP10-3SCpshCXCL16细胞被收获。 有趣的是,M2-macrophage和/或angiogenesis-related度等引发,MMP9,PLAU,亚当±8,THBS2,AHNAK2,XDH明显的肿瘤表达下调BHP10-3SCp吗shCXCL16细胞与BHP10-3SCp相比控制细胞(图。4摄氏度)。 肿瘤,肿瘤生长明显延迟的摇来摇去shCXCL16细胞与摇来摇去控制细胞(图。4 d)。
先前的研究表明,人类单核细胞和PTC THP-1细胞表达CXCR6和治疗条件培养基培养的单核细胞和BHP10-3SCp细胞差异CXCR6在两个细胞表达9。 因此,我们的表达水平进行比较CXCR6并证明了THP-1细胞的表达明显高于正常的甲状腺上皮或甲状腺癌细胞系包括BHP10-3SCp来回细胞(补充图。S2)。 此外,CXCL16增强细胞迁移势THP-1细胞不改变细胞的生存能力(补充图。S3),这表明PTC-producing CXCL16可能招募巨噬细胞为PTC微环境。
因为CXCL16生产不仅从癌细胞,也从不同的基质细胞包括巨噬细胞和成纤维细胞9,23,然后我们耗尽它通过使用anti-CXCL16中和抗体在macrophage-laden异种移植肿瘤模型。 BHP10-3SCp细胞的致瘤的克隆与人类单核细胞,移植和anti-CXCL16抗体(aCXCL16)每周注射一次。 肿瘤体积明显减少10天(435±154毫米3.vs 234±44毫米3.,P = 0.03)和15天(697±118毫米3.vs 402±97毫米3.(P < 0.01); 无花果。5)。 一致,ERG+内皮细胞和F4/80+巨噬细胞显著减少aCXCL16-treated组相对于对照组(P < 0.05; 无花果。5 b)。 此外,TUNEL染色显示,细胞凋亡明显增加(P < 0.05; 无花果。5 b),和增殖ki - 67阳性细胞减少边际意义(P = 0.07; 无花果。5 b)aCXCL16-treated组与对照组相比。 集体,CXCL16的禁忌针对肿瘤细胞或肿瘤微环境可能是一种有效的治疗策略,先进的甲状腺癌。
阻塞CXCL16使用anti-CXCL16抗体(aCXCL16)减少肿瘤生长的ptc异种移植小鼠模型。 BHP10-3SCp细胞co-transplanted裸体小鼠巨噬细胞,和aCXCL16 anti-IgG(控制)腹腔内注入。 (一个)aCXCL16和对照组之间比较肿瘤生长; (BERG)免疫组织化学染色,F4/80, ki - 67和TUNEL分析进行异种移植肿瘤。 代表图像(放大、x400)和ERG的百分比+,F4/80+ki - 67+,TUNEL+细胞。 *与对照组相比P < 0.05。
讨论
累积证据证明各种细胞因子调节pro-tumorigenic行动组织的方式。 在目前的研究中,分析表明更高TCGA的数据集CXCL16表达呈正相关,M2巨噬细胞和angiogenesis-related基因表达式和与不良预后相关因素包括BRAFV600E突变和TNM分期越高。 虽然独自CXCL16没有预测疾病的预后,包括3基因的组合CXCL16和2度相关,AHNAK2,THBS2预测recurrence-free残留。 在小鼠异位肿瘤模型中,CXCL16-depleted PTC细胞表现出显著降低肿瘤的生长与降低巨噬细胞浸润和肿瘤血管生成。 此外,调节CXCL16-related度从人类研究肿瘤明显减少CXCL16-depleted的肿瘤细胞,这表明CXCL16可能积极调节protumorigenic PTC肿瘤微环境的调节。 最后,治疗anti-CXCL16阻止抗体显著抑制肿瘤生长的macrophage-laden ptc在小鼠模型中。 综上所述,一个包括3基因面板CXCL16ptc(列车自动控制系统)可以预测预后较差,针对CXCL16也许是个不错的治疗策略,先进的甲状腺癌。
CXCL16是一种最近pro-angiogenic特征是细胞因子在各种人类的病理生理学。 CXCL16诱发内皮细胞增殖、迁移和新血管的形成在体外24,25。 在风湿性关节炎小鼠模型中,CXCL16 / CXCR6信号报道中有一个中心作用内皮祖细胞趋化性和血管生成26。 CXCL16也扮演一个重要的血管生成因子在肿瘤微环境。 肿瘤cell-conditioned骨髓抑制细胞可以产生CCL2 CXCL16,增强血管生成27。 在肝细胞癌异种移植小鼠模型,抑制CXCR6, CXCL16受体,减少肿瘤血管生成28。 在目前的研究中,我们第一次报道,针对CXCL16在癌细胞使用成分或微环境使用中和抗体在甲状腺癌有效地阻止肿瘤生长和血管生成。 肿瘤血管生成在甲状腺癌的发展有重要的作用21。 多靶向酪氨酸激酶抑制剂包括lenvatinib和索拉非尼,目前用于RAI-refractory先进的甲状腺癌、抗血管生成剂主要目标VEGF受体。 因此,CXCL16可以是另一个先进的抗血管生成治疗甲状腺癌的目标,和患者更高CXCL16表达式可能会选择挑战目标CXCL16精密医学方法。
一项研究表明CXCL16作为一个潜在的肿瘤相关巨噬细胞(tam),中介支持TAM-mediated细胞迁移和入侵ptc的潜力9。 目前的研究证实的表达CXCL16与TAM-related呈正相关,BRAFV600E——签名基因在人类ptc(列车自动控制系统)。 因为建立了tam pro-tumorigenic角色在不同的人类癌症包括甲状腺癌29,tam作为抗癌治疗的目标是调查集中在细胞和分子水平30.。 第一种方法是针对巨噬细胞本身的系统性的损耗。 然而,这种长期的系统损耗的巨噬细胞可能导致宿主免疫抑制和致敏机会性感染30.。 因此,针对下游介质tam可能是一个不错的选择策略。 一些血管生成因素包括VEGF-A和MMP9调解tam的行动29,这取决于组织或器官。 因此,组织TAM介质需要确认和验证在每个特定的器官。 拟合目标tam的后一种方法,CXCL16可能是一个不错的癌症治疗晚期甲状腺癌的目标。 本研究的一个重要的发现是,CXCL16-related TCGA的度数据集M2-macrophage和/或血管生成相关基因被抑制在异种移植肿瘤从CXCL16-depleting细胞。 这意味着CXCL16 TAM-enriched肿瘤微环境的重要球员,可以有效的治疗目标。
本研究的优势之一是它显示的临床意义CXCL16表达式是作为人类的ptc的预后标志物进行验证。 事实上,肿瘤微环境是一个非常异构复杂,由各种类型的细胞分泌大量的细胞因子和生长因子1,31。 因此,为单因素预测价值可能有限制。 本研究证明了一个可接受的预测价值的基因组成的小组对PTC预后CXCL16 2相关基因。 进一步的研究需要运用这种基因对人类ptc面板。
总之,更高CXCL16表达式与巨噬细胞、血管生成和BRAFV600E——签名基因在人类ptc(列车自动控制系统)。 three-gene面板相关CXCL16可以用来预测疾病的预后,并针对CXCL16 macrophage-enriched也许是个不错的治疗策略,先进的甲状腺癌。
方法
甲状腺组织微阵列
甲状腺组织微阵列,如前所述32被用于这项研究。 短暂,甲状腺组织的石蜡包埋块从病人甲状腺手术从1993年1月至2003年12月Boramae首尔国立大学医学中心,首尔国立大学医院。
TCGA处理从SNUH基因组数据和数据集
我们使用mRNA表达数据从77年ptc, 25甲状腺滤泡腺瘤,81正常甲状腺组织SNUH队列。 RNA序列的过程被详细描述33。 作为验证集,我们使用TCGA的mRNA表达数据; 核糖核酸测序获得的临床资料和mRNA表达数据从492年ptc和59配对正常甲状腺组织从UCSC的癌症下载浏览器(https://genome-cancer.ucsc.edu于2017年10月12日)。 度被定义为DESeq2核反应能量< 0.05,|日志2(褶皱变化)|≥1,baseMean≥100,使用标准化的原始计数正规化的顺序读取日志转换方法34。 多个测试调整,计算出的核反应能量Benjamini-Hochberg使用校正。 构造一个热图,集中rlog值应用于分层集群使用集群3.035。 量化的程度相似的特定肿瘤的基因表达谱BRAFV600E或拉突变,br、一个mRNA-based签名得分TCGA开发的研究36使用。 肿瘤- br被定义为BRAFV600E——而积极的BRS被定义为肿瘤拉的地方。
此外,从GenePattern ssGSEA (http://software.broadinstitute.org/cancer/software/genepattern/)实施评估几个信号通路的激活每个样本37。 在分析之前,我们排除基因低表达水平在整个样本根据从DESeq2 baseMean值(< 100)34。 PI3K / AKT和MAPK通路,我们使用了《京都议定书》百科全书的基因和基因组(KEGG)数据库提供的分子签名数据库(MSigDB)38,39。 M2巨噬细胞和血管生成,我们使用自定义基于以前的研究基因列表20.,40,41。 ERK得分也计算了ssGSEA TCGA的52个基因列表的研究36,42。
发展预测模型
预测复发的表达CXCL16、M2 macrophage-related基因和angiogenesis-related基因,每个基因表达分为两组(高、低组)每个基因值表达式值的基础上,从2到4基因和组合。 所有的组合基因检查发现一个重要的协会与复发。 Recurrence-free ptc的生存与高表达的基因是比别人使用kaplan meier生存分析。
免疫组织化学染色
Formalin-fixed,石蜡包埋组织切片的组织微阵列或异种移植肿瘤CXCL16使用免疫组织化学染色(Abcam、剑桥、马、美国; 稀释比例1:10 0),ERG(美国亚利桑那州图森市Ventana医疗系统),F4/80 (eBioscience、圣地亚哥、钙、美国、稀释比1:200),和ki - 67(美国Neomarkers,弗里蒙特CA,稀释比例1:50 0),使用基准XT自动免疫组织化学染色滑动系统(Ventana)根据制造商的指示。 TUNEL检测(美国微孔,MA)是用于检测凋亡细胞异种移植肿瘤部分。 分析免疫反应性,核心肿瘤领域被分为季度,和5个地区被随机选择从每个季度和中央区域。 在400 x放大,免疫反应性的细胞被两个不同的医生包括一个病理学家和表达为阳性细胞单位面积的百分比。
动物研究
六个雌性BALB / c裸小鼠(东方生物、Seongnam-si、韩国)购买并用于这项研究。 建立甲状腺癌异种移植模型,细胞(5×106/ 100μL PBS)或细胞(2×106/ 100μL PBS)窝藏shCXCL16或控制,混合经济增长因素都可以降低人工基底膜(70μL, 4°C; 美国圣何塞CA BD生物科学),移植到裸鼠的背侧皮肤褶皱。 macrophage-laden异位肿瘤,THP-1细胞(1.25×106/ 100μL PBS)与BHP10-3SCp co-transplanted细胞。 Anti-CXCL16抗体或免疫球蛋白(研发系统,明尼阿波利斯,美国)是注入腹腔内肿瘤细胞移植后一周一次。 我们用测径规测量肿瘤大小和肿瘤体积计算使用以下方程:体积=½×一个Xb2,在那里一个=长肿瘤直径b=短肿瘤直径43。 5到6周后,小鼠安乐死,肿瘤手术切除和10%福尔马林固定。
细胞培养
人类PTC细胞系,BHP10-3SCp,肿瘤发生的克隆BHP10-3M细胞系的包含RET / PTC(列车自动控制系统)重排,开发和提供的请Soon-Hyun Ahn博士(首尔国立大学医学院,首尔,韩国)和Gary l . Clayman博士(MD安德森癌症中心,休斯顿,德克萨斯州,美国)44。 细胞(细胞未分化甲状腺癌)窝藏BRAFV600E和叔C250T突变和THP-1细胞(人类单核细胞/巨噬细胞)窝藏CDKN2A,拉,TP53突变是June-Key涌博士和Hyo-Soo金博士的礼物(首尔国立大学医学院、首尔、韩国),分别。 所有细胞培养在罗斯威尔公园纪念研究所(RPMI) -1640中补充10%胎牛血清的边后卫。
转导的CXCL16成分
耗尽CXCL16内源性表达的甲状腺癌细胞,CXCL16成分稳定转导到BHP10-3SCp来回细胞。 简而言之,人类CXCL16-specific成分(任务TRCN0000057990和TRCN0000057991 1×106你/毫升,pLKO。 1的向量)和非目标成分控制(SHC003)慢病毒转导粒子获得Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国)。 细胞被镀在96孔板上1.6×10的浓度4细胞/好,慢病毒颗粒感染(MOI 5)表达的具体成分。 2天后,细胞被选中与嘌呤霉素(Sigma-Aldrich),直到完成观察未感染的细胞的死亡。
RNA提取和rt - pcr分析
试剂盒(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)被用来收割mRNA的异种移植肿瘤和细胞。 使用优秀的rt - PCR进行GeneAmp PCR系统9600(美国沃尔瑟姆,MA)。 PCR引物组补充表中列出S2。
统计分析
提出了数据的均值和标准差。 我们分析了连续变量由克鲁斯卡尔-沃利斯检验或测试Mann-Whitney U。 Recurrence-free生存曲线被绘制使用kaplan meier方法使用生存率较和比较。 统计分析使用SPSS 22.0版软件在Windows(美国SPSS,芝加哥,IL),和一个P< 0.05被认为是具有统计学意义。
道德的声明
实验与人类甲状腺组织的机构审查委员会批准Boramae首尔国立大学医学中心(06-2010-176),首尔国立大学医院(1107-060-369)。 知情同意后从所有患者获得解释的目的和过程的研究。 动物实验协议批准的首尔国立大学动物保健和使用委员会制度(snu - 160203 - 1)。 所有方法包括人类和动物在这个研究是按照指导方针和有关规定执行。