海藻糖通过TFEB介导的自噬增强促进随机皮瓣的存活 - ELISA试剂盒,酶免试剂盒,酶联免疫吸附试验, ELISA实验,ELISA,双抗体夹心法,科研蛋白,抗体,细胞系,武汉新启迪生物科技有限公司

摘要

随机皮瓣是重建手术中常用和有价值的工具，然而，术后随机皮瓣坏死仍然是一个主要和常见的并发症。先前的研究表明，激活细胞内废物降解的主要途径——自噬，可能会改善皮瓣存活。在这项研究中，我们研究了海藻糖，一种新的和有效的自噬激活剂，是否能提高随机皮瓣的生存力。我们的结果表明海藻糖显著提高生存能力，增加血流量，减少组织水肿。此外，我们发现海藻糖导致血管生成增加、凋亡减少和氧化应激减少。使用免疫组化和蛋白质印迹，我们证明海藻糖增加自噬，并且使用3MA抑制自噬增加显著减弱了海藻糖治疗的上述益处。从机制上讲，我们发现海藻糖的自噬增加是由转录因子结合蛋白的激活和核转位介导的，这可能是由于Akt的抑制和AMPK-SKP2-CARM1信号通路的激活。总之，我们的结果确定海藻糖是一种有效的试剂，能够通过增加自噬和随后促进血管生成、降低氧化应激和抑制细胞死亡来显著提高随机模式皮瓣的存活率。

介绍

随机样式的皮瓣通常用于修复因各种原因如外伤、先天性疾病、癌症和糖尿病引起的皮肤缺损的重建手术1,2,3。然而，随机模式的皮瓣具有非特异性(或“随机”)血供，使得术后皮瓣坏死成为常见的并发症。缺乏特定的动静脉系统和血液供应对于皮瓣的远端区域尤其成问题4,5并且皮瓣存活依赖于从皮瓣蒂向远端区域开始的血管生成。血液供应不足和随后的缺血再灌注损伤会导致显著的氧化应激和细胞凋亡6,7,8最终导致皮瓣死亡。鉴于随机模式皮瓣的普遍使用和皮瓣坏死的高频率，近年来促进血管生成、减轻氧化应激和减少细胞死亡的策略一直在积极研究中7,9,10。

自噬是细胞内容物被自噬泡中细胞自身溶酶体系统降解的过程11。先前的研究表明自噬是促进血管生成的关键机制12,13减轻氧化应激，抑制细胞凋亡14。我们对大鼠皮瓣模型的研究证实，自噬可以通过这些机制促进皮瓣存活，突出了使用自噬激活剂改善预后的潜力8。

海藻糖(TRE)是一种天然的非还原性α-连接二糖(α，α-1，1-葡萄糖苷)，已被鉴定为一种有效的mTOR非依赖性自噬增强剂，并通过激活自噬在细胞存活和维持中发挥重要作用15。先前的研究已经发现海藻糖的各种治疗用途，例如在动脉粥样硬化中，TRE诱导的自噬增强巨噬细胞自噬-溶酶体系统的功能，以减少动脉粥样硬化斑块负担16。在肌萎缩性侧索硬化的细胞模型中，TRE诱导神经元自噬并加速焦油脱氧核糖核酸结合蛋白-43的去除17。TRE还可以通过激活自噬减少慢性缺血性重塑中的心肌肥大、凋亡和纤维化18。尽管海藻糖有明显的前景，但它对自噬的作用是最近的一项发现，而且它仍然是一种研究不足的药物。海藻糖是否能对重建移植后的组织存活产生有益的影响是完全未知的。因此，本研究旨在探讨海藻糖是否能通过自噬增强促进随机模式皮瓣存活，并探讨其作用机制。

材料和方法

实验动物

192只健康C57BL/6小鼠(雄性，平均体重2005)购自中国浙江省温州医科大学实验动物中心(许可证号SCXK 2005-0019)。温度为22–25℃，湿度为60–70%，光照为12小时:采用12小时黑暗循环作为动物居住的标准环境条件，小鼠可以自由获得食物和水。本研究使用的动物经温州医科大学动物研究委员会(wyd 2017-0022)批准，并按照中国国家卫生研究院实验动物动物实验伦理指南进行护理。为了进行我们的研究，动物被随机分成六组:对照组(n= 36)、蔗糖(SUC、n= 36)，TRE(n= 36)，3-甲基腺嘌呤(3MA，n= 18)，TRE+3MA(n= 18)，TRE +腺相关病毒(AAV)-加扰控制(TRE+加扰控制，n= 24)，TRE+AAV-TFEB短发夹核糖核酸(TRE+TFEB shRNA，n= 24)。

试剂和抗体

获得的试剂和抗体及其供应商如下:索拉博科技(中国北京):海藻糖(中国12H22O112H2o .纯度≥ 99.5%)，蔗糖(碳12H22O11；纯度%3E 99.9%)、健康和环境染色试剂盒、DAB显影剂和戊巴比妥钠。博斯特生物技术(中国武汉):钙粘蛋白5初级抗体。Biogot Technology(中国上海):GAPDH一级抗体。蛋白质技术组(芝加哥，伊利诺伊州，美国):血管内皮生长因子，超氧化物歧化酶1 (SOD1)，液泡蛋白分选34 (VPS34)，基质金属蛋白酶9 (MMP9)，血红素加氧酶1 (HO1)，组织蛋白酶D (CTSD)，胱天蛋白酶3 (CAPS3)，组蛋白-H3，Akt和SKP2一级抗体。细胞信号技术(美国马萨诸塞州贝弗利):细胞色素C (CYC)、Bax、AMPK、p-AMPK、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、FOXO3a、p-FOXO3a和CARM1初级抗体。Abcam(英国剑桥):SQSTM1/p62和CD34一级抗体。西格玛-奥尔德里奇化学公司(美国威斯康星州密尔沃基市):微管相关蛋白1A/1B轻链3初级抗体和3MA6H7N5；纯度≥ 98.00%，)。贝瑟尔实验室(美国德克萨斯州蒙哥马利):TFEB一级抗体。信号途径抗体(美国马里兰州大学公园):p-Akt一级抗体。博运生物技术(南京，中国):异硫氰酸荧光素(FITC)-共轭IgG二级抗体。碧瑶生物技术(江苏，中国):4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)溶液。Thermo Fisher Scientific(美国伊利诺伊州罗克福德):BCA试剂盒、东北-佩尔核质提取试剂和皮尔斯共免疫沉淀试剂盒。珀金内尔生命科学(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆):ECL Plus试剂盒。

皮瓣动物模型

腹腔注射1%(重量/体积)戊巴比妥钠用于麻醉每只动物(50毫克/千克)。然后，用电动剃须刀和脱毛膏去除背毛。如前所述，在鼠笼下的小鼠背部抬高一个1.5×4.5厘米的基于尾的随机图案皮瓣19。所有已知的血管都被完全横切，4-0根不可吸收的缝线被立即放置到位，以将皮瓣固定在其原始位置。在每个翼片上划分了三个独立的相等区域:区域一(相对于翼片的尾部基部最近)、区域二和区域三(最远端)。

AAV矢量包装

上海基因化学公司(中国上海)建造并包装了我们实验中使用的AAV-TFEB shRNA。蛋白激酶转录因子激活的shRNA序列被合成并克隆到PaV-U6-shRNA-巨细胞病毒-EGFP质粒中，产生PaV-U6-shRNA-巨细胞病毒-EGFP。通过用PaV-U6-shRNA(TFEB)-巨细胞病毒-EGFP、腺病毒辅助质粒(Ad辅助质粒)和AAV代表/帽表达质粒转染AAV-293细胞产生AAV 9-U6-shRNA(TFEB)-巨细胞病毒-EGFP。用类似的方法，产生AAV9-U6-shRNA(加扰)-巨细胞病毒-EGFP作为加扰控制。用碘克沙醇梯度法纯化病毒颗粒。AAV 9-U6-shRNA(TFEB)-巨细胞病毒-EGFP和AAV 9-U6-shRNA(scramble)-巨细胞病毒-EGFP效价为1.243 × 1012，1.22 × 1012通过定量聚合酶链反应分别测定每毫升基因组拷贝数。

药物和AAV媒介管理局

从TRE组手术前12天开始，每天腹膜内注射2 g/kg海藻糖，并持续至动物安乐死。虽然腹膜内(每天2克/千克)和口服(3%重量/体积，随意)海藻糖给药已经普遍用于动物模型中各种疾病的先前研究20,21,22,23最近的研究报告显示，TRE的胰岛素抵抗疗法导致海藻糖含量比口服给药高得多20。此外，静脉注射给药可以很容易地等同于静脉注射给药，这对于术前和术后患者的患者和医院工作人员来说非常方便，尤其是如果患者出于任何原因(例如临床状况、围手术期考虑等)需要成为非营利组织(无需口服)。)。因此，我们使用海藻糖的i.p .给药进行了研究。SUC组和对照组分别以相同的方式施用2 g/kg蔗糖和盐水。每天腹腔注射15毫克/千克3MA对3MA组以相同的方式进行。TRE + 3MA组在海藻糖给药前30分钟每天腹腔注射15毫克/千克3MA。TRE +加扰对照组和TRE + TFEB shRNA组每天皮下注射6微毫升5 × 10的PBS病毒载体9手术前14天(海藻糖给药前2天)3个区域的包装基因组颗粒总数；然后，TRE+TFEB ShRNA和TRE+Scramble组继续注射海藻糖，其方案与TRE组相同。

皮瓣存活评估

术后第3天和第7天，通过高质量摄影评估平坦生存能力。使用图像专业增强成像软件(ver)识别存活和缺血区域。6.0；培养基化学制剂)，活面积百分比计算如下:x 100%。

激光多普勒血流(LDBF)成像

为了测量血流，每组6只小鼠被置于麻醉下，并使用POD 7上的激光多普勒仪器(Moor Instruments，Axminster，UK)进行扫描。先前已经描述了LDBF测量协议24。使用灌注单位对血流进行量化，并使用摩尔LDI回顾软件(版本6.1；摩尔仪器)。每只动物被扫描和测量3次，平均值用于进一步的统计分析。

组织水肿测量

组织水肿采用以下方案进行测量。在POD7上，每组6只动物的皮瓣被移除并称重以获得“湿重”然后，将这些翼片置于50摄氏度的高压釜中脱水，并让其稳定2天。然后，再次称重襟翼以获得“干重”水肿以POD7上含水量的百分比报告，并通过以下公式计算:(/湿重)× 100%。

苏木精伊红染色

在POD7上对动物实施安乐死后，从皮瓣的第二区域(中间位置)取回6个1cm×1cm的组织样本。然后用4%多聚甲醛固定并包埋在石蜡中后，将这些样品横向切片。然后在安装在聚赖氨酸包被的载玻片上的4 m厚切片上进行H&E染色。在x200光学显微镜下(奥林巴斯公司，日本东京)，在从三个随机切片中随机选择的6个区域中计数微血管，以及每单位面积的微血管数量(/mm2)被计算以量化血管密度。

免疫组织化学(IHC)

使用二甲苯将第节中描述的六个石蜡切片脱蜡，并通过分级乙醇浴再水合进行免疫组织化学分析。冲洗切片，然后用3%(体积/体积)的氢封闭2O2。然后，将切片置于95℃的10.2 mM柠檬酸钠缓冲液中20分钟，然后用10% (w/v)牛血清白蛋白磷酸盐缓冲盐水封闭10分钟。最后，切片在4摄氏度下用下列主要抗体孵育过夜:抗CD34 (1:100)、抗血管内皮生长因子(1:300)、抗钙粘蛋白5 (1:100)、抗CASP3 (1:200)、抗SOD1 (1:100)和抗CTSD (1:100)。接下来，切片用辣根过氧化物酶结合的第二抗体孵育，并用苏木精复染。使用DP2-TWAN图像采集系统(奥林巴斯公司，日本东京)，以×200倍的放大率对皮瓣组织进行成像，并且图像-专业Plus(媒体控制论，美国马里兰州洛克维尔)量化吸收值以估计血管内皮生长因子、钙粘蛋白5、CASP3、SOD1和CTSD表达。CD34阳性血管的密度用第2.9节中描述的类似方法计算。总体而言，IHC分析包括三个随机截面的六个随机场。

免疫荧光染色

与关于IHC的章节中描述的方法相似，切片被脱蜡、再水合、洗涤，然后在95℃下用10.2毫米柠檬酸钠缓冲液处理20分钟。然后，使用0.1%(体积比)的PBS-Triton X-100渗透切片30分钟。在PBS中用10% (v/v)牛血清白蛋白封闭1小时后，样品与针对TFEB (1:100)和LC3I(1:200)的初级抗体在4℃孵育过夜。随后，样品在室温下与FITC结合的第二抗体孵育1小时。荧光显微镜(Olympus，Tokyo，Japan)用于可视化和评价从每个标本的3个随机切片中随机选择的6个区域的真皮层，并计算LC3II阳性细胞和TFEB易位到细胞核中的百分比。

蛋白质印迹和共免疫沉淀

在POD 7上，从第二区的中部取出6个0.5厘米乘0.5厘米的皮肤样品，并在80摄氏度下储存，用于蛋白质印迹和共免疫沉淀分析。对于共免疫沉淀(Co-IP)分析，来自对照组、SUC组和TRE组的样品根据制造商(皮尔斯)提供的方案进行处理。接下来，使用偶联树脂固定抗体，并与活片裂解物混合，在4摄氏度下储存过夜。然后，我们洗脱蛋白质进行蛋白质印迹。此外，通过用裂解缓冲液提取蛋白质来处理每组中的六个样品。每组中的另外六个样品通过用核和细胞质提取试剂提取细胞质蛋白和核蛋白来处理。蛋白质浓度使用碱性磷酸酶测定法计算。蛋白质通过12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后转移到聚偏氟乙烯膜上。用5%(重量/体积)脱脂牛奶封闭后，将膜与下列一级抗体在4℃孵育过夜:血管内皮生长因子(1:1000)、基质金属蛋白酶-9 (1:1000)、钙粘蛋白5 (1:1000)、血红素氧合酶-1 (1:1000)、内皮细胞瘤(1:1000)、SOD1 (1:1000)、Bax (1:1000)、CYC (1:1000)、CASP3 (1:1000)、BEN1/Becn1然后将膜与二级抗体在室温下孵育2小时。免疫反应蛋白用ECL Plus试剂盒进行可视化。最后，使用图像实验室3.0软件(美国加利福尼亚州赫拉克勒斯的Bio-Rad实验室公司)对波段强度进行量化。

实时聚合酶链反应

获得6个0.5厘米×0.5厘米的第二区皮肤样品，用于实时聚合酶链反应分析。用Tizol试剂处理后，从皮瓣中收集总核糖核酸。接下来，根据初级脚本二第一链cDNA合成试剂盒(6210B，TAKARA BIO INC)制造商的说明，通过逆转录酶合成了cDNA。引物采用引物Premier 5.0，根据基因银行核查的BECN1/Beclin1、VPS34、CTSD、SQSTM1/p62和LC3的基因序列设计，由南京中联生物回声有限公司合成，引物序列如下:beclin 1 5′-ATGGAGGGTCTAAGGGTC-3′(正向)和5′-TGGGGGCTGTGGTAAGTAAGGGA-3′(反向)；VPS 34 5′-TAACGTGGAGGGCAGATT-3′(前进)和5′-CATGTGTCCTTGCCGGAG-3′(后退)；CTSD 5′-GGGCATCCAGGGTATTT-3′(前进)和5′-CGTCTTGCCTCTCTATTTT-3′(后退)；SQSTM 1/p62 5′-ACACACCCGGTTTCCTTT-3′(正向)和5′-TGCCCCTTTCACTCACTA-3′(反向)；LC3 5′-CTAGCCTCCCACAGAACC-3′(正向)和5′-AGAGAGCACCCGCAGACT-3′(反向)；TFEB 5′-CAGGGTGGtgAAGCAAGAGT-3′(向前)和5′-TCCAGGGTGAGGAACGGAGAACT-3′(反向)；β-肌动蛋白5′-ATGTGGATCAGAGAGGA-3′(正向)和5′-AAGGGTAAAAAAACAGCTCA-3′(反向)。实时聚合酶链反应是使用SYBR预混剂Ex Taq (RR420A，TAKARA BIO INC .)进行的。反应条件包括在95℃变性30秒，在65℃退火30秒，在72℃延伸45秒30个循环。最后，在72℃下检测到信号。贝克兰1、VPS34、CTSD、SQSTM1/p62和LC3基因被归一化为β-肌动蛋白基因。

统计分析

所有统计分析都使用了19.0版的统计软件。数据以平均值的平均标准误差表示。独立样本t-在适当的情况下，使用带LSD(假设相等方差)或邓尼特T3(不假设相等方差)的试验和单向方差分析。p值小于0.05被认为具有统计学意义。

结果

TRE提高皮瓣存活率

与海藻糖相比，蔗糖(SUC)的非还原性使其成为理想的对照二糖20。因此，SUC组被用于建立阴性对照，并且预期产生与对照组相似的结果。手术后第三天，各组皮瓣在第三区无明显坏死，但出现水肿和苍白。手术后7天，虽然所有组的ⅰ区存活明显，但ⅲ区开始显示坏死迹象，伴有变黑、硬化和结痂，一些类似的发现扩散到ⅱ区皮瓣(图1)。1a)。TRE组的存活率明显高于对照组和SUC组(图1b)。从质量上看，对照组和SUC组明显水肿和皮下静脉充血，但TRE组的程度较低(图1c)。从数量上看，TRE组的含水量较低(图1d)。TRE组的血流得到改善(图1e)，定量血流测量也明显更好(图1f)。对于血管生成，我们在TRE组发现明显更多的微血管(图第一代)，平均血管密度高于对照组和SUC组(图1h)。TRE组也显示更多CD34+血管(图1i，j)。同时，在上述测试中，对照组和SUC组之间没有显著差异。总之，这些数据表明海藻糖能提高皮瓣的存活率。

TRE促进随机皮瓣血管生成

血液供应和血管生成是决定皮瓣存活的关键因素，因此，我们询问海藻糖对皮瓣存活的积极作用是否可能通过增加血管生成来介导。IHC评价血管内皮生长因子和钙粘蛋白5的表达。在TRE组，皮瓣二区血管内皮生长因子的表达明显高于对照组和SUC组。2a，b)。这些发现被蛋白质印迹分析证实(图2f，I)。内皮细胞和基质细胞钙粘蛋白5的表达在TRE也增加(图2c，d)。这一结果通过显示相似差异的蛋白质印迹得到证实(图2g，j)。我们使用蛋白质印迹法进一步评估基质金属蛋白酶9蛋白水平。在这里，我们还发现与对照组和SUC组相比，TRE组的水平显著增加(图2e，h)。同时，在上述测试中，对照组和SUC组之间没有显著差异。总之，这些数据表明海藻糖促进皮瓣血管生成。

TRE减少随意皮瓣的凋亡

接下来，我们研究海藻糖是否调节皮瓣细胞凋亡。通过IHC和积分吸光度分析测量的真皮中CASP3水平显示，与对照组和SUC组相比，TRE组显著降低(图。3a，b)，与蛋白质印迹中看到的一致(图3e，h)。IHC和蛋白质印迹检测到的水平在对照组和SUC组之间没有差异(图3a、b、e、h)。此外，蛋白质印迹显示，与对照组和SUC组相比，TRE组的Bax和CYC水平显著降低，而对照组和SUC组之间没有差异(图1)。3c、d、f、g)。总之，这些结果表明海藻糖减少皮瓣细胞凋亡。

TRE减少随意皮瓣的氧化应激

鉴于氧化应激在皮瓣存活中起主要作用，我们也研究海藻糖是否调节氧化应激。SOD1水平通过真皮的IHC和蛋白质印迹分析，结果显示TRE组的SOD1水平高于对照组和SUC组(图1)。4a、b、c、f)。与对照组和SUC组相比，TRE组HO-1和eNOS蛋白水平也增加(图。4d，例如，h)。然而，在上述测试中，对照组和SUC组之间没有显著差异。这些数据提供了证据，表明TRE可能通过减少氧化应激来提高皮瓣的存活能力。

TRE激活随机皮瓣的自噬

为了评估自噬激活，我们量化了Beclin1、VPS34、LC3II、CTSD和SQSTM1/p62蛋白水平。这些蛋白质是自噬过程中的直接参与者，Beclin1、VPS34和LC3II是自噬体蛋白质，CTSD是一种自溶体相关蛋白质，SQSTM1/p62是一种自噬底物蛋白质。TRE组真皮LC3II阳性细胞的频率高于对照组和SUC组(图。5a，b)。IHC分析显示TRE组的CTSD水平较高(图5c，d)，这也通过蛋白质印迹证实(图5e，f)。自噬体蛋白Beclin 1、VPS34和LC3II在TRE组也均上调(图。5e，f)。最后，自噬底物蛋白SQSTM1/p62响应TRE处理而减少(图5e，f)。实时聚合酶链反应分析还显示，在TRE组，贝克林1、VPS34、CTSD、SQSTM1/p62和LC3的基因水平显著上调(图。5g)。在上述测试中，对照组和SUC组之间没有显著差异。这些数据证明海藻糖确实激活了皮瓣的自噬，这可能是观察到的氧化应激抑制、凋亡减少和血管生成增加的原因。

抑制自噬逆转了TRE对血管生成、凋亡、氧化应激的影响，并抑制了随意皮瓣的存活

为了证明自噬的激活是TRE发挥上述疗效的主要机制，我们单独给予3MA(一种自噬抑制剂)，并与TRE联合给予3MA，然后评估结果。我们的结果表明，与单独使用TRE相比，使用TRE和3MA处理的动物真皮中LC3II阳性细胞的频率降低；同时，3MA组的平均频率值小于对照组，尽管没有显著性(图6a，b)。蛋白质印迹进一步显示在TRE+3MA组中，SQSTM1/p62增加，VPS34、Beclin 1、CTSD和LC3 II水平降低(图。6c，d)与TRE集团相比。3MA的处理也上调了SQSTM1/p62的水平，下调了VPS34、Beclin1、CTSD和LC3II的表达(图。6c，d)。总之，这些结果表明3MA在我们的模型中抑制海藻糖的自噬激活作用。我们的结果还显示，与单独使用TRE相比，在TRE+3MA小鼠中基质金属蛋白酶9、血管内皮生长因子和钙粘蛋白5的表达显著下调，在3MA小鼠中与对照组相比表达下调(图1)。6c，d)。与单独的TRE小鼠相比，TRE+3MA小鼠的eNOS、SOD1和HO-1也出现这种情况，3MA小鼠的eNOS、SOD1和HO-1与对照组小鼠相比有所下降(图1)。6e，f)。相反，在TRE+3MA组中，Bax、CYC和CASP3与单独的TRE相比均显著上调，在3MA组中也与对照组相比上调(图。6c–f)。这些结果表明，当3MA共同给药时，海藻糖对蛋白质水平的调节受到显著影响。

接下来，我们询问联合施用3MA是否能在皮瓣存活性、水肿和血管生成方面降低海藻糖的治疗效果。在对照组中，3MA、TRE和TRE + 3MA组中，皮瓣存活在第3天没有显著差异，但是3MA组在第7天显示出比对照组更低的皮瓣存活，TRE+3MA组在第7天显示出比单独TRE组明显更低的皮瓣存活，水肿明显增加(图1)。6g–I)。3MA显示出比对照组更高的组织含水量，TRE+3MA产生的组织含水量比单独的TRE更高(图3)。6j)。如LDBF所示，与对照组相比，3MA单独影响血流，与TRE单独相比，TRE+3MA也影响血流(图。6k，l)。苏木精-伊红染色显示3MA和TRE+3MA组微血管数量减少(图6m)，平均血管密度明显低于对照组和TRE组(图6n)和较少的CD34阳性血管(图6o，p)。综上所述，我们的研究表明，3MA破坏了TRE的自噬激活效应，影响了TRE对关键蛋白质的调节，也损害了TRE在皮瓣方面的治疗效果。

TRE通过增强TFEB活性激活自噬

为了研究海藻糖调节自噬的机制，我们研究了已知的自噬激活剂TFEB是否起作用。如图所示7a，b与对照组和SUC组相比，TRE组进入真皮层细胞核的TFEB易位率增加。实时聚合酶链反应分析显示，转录因子结合蛋白基因水平显著上调(图7c)，蛋白质印迹也显示海藻糖处理后核转录因子结合蛋白水平上调(图7d，f)。为了探讨TFEB在TRE相关自噬中的作用，用TFEB shRNA AAV载体处理TRE处理的皮瓣，然后评估核TFEB、自噬和皮瓣活力的水平。与TRE和TRE +加扰对照组相比，AAV- TFEB shRNA注射液显著降低了TFEB核易位(图。7e，g)，并且在TRE和TRE +加扰控制组之间没有显著差异(图7e，g)。这些结果表明，TFEB可能在海藻糖的作用机制中起着核心作用。

然后我们评估海藻糖引起的TFEB核移位是否是自噬相关蛋白的调节。我们的结果表明，与TRE和TRE+加扰对照组相比，TRE+TFEB shRNA组的VPS34、Beclin1、CTSD和LC3II较低，p62水平较高(图1)。7h，I)。这些蛋白的表达在TRE和TRE +加扰对照组之间没有显著差异(图7h，I)。此外，还采用实时聚合酶链反应检测了三叶皂苷及其靶基因。如图所示7j与TRE和TRE +加扰对照组相比，TRE + TFEB shRNA组TFEB、Beclin1、VPS34、CTSD、SQSTM1/p62和LC3水平显著下调。同时，我们的结果表明血管生成相关蛋白血管内皮生长因子、钙粘蛋白5和基质金属蛋白酶9以及氧化应激相关蛋白SOD1、HO1和eNOS在TRE + TFEB shRNA中较低(图。7k，l)。相反，凋亡相关蛋白Bax、CYC和CASP3在TRE + TFEB shRNA组上调(图。7k，l)。这些蛋白质和基因的表达在TRE和TRE +加扰对照组之间没有显著差异(图1)。7k，l)。综上所述，这些结果表明海藻糖引起的TFEB核移位是VPS34、Beclin 1、CTSD、LC3II和SQSTM1/p62调节的原因。

最后，我们评估了在随机模式皮瓣的情况下，TFEB的核移位是否是海藻糖治疗益处的原因。如图所示7m，n术后第3天，TRE、TRE +加扰控制组和TRE + TFEB shRNA组之间的皮瓣存活面积无显著差异，然而，TRE + TFEB shRNA组的皮瓣存活面积比术后第7天的TRE和TRE +加扰控制组减少。定性地说，TRE+TFEB shRNA组明显水肿和皮下静脉淤血，但在TRE和TRE+Scramble对照组中程度较轻(图。7o)。从数量上看，TRE+TFEB shRNA组比TRE和TRE+Scramble对照组表现出更高的含水量(图2)。7p)。TRE+TFEB shRNA组血流减少(图7q)，定量血流测量值在TRE+TFEB shRNA组中明显较低(图。7r)。对于血管生成，我们发现TRE+TFEB shRNA组微血管明显减少(图。7s)，平均血管密度低于TRE和TRE+加扰对照组(图7t)。TRE和the加扰对照组的上述试验没有显著差异。综上所述，这些结果表明海藻糖通过促进TFEB的核易位而上调自噬，从而发挥其治疗作用。

TRE调节Akt信号蛋白和AMPK-SKP2-CARM1信号通路

最后，我们试图研究海藻糖信号传递给TFEB核转位的机制。蛋白质印迹分析显示，与对照组和SUC组相比，TRE组磷酸化Akt水平降低(图8a，b)。Akt的总水平在这些组之间没有差异，这表明Akt信号被海藻糖抑制。AMPK是饥饿和低能量状态的关键应答者，已被证明是已知由海藻糖调节的TFEB活性的关键调节剂。与对照组和SUC组相比，TRE组的AMPK、磷酸化的FOXO3a和CARM1增加(图。8c，d)。与对照组和SUC组相比，TRE组的SKP2降低(图8c，d)。过去的研究表明，AMPK激活导致FoxO3a磷酸化，这导致SKP2的减少和CARM1的增加，增加CARM1与TFEB的结合，促进TFEB转录。为了进一步验证海藻糖增强了这一信号通路，我们进行了co-IP评估TRE在CARM1和TFEB结合中的作用，我们的结果表明，在TRE给药后，与对照组和SUC组相比，TFEB结合CARM1的速率增加(图。8e)。此外，对远蛋白印迹的Co-IP分析显示，与对照组和SUC组相比，TRE组的TFEB和CARM1水平增加(图1)。8f)。然而，在上述测试中，对照组和SUC组之间没有显著差异。总之，这些结果表明海藻糖可能通过减少Akt信号和激活AMPK-SP2-CARM1途径导致TFEB增加。

讨论

在这项研究中，我们表明海藻糖通过增加自噬、导致缺血区域血管生成、抑制氧化应激和减少凋亡来促进随机皮瓣的存活。在机制上，我们发现TRE通过AKT信号下调和AMPK-mTOR-TFEB途径激活上调TFEB表达诱导自噬。这些发现突出了海藻糖在临床上用于改善随机型皮瓣效果的潜力

随机模式皮瓣是重建手术中常用的工具，也是缺血皮瓣的一种形式，其存活面积与皮瓣建立后的血管生成密切相关。先前的研究表明，促进血管生成可以延长随意皮瓣的存活时间9,25。在我们的研究中，用TRE治疗显著增加了随机皮瓣真皮中的微血管，并改善了皮瓣血流量。血管生成是一个复杂的过程26涉及内皮细胞的增殖、迁移和空间组织27。血管内皮生长因子已知能增加微血管通透性，对血管生成至关重要28,29并且，基质金属蛋白酶9是血管内皮生长因子释放和血管生成转换的主要参与者30。另一方面，钙粘蛋白5形成细胞间连接，阻止新生血管分解成无组织的内皮聚集物31。我们的结果显示海藻糖处理后基质金属蛋白酶9、血管内皮生长因子和钙粘蛋白5蛋白水平显著增加。总之，TRE通过增加血管内皮生长因子、基质金属蛋白酶9和钙粘蛋白5的水平来促进血管生成，从而促进皮瓣存活。

缺血是皮瓣建立后常见的并发症，随着血液供应的恢复，组织可能会发生缺血再灌注损伤。结果，产生过量的活性氧32。据报道海藻糖通过调节抗氧化基因表达和自噬途径对高水平的活性氧做出反应33。在目前的研究中，我们发现海藻糖增加了皮瓣真皮中SOD1、eNOS和HO1的水平，提示海藻糖抑制氧化应激。细胞凋亡是一种积极调节的细胞死亡形式，涉及许多生理和病理条件，包括缺血再灌注损伤，并可导致皮瓣坏死。TRE已被证明能减少各种疾病(如慢性缺血性心脏重塑)中的细胞凋亡18，糖尿病周围神经病变34和骨关节炎35)。我们的结果显示海藻糖导致凋亡减少，这是由凋亡相关蛋白Bax、CYC和CASP3测定的。总之，这些结果表明海藻糖可以通过降低氧化应激和抑制细胞凋亡来提高皮瓣存活率。

自噬是细胞清除和降解细胞内废物的主要途径，对细胞内环境稳定、能量学和宿主防御非常重要36。我们以前的研究表明，自噬的激活促进了随机皮瓣的存活8,25,37。最近，TRE疗法已被证明能诱导自噬以及防止心脏慢性缺血性重塑18，动脉粥样硬化16,20和运动神经元退化38。自噬过程被广泛研究，包括三个连续的步骤:隔离、运输和降解。简而言之，在螯合过程中，VPS34、Beclin1和LC3II水平增加39,40在运输和降解过程中，自噬通量的刺激导致SQSTM1/p62的耗竭41。CTSD是溶酶体天冬氨酰蛋白酶，在降解过程中发挥重要作用42。在本研究中，我们发现海藻糖处理后，Beclin 1、VPS34、LC3II和CTSD的皮瓣水平增加，SQSTM1/p62降低，提示海藻糖增加自噬。此外，3MA，一种有效的自噬抑制剂，逆转了海藻糖对皮瓣存活和预后的所有治疗益处，表明自噬是海藻糖对皮瓣有益作用的原因。

据信，对应激条件的自噬反应取决于转录调控43,44。TFEB是一种已知的自噬主转录调节因子45,46和溶酶体基因上的CLEAR(协调溶酶体表达和调节)元件结合来诱导它们的表达，从而控制自噬体和溶酶体生物发生并促进自噬体-溶酶体活性47。在应激过程中，无活性的TFEB去磷酸化并转移到细胞核，对其靶基因起作用48为了促进大量溶酶体和自噬基因的转录49,50。TRE已经证明通过增加TFEB的激活来增强自噬的活性51。在这里，我们的结果表明，TRE治疗显著增加了转铁蛋白肽转运入细胞核的百分比。我们还发现AAV-转录因子结合蛋白shRNA，转录因子结合蛋白易位的抑制剂，显著减弱TRE对转录因子结合蛋白核易位的影响，下调自噬水平。AAV-TFEB shRNA也逆转了TRE对随意皮瓣存活能力的影响。这些发现表明，TRE通过增强缺血皮瓣中TFEB的核移位来上调自噬并改善皮瓣存活。

TFEB活性在不同水平上受到调节，包括翻译后修饰和蛋白质-蛋白质相互作用52。TFEB去磷酸化的促进能增强TFEB核移位，上调TFEB活性。过去的研究表明，使用药物抑制剂抑制Akt活性可促进TFEB的核易位，并激活自噬溶酶体途径53。一旦转位到细胞核中，活跃的转位受到AMPK-SKP2-CARM1信号通路的调节54。具体来说，AMPK是由营养缺乏时三磷酸腺苷/二磷酸腺苷比率的降低激活的，导致FOXO3a磷酸化和SKP2转录的抑制54,55。SKP2的下调稳定了CARM156，然后绑定并激活TFEB55。在本研究中，我们观察到TRE治疗导致Akt活性的抑制以及AMPK-SKP2-CARM1信号轴的激活，共同表明海藻糖通过这些信号通路的组合调节起作用。值得注意的是，过去的研究表明钙调神经磷酸酶也可能负责TFEB去磷酸化和核易位38,46。未来探索钙调神经磷酸酶在海藻糖介导的自噬激活中的作用的研究进一步阐明海藻糖的作用机制。