摘要
抑制性受体PD-1、Tim-3和Lag-3在肿瘤浸润淋巴细胞上高度表达并损害其抗肿瘤活性。为了有效的癌症免疫治疗，重要的是防止嵌合抗原受体细胞衰竭。在这里，我们同时下调了细胞上的这三个检查点受体，这表明产生的PTL细胞经历表观遗传修饰并更好地控制肿瘤生长。此外，我们意外地发现PTL-卡尔-T细胞的肿瘤浸润增加，并且它们聚集在活的和坏死的肿瘤组织之间。从机制上讲，PTL-卡尔-T细胞上调CD56 (NCAM)，CD56对其效应器功能至关重要。细胞间CD56分子间的嗜同性相互作用与细胞浸润增强、干扰素γ分泌增加和细胞存活延长相关。异位表达的CD56促进细胞存活和抗肿瘤反应。我们的发现表明，对三种检查点抑制受体的基因阻断以及由此导致的CD56在CAR-T细胞上的高表达增强了对肿瘤生长的抑制。
介绍
肿瘤浸润淋巴细胞最终进入衰竭状态，丧失抗肿瘤功能。这种现象很大程度上是由于各种抑制性受体在其表面接收负信号1,2。已经鉴定出许多抑制性共受体，包括CTLA-4、帕金森-1、蒂姆-3、拉格-3、提格雷、CD160、维斯塔和2B43,4,5,6,7,8,9,10其表达在不同的肿瘤微环境中上调11。PD-1和相应配体PD-L1的相互作用导致含有Src同源结构域的磷酸酶1 (SHP1)和SHP2的募集，这促进CD28细胞质结构域的去磷酸化，并最终通过信号级联上调BATF表达12,13。处于衰竭状态的T淋巴细胞不能杀死靶细胞，缺乏多种细胞因子的分泌，包括干扰素-γ (IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、白细胞介素-2 (IL-2)等。它们有特定的表观遗传和染色质结构变化14,15。共抑制受体和相应配体的阻断显著增强了TILs的抗肿瘤活性。最近针对共抑制分子如PD-1或CTLA-4的抗体治疗的临床成功强调了抵抗免疫抑制的治疗潜力16,17。
嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)已经发挥了强有力的抗肿瘤活性。尽管它们有效地根除了白血病/淋巴瘤细胞并导致了令人印象深刻的临床成功，但它们对实体肿瘤的抑制作用却受到了损害18。癌细胞与靶向共抑制分子的抗体的结合，或PD-1在癌细胞上的表达敲除或其他内在阻断，已经发挥了增强的抗肿瘤活性19,20,21,22。最近，人们已经做出了更多的努力来提高抗肿瘤活性，包括白细胞介素-7和CCL19、乙酰肝素酶、白细胞介素-12或CCR2b在CAR-T细胞中的共表达23,24,25,26,27。然而，它们对患者抗肿瘤活性的增强作用仍有待确定。迫切需要有更多的策略来提高细胞的抗肿瘤效果。
已经表明PD-1、Tim-3和Lag-3在各种实体肿瘤类型的TILs上高度表达4,28,29,30,31，以及CD8+慢性病毒感染期间的t细胞32,33。在本研究中，我们通过短发夹状核糖核酸(shRNA)簇同时降低了细胞中PD-1、Tim-3和Lag-3的表达，并发现这种处理显著增强了抗Her2的作用+Her2特异性CAR-T细胞的实体瘤效应。我们发现PTL-Her2-CAR-T细胞向异种移植肿瘤组织的浸润显著增加。进一步的研究表明CD56分子在这些PTL-Her2-CAR-T细胞上上调，细胞间CD56分子间的亲嗜性相互作用能有效增强抗肿瘤活性和延长生存期。
结果
PTL-赫尔2-CAR-T细胞发挥了强有力的抗肿瘤活性
首先，我们在慢病毒载体中构建了对Her2具有特异性细胞毒性的Her2特异性CAR+人卵巢癌SKOV3细胞(补充图1)，及其与sh-PD-1、sh-Tim-3、sh-Lag-3或加扰shRNA之一的组合(补充图2a)。在我们的研究中使用了shRNA而不是sgRNA引导的CRISPR-CAS9，因为这些基因的表达减少而不是完全失活可能更有利于T细胞在肿瘤微环境中的存活，因为它们具有其他必需的功能34,35,36。PD-1、Tim-3和Lag-3的特异性shRNA簇导致对其靶基因的mRNAs的显著抑制(补充图。2b)。在证实每种抑制性受体下调的Her2特异性CAR-T细胞具有更高的Her2特异性细胞毒性后(补充图2c，d)，我们产生了携带三种共抑制分子的shRNA簇的Her2特异性CAR-T细胞，后来命名为PTL-Her2-CAR-T细胞。与对照Her2-CAR-T细胞相比，在PTL-Her2-CAR-T细胞中发现所有三种受体的敲除效率超过80%(补充图3a)。三种抑制性受体的联合下调同时发挥了比基于细胞毒性和γ干扰素分泌的单或双抑制性受体的下调更大的协同作用(补充图3b，c)。此外，将PTL-Her2-CAR-T细胞和对照CAR-T细胞分别给予含SKOV3的NOD-Prkdc锡特Il2rg空(NSG)小鼠通过单一静脉注射(图1a)。观察到PTL-Her2-CAR-T细胞具有更强的抗肿瘤活性(图1b)。重要的是，用PTL-Her2-CAR-T细胞处理的小鼠的存活率显著提高(图1c)并且在这些小鼠的正常组织中发现非特异性浸润(补充图4)。当CD19+将携带Raji的NSG小鼠注射携带三种共抑制分子(PTL-CD19-CAR-T细胞)的shRNA簇的CD19特异性CAR-T细胞(补充图。5)。尽管在体内不同时间点抑制受体对PTL-卡尔-特细胞的持续下调(补充图6)，在异种移植肿瘤组织中，PTL-Her2-CAR-T细胞的浸润和干扰素-γ分泌显著升高(图1)。1d，e)。此外，为了测试持续的长期PTL-卡尔-T细胞的体内功能，我们在第28天进行了肿瘤再激发实验，之后递送了双剂量卡尔-T细胞，以确保在常规的her 2-卡尔-T细胞治疗组中可以有效地抑制肿瘤。我们发现，在PTL-卡尔-T细胞治疗组中发生了对肿瘤再攻击的有效控制，而在赫尔2-卡尔-T细胞治疗组中仅发生了对肿瘤的微弱控制(图1)。1f)。
PTL-Her2-CAR T细胞在肿瘤组织中发挥了强有力的抗肿瘤活性和浸润作用。a的完整动物实验示意图b,c。将SKV3/Luc细胞皮下接种到NSG小鼠中。7天后，通过尾部注射注入各种细胞，并将GP120细胞用作模拟细胞。所有小鼠每周在IVIS进行一次分析(n= 3，GP120-CAR-T组；n= 8，其他组)。b肿瘤负荷随时间推移显示每只小鼠量化的生物发光信号。黑十字意味着虚弱老鼠的死亡或杀死。c卡普兰——小鼠迈耶存活率分析。d,e将SKOV3细胞皮下接种到NSG小鼠体内。七天后，通过尾部注射(n= 3，适用于GP120-CAR-T组和n =其他组5)。在细胞输注后的第28天，从小鼠体内切除肿瘤组织，然后进行消化和流式细胞仪分析。d肿瘤中浸润细胞的百分比。e左图显示了干扰素-γ阳性细胞的代表性流式细胞术分析；右图显示了不同组间肿瘤浸润性细胞中干扰素γ阳性细胞的百分比。f上图显示了SKV3/Luc肿瘤再激发试验的示意图。将SKV3/Luc细胞皮下接种到NSG小鼠的相对半球。七天后，2 × 106通过尾部注射(n=每组4)。在细胞输注后的第28天，用第二次接种SKV3/Luc细胞对长期存活的小鼠进行再次攻击。另外三只NSG小鼠接种并用作阳性对照。黑十字意味着虚弱老鼠的死亡或杀死。*P %3C0.05，**P %3C0.01 * * *P %3C0.0001。ns，无显著差异(单向方差分析与图基的事后检验(d,e)；对数秩曼特尔-考克斯检验(c))。所有数据均指扫描电镜。显示的数据代表两个独立的实验。底层的源数据b–f作为源数据文件提供
据报道，高效诱导CD62L和CD127高表达的中央记忆表型对于免疫治疗中肿瘤的持续控制是必不可少的37,38。然后，我们检测了异种移植小鼠中CAR-T细胞可能的记忆表型，这些小鼠在过继转移后存活了60天。在我们的实验中还引入了Her2-CAR-T细胞和对照GP120-CAR-T细胞。人类CD8+与对照组相比，用PTL-Her2-CAR-T细胞处理的小鼠脾脏中的T细胞高度积累(补充图7a)。我们进一步确定CD62L+CD127+用PTL-Her2-CAR-T细胞处理的小鼠脾脏中的CAR-T细胞明显高于用常规CAR-T细胞处理的小鼠脾脏中的CAR-T细胞(补充图7b)。
来自用PTL-Her2-CAR-T细胞处理的小鼠的异种移植肿瘤组织的组织切片也显示了增强的CAR-T细胞浸润和在该边缘区域广泛的干扰素-γ释放(图1)。2a，b)。在所有移植的肿瘤组织切片中的免疫荧光染色进一步证实，与其他CAR-T细胞治疗组相比，PTL-Her2-CAR-T细胞显著增加了浸润。在这些细胞周围和内部，也观察到大量干扰素γ的释放(图2c，d和补充图8)。鉴于γ-干扰素在诱导肿瘤细胞凋亡中的重要作用39,40可以合理地假设附近经历凋亡的肿瘤组织可能是聚集在活肿瘤组织内的CAR-T细胞的受害者。
PTL-赫尔2-卡氏细胞增强了肿瘤组织的浸润。用各种细胞处理携带SKOV3的小鼠细胞。在输注CAR-T细胞后的第28天，杀死小鼠并从小鼠中切除肿瘤组织，并用苏木精和伊红(苏木精-伊红)、免疫组织化学(IHC)或免疫荧光染色进行染色。a肿瘤组织切片的苏木精-伊红染色。右侧面板分别从左侧的框(左侧，比例尺200m；右侧，比例尺50米)。b抗人CD3抗体和抗人干扰素-γ抗体用于IHC分析中的初级染色(比例尺，200米)。c肿瘤冷冻组织切片的免疫荧光染色。卡氏细胞用抗小鼠IgG H&L(阿列克谢·弗洛488)染色，干扰素-γ用抗人干扰素-γ(阿列克谢·弗洛647)染色。凋亡细胞用TUNEL法染色，细胞核用DAPI法染色。比例尺，20米。显示的图片代表两个独立的实验。d左侧面板，汽车的百分比+每毫米t细胞2发现于不同的抗逆转录病毒治疗组；右侧面板，干扰素-γ的百分比+每毫米斑点数2在不同的群体中发现。计算每只小鼠的至少三个独立的场和每组的三只小鼠。****P %3C0.0001。ns，无显著差异(单向方差分析与图基的事后检验(d))。所有数据均指扫描电镜。显示的数据代表两个独立的实验。底层的源数据b–f作为源数据文件提供
CD56介导细胞间的嗜同性相互作用
基于上述观察结果，我们假设PTL-Her2-CAR-T细胞的细胞间粘附或相互趋化性可能是增加浸润的关键因素。为此，我们分别比较了从肿瘤组织中分离的PTL-Her2-CAR-T细胞和Her2-CAR-T细胞之间的基因表达谱。基因本体富集分析显示一些趋化因子家族成员显著增加，如cxcl9,cxcl10，和cxcl12尤其是细胞粘附因子，CD56（NCAM,神经细胞粘附分子)在从肿瘤组织分离的PTL-赫尔2-CAR-T细胞中(图3a)，通过定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)分析进行验证(图3b)。此外，PTL-Her2-CAR-T细胞还显示编码效应分子的多个基因的表达增加，例如干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α和Bcl-2(图1)。3c)。通过ATAC序列技术，我们发现一些基因位点上调了异种移植肿瘤PTL癌抗原提呈细胞的基因表达，包括ifng(Chr12: 68，154，768-68，159，747)，tnfa(Chr6: 31，575，567-31，578，336)，以及cxcl12(Chr10: 44，370，165-44，386，493)，bcl2(Chr18: 63，123，346-63，320，128)，以及CD56(Chr11: 112，961，247-113，278，436)，显示出高得多的峰，表明许多功能基因的染色质可及性发生了显著变化(图3d)。
CD56的增加是PTL-Her2-CAR-T细胞聚集的关键因素。a–d,f,g通过尾部给携带SKOV3的NSG小鼠注射各种细胞因子。细胞输注后28天，切除肿瘤组织。每个组织被分成两部分。消化其中一部分，分离肿瘤浸润性癌细胞的核糖核酸序列(a)、快速反应堆–聚合酶链反应(b,c)，ATAC序列(d)，另一个用于免疫荧光染色(f)。a热图显示z-对参与细胞粘附和趋化性的差异表达基因的标准化表达进行评分，这些差异表达基因显著丰富了基因本体(GO)的生物学过程术语P-值%3C 0.001。高表达水平和低表达水平分别用红/绿标度表示。b,c基因的相对基因表达水平通过定量逆转录聚合酶链反应进行验证。d显示基因开放染色质的标准化ATAC序列数据的基因组比对轨迹ifng,tnfa，和cxcl12,bcl2，和CD56在不同的细胞中。ePTL-Her2-CAR-T的细胞毒活性(n= 3，3个健康供体)细胞，CD56敲除SKOV3细胞和丙二醛-甲基溴-231(阴性对照)。f肿瘤冷冻组织切片的免疫荧光染色。用抗小鼠IgG H&L(绿色)染色卡氏细胞。CD56用抗人CD56(白色)染色，干扰素-γ用抗人干扰素-γ(红色)染色。细胞核被DAPI染色(蓝色)。比例尺，20米。g左侧面板，汽车的百分比+每毫米t细胞2发现于不同的抗逆转录病毒治疗组；中间面板，CD56的百分比+每毫米细胞数2在不同的群体中；右侧面板，干扰素-γ的百分比+每毫米斑点数2在不同的小组里。计算每只小鼠至少三个独立的场，每组三只小鼠。*P %3C0.05，**P %3C0.01，* * * *P %3C0.001 * * *P %3C0.0001。ns，无显著差异(单向方差分析与图基的事后检验(e,g)；双尾学生的t-测试(b，c))。所有数据均指扫描电镜。b,c,e所示数据是来自三个独立实验的代表性数据(a,d,f)来自两个独立的实验。底层的源数据b,c,e和g作为源数据文件提供
为了确定导致PTL-Her2-CAR-T细胞抗肿瘤活性增加的关键因素，我们进一步分别敲除了与细胞间粘附或趋化性相关的上调因子。只有CD56下调的PTL-Her2-CAR-T细胞在体外显示显著降低的细胞毒性活性(图3e和补充图9)，表明CD56的增加在增强抗肿瘤活性中起关键作用。此外，我们通过在异种移植物来源的组织切片中对人CD56、CD3和干扰素-γ进行染色来进行免疫荧光，并发现CD56+细胞与浸润的CD3强烈共定位+-PTL-Her2-CAR-T细胞和干扰素-γ分泌(图3f，g和补充图10)。在PTL CD19-CAR-T细胞中也观察到CD56的类似上调，其渗入CD19+拉吉肿瘤组织(补充图11)。然而，尽管用Her2-CAR-T细胞加抗PD-1阻断抗体的治疗也发挥了增强的抗肿瘤作用，但是CD56分子在Her2-CAR-T细胞上的表达没有显著变化(补充图12)。综上所述，这些结果表明PD-1、Tim-3和Lag-3的三重下调导致CD56的上调和PTL-Her2-CAR-T细胞在肿瘤组织中的增强浸润可由CD56介导。CD56的亲同性相互作用在神经系统中已经得到了很好的研究41,42。CD56的Ig1和Ig2模块介导位于同一细胞表面的CD56分子的二聚化(独联体相互作用)，而Ig3模块介导在相对细胞表面表达的CD56分子之间的相互作用(trans相互作用)通过同时结合Ig1和Ig2模块42,43。我们假设CD56的细胞间嗜同性相互作用可能有助于PTL-Her2-CAR-T细胞的相互作用。因为CD56 Ig3结构域的Lys303和Phe305介导了transCD56在相对细胞表面的相互作用41,42，我们插入了CD56或者CD56带有突变K303A和F305A，此后命名为CD56mut，进入Her2-CAR表达载体。CD56在Her2-CAR-T细胞中的过表达在体外显示出增强的抗肿瘤活性，而CD56mut没有(图1)。4a)。此外，在采用转移到携带SKOV3的NSG小鼠实验中，CD56过表达的Her2-CAR-T细胞显示出显著增强的抗肿瘤能力，而CD56mut的过表达没有(图1)。4b)。此外，肿瘤组织中表达CD56的细胞浸润和干扰素-γ分泌明显高于表达CD56mut的细胞(图1)。4c)，表明CD56的亲同作用对Her2-CAR-T细胞的浸润、存活和抗肿瘤活性很重要。
CD56的亲同作用介导了细胞间的相互作用。a用乳酸脱氢酶释放法检测CD56对Her2-CAR-T细胞靶向SKOV3细胞细胞毒活性的影响，以丙二醛-甲基溴-231细胞为阴性对照(n= 3，3名健康捐赠者)。b,c分别用CD56-Her2-CAR-T细胞或CD56mut-Her2-CAR-T细胞经尾部注入携带SKOV3的NSG小鼠。监测肿瘤，6天后切除肿瘤组织并消化进行流式细胞术。b小鼠体积(n= 6，CD56mut-Her2-CAR-T组；n =4、CD56-Her2-CAR-T组)。c左图，通过用抗Fab抗体检测癌细胞部分的单链抗体片段，对肿瘤浸润的癌细胞进行代表性流式细胞术分析。右图，不同组肿瘤浸润细胞中γ-干扰素阳性细胞的百分比。d左侧面板，细胞间CD56间FRET分析示意图。右图，CFP(青色荧光蛋白)-CD56-表达CD8之间的FRET增加+t细胞和表达YFP(黄色荧光蛋白)-CD56的CD8+t细胞(n= 3，3名健康捐赠者)。表达CFP CD56的CD8+与表达YFP-PD-1的CD8混合的t细胞+t细胞被测量为阴性对照。e分别携带Her2-CAR-T部分和SrtA-CD56、G5-CD56或G5-CD56mut的慢病毒载体的构建。f直方图显示G5-CD56-Her2-CAR T细胞或G5-CD56mut-Her2-CAR T细胞(指示细胞间转移)中的共轭阿列克谢弗罗488。以含有G5-帕金森病-L1细胞的SrtA-帕金森病-1细胞作为阳性对照，以含有G5-CD56-Her2-CAR T细胞的SrtA-帕金森病-1细胞作为阴性对照。数据代表三个独立的实验。g体内LIPSTIC分析程序。h左图显示通过流式细胞术分析肿瘤中G5-CD56-Her2-CAR T细胞或G5-CD56mut-Her2-CAR T细胞(CFSE标记)的生物素标记。右图显示生物素的百分比+G5-Her2-CAR T细胞门控，如左侧面板所示(n =每组3个)。*P %3C0.05，**P %3C0.01(图基事后测试的单向方差分析(a,d)；双尾学生的t-测试(b,h))。所有数据均指扫描电镜。（a,d,f)所示数据是来自三个独立实验的代表性数据，并且(b,c,h)来自两个独立的实验。底层的源数据a,b,d和h作为源数据文件提供
寻找CD56之间嗜同性相互作用的更多证据+我们产生了表达CFP CD56和YFP CD56的载体，并将其转化为CD8+t细胞分开。我们发现CFP CD56和YFP CD56之间荧光共振能量转移的发射率显著增加，表明CD56的亲同作用发生在细胞间(图2)。4d)。此外，我们引入了“通过细胞间接触分类标记免疫伙伴关系”系统，以酶法测量CD56-CD56嗜同性相互作用44。将与G5-CD56或SrtA-CD56共表达Her2-CAR的双顺反子载体转导至CD8+通过细胞培养中的LIPSTIC标记分别证实了t细胞和CD56-CD56的相互作用(图4e，f)。然后我们采用共转移携带G5-CD56或SrtA-CD56的Her2-CAR-T细胞到携带SKOV3的NSG小鼠，随后在72小时后进行LIPSTIC标记(图1)。4g)，并且发现LIPSTIC标记在肿瘤浸润的G5-CD56-ⅰ-CAR T细胞上，而不在G5-CD56 mut-ⅰ-CAR T细胞上，这直接证实了CD56-CD56在体内CAR-T细胞之间的分子间相互作用(图。4h)。
CD56的亲同作用增强了抗肿瘤活性
据报道，P3DE或P3G肽能有效阻断CD56的亲同作用42。因此，我们研究了这些合成肽对内源性CD56嗜同性相互作用的影响，以及随后对PTL-Her2-CAR-T细胞活性的影响。FRET试验表明P3DE和P3G联合治疗抑制CD8中CD56-CD56的相互作用+t细胞呈剂量依赖性(图5a)。用这些肽而不是对照P3B肽处理后，PTL-Her2-CAR-T细胞的特异性细胞毒性从46.18%降低到6.19%(图1)。5b)。因此，干扰素-γ分泌水平也受到显著损害(图5c)。此外，通过单次静脉注射，将PTL-赫尔2-CAR-T细胞输注到用封闭肽(P3DE + P3G)或对照肽治疗的携带SKOV3的NSG小鼠中。我们发现阻断肽显著削弱了PTL-Her2-CAR-T细胞的抗肿瘤浸润和干扰素-γ分泌能力(图5d–h和补充图13)。
CD56的亲同作用增强了细胞的抗肿瘤活性。a图表显示了CFP CD56和YFP CD56之间的FRET排放比率。数据绘制为500~550纳米/495~505纳米比与P3DE + P3G肽浓度的关系。b,c用细胞毒活性(n= 4，4名健康捐赠者) (b)和IFN-γ酶联免疫斑点试验(n= 2，2名健康捐赠者)c)。所有肽均以200微克/毫升的浓度使用—1。d–h携带SKOV3的NSG小鼠通过尾部注入各种细胞。接受PTL-Her2-CAR-T细胞输注的小鼠被分成两组，分别用P3DE + P3G或PNC肽。十三天后，杀死小鼠，消化肿瘤组织进行流式细胞术。d老鼠的体积(n=每组4-5只小鼠)。e典型的流式细胞术通过用抗Fab抗体检测CAR部分的单链抗体片段来分析CAR-T细胞。f不同组肿瘤浸润细胞中γ-干扰素阳性细胞的代表性流式细胞术分析。g在P3DE + P3G肽或PNC存在下，用PTL-Her2-CAR-T细胞处理的异种移植肿瘤冷冻组织切片的免疫荧光染色。用抗小鼠IgG H&L(绿色)染色卡氏细胞。CD56用抗人CD56(白色)染色，干扰素-γ用抗人干扰素-γ(红色)染色，细胞核用DAPI(蓝色)染色。比例尺，20米。h左侧面板，汽车的百分比+每毫米t细胞2发现于不同的抗逆转录病毒治疗组；中间面板，CD56的百分比+每毫米细胞数2在不同的群体中；右侧面板，干扰素-γ的百分比+每毫米斑点数2在不同的小组里。计算每只小鼠的至少三个独立的场和每组的三只小鼠。**P %3C0.01，* * * *P% 3C 0.001 * * *P%3C 0.0001。ns，无显著差异(单向方差分析与图基的事后检验(b,d)；双尾学生的t-测试(c,h))。所有数据均指扫描电镜。底层的源数据a–d和h作为源数据文件提供
CD56增强PTL-Her2-CAR-T细胞的抗凋亡能力
由于Bcl-2在PTL-Her2-CAR-T细胞中的表达较高，我们测量了携带外源CD56的PTL-Her2-CAR-T或Her2-CAR-T细胞的抗凋亡能力，并发现PTL-Her2-CAR-T细胞和携带外源CD56的Her2-CAR-T细胞的凋亡细胞百分比远低于常规的Her2-CAR-T细胞(图1)。6a)。肿瘤坏死因子-α和FasL诱导的细胞凋亡(10 ng·ml—1)在PTL-Her2-CAR-T细胞和携带外源CD56的Her2-CAR-T细胞中也显著低于Her2-CAR-T细胞(图1)。6b)。这些数据表明CD56的表达增强了细胞的抗凋亡能力。
CD56增强了细胞的抗凋亡能力。a左图为细胞因子缺失培养6天后Her2-CAR-T、PTL-Her2-CAR-T和CD56-Her2-CAR-T细胞中凋亡细胞比例的代表性流程图。右侧面板，膜联蛋白ⅴ的百分比−和个人信息−如左侧面板中一样门控的单元。b左图，肿瘤坏死因子-α和FasL诱导的凋亡细胞比例的代表性流程图(10 ng ml—1)存在于不同的细胞中。右侧面板，膜联蛋白ⅴ的百分比−和个人信息−像左边的面板一样选通单元格。**P% 3C 0.01 * * *P%3C 0.0001(双尾学生t-测试)。所有呈现的数据总结了平均扫描电镜。显示的数据是来自三个独立实验的代表性数据。底层的源数据a,b作为源数据文件提供
讨论
CD56，也称为NCAM，在神经元生长、发育、再生、突触形成和维持中起着关键作用41,42,43。此外，CD56是自然杀伤细胞的典型细胞表面标志。更多的研究表明CD56也在其他淋巴细胞上检测到，包括γδT细胞和活化的CD8+t细胞，以及树突状细胞45,46,47。CD56通常与免疫细胞的活化或细胞毒性有关48,49,50,51。据报道，人CD56阳性细胞毒性淋巴细胞更具活性，并发挥更强的抗肿瘤作用52。人类CD56高的自然杀伤细胞能够产生更多的细胞因子，如干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α等。53。不幸的是，由于小鼠自然杀伤细胞中CD56的表达很低，尚不清楚为什么CD56的高表达与干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α的更多激活和高分泌相关。尽管体外研究表明CD56+自然杀伤细胞和CD56+基质细胞可能有助于自然杀伤细胞的运动，其分子机制仍有待确定54。
通过研究癌细胞在肿瘤组织中浸润和抗肿瘤活性增加的机制，我们证明了在PD-1、Tim-3和Lag-3同时表达减少后，癌细胞上出现了大量CD56。这种三重下调，而不是单次下调PD-1的表达，导致CAR-T细胞的表观遗传修饰，增加了细胞染色质的可及性CD56基因，以及一些重要基因，包括IFN-γ、TNF-α和Bcl-2，并随后增强它们的转录表达。此外，包括CXCL9、CXCL10和CXCL12在内的多种趋化因子通过肿瘤浸润的PTL细胞的全基因组转录谱上调。然而，在初步的体外试验中，我们没有发现PTL-卡尔-T细胞的任何增强迁移(数据未显示)。尽管如此，这些趋化因子仍有可能在肿瘤组织内的PTL-卡尔-T细胞相互吸引中发挥作用，并促进PTL-卡尔-T细胞的活性。
CD56在细胞中的过表达也具有很强的抗肿瘤作用。此外，细胞间CD56嗜同性相互作用的阻断，无论是通过阻断肽还是CD56在嗜同性相互作用界面上的突变，都显著降低了抗肿瘤效果。因此，通过比较CD56表达与否的抗肿瘤作用，以及肿瘤组织中附加的抗肿瘤作用、干扰素-γ分泌、抗凋亡性和CAR-T细胞的浸润或存活，我们揭示了CD56嗜同性相互作用的重要性。这种嗜同性相互作用可通过(1)导致局部高得多的干扰素-γ浓度而有益于肿瘤杀伤效果，干扰素-γ会损害局部血管生成并因此诱导肿瘤细胞死亡39,40；(2)将存活信号通过CD56分子传递给彼此，这可能导致CAR-T或其它CD56+免疫细胞更能抵抗当地恶劣的环境；(3)同步CD56的其他未知功能+免疫细胞通过可能的信号途径，如Fyn/黏着斑激酶/ERK2、Ras丝裂原活化蛋白激酶、磷脂酶Cγ、spectrin/CaMKII、spectrin/PKCβ、PAK1、RPTPa或TrkB，作为NCAM (CD56)在神经组织中的亲同作用43,55,56。
用一种不寻常的方法，我们意外地鉴定了CD56在免疫细胞中高表达的效果。需要更多的研究来进一步揭示PD-1、Tim-3和Lag-3的同时敲除是如何导致活化的机制CD56基因，以及细胞间CD56分子的嗜同性相互作用如何能直接增强干扰素-γ的分泌和对凋亡的抵抗。此外，如我们在这项工作中所描述的，CD56表达的操纵可能是根除各种实体肿瘤和控制许多其他疾病的特别合适的治疗策略。
方法
细胞系
HEK293T、SKOV3和MDA-MB-231细胞系从ATCC获得，并在杜尔贝科改良的鹰培养基(加利福尼亚州吉布科、Invitrogen、卡尔斯巴德)中培养，该培养基补充有10%胎牛血清(加利福尼亚州吉布科、Invitrogen、卡尔斯巴德)。通过用携带荧光素酶-IRES-RFP部分的重组逆转录病毒感染SKV3，然后分选RFP，建立SKV3/Luc/RFP细胞高的细胞。拉吉细胞也从ATCC获得，并于1640年在RPMI(吉布科、Invitrogen、卡尔斯巴德、加利福尼亚州)培养，补充10%胎牛血清(吉布科、Invitrogen、卡尔斯巴德、加利福尼亚州)。所有细胞培养基含有100微升—1青霉素和100微克毫升—1链霉素。细胞保持在含5%一氧化碳的潮湿环境中2作为分别高表达Her2或CD19的常规细胞系，SKOV3和Raji细胞系用于卵巢癌或淋巴瘤的肿瘤模型。确认细胞系表面表达靶抗原，并常规检测排除支原体污染。
人原代T淋巴细胞的分离培养
外周血单核细胞(PBMCs)来源于健康志愿者的样品，样品来自健康献血者(广州血液中心，广州)的匿名血沉棕黄层。初级人类CD8+用磁珠从富集集DM (BD-IMag)的多溴环十二烷中对t细胞进行负纯化，纯度为%3E98%TM)。抗CD3 (R&D系统)和抗CD28 at (R&D系统)抗体(Abs)1μg·ml激活t淋巴细胞—1并在后连接蛋白包被的平板中感染(日本志贺高田生物有限公司)。转导的T细胞在含有90% RPMI 1640(吉布科，Invitrogen，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)的条件培养基中扩增，该培养基补充有10% FBS(吉布科，Invitrogen，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、0.1毫摩尔非必需氨基酸(吉布科，Invitrogen，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、2毫摩尔谷氨酸(吉布科，Invitrogen，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)和0.05毫摩尔2-巯基乙醇，初始浓度为1 × 106每毫升细胞数。每周给细胞喂两次重组白细胞介素-2 (10纳克毫升—1)(R&D系统公司)。
编码CAR的慢病毒载体的构建
抗Her2单链抗体来源于单克隆抗体FRP557抗CD19单链抗体来源于单克隆抗体FMC6358。如补充图所示1a单链抗体区域与CD28的内结构域融合(核苷酸460–660；GenBank登记号NM_006139.3)，CD137(核苷酸640–765；纳米_001561.5)和CD3ζ(核苷酸160–492；重叠聚合酶链反应。GP120-CAR，特异性靶向HIV-1 gp 120抗原59，被用作模拟汽车试验细胞。补充图中显示了携带Her2特异性CAR部分和衍生自miR-106b簇的shRNA的慢病毒载体。2a。siRNA序列列于补充表1。
重组慢病毒颗粒的转导
为了产生假型慢病毒上清液，在转导的前一天，以8 × 10接种HEK293T细胞6每100毫米培养皿中的细胞。24小时后，按照制造商的说明，用编码不同CAR部分(13.5 μg)、编码VSV-G包膜(7.5 μg)的pMD.2 G和包装载体psPAX2 (16.5 μg)的质粒共转染HEK293T细胞，产生假病毒。48小时后收集上清液，并通过0.45微米膜过滤以除去细胞碎片。假病毒通过超速离心(Optima XE-100，贝克曼)浓缩至827，000倍g在4℃下放置2小时，然后激活CD8+t淋巴细胞用慢病毒上清液用反向连接蛋白包被的平板转导，聚芳烃(TR-1003-G，西格玛)为8微克/毫升—1随后在350 ×下离心90分钟g然后在37℃孵育12小时后，除去重组病毒，并如上所述在条件培养基中扩增T细胞。在白细胞介素-2存在下，将基因修饰的T细胞维持在完整的T细胞培养基中(每周两次，10纳克毫升—1)并用于转导后14天的功能测定。
核糖核酸分离和定量逆转录聚合酶链反应
总核糖核酸用TRIZOL试剂(Life Technologies)分离，并根据制造商的说明，用引物反转录试剂盒(TaKaRa)作为制备cDNA的模板。补充表中列出了实时定量逆转录聚合酶链反应引物2。定量聚合酶链反应是在CFX96实时系统(Bio-Rad)上用SYBR预混物ExTaq试剂盒(TaKaRa)进行的。测量人甘油醛-3-磷酸脱氢酶作为内源性对照。
流式细胞术
CAR部分用驴抗小鼠Fab (Abcam，150109)标记。对于T细胞表型，使用了下列抗体:小鼠抗人PE-CD8(克隆HIT8a，12-0089-42)，eBiosciences的APC-CD56(克隆TULY56，17-0566-42)；来自Biolegend的小鼠抗人APC-CD279(克隆EH12.2H7，329908)、FITC-CD223(克隆11C3C65，369308)、亮紫421-CD127(克隆A019D5，351310)、PE/cy7-CD62L(克隆DREG-56，304822)、PE-生物素(克隆1D4-C5，409003)；和小鼠抗人亮紫421-Tim-3(克隆7D3 (RUO)，565562)。对于细胞内染色，按照制造商的建议，使用BD细胞固定/细胞渗透试剂盒固定和渗透T细胞。抗人CD8-PE(克隆HIT8a，eBiosciences，12-0089-42)和驴抗小鼠Fab(多克隆，Abcam，ab150109)用于细胞外染色，抗人IFN-γ-EFLo 450(克隆4 S.B3，85-48-7319-42，eBiosciences)用于细胞内染色。染色样品在BD FACSAria上采集，并使用FlowJo软件(树星、阿什兰或手术室)进行分析。
酶联免疫吸附试验
在96孔板(垂直底部)中，以5∶1(电∶热比)将各种细胞与靶细胞共培养。16小时后收集上清液，并根据制造商说明使用肿瘤坏死因子-α-(新生物科学)和白细胞介素-2-(多科学)特异性酶联免疫吸附测定试剂盒分析细胞因子释放。
酶联免疫吸附斑点
对于酶联免疫吸附斑点(ELISpot)测定，将CAR-T细胞与靶细胞混合(104细胞)，然后从人干扰素-γ酶联免疫斑点检测试剂盒(DKW22-1000-096s；Dakewei)，以及阴性对照(效应器CD8+t细胞单独)或阳性对照(植物血凝素刺激)。平板在含5%一氧化碳的潮湿环境中孵育16-20小时2然后根据制造商的说明进行酶联免疫斑点试验。用S6超免疫扫描扫描仪(细胞技术有限公司)扫描平板，用免疫斑点软件(版本5.1.34)(细胞技术有限公司)计算干扰素-γ阳性的T细胞的数量。
细胞毒性试验
通过乳酸脱氢酶释放试验来测定T细胞杀死肿瘤靶细胞的能力。简而言之，在96孔板(V底)中，以不同的比例(从5∶1到0.15∶1)与靶细胞共培养24小时。然后根据制造商的说明，通过细胞毒性96非放射性细胞毒性试验(Promega，G1781)测量乳酸脱氢酶的释放。检测仅包含效应细胞和仅包含靶细胞的孔的吸光度值，并将其作为背景从共培养物的值中减去。将仅含有靶细胞的孔与裂解试剂在37℃下混合30分钟，并将所得发光设定为100%裂解。细胞毒性通过以下公式计算:%细胞毒性=(实验效应自发——靶自发)/(靶最大——靶自发)× 100%
异种小鼠模型
我们使用了NSG锡特IL2rgtm1/Bcgen，北京生物细胞基因有限公司)小鼠模型，以评估转导的CAR-T细胞的体内抗肿瘤作用。所有小鼠实验均严格遵守伦理法规，并获得中山大学动物护理与使用机构委员会的批准。为了观察小鼠体内癌细胞的抗肿瘤活性，将6-8周龄的雌性NSG小鼠皮下接种到右侧，接种量为5 × 106SKV3/Luc细胞在100μL 50:50基质凝胶(Corning)和磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。在第7天，小鼠腹腔内(腹腔内)输注VivoGlo荧光素(Promega，150毫克千克—1体重)，用异氟醚麻醉，用活体成像软件(PerkinElmer)在体内成像系统(IVIS)上成像。然后是1 × 106通过尾静脉将转导的CAR-T细胞(在200 μl的PBS中)移植到荷瘤小鼠中，每3天给所有小鼠静脉注射1 μg白介素-2。对于再挑战实验，2 × 106采用转导的CAR-T细胞(在200 μl的PBS中)，其剂量是上述实验剂量的两倍，以确保在常规Her2-CAR-T细胞治疗组中肿瘤可以被根除。每周在IVIS对老鼠进行一次重新分析。没有使用随机化。
对于其他动物实验，5 × 106SKOV3电池或2 × 106将悬浮在0.1毫升PBS中的Raji细胞s.c .注射到6-8周龄雌性小鼠的右侧。7天后通过尾静脉输注细胞，通过二维测量(毫米)测量肿瘤体积:肿瘤体积=长度×宽度2/2。每3天给小鼠静脉注射1微克白介素-2。当对照组小鼠的平均肿瘤负荷达到1500-2000毫米时，杀死小鼠3。一些组织用ⅳ型胶原酶消化(2毫克毫升—1西格玛)在37℃下培养30分钟，通过在不连续的Percoll梯度上离心分离肿瘤浸润性T细胞(中国浩阳)。其他用于免疫组织化学(IHC)和免疫荧光分析。对于涉及动物实验的检查点阻断，每3天给每只小鼠注射200 μg的抗PD-1阻断抗体(克隆EH12.2H7，329946，Biolegend)。
全基因组转录谱
对于微阵列分析，来自Trizol中肿瘤浸润性T细胞的纯化核糖核酸在干冰上运输到阿克苏米克斯(中国上海)通过安捷伦全人类基因组寡微阵列平台进行分析。核糖核酸制备和微阵列杂交是根据制造商的说明进行的。简而言之，根据制造商的说明，每个样品的总核糖核酸被扩增并转录成荧光核糖核酸。标记的克隆抗体杂交到全人类基因组寡微阵列上(4 × 44 K，安捷伦科技公司)。冲洗载玻片后，安捷伦扫描仪G2505C扫描阵列。安捷伦特征提取软件(11.0.1.1版)用于分析采集的阵列图像。分位数标准化和后续数据处理使用基因弹簧GX v12.1软件包(安捷伦科技公司)进行。在对原始数据进行分位数标准化后，通过折叠变化过滤来鉴定差异表达基因。穿过z-评分标准化，差异表达基因的转录谱数据被用于用MEV软件通过热图可视化(http://www.tm4.org/)。GO富集分析被用于确定富集在特定GO生物过程术语中的这些差异表达基因的作用。
ATAC序列
ATAC序列在每种条件下进行两次独立实验60。简而言之，使用10 mM Tris-HCl、10 mM氯化钠、3 mM氯化镁溶液，每次复制从50，000个分选细胞中分离细胞核2和0.1% IGEPAL CA-630。细胞核分离后，立即用Nextera Tn5转座酶和TD缓冲液(Illumina)在37℃下进行转座反应45分钟。转座的脱氧核糖核酸片段用Qiagen MinElute试剂盒纯化，用双指数条形码(Illumina Nextera)，并用NEBNext高保真2 ×聚合酶链反应主混合物(新英格兰实验室)进行聚合酶链反应扩增。测序文库的大小分布和摩尔浓度通过安捷伦生物分析仪和KAPA定量逆转录聚合酶链反应(KAPA生物系统)测定。测序是使用Illumina海信X10平台进行的，至少获得∷每个样本50 M碎片。使用Bowtie2将成对末端读数映射到hg38参考基因组。只保留了一致映射的对用于进一步分析。峰值调用使用MACS v1.4来识别序列标签富集的区域。这些峰显示在IGV基因组浏览器中，并进一步处理用于注释和差异开放染色质检测。
组织加工和免疫组织化学
组织样本按照标准程序进行固定、处理和染色。简言之，从小鼠身上切除肿瘤并用中性缓冲的4%甲醛固定，并应用于由生物病理学研究所有限公司(中国服务生物)进行的苏木精和伊红染色。对IHC来说，将切除的肿瘤组织浸泡在组织冷冻复合物(4583，樱花精华素)中，并通过冷冻切片机(Thermo NX50)速冻以产生冷冻切片。用于IHC染色的主要抗体是多克隆兔抗人CD3单克隆抗体(17617-1-AP，蛋白质技术)或多克隆兔抗人干扰素-γ单克隆抗体(ab9657，Abcam)。使用显微镜(徕卡，DM6000B)获得了氢氧染色样品和IHC切片的图像。
免疫荧光
将切除的肿瘤组织浸入组织-泰克O.C.T .化合物(4583，樱花)中并速冻以产生冷冻切片。用Alexa Fluor 488-缀合驴抗小鼠IgG H&L(多克隆，ab150109，Abcam)染色CAR-T细胞。主要抗体如下:兔抗人CD56抗体(克隆EP2567Y，ab75813，Abcam)和山羊抗人干扰素-γ抗体(AF-285-SP，R&D)。Alexa Fluor 594-共轭驴抗兔IgG H&L (ab150076，Abcam)和Alexa Fluor 647-共轭驴抗山羊IgG H&L (ab150075，Abcam)用作二级抗体。原位细胞死亡TMR(罗氏BR，12156792910)用于标记凋亡组织。DAPI(4′，6-二氨基-2-苯基吲哚)；热费希尔科学公司)用于细胞核染色。使用激光扫描共聚焦显微镜(蔡司LSM 800)检测荧光信号。为了量化免疫荧光结果，使用Imaris软件(7.4版)(BITPLANE)进一步分析活的和经历凋亡的肿瘤组织之间的边缘图像，使用Spot函数基于大小和强度阈值定位和计数CAR-T细胞、IFN-γ或CD56阳性细胞。或者，CD8的绝对数字+t细胞、干扰素-γ或CD56阳性细胞每毫米斑点2对感兴趣区域的九个高功率场进行统计分析(每只小鼠三个独立场，每组三只小鼠)。
LIPSTIC分析
LIPSTIC分析是通过以下先前的报告进行的，只是做了一些小的修改44。简而言之，在CD56的5’端，cDNA截短了信号肽；SrtA基因或G5通过基于聚合酶链反应的连接分别添加在5’端具有信号肽的基因。G5-CD56mut(带有K303A和F305A突变的CD56)用作对照。它们分别通过IRES主题与Her2-CAR相连。SrtA-PD-1和G5-PD-L1也用与阳性对照相同的方法构建。对于体外试验，CD8+用重组慢病毒转导t细胞，所述重组慢病毒携带以1∶1比例(106每个群体的细胞)在1.5毫升锥形管中加入化学合成的Alexafluor 488-SELPEGG至最终浓度为100 μM。细胞在室温下孵育30分钟，并在荧光激活细胞分选(FACS)染色前洗涤三次。对于LIPSTIC体内实验，用5 × 10将6-8周龄的雌性NSG小鼠接种到右侧6100μL 50:50基质凝胶(康宁)和PBS中的SKOV3细胞。用羧荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记G5-CD56-Her2-CAR-T/G5-CD56 mut-Her2-CAR-T细胞。将SrtA-CD56-Her2-CAR-T细胞和G5-CD56-Her2-CAR-T/G5-CD56 mut-Her2-CAR-T细胞以1∶1的比例混合(106每只小鼠的细胞总数),然后在第7天通过尾静脉转移给小鼠。72小时后，将生物素-氨基己酸-LPETG注射入小鼠体内。12小时后，杀死小鼠并切除肿瘤组织，然后消化进行流式细胞术分析。在中国漳州Sinobioway定制合成了与AlexaFluor488琥珀酰亚胺酯染料和生物素-氨基己酸-LPETGS(碳端酰胺，95%纯度)共轭的SELPETGG(碳端酰胺，95%纯度)。
FRET分析
FRET检测是通过遵循之前的程序进行的，只需稍加修改61,62。简而言之，在CD56、CD56mut或PD-1的5’端，如所示添加青色荧光蛋白(CFP)或黄色荧光蛋白(YFP)(在CD56的5’端，通过基于聚合酶链反应的连接分别添加在5’端具有信号肽的CFP或YFP。CD8+用携带CFP-CD56、CD56mut、YFP-CD56或YFP-PD-1的重组慢病毒转导t细胞6每个群体的细胞)，并重新悬浮在不含酚红的培养基中，接种在96孔板(康宁)中。引入不同浓度的P3DE和P3G肽来阻断CD56-CD56的相互作用。孵育4 h后，用Glomax发现检测系统(Promega)测量495~505 nm(供体)和500~550 nm(受体)的发射。数据绘制为500~550纳米/495~505纳米比与P3DE/P3G肽浓度的关系。实验独立重复至少三次，结果用一次实验的平均扫描电镜表示，一式三份。
凋亡检测
根据制造商的说明，使用膜联蛋白V-FITC凋亡检测试剂盒(中国上海多印多)检测凋亡。用重组肿瘤坏死因子-α (10纳克/毫升)培养后—1)和FasL (10纳克/毫升—1)24小时或在缺乏任何额外细胞因子的情况下培养6天，用抗人APC-CD56(克隆TULY56，17-0566-42)、膜联蛋白V和碘化丙锭标记CAR-T细胞，然后用流式细胞仪BD FACS Aria检测。
统计分析
使用棱镜软件进行统计测试。所有实验数据均以平均扫描电镜表示。高斯分布由科尔莫戈罗夫-斯米尔诺夫正态性检验证实。不成对的双尾学生t-使用了与图基事后测试的测试和单向方差分析，以进一步进行多重比较。
报告摘要
有关研究设计的更多信息，请参见自然研究报告摘要链接到这篇文章。