摘要
肾脏老化导致终末期肾病(ESRD)的发病率增加的老年人,和老化是一个复杂的生物过程控制的信号通路和转录因子。 足突细胞衰老过程中扮演着重要的角色在损伤造成肾脏衰老。 这里,我们证明了C / EBPα的关键作用在足细胞衰老和肾脏衰老通过生成一个转基因小鼠模型的老化时间C / EBPα在足细胞和有选择地删除overexpressing C / EBPα培养足细胞,过早的衰老与阿霉素治疗引起的。 此外,我们照足突细胞衰老的机制导致管通过刺激HK-2细胞损伤与牛血清白蛋白(BSA)和氯喹。 我们的研究表明,C / EBPα淘汰赛中足细胞足突细胞衰老加剧通过AMPK / mTOR通路,导致肾小球硬化症,随后蛋白尿加剧了epithelial-mesenchymal衰老的管状细胞通过分化转移通过抑制自噬。 这些观察强调C / EBPα的重要性作为一个新的潜在目标肾脏衰老。
介绍
随着全球人口年龄,肾脏疾病的发病率在扩大老年人口比例增长。 逐渐下降的所有器官和系统的生理功能是一种常见的衰老的特征1。 在肾脏,这种下降趋势似乎涉及一个~ 10%肾小球滤过率下降35岁后每十年2。 组织学检查这种变化表现为功能肾单位的损失,包括足突细胞耗竭、肾小球硬化症,肾小管萎缩,微血管稀疏,间质纤维化,以及补偿剩余的肾单位。 正常值、老化引起的积累受损细胞器,线粒体和蛋白质聚集在肾细胞,导致衰老和功能障碍。 延长寿命一直是一个神秘而有吸引力的主题贯穿人类历史。
CAAT enhancer-binding蛋白(C / ebp)是一个转录因子家族属于基本地区亮氨酸拉链(bZIP)家族的蛋白质。 他们广泛表达于肝脏,脂肪和造血细胞和其他细胞终末分化3.。 先前的研究已经发现C / EBPα各肾小球细胞广泛表达,尤其足细胞中高度表达4。 C / EBPα控制广泛的细胞过程,包括细胞增殖、分化、能量代谢、炎症和自身免疫5。 特别是,我们之前的研究表明,C / EBPα维护足突细胞完整性的体内和体外实验FSGS模型4。 然而,C / EBPα足突细胞衰老的影响和肾脏衰老仍然未知。
在这里,我们证明了C / EBPα的保护作用在足细胞衰老和肾脏衰老产生转基因小鼠模型的按时间顺序的老化C / EBPα在足细胞和有选择地删除overexpressing C / EBPα培养足细胞和由阿霉素诱导衰老。 我们的研究表明,C / EBPα足细胞足突细胞衰老加剧击倒,这进一步加剧了在衰老小鼠肾小球硬化症和肾小管损伤。 这些观察强调C / EBPα的重要性作为一个新的潜在目标肾衰老。
材料和方法
动物实验
动物实验程序维护和动物保健委员会批准瑞金医院,上海交通大学医学院(上海,中国)。 老鼠被安置在一个特定的无菌室的恒温22±2°C和恒定的湿度下50±5% 12 h日夜循环。Podocin-Cre和液氧Cebpa(Cebpa液氧/液氧)转基因小鼠C57BL / 6背景交叉生成Cebpa液氧/液氧; podocin-Cre老鼠(以下称为CebpaPod-f / f老鼠),他们繁殖和基因分型实验室如前所述4。 研究涉及的删除C / EBPα足细胞在衰老小鼠,小鼠分为以下四类:Cebpa- + / +仓老鼠被杀死在12周和20个月大的时候(分别为WT-Young组和WT-Aging组)CebpaPod-f / f同窝出生(KO-Young组和KO-Aging组)。 老鼠能有免费的食物和水。
细胞培养
HK-2细胞获得美国类型文化集合(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)和培养与10%胎牛血清的DMEM / F12培养基。 不灭的小鼠足细胞被教授约翰Cijiang他请提供(肾脏学,伊坎在西奈山医学院,纽约,纽约,美国),培养如前所述6在37°C,分化3天。 足细胞转染如前所述6。C / EBPαNGFR超表达质粒及其负控制礼物从艾伦罗斯伯格(Addgene质粒# 44627,水城,妈,美国)7。
代谢和生理参数
在小鼠安乐死之前,他们提供水随意和24小时尿代谢笼收集。 尿白蛋白浓度是衡量使用鼠标白蛋白ELISA定量组(TX Bethyl实验室,Inc .,蒙哥马利,美国)。 尿肌酐浓度在同一样本使用QuantiChrom衡量TM肌酐测定工具包(美国生物测定系统,海沃德,CA)根据制造商的协议。
肾脏组织病理学
麻醉小鼠的肾脏被移除,立即在4%多聚甲醛固定,石蜡嵌入,在4μm分段。 部分是沾染了周期性acid-Schiff (PAS)和三色的马森。 不是显微图观察估计肾小球簇和系膜区。 肾小球簇的横截面积是决定簇的轮廓使用程序Adobe Photoshop 7.0(奥多比系统公司,圣何塞,CA)。 系膜分数计算比肾小球系膜面积的区域的簇4。 失明的方式组织病理学特征进行量化的基础上至少10每鼠肾小球的放大~×400 (DM1000、徕卡、德国)。
透射电子显微镜法
肾皮质组织被固定在2%戊二醛磷酸盐溶液pH值(7.4)。 样本进一步孵化2%四氧化锇在磷酸盐溶液pH值(7.4)在4°C 2 h。 超薄部分与柠檬酸铅染色和醋酸双氧铀和查看HT770透射电子显微镜(日立、日本)的加速电压80 kV。 ImageJ 1.51 k软件(National Institutes of Health), rsb.info.nih.gov)是用来衡量肾小球膜厚度。 分离后的各种片段,只留下“绿带运动”,我们使用BoneJ, ImageJ插件的骨骼图像分析,测量GBM厚度如前所述8。
总RNA提取和定量实时PCR
肾皮质组织的总RNA提取利用试剂盒(美国应用生物系统公司,沃尔瑟姆,MA)。 RNA浓度是衡量nd - 1000分光光度计(NanoDrop技术,威明顿、德、美国)。 第一链cDNA合成是由使用2μg RNA和高容量cDNA逆转录工具包(应用生物系统公司)根据制造商的指示。 使用SYBR实时定量rt - pcr进行®预混料交货Taq™(豆类、日本)和StepOnePlus实时PCR系统(应用生物系统公司)。 鼠标引物的序列波形蛋白,β-actin,p21CIP1p27KIP1,p15INK4b都可以在请求。 序列的寡核苷酸引物nephrin,synaptopodin,podocin,WT-1,podocalyxin也可用如前所述4。 每个信使rna的表达水平计算后的正常化β-actin。 结果通过比较分析周期阈值(2——∆∆Ct)方法。
免疫组织化学染色
包含IHC染色进行石蜡包埋后肾脏部分标准程序通过孵化部分主要抗体LC3B(细胞信号技术,Inc .,丹弗斯,妈,美国),钙粘蛋白(英国Abcam)α-SMA(圣克鲁斯生物技术、钙、美国)和FSP1 (S100A4 Abcam)一夜之间在4°C。 洗后,部分抗体与生物素化的二次孵化,其次是孵化与民建联的avidin-biotin-peroxidase复杂基质使用ABC开发工具包(美国向量实验室,伯林盖姆,CA)在室温下,他们安装使用Aqua PolyMount (Polysciences, Inc .,沃灵顿,PA,美国)。 图像通过使用徕卡DM1000显微镜和数码相机。
免疫荧光
抗原检索和阻塞后,一夜之间,5毫米肾脏切片被孵化与山羊anti-synaptopodin 4°C(圣克鲁斯生物技术),鼠标anti-WT-1(圣克鲁斯生物技术),鼠标anti-p16INK4a(Abcam),或鼠标anti-C / EBPα主要抗体(圣克鲁斯生物技术)。 洗后,部分是孵化FITC-conjugated驴anti-mouse抗体/二次抗体。 使用一个AxioVert A1显微镜检查的部分(德国蔡司),数码相机。 ImageJ 1.51 k软件(美国国立卫生研究院)是用来衡量肾小球免疫染色的水平。 首先,图像转换为8位灰度图像。 肾小球地区选择测量区域。 灰度反转后,光密度(OD)校准。 然后,积极彩色地区肾小球与适当的设置和整合阈值选择,细胞计数,积极染色面积计算,测量归一化到肾小球的地区。
Senescence-associatedβ-galactosidase染色
Senescence-associatedβ-galactosidase (SA-β-gal)染色进行肾组织10月制冷剂和SA-β-gal的足细胞进行染色玻璃盘子(热科学、美国)使用衰老β-galactosidase染色工具包(猫。 不。 9860年,细胞信号技术,美国)。 短暂,10-µm组织cryosections在固定剂固定在室温下5分钟解决方案,然后根据制造商的协议处理。 用莱卡DM1000显微镜和图像获取量化使用ImageJ 1.51 k软件。
免疫印迹分析
肾皮质组织地面和细胞溶解,细胞被收集和细胞溶解里帕缓冲区中含有蛋白酶抑制剂的鸡尾酒。 等量的蛋白质样本加载在SDS聚丙烯酰胺凝胶,转移到PVDF膜(微孔、马、美国),与抗体探测,可视化与发光成像工作站(Tanon,中国)。 乐队使用ImageJ强度进行量化。 以下使用抗体:兔子anti-nephrin抗体(Abcam),鼠标anti-E-cadherin抗体(Abcam),鼠标anti-α-SMA抗体(圣克鲁斯生物技术),兔子anti-p62抗体(细胞信号技术,Inc .)和兔anti-LC3B抗体(细胞信号技术,Inc .)。 鼠标anti-β-actin抗体(σ,妈,美国)或鼠标anti-GAPDH抗体(Abcam)被用来加载控制。
统计分析
组数据表示为平均值±标准平均误差(SEM)。 比较两组进行了使用一个未配对t测试后确定数据的分布和方差。 单向方差分析(方差分析)其次是图基的多重比较测试时使用超过两组。 所有测试都是双尾P< 0.05被认为是一个具有统计学意义的结果。
结果
对C / EBPαpodocyte-specific表达式C / EBPα零小鼠模型,按时间顺序的衰老小鼠模型
我们走过Cebpa-floxed(Cebpa液氧/液氧表达podocyte-specific)小鼠转基因老鼠Cre重组酶的podocin启动子(podocin-Cre)生成podocyte-specificC / EBPα击倒(CebpaPod-f / f老鼠)和控制(Cebpa- + / +仓如前所述)老鼠4。 每组有6 - 9只老鼠。 我们之前的研究表明,在基础条件下,年轻的老鼠podocyte-specific删除C / EBPα(KO-Young)表型正常的12个月的年龄,按照孟德尔定律生于一个男女比例成比例4。 因此,年轻和衰老组牺牲3和20个月大的时候,分别。 评估C / EBPα表达的变化与衰老,我们为西方墨点法孤立肾皮质,发现C / EBPα强劲水平在KO小鼠表达下调的价格相比WT老鼠,和老龄化也显著降低(图C / EBPα水平。1 a, b)。 通过检查C / EBPαcolocalization和足突细胞免疫荧光标记synaptopodin,我们发现C / EBPα肾脏足细胞,主要是C / EBPα表达在KO小鼠足细胞是专门删除,对老化(图表达下调。1 c)。
一个免疫印迹分析用于评估一个改变表达式在肾皮质组织衰老小鼠和确认C / EBPα表达式的中断C / EBPαPod-f / f老鼠。 β-actin被用作加载控制。b平均带强度的量化C / EBPα。 表达式的值C / EBPα- + / +仓年轻(WT-Young)组设置为1。 结果表现为手段±sem。 单向方差分析(方差分析)其次是图基使用了多重比较检验。 *P< 0.05,* *P< 0.01,* * *P< 0.001表示组之间。c代表疣状显微图C / EBPα(绿色)和synaptopodin(红色,表明足细胞)降低C / EBPα表达足细胞在衰老和删除C / EBPα淘汰赛。 酒吧= 20μm规模。 所有图片合并预测594 - 488 nm Z-serial渠道
有针对性的删除C / EBPα在按时间顺序的衰老小鼠足细胞足突细胞衰老加速
然后我们调查了衰老小鼠足细胞的结构和功能障碍。 肾皮质的免疫印迹结果表明nephrin表达水平显著下调在衰老和减少KO-Aging组明显多于WT-Aging组(无花果。2 a, b)。 足细胞的mRNA水平的几个标记,包括nephrin,synaptopodin,podocin,WT-1,podocalyxin孤立肾皮质组织的未来取决于实时定量PCR分析和也在KO-Aging显著减少小鼠相比WT-Aging老鼠(图。2摄氏度)。 此外,透射电子显微镜(TEM)显微图还显示足脚过程抹杀和肾小球基底膜(GBM)增厚在衰老和这些形态KO-Aging老鼠的伤势更严重比WT-Aging老鼠(图。2 d, e)。 除了加重形态损伤,C / EBPα损失在足细胞也加速功能老化引起的破坏,这是证明了的显著增加尿albumin-to-creatinine比例WT-Aging老鼠的价格相比其他三组(图。2 f)。
一个足突细胞标志物的表达nephrin肾皮质的年轻和衰老野生型和基因敲除小鼠(WT-Young, KO-Young、WT-Aging KO-Aging组)是由免疫印迹分析。b西方的屁股的光密度分析(一个)。 乐队是规范化的相对强度的强度各自β-actin信号,和WT-Young组的值设置为1。c足突细胞标记的信使rna表达水平的量化描述的四组(一个)。d代表TEM显微图的脚流程和GBM WT-Young, KO-Young, WT-Aging, KO-Aging组。 酒吧= 2.0μm规模。e“绿带运动”的量化厚度。f蛋白尿在老龄化的发展C / EBPαPod-f / f老鼠(KO-Aging集团)是由尿albumin-to-creatinine比率。 结果表现为手段±sem。 单向方差分析(方差分析)其次是图基使用了多重比较检验。#P< 0.05与其他组相比,*P< 0.05,* *P< 0.01,* * *P< 0.001,NS表示组之间没有意义
为了更好的理解是否加剧了KO-Aging小鼠足细胞损伤是由于加速度的足突细胞衰老C / EBPα淘汰赛,我们首先评估双足细胞的核组织化学染色标记WT-1 p16和细胞衰老标志INK4a。 显微图显示p16的显著增加INK4a积累(无花果。3 g)和减少数量的WT-1-positive细胞(图。3 b、e、h在肾小球在老化,C / EBPα淘汰赛显著增强这些趋势。 p16的显微图显示colocalizationINK4ap16和WT-1表示增加INK4a积累在WT-1-positive细胞WT,按时间顺序的KO小鼠衰老小鼠模型(无花果。3 d)。 此外,p16INK4a积累在KO-Aging WT-1-positive细胞更严重比WT-Aging肾小球肾小球(无花果。3 d),尽管WT-1-positive核的比例大幅降低KO-Aging肾小球(无花果。3 b、e、h)。
代表免疫荧光显微图肾脏部分从野生型和C / EBPα基因敲除小鼠在12周和20个月大的时候沾主要p16抗体INK4a(绿色)(一个)和WT-1(红色)(b)。 细胞核与DAPI复染色(蓝色)。c,d图像融合的预测594 - 488 nm Z-serial渠道。e图像融合的预测454 - 488 nm Z-serial渠道。f三个通道的图像融合图像。gp16的量化INK4a在肾小球,h每μm WT-1-positive细胞的数量2在肾小球簇区域确定通过计算每组10个随机肾小球从三个独立的实验。 数据显示为均值±SEM。 统计分析是由单向方差分析之后,图基的多重比较检验。 *P< 0.05和* * *P< 0.001表示组之间;###P< 0.001与其他三组相比。 在面板(一个- - - - - -f),酒吧= 20μm规模
我们进一步确定SA-β-gal的活动水平,最常用的细胞衰老的标志,在肾脏,发现类似p16的积累INK4a,积极染色KO-Aging肾小球的价格相比显著增加WT-Aging肾小球(无花果。4 a、b),确认C / EBPα删除足突细胞衰老加速老化。 此外,SA-β-gal活动显著增加相比,老化的皮质与年轻的皮质; 然而,它没有进一步增加KO-Aging组相比WT-Aging组(无花果。4 c, d)。 此外,我们量化的mRNA水平细胞衰老标记,包括细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21CIP1p27KIP1,p15INK4b在肾皮质,发现他们显著增加衰老组较年轻组(无花果。4 e)。 与SA-β-gal染色的结果一致,与podocyte-specific老鼠C / EBPα删除展出这些标记没有mRNA水平的变化而表现出的野生型老鼠相同的年龄(图。4 e)。 我们的数据的基础上,我们假设C / EBPα淘汰赛加剧aging-induced足突细胞衰老,这表现为足突细胞结构和功能受损和衰老标记物的积累,但这种积累不是tubulointerstitium明显加剧。
一个代表显微图显示SA-β-gal染色肾小球从野生型和C / EBPα基因敲除小鼠在12周和20个月大的时候。 肾小球的三角形表示。 酒吧= 50μm规模。b肾小球SA-β-gal-positive区域的量化确定通过计算每组10个随机肾小球从三个独立的实验。c代表的SA-β-gal染色显微图中描述的老鼠的肾脏皮质(一个)。 酒吧= 100μm规模。dSA-β-gal-positive区域肾皮质区域的比例(c)。 两个随机字段的视图放大×100计算每个动物(n= 5老鼠每组)。emRNA的表达p21CIP1,p27KIP1,p15INK4b从四组在肾皮质。 结果表现为手段±sem。 *P< 0.05,* *P< 0.01,* * *P< 0.001,NS表示组之间没有意义###P< 0.001与其他三组相比,分析了图基单向方差分析后的测试(n= 6 - 8为每个组)
删除C / EBPα在足细胞加剧aging-induced肾小球硬化症阻力指标EMT也许可以和
进一步研究C / EBPα损失足细胞是否会影响老化引起的肾损伤,我们进行了组织学染色和TEM显微照片分析,发现老化引起显著的系膜扩张和更实质性的系膜基质积累KO-Aging肾小球比WT-Aging肾小球以PAS染色(图5,第一行和无花果。5 b)。 同样,马森三色的染色和透射电镜,我们发现在KO-Aging肾小球细胞外基质的增加更严重比WT-Aging肾小球(无花果。5行2和3)。此外,PAS-staining显微图显示适度的管式地下室WT-Aging组的增厚,但严重的增厚KO-Aging组(无花果。5马森,第1行),三色的染色也显示阻力指标纤维化也许可以增加KO-Aging组与其他三组相比(图5第2行)。这些结果表明podocyte-specificC / EBPα淘汰赛不仅加重肾小球硬化症的设置按时间顺序的老化,还诱导阻力指标受伤也许可以发展的。
一个代表光显微图的周期性acid-Schiff (PAS)染色(第1行,规模酒吧= 20μm),和三色的Masson-stained(第二行,规模酒吧= 50μm)肾脏部分和TEM显微图(第三行,规模酒吧= 5.0μm)从WT-Young KO-Young, WT-Aging, KO-Aging老鼠。b在肾小球系膜区部分的量化簇从10到15随机选择每个动物在每个显示组肾小球(n= 5老鼠每组)。c比较EMT标记的表达在肾皮质的四组。 β-actin作为加载控制。 光密度分析表明显著减少钙粘蛋白的表达(d),并增加α-SMA的表达(e在老化C / EBPα基因敲除小鼠。f免疫组织化学显微图代表的钙粘蛋白(第1行),α-SMA(第2行),和FSP-1(第3行)表达式描述的四组(e)。 酒吧= 50μm规模。 结果表现为手段±sem。 *P< 0.05,* *P< 0.01,* * *P< 0.001表示组之间,分析了图基单向方差分析后的测试(n= 6 - 8为每个组)
地下室我们的观察表明更大的管状增厚KO-Aging组比基于PAS染色尽管WT-Aging组肾小管细胞衰老的相似度基于SA-β-gal染色。 确认C / EBPα阻力指标epithelial-mesenchymal也许可以足细胞损失加剧分化转移(EMT),我们孤立肾皮质和评估钙粘蛋白通过免疫印迹和α-SMA水平。 钙粘蛋白的表达水平和α-SMA WT-Young和KO-Young老鼠之间没有明显的变化; 然而,钙粘蛋白水平的降低和α-SMA水平显著增加老化(图。5汉英)。 WT-Aging之间的变化更为重要和KO-Aging组(无花果。5汉英)。 然后,我们进行了免疫组织化学染色(包含IHC)确定EMT的定位指标。 钙粘蛋白主要表达的管状细胞,α-SMA间质中表达。 四组之间的变化是一样的免疫印迹(图所示。5 f行1和2),积极FSP-1包含IHC染色技术领域,主要位于tubulointerstitium,也增加了在老龄化,C / EBPα删除在足细胞诱导的积累FSP-1(无花果。5 f行3)。基于这些发现,我们的结论是,目标击倒的C / EBPα表达在足细胞阻力指标EMT也许可以导致肾小球硬化症的恶化和老化。
蛋白尿在podocyte-specificC / EBPα零衰老小鼠阻力指标EMT也许可以加剧
我们发现podocyte-targetedC / EBPα在衰老小鼠阻力指标EMT也许可以删除加剧,但基因删除足细胞如何影响管式表型仍然是一个有趣的问题。 已经提出,管状细胞表现出高水平的本构自噬,自噬缺陷加速肾小管损伤9。 也因此,我们调查是否aging-induced EMT在管状细胞伴随着异常的自噬体内平衡。 首先,我们决定改变表达式的自噬在肾皮质标记p62和LC3B西方墨点法,发现p62调节略WT-Aging老鼠和老鼠从年轻组相比,但衰老LC3-II的表达显著减少(~ 50%,P< 0.01)(图6 a - c)。 此外,在KO-Aging集团p62的表达水平显著高于其他组,和LC3-II下降更明显(~ 80%,P与WT-Young组相比p < 0.001)比WT-Aging组(无花果。6 a - c)。 LC3B包含IHC染色显示,主要表达在管状细胞,和积极的面积和程度下降表明自噬活动减少衰老小管podocyte-specific中断后(图C / EBPα表达式。6 d)。 这些发现表明,自噬可能参与特异表达的发生和进展管状EMT在按时间顺序的老化模型。
一个比较表达的自噬标记p62和LC3-II / LC3-I肾皮质的四个表示组,由西方墨点法。 β-actin担任p62的加载控制。b乐队的光密度分析(一个)表明显著增加p62表达KO-Aging老鼠。c乐队的光密度分析(一个)显示显著降低LC3-II / LC3-I表达式WT-Aging组相比WT-Young组和一个更具戏剧性的减少KO-Aging组。d代表免疫组织化学显微图的LC3B四组确认修改表达式观察到免疫印迹。e免疫印迹乐队EMT标记(钙粘蛋白和α-SMA)和自噬标记(p62和LC3-II / LC3-I) 100年HK-2细胞刺激μM CQ + 20毫克/毫升BSA 24 h (2 h的细胞与CQ prestimulated之前的BSA)。 GAPDH作为加载控制。f- - - - - -我乐队的光密度分析(e)。 相对强度WT-Young组被设置为1。 结果表现为手段±sem。 *P< 0.05,* *P< 0.01,* * *P< 0.001,NS表示组之间没有意义,在分析了图基单向方差分析后的测试(n= 6 - 8为老鼠实验,每组n= 3细胞实验一式三份)
我们的下一个工作HK-2细胞体外构建模型和确认机制。 鉴于蛋白尿增加KO-Aging组与WT-Aging组相比,HK-2细胞刺激了牛血清白蛋白(BSA)和免疫印迹结果表明,刺激20毫克/毫升BSA 24 h管状细胞EMT引起的,这是证明了钙粘蛋白的表达显著降低,增加α-SMA(图的表达式。6 eg),抑制自噬,证明了p62水平显著增加和减少的水平LC3-II /我(无花果。6 e、h、i)。 这些研究结果一致的管状细胞的变化在WT-Aging老鼠体内。 增加100μM CQ(一种自噬抑制剂)除了20毫克/毫升BSA (BSA + CQ集团)造成更戏剧性的增加p62 LC3-II /我的水平(无花果。6 e、h、i),这表明CQ封锁自噬小体融合和退化。 进一步减少钙粘蛋白表达和增加α-SMA表达式(无花果。5比)观察BSA + CQ组与BSA组。 总的来说,这些结果表明,蛋白尿加速管EMT通过阻断自噬在老化的肾脏。
足细胞的C / EBPα过度减轻ADR-induced过早衰老
我们随后的作用和机制进行了探讨C / EBPα在体外的足突细胞衰老。 ADR,导致DNA损伤的化学治疗剂,受雇于一个浓度0.5μM诱导过早衰老10,11足细胞,我们发现C / EBPα的表达水平显著降低在足细胞治疗与ADR(0.5μM ADR组)与足细胞不接受美国存托凭证(对照组)(图7 a、b)。 接下来,我们研究overexpressing C / EBPα能否扭转ADR-induced衰老。 C / EBPα的超表达是通过免疫印迹(图确认。7一个),形态和SA-β-gal染色阳性染色没有明显改变C / EBPα过度(无花果。7 c上一行)。 然而,ADR刺激明显加重衰老表型(无花果。7 c左下角),包括扩大足细胞,增加活动的SA-β-gal(无花果。7 c由箭头表示)和双核或多核的足细胞(无花果。7 c,由三角形表示)和C / EBPα超表达显著减弱这些衰老的形态学特征与SA-β-gal活动积累(无花果。7 c右下角)。
一个免疫印迹分析C / EBPα在永生的小鼠足细胞刺激有或没有0.5μM ADR 24 h与NGFR-C / EBPα或NGFR-vector质粒转染后24 h。b半定量的平均带强度(一个)。 GAPDH作为加载控制。 结果表现为手段±sem。 *P表示两组之间的< 0.05,分析学生的t测试(n为每个组= 3)。c代表光显微图不灭的小鼠足细胞暴露在条件表示(一个),然后接受SA-β-gal染色。 放大倍数=×400。 活动的增加SA-β-gal由箭头表示,和双核或多核的足细胞是由三角形表示
测试是否C / EBPα过度产生一种保护作用对ADR-induced足突细胞衰老,我们确定的蛋白质含量足突细胞标记synaptopodin和nephrin通过免疫印迹,并发现这两个标记的表达显著降低在诱导衰老足细胞(NGFR向量+ ADR)与控制足细胞(NGFR向量+控制)和C / EBPα过度扭转了下降的表达synaptopodin和nephrin (NGFR-C / EBPα+ ADR)(图。8 a、b)。 ADR刺激也显著诱导的表达TGF-β1,PAI-1, NLRP3(无花果。8 c, d),这表明senescence-associated分泌表型(SASP)底部突起12; 然而,这些蛋白的表达明显减少NGFR-C / EBPα+ ADR组相比NGFR向量+ ADR组(无花果。8 c, d)。 此外,ADR刺激诱导的mRNA表达CTGF和VEGFA在足细胞,这种效应是由C / EBPα逆转过度(无花果。8 e)。 此外,C / EBPα过度扭转phospho-AMPK表达减少和增加phospho-mTOR表达引起的ADR(无花果。8 f, g),它可能会显示一个潜在的分子机制。
一个免疫印迹分析synaptopodin和nephrin永生的小鼠足细胞刺激有或没有0.5μM ADR 24 h与NGFR-C / EBPα或NGFR-vector质粒转染后24 h。b半定量的平均带强度(一个)。c免疫印迹分析TGF-β1、PAI-1 NLRP3在永生的鼠标底部突起接受条件表示(一个)。d半定量的平均带强度(c)。emRNA的表达CTGF和VEGFA在四组表示。f免疫印迹分析phospho-AMPK和phospho-mTOR永生的小鼠足细胞暴露在表示条件。g半定量的平均带强度(f)。 结果表现为手段±sem。 GAPDH作为加载控制和NGFR向量中的值+对照组被设置为1。 *P< 0.05,* *P< 0.01,* * *P< 0.001表示组之间,分析了图基单向方差分析后的测试(n= 3一式三份)
讨论
本研究确定了C / EBPα足突细胞衰老的重要性及其对aging-induced肾损伤的影响。 虽然前两项研究报告底层C / EBPα与细胞衰老的关系13,14,据我们所知,这是第一个研究阐明的重要性C / EBPα体内肾损伤。 我们发现podocyte-specific删除C / EBPα足突细胞衰老加速体内,它表现为在足细胞衰老标记物的积累,不稳定的结构,受损的功能,更多的细胞外基质的合成,蛋白尿的增加。 此外,蛋白尿阻力指标EMT也许可以加重通过抑制自噬。 此外,我们确认的C / EBPα保护作用ADR-induced培养小鼠足细胞过早衰老。
提出了细胞衰老是一个不可逆转的状态增长逮捕尽管代谢活动的维护15。 这并不意味着所有永久退出细胞周期的细胞类型,如postmitotic neuron-like足细胞,进行终端分化和展示功能和形态变化过程中分化和成熟,衰老。 在文献中报道16衰老,在体外可分为两种类型,即复制衰老和诱导衰老,这是DNA损伤的结果,如果没有端粒缩短,分别。 前者是有丝分裂造成的,后者是由外生的压力引起的。 足细胞在成年哺乳动物没有增殖能力或完全分化条件下体外。 因为这些细胞退出复制和静止细胞周期意味着,很难模型复制的或基于完全不同的足细胞体外诱导衰老。 因此,我们采用部分分化足细胞,像足细胞在婴儿哺乳动物,保持增殖能力和表达synaptopodin,其中一个最敏感的和特定的标记区分足细胞识别到目前为止17ADR,诱导过早衰老。
我们确定podocyte-specificC / EBPα足细胞的缺失加剧体内按时间顺序的衰老,基因upregulationC / EBPα改善ADR-induced过早衰老表型,包括有丝分裂灾难(MC)和SASP体外。 足细胞需要一个肌动蛋白细胞骨架维持他们复杂的形态结构; 然而,双核或多核的足细胞失去正常的标记和脚的过程。 培养足细胞暴露于ADR退出有丝分裂,成为双核或多核的,接受了衰老。 非整倍体足细胞特性的MC在体外和体内,这表明他们可能会分离,在很短的时间内死亡18。 SASP是一种常见的所有类型的衰老的特征,这些变化包括一些分泌的生产因素,增强细胞的衰老本身或周围的细胞,如纤溶酶原激活物inhibitor-1 (PAI-1),其上游TGF-β112,NLRP3 inflammasome19通过旁分泌和自分泌机制20.。 此外,upregulation足突细胞结缔组织生长因子(CTGF)和血管内皮生长因子(VEGF)——对系膜细胞旁分泌的影响,使他们过度生产基质蛋白,最终导致血管系膜基质积累和肾小球硬化症在慢性肾小球疾病18。 随后,我们测试了这一过程的分子机制。 活化蛋白激酶(AMPK)是一个至关重要的传感器的能量,以及哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR)已被确定为一个senescence-regulated因素。 催化亚基的磷酸化AMPKα1直接使磷酸化mTOR-binding伙伴猛禽,和猛禽磷酸化抑制mTOR活动21。 mTOR复合物是最保守的因素之一参与衰老,和基因多态性与减少mTOR活动与长寿在人类和生物模型22,23,24。 研究人员建议,mTOR促进体内肾衰老25衰老和肾小管上皮细胞在体外26,但很少有报道mTOR在足细胞衰老的影响。 AMPK关闭mTOR复杂参与能量依赖性衰老调控和演示了在这个研究是分子机制的一部分C / EBPα调节足突细胞衰老。
据报道,C / EBPα,除了发挥转录调控作用,影响细胞的命运通过控制核扩散,包括p21的诱导和稳定CIP1 27的直接相互作用和抑制激酶cdk2和到28,E2F-Rb复合物29。 这些分子标记p53-Rb衰老的途径也很重要。 我们的足细胞培养实验显示,这些标记物的表达引起的ADR,但C / EBPα超表达没有影响这些标记物的水平(数据没有提供)。 此外,我们发现在老化条件下,足细胞的信使rna和蛋白质水平的标记,nephrin, podocin, synaptopodin, WT-1,之间存在着显著的差异与基因敲除/ C /超表达EBPα体内和体外; 然而,C / EBPα对四足突细胞标记的影响是轻微的和没有意义的蛋白质和年轻的老鼠的mRNA水平。 这些发现表明,C / EBPα的影响四个标记senescence-dependent和年轻和老化条件下通过不同的分子机制。 考虑到C / EBPα促进新陈代谢和抑制巨噬细胞的炎症30.,31代谢和炎症性疾病是重要的促进细胞衰老的机制,我们假设C / EBPα抑制足突细胞衰老通过调节代谢和炎症,我们随后证实了这一科学假说。 我们表明,C / EBPα足突细胞衰老通过调节机制与代谢(AMPK / mTOR通路在这项研究)或炎症(NLRP3 inflammasome在这项研究),但不与细胞周期蛋白或p53-Rb通路。 然而,目前尚不清楚哪些基因被C / EBPα直接转录调控,转录因子,减轻足突细胞衰老。
C57BL / 6小鼠可能是一个适当的模型为研究肾脏衰老,因为他们,像人类一样,不发展蛋白尿在生理衰老,而是显示功能肾单位的损失为主要表型32。 终末分化细胞的增殖能力,足细胞老化肾中发挥核心作用33。 最近的观察表明,足突细胞耗竭导致各种glomerulopathies肾小球硬化症,如糖尿病性肾小球硬化症、IgA肾病,高血压肾小球硬化症34,紧随其后的是后续的管状损伤和间质纤维化35。 C / EBPα专门淘汰后在足细胞在我们的研究中,大量蛋白尿,伴随着更大的足突细胞衰老和损耗发生在衰老小鼠。 因此,我们认为足突细胞衰老是体内肾小球硬化症的启动过程和肾小管损伤。 随后,我们验证的机制之一,足突细胞衰老导致肾小管损伤采用HK-2细胞体外培养; 白蛋白过载的原因和自噬抑制是其机制。 管状细胞是上皮细胞与高能量消耗和高水平的本构自噬,自噬减少老化32。 自噬抑制增强肾小管细胞凋亡和间质纤维化8。 因此,我们主要关注自噬,发现自噬活动是减少与增加管EMT在衰老小鼠和BSA-stimulated HK-2细胞,增强了EMT BSA的感应CQ体外抑制自噬。
总之,我们的研究结果发现C / EBPα在足细胞足突细胞衰老和肾内稳态的关键因素在衰老,和AMPK / mTOR途径的分子机制。 此外,我们表明,老龄化带来的管状加重EMT蛋白尿和自噬活动下降。 研究结果报道在此不仅可能相关的时间顺序老化动物,而且过早衰老,这些见解可能为治疗和预防提供新的方法肾损伤衰老的进程。