RIPK 1泛素化通过调节RIPK 1激酶激活抑制细胞程序性死亡 - ELISA试剂盒,酶免试剂盒,酶联免疫吸附试验, ELISA实验,ELISA,双抗体夹心法,科研蛋白,抗体,细胞系,武汉新启迪生物科技有限公司

摘要

RIPK 1的泛素化状态被认为是决定细胞命运的关键因素。然而，RIPK 1泛素化在体内的作用尚不明确。这里我们展示了表达RIPK 1的小鼠K376RRIPK 1泛素化在胚胎发生过程中存在缺陷。这种致命性完全通过同时删除FADD和RIPK 3或MLKL..机械地，表达RIPK 1的细胞K376R更易受肿瘤坏死因子-α诱导的细胞凋亡和坏死的影响，其II型的形成更为复杂，RIPK 1的活性增强，这与观察到的结果一致。Ripk 1K376R/K376RRIPK 1激酶抑制剂治疗可有效地防止致死性，并可通过删除Tnfr1而获救。然而，Tnfr1−/− Ripk 1K376R/K376R小鼠出现全身炎症，2周内死亡。值得注意的是，这种致命的炎症是通过删除RIPK 3..综上所述，这些发现揭示了Lys 376介导的RIPK 1泛素化在抑制RIPK 1激酶活性依赖的胚胎发生和RIPK 3依赖的炎症过程中的关键作用。

导言

RIPK 1是各种天然免疫信号通路中的重要信号节点，在TNFR 1信号通路中的研究最为广泛。TNFR 1的连接导致了一种称为复合物I或TNFR 1-Siganling复合物(TNFR 1-SC)的快速形成，该复合物由Tradd、RIPK 1、TRAF 2和cIAP 1/2组成。1,2..RIPK 1被多种形式的泛素链泛素化，为两种蛋白复合物提供停靠位点，TAB/TAK复合物由TAK 1和TAB 2/3组成，IKK复合物由nemo、ikkα和ikkβ组成。3,4,5,6..这两种复合物的个体形成导致NF-κB和MAPK信号通路的激活，从而促进细胞存活。然而，在某些情况下，当来自复合物i的亲存活信号受到干扰时，ripk 1就会从复合物i中分离出来，并招募fdd和caspase-8形成复合物IIa，从而导致细胞凋亡。1,7,8,9,10,11..然而，当细胞凋亡被抑制时，ripk 1可以与ripk 3相互作用形成淀粉样复合物，称为复杂的ib或坏死体，从而激活坏死。12,13,14,15,16,17.

近年来，通过对RIPK 1信号通路的广泛遗传研究，发现RIPK 1在体内调控细胞存活和细胞死亡的作用。基因缺失Ripk 1动物导致出生后死亡，淋巴系和脂肪系细胞大量死亡。18..烧蚀caspase-8/FADD和RIPK 3允许Ripk 1缺陷小鼠的正常发育和成熟19,20,21,22..同样，肠上皮细胞(Iecs)中的Ripk 1有条件缺失，导致小鼠过早死亡，并伴有广泛的肠道凋亡和随后的炎症反应。23,24..这些表型在缺乏肠道的小鼠中很大程度上得到了解决。FADD/caspase-8或者两者兼而有之FADD和RIPK 323,24..此外，小鼠角质形成细胞特异性。Ripk 1缺乏症逐渐发展为严重的炎症性皮肤损害，完全预防删除RIPK 3或MLKL24..因此，RIPK 1似乎是FADD/Caspase-8和RIPK 3/MLKL参与的致死途径的抑制因子。然而，RIPK 1也被建议在某些情况下介导细胞死亡。烧蚀Ripk 1防止早期胚胎死亡caspase-8或FADD，虽然这些老鼠在出生后的早期死亡，类似于Ripk 1缺乏性小鼠21,22,25..另一项惊人的研究表明，纯合子小鼠RIPK 3D161N死亡于E10.5，但通过共同删除Ripk 126..这些研究揭示了RIPK 1的相反功能，它也能诱导细胞死亡。因此，RIPK 1的矛盾作用提出了以下基本问题：RIPK 1的两个相反功能的转换是什么？

RIPK 1由N端丝氨酸/苏氨酸激酶结构域、中间结构域和C末端死亡结构域(DD)组成。27,28..激酶活性对诱导坏死和RIPK 1依赖的细胞凋亡是必不可少的，但对NF-κB的激活是可有可无的。29,30,31..具有激酶活性突变体ripk 1的动物在体外和体内均能正常发育，不受rfn-α诱导的死亡的保护，提示ripk 1的促存活功能不需要ripk 1激酶活性。32,33..中间结构域包含一个rip同型相互作用模体(Rhim)，它与ripk 3的rhim结合以启动坏死，而遗传学研究表明rhim在抑制发育和炎症过程中ZBP 1/ripk 3/mlkl依赖的死亡中起着关键作用。34,35,36..此外，最近的一项研究表明，dd介导的ripk 1二聚对ripk 1的激活至关重要，突变dd的小鼠对ripk 1依赖的凋亡和坏死具有抗性。37..因此，虽然这些基因研究表明RIPK 1参与了细胞凋亡、凋亡和细胞存活的调控，但RIPK 1在体内调控这些途径的机制尚不清楚。

鉴于RIPK 1的泛素化状态对于配合物I向配合物II的转变至关重要，答案的线索可能来自于人RIPK 1的一个主要的功能泛素化位点K 377，它为K-63连接的聚泛素链提供了一个停靠位点，并参与了TAK 1和IKK复合物的合成。3,5,38,39..体外研究表明，用精氨酸(K377R)替代Lys-377可阻断rIPK 1泛素化和TNF-α介导的NF-κB活化，使细胞对TNF-α诱导的细胞凋亡产生敏化作用。3,5,38,39..然而，作为揭开RIPK 1自相矛盾作用的谜团的关键，K 377的体内功能尚未确定。

在本研究中，我们生成了表达ripk 1的小鼠。K376R，小鼠RIPK 1的K 376与人RIPK 1的K 377同源。特别是，老鼠Ripk 1K376R/K376R胚胎第12.5天死亡(E12.5)，胚胎组织和卵黄囊细胞过度死亡。因此，表达RIPK 1的小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)K376R在肿瘤坏死因子-α诱导的泛素化方面存在缺陷，对肿瘤坏死因子-α诱导的细胞凋亡和坏死更敏感.NEC-1处理可以有效地防止突变胚胎细胞过度死亡，这与RIPK 1的激酶活性有关。有趣的是，Ripk 1K376R/−RIPK 1突变小鼠K376R虽然这些老鼠在出生后就会发生全身炎症，但仍然是可行的。此外，烧蚀FADD和RIPK 3/MLKL援救Ripk 1K376R/K376R表明突变小鼠的致死表型是由FADD依赖性凋亡和RIPK 3/MLKL依赖性的坏死所致。此外，删除Tnfr1援救Ripk 1K376R/K376R小鼠处于胚胎阶段，但不能阻止突变小鼠的出生后全身炎症。重要的是，RIPK 3缺乏症预防致死性炎症Tnfr1−/− Ripk 1K376R/K376R提示RIPK 1的泛素化在小鼠出生后的发育过程中也参与了炎症的调节。因此，我们的发现提供了遗传学证据，表明Lys 376介导的RIPK 1泛素化在调节胚胎发生和炎症过程中起着关键作用。

结果

Ripk 1 K376R/K376R小鼠胚胎发生死亡

为了探讨RIPK 1泛素化在体内的潜在作用，我们在一个突变为精氨酸(K376R)的关键泛素化位点上生成了赖氨酸的敲入小鼠。1A)。出乎意料，不像Ripk 1−/−出生后3天内死亡的老鼠，Ripk 1K376R/K376R在胚胎发生过程中，小鼠作为杂合子和野生型(WT)后代杂交死亡。1B). Ripk 1K376R/+小鼠的正常寿命与WT的寿命相同，排除了RIPK1K376R作为显性阴性突变体的可能性。才能更深入地了解Ripk 1K376R/K376R小鼠，我们通过交配杂合子动物进行怀孕。结果表明：Ripk 1K376R/K376R胚胎及其卵黄囊在E11.5时表现正常。1C)。然而，TUNEL染色显示，突变胚胎的胎肝中死亡细胞增多(如图所示)。1D)。在E12.5，虽然Ripk 1K376R/K376R胚胎正常，组织学检查显示部分胎肝组织丢失明显(图一)。1C、d)。免疫印迹分析表明，突变胚体内有活化的caspase-3和PARP的裂解，以及RIPK 1和RIPK 3的聚集，提示细胞凋亡的激活和坏死作用是导致突变胚胎细胞死亡的重要原因。1F)。此外，VE-cadherin卵黄囊免疫染色显示突变胚卵黄囊中caspase-3活性明显增强，表明突变引起的细胞死亡对胚胎组织和卵黄囊均有影响。1E)。在E13.5和E14.5，Ripk 1K376R/K376R胚胎贫血，发育异常，表明突变胚胎死亡(图一)。1C)。因此，这些结果表明：Ripk 1K376R/K376RE12.5引起胚胎死亡，细胞过度死亡，包括细胞凋亡和坏死。

K376R阻断RIPK 1的泛素化

为了研究RIPK 1 K376对多种信号的贡献，我们从Ripk 1K376R/K376R老鼠和Ripk 1+/+肿瘤坏死因子-α小鼠。在刺激肿瘤坏死因子-α5 min内，可检测到复合物Ⅰ中RIPK 1明显泛素化。Ripk 1+/+细胞，而RIPK 1泛素化则显著减少Ripk 1K376R/K376R细胞(图1.2A)。因此，RIPK 1与NEMO之间的相互作用在Ripk 1K376R/K376R细胞(图1.2C)。CIP拮抗剂smac对细胞的泛素化有明显的抑制作用，提示RIPK 1在K 376上的泛素化主要由E3泛素连接酶cIAP 1/2介导(图1/2)。2B)。泛素链的免疫沉淀结果表明，K376R突变对RIPK 1的K63泛素化影响更大。1A)，这与以前的报告一致，表明RIPK 1上的多聚泛素链主要是通过泛素的K63连接的。3,40..为了确定NF-κB活化是否需要RIPK 1在K 376上泛素化，我们用肿瘤坏死因子-α(TNF-α)处理细胞进行了时间过程实验。在……里面Ripk 1+/+细胞对肿瘤坏死因子-κ-α的反应在5 min内被磷酸化，并迅速降解。二维空间)。因此，观察到p65的磷酸化和逐渐移位。2D，e)，激活靶基因的转录。2F)。相反，在Ripk 1K376R/K376R细胞IκBα的活化被明显阻断，p65的易位延迟，导致NF-κB靶向基因的转录诱导减弱(如图所示)。二维f)。重要的是，除了NF-κB通路，Ripk 1K376R/K376RJNK、p38和ERK 1/2的活化等细胞几乎不受影响(见图)。二维空间)，表示RIPK 1的独特作用。K376R在MEFs中激活NF-κB信号。因此，我们的结果表明，K 376在介导RIPK 1泛素化和NF-κB活化反应中起着关键作用。

RIPK 1K376R促进细胞凋亡和坏死

RIPK 1缺陷泛素化促进肿瘤坏死因子-α诱导的Jurkat T细胞凋亡3,5,38..然而，在MEFs中，我们发现K376R介导的RIPK 1泛素化的破坏不仅使细胞凋亡，而且对死亡也有影响。作为对肿瘤坏死因子-α的反应，Ripk 1K376R/K376R与之相比，细胞死亡Ripk 1+/+对照细胞(图1.3A)。经肿瘤坏死因子-α处理24h后，可清楚地检测到caspase-3和磷酸化的mlkl。Ripk 1K376R/K376R细胞，指示同时发生凋亡和坏死(图一。3B)。根据这些结果，突变体RIPK 1K376R在肿瘤坏死因子-α刺激12小时后，在复合物II中被发现，提示RIPK 1K376R促进RIPK 1从复合物Ⅰ向复合物Ⅱ的转变，从而导致细胞凋亡和坏死(图1)。三维空间)。此外，用TNF-α和Smac模拟物(TS)联合刺激MEF，Ripk 1K376R/K376R细胞比Ripk 1+/+细胞有(如图所示)。3A)。在caspase抑制剂zvad-fmk(Z)的存在下，TS诱导了更高水平的死亡。Ripk 1K376R/K376R与Ripk 1+/+细胞作为磷酸化MLKL的寡聚和RIPK 1和RIPK 3的聚集。Ripk 1K376R/K376RMEF早于Ripk 1+/+MEFs(图1.3A，c).

接下来我们将研究NF-κB信号缺陷对细胞凋亡的影响。Ripk 1K376R/K376R它对细胞死亡的敏感性。有趣的是，p65激活NF-κB信号S275D过表达未能挽救突变细胞从肿瘤坏死因子-α诱导的凋亡和死亡(补充图)。1B)。此外，用肿瘤坏死因子-α联合放射线酰亚胺(CHX)阻断NF-κB依赖基因的表达，Ripk 1K376R/K376RMEF对细胞死亡的敏感性仍高于Ripk 1+/+控制(图1.3A这些结果表明NF-κB缺陷是导致突变细胞死亡增加的主要原因。因此，我们认为RIPK 1K376R促进复合物Ⅱ的形成，促进凋亡和坏死的发生。

RIPK 1K376R诱导细胞死亡依赖于其激酶活性

研究表明，RIPK 1激酶活性的激活促进了RIPK 1的自磷酸化，是从复合物I向配合物II过渡的关键。29..以磷酸-Ser166-RIPK 1(p-ripk 1(S 166)抗体作为ripk 1激活的标志，我们发现在tf-α刺激的复合物I和复合物Ⅱ中，磷酸化的ripk 1更多。Ripk 1K376R/K376RMEFs(无花果)2一个,三维空间)。因此，我们想知道RIPK 1是否K376R-细胞死亡依赖于RIPK 1的激酶活性。RIPK 1激酶抑制剂坏死抑素-1(NEC-1s或N)的治疗能有效延长Ripk 1K376R/K376RMEFs对TNF-α(或TC或TS)的作用可诱导细胞凋亡和坏死。4A)。TZZ或TCZ的处理也得到了类似的结果(见图)。4A)。一致地，我们发现p-Ser166RIPK 1的水平在突变细胞中升高，并被NEC-1s显著阻断(图1)。5C)。因此，Caspase-3和p-MLKL的水平也降低，说明RIPK 1在K 376上泛素化是抑制RIPK 1激酶介导的细胞凋亡和坏死的必要条件。5C).

正如我们所观察到的，p-ripk 1在Ripk 1K376R/K376R胚胎(图1.1E)，接下来我们研究了NEC-1s对Ripk 1K376R/K376R体内致命性。在妊娠期用NEC-1s喂养杂合子母亲能有效地防止纯合子后代的致死表型(见图)。4B)。相比较Ripk 1K376R/K376R未经NEC-1s处理的胚胎在E13.5时死亡和贫血，NEC-1处理的突变胚胎看起来要正常得多，尽管它们的卵黄囊没有被完全拯救(图一)。4B)。组织学检查显示，NEC-1s治疗可有效地防止大鼠的组织丢失。Ripk 1K376R/K376R胚胎(图1.4C)。此外，免疫印迹分析证实，NEC-1S处理可抑制突变胚胎中以CC3为特征的RIPK 1磷酸化和凋亡。4F)。胎儿肝脏TUNEL阳性细胞数Ripk 1K376R/K376R胚胎经NEC-1S处理后明显减少，表明RIPK 1激酶抑制对大量细胞死亡有很大的抑制作用(图一)。4D，e)。综合来看，这些结果表明RIPK 1K376R-细胞过度死亡主要依赖于RIPK 1的激酶活性。

Ripk 1 K376R/−老鼠是活的，但会发展成严重的炎症。

假设RIPK 1的激活是导致细胞死亡的原因Ripk 1K376R/K376R接下来，我们测试RIPK 1激活量是否对这种致命性有影响。通过交叉Ripk 1K376R/+进Ripk 1+/−老鼠，我们Ripk 1K376R/−RIPK 1剂量仅为一半的小鼠K376R..令人吃惊的是，与之形成鲜明对比的是Ripk 1K376R/K376R在E13.5时完全异常的小鼠，Ripk 1K376R/−老鼠发育正常(无花果。1c，5A)。分离自Ripk 1K376R/−胚胎对肿瘤坏死因子-α诱导的细胞凋亡和坏死不敏感。Ripk 1K376R/K376RMEFs(图1.5B)。用TC、TS、TCZ和TZZ处理细胞也得到了类似的结果(见图)。5B)。根据这些数据，高水平的p-rIPK 1(S 166)与caspase-3被切割，并检测到MLKL的磷酸化。Ripk 1K376R/K376RMEF大大减少了Ripk 1K376R/−MEFs(图1.5C)。这些结果表明，可能存在一个激活RIPK 1的阈值。K376R能在胚胎发生过程中触发致死途径。

有趣的是，Ripk 1K376R/−老鼠可以成长到成年，尽管它们的体型要小得多，体重也比它们的白蚁控制的小得多(见图)。5D，f)。4周至8周龄的组织学检查Ripk 1K376R/−小鼠在包括皮肤、肺、肠和肝脏在内的多个器官中出现炎症迹象(图一)。5E)。流式细胞术分析Ripk 1K376R/−脾脏和淋巴结显示T细胞数量减少(CD3)+)和B细胞(B 220)+或CD 19+)而粒细胞(Gr-1)的数量却显著增加。+)和巨噬细胞(CD11b)+)(图1.5G)，表示Ripk 1K376R/−小鼠出生后出现全身炎症。这些数据表明，K376介导的RIPK 1泛素化对抑制出生后发育过程中的炎症至关重要。

损失Tnfr1拯救Ripk 1 K376R/K376R小鼠

进一步研究上游信号诱导Ripk 1K376R/K376R致命，我们越过了Ripk 1K376R进Tnfr1−/−或伊夫纳−/−背景生成Tnfr1−/− Ripk 1K376R/K376R和伊夫纳−/−Ripk 1K376R/K376R分别是老鼠。定时怀孕的结果显示Tnfr1全救出Ripk 1K376R/K376R胚胎发育过程中的致命性(图一。6A-c)。相反，消融伊夫纳对Ripk 1K376R/K376R胚胎，未能将它们从胚胎死亡中拯救出来(见图)。6A)。与这些观察相一致的是，在胎儿肝脏中，tUNEL阳性细胞数量显著增加，caspase-3被清楚地检测到。伊夫纳−/−Ripk 1K376R/K376R胚胎(附图)2A，b)。因此，这些结果表明，TNFR 1，而不是IFNR 1，诱导了触发死亡的信号。Ripk 1K376R/K376R小鼠胚胎发生过程中。

虽然烧蚀Tnfr1防止胚胎死亡Ripk 1K376R/K376R老鼠，Tnfr1−/−Ripk 1K376R/K376R小鼠在出生后2周左右死亡。六小时)。这些小鼠由于皮肤、肺、肝脏和肠道中明显的炎症细胞浸润而屈服于全身炎症(见图)。6E)。定量RT-PCR检测显示肺和肠内炎性细胞因子水平增高。Tnfr1−/−Ripk 1K376R/K376R老鼠(图1.6d)。此外，突变小鼠脾脏和胸腺中的免疫细胞组成也受到很大程度的破坏。相比较Tnfr1−/−对照组淋巴细胞数(CD3)+细胞和B 220+脾细胞减少，髓系细胞数目减少(CD11b)。+或Gr-1+细胞)大量增加(附图)。2D，e)。在胸腺中，T细胞的异常区使细胞总数显著减少，其中CD4细胞异常。+和CD8+单阳性人群增加，而CD4则增加。+CD8+双阳性人群减少(附图)。2D，e)。这些结果表明免疫系统的动态平衡Tnfr1−/−Ripk 1K376R/K376R小鼠被破坏，提示K 376介导的RIPK 1泛素化也有助于调节免疫稳态。

然后，我们试图找出婴儿出生后死亡的原因。Tnfr1−/−Ripk 1K376R/K376R..组织学检查显示Tnfr1−/−Ripk 1K376R/K376R小鼠表现出组织丢失和结构异常，说明这些表型可能是大量细胞死亡的结果。6E)。用裂解caspase-3作为细胞凋亡的标志，我们观察到在皮肤、肝脏和肠道中没有检测到明显的阳性细胞。Tnfr1−/−Ripk 1K376R/K376R提示细胞凋亡并不是这些表型的主要原因(附图)。2C)。然而，当我们治疗骨髓来源的巨噬细胞时，Tnfr1−/−Ripk 1K376R/K376R脂多糖(LPS)或聚(I：C)小鼠在zVAD存在下，细胞较对照组更易受损伤，RIPK 1和RIPK 3的磷酸化作用更为明显，提示RIPK 3介导的坏死作用在这种情况下起着重要作用(附图)。2F，g)。因此，我们通过交叉检测RIPK 3介导的信号传递的贡献。RIPK 3−/−进Tnfr1−/−Ripk 1K376R/K376R老鼠。重要的是，RIPK 3的缺失挽救了Tnfr1−/−Ripk 1K376R/K376R并使他们得以正常发展(图中图)。6f，h)。此外，组织学检查显示RIPK 3消融术能明显防止组织丢失和炎症。Tnfr1−/−Ripk 1K376R/K376R老鼠(图1.6g)。综上所述，这些发现揭示了K 376的RIPK 1泛素化在抑制出生后发育过程中RIPK 3依赖的炎症中的关键作用。

Fadd和RIPK 3/MLKL的消融治疗Ripk 1K376R/K376R小鼠

鉴于RIPK 1的激活导致了随后的两条信号通路，包括FADD/Caspase-8介导的凋亡和RIPK 3/MLKL介导的坏死。Ripk 1K376R/K376R死亡是由这些途径造成的。首先，我们穿越了Ripk 1K376R/+进RIPK 3−/−或MLKL−/−检测小鼠对死亡的贡献。结果RIPK 3−/−Ripk 1K376R/K376R和MLKL−/−Ripk 1K376R/K376R小鼠在胚胎发生过程中死亡，因为我们没有观察到杂合子育种的纯合子后代(附图)。3B)。定时怀孕的结果表明RIPK 3−/−Ripk 1K376R/K376R和MLKL−/− Ripk 1K376R/K376R胚胎在E13.5出现正常，但在E14.5时表现出明显的发育异常(附图)。3A)。虽然烧蚀RIPK 3或MLKL稍微延长了Ripk 1K376R/K376R胚胎的致命性并没有被阻止。这些结果表明RIPK 3/MLKL-非依赖性通路的参与。

接下来，我们Ripk 1K376R/+进RIPK 3−/−FADD−/−和MLKL−/−FADD−/−小鼠产生RIPK 3−/−FADD−/−Ripk 1K376R/K376R和MLKL−/−FADD−/−Ripk 1K376R/K376R分别是老鼠。烧蚀FADD和RIPK 3或MLKL完全拯救了Ripk 1K376R/K376R并表现出正常的发育和成熟(图一)。7a，b)。从这些三重突变小鼠中分离到的MEF对肿瘤坏死因子(α)具有耐药作用，能诱导细胞凋亡和坏死，而激活NF-κB信号传导通路有缺陷Ripk 1K376R/K376R细胞，表明大量细胞死亡而不是受损的NF-κB激活导致了Ripk 1K376R/K376R小鼠(附图)4B，c)。RIPK 1K376R在三突变小鼠的主要器官中广泛检测到，其表达水平与WT对照组相当，说明ripk 1的表达水平与wt对照组相当。K376R不影响RIPK 1的表达。4A)。到了年纪，RIPK 3−/−FADD−/−Ripk 1K376R/K376R和MLKL−/−FADD−/−Ripk 1K376R/K376R小鼠淋巴细胞增殖综合征伴CD3蓄积+B 220+外周血淋巴细胞RIPK 3−/−FADD−/−和MLKL−/−FADD−/−老鼠(图1.7D，f，补充图。4D)19,20,21,22,41,42,43..本病以淋巴结肿大、脾肿大为特征，破坏了淋巴结和脾脏的正常结构(图一)。7C，d)。流式细胞术分析显示，脾脏和淋巴结中的多个细胞数量显著增加，其中包括淋巴细胞(T细胞/B细胞)、巨噬细胞和粒细胞(图1)。7E)。此外，炎症在多种组织中被观察到。RIPK 3−/−FADD−/−Ripk 1K376R/K376R或MLKL−/−FADD−/−Ripk 1K376R/K376R小鼠，表明全身炎症的发生。7C)。这些数据表明，阻断FADD介导的凋亡通路和RIPK 3/MLKL介导的死亡途径可以挽救胚胎的致死性。Ripk 1K376R/K376R小鼠，虽然这些小鼠发展淋巴增殖疾病与全身炎症。

讨论

在本报告中，我们发现在体内由K 376点突变引起的RIPK 1泛素化破坏在E12.5时引起胚胎死亡，这与Ripk 1缺乏的老鼠。从这个结果中产生了一个基本的问题：为什么种系Ripk 1K376R突变引起胚胎发生过程中的致死性Ripk 1不是吗？这个问题的答案可能来自RIPK 1的独特结构，它包含一个C末端死亡域(DD)，一个包含Rhim和N端Ser/Thr激酶结构域的中间结构域。dd和rhim可分别招募fdd和ripk 3启动外源性凋亡和坏死，而中间结构域可介导NF-κB信号的激活。28,44,45..在本研究中，我们用R 376取代中间结构域的K 376来阻止RIPK 1的多泛素化。这种突变导致了两种后果：NF-κB激活缺陷和细胞过度死亡。结论如下：(1)K 376介导的RIPK 1泛素化在体内激活NF-κB；(2)K 376介导的RIPK 1泛素化对抑制细胞凋亡和凋亡具有重要作用。事实上，RIPK 1K376R突变不影响RIPK 1的表达和其他结构域的功能，但易激活RIPK 1。RIPK 1激酶抑制剂nec-1或删除一种激酶可防止这种情况发生。Ripk 1K376R说明RIPK 1的过度激活导致细胞凋亡和坏死，导致胚胎发生过程中的致死性。因此，RIPK 1泛素化抑制RIPK 1本身在胚胎发育过程中激活细胞死亡，这就是为什么删除RIPK 1的原因。Ripk 1在这个阶段不会导致致命的表型。

Ripk 1−/−小鼠出生后不久就死亡，这种死亡最初被认为是由于RIPK 1失去了促进生存的功能，RIPK 1介导NF-κB信号传导。46..以前曾研究过NF-κB信号通路在维持正常胚胎发育中的作用，而缺乏NF-κB组分的小鼠在胚胎发生过程中由于多个组织中大量的细胞死亡而死亡。47,48,49..此外，RIPK 1激酶的失活也能挽救胚胎的致死性。雷拉-缺乏小鼠50,51..这些小鼠的表型与我们在Ripk 1K376R/K376R表明NF-κB信号受损可能是导致小鼠胚胎死亡的原因之一。Ripk 1K376R/K376R老鼠。然而，当治疗Ripk 1K376R/K376RTNF-α联合CHX可阻断NF-κB依赖基因的表达，Ripk 1K376R/K376RMEF更容易受到刺激。此外，p65还能激活NF-κB信号。S275D过表达未能阻止突变细胞死亡。此外，据报道RIPK 1 K 377-介导的抑制肿瘤坏死因子-α诱导的细胞凋亡在刺激早期与NF-κB无关。38，这与我们在Ripk 1K376R/K376R细胞。因此，NF-κB缺陷可能不是导致Ripk 1K376R/K376R致命。

围产期死亡Ripk 1−/−两只老鼠都被烧蚀而完全获救。caspase-8/FADD和RIPK 319,20,21,22..因此，RIPK 1被认为可以抑制FADD-Caspase-8和RIPK 3参与的致死途径。然而，RIPK 1抑制围产期死亡的机制尚不清楚。RIPK 1基因突变导致围产期死亡，类似于Ripk 1−/−老鼠，这种致命性可以通过消融RIPK 3或Zbp 135,36..提示RIPK 1通过Rhim结构域抑制RIPK 3/ZBP 1介导的围产期坏死。在我们的研究中，RIPK 3抢救产后死亡Tnfr1−/−Ripk 1K376R/K376R老鼠。因此，我们认为RIPK 1 K376对抑制RIPK 3依赖的坏死和出生后的炎症具有重要作用。有趣的是，在RIPK 1的设置中K376R突变后，RIPK 1不能通过Rhim阻止出生后的坏死，提示K 376介导的泛素化可能调节Rhim介导的抑制RIPK 3依赖的坏死。

虽然烧蚀Tnfr1获救Ripk 1K376R/K376R小鼠胚胎发育过程中，Tnfr1−/−Ripk 1K376R/K376R老鼠死后死亡。这些结果表明，K 376上的RIPK 1泛素化可能在不同发育阶段介导了不同的途径。TNF/TNFR 1是K 376介导的胚胎发育过程中的主要上游信号，而在出生后则有额外的信号参与。虽然目前尚不清楚哪些信号通路参与了研究，但对Ripk 1−/−老鼠可以提供一些候选人。类似于我们在Tnfr1−/−Ripk 1K376R/K376R老鼠，Tnfr1−/−Ripk 1−/−小鼠出生后2周内死亡21..有趣的是，删除TRIF或I型干扰素受体延长Ripk 1−/−Tnfr1−/−老鼠，虽然没有一只老鼠在断奶后存活下来21..此外，删除MyD 88可提高小鼠的生存期。Ripk 1−/−小鼠22..因此，我们假设，除了TNFR 1，IFNR 1和TRIF是很有可能触发RIPK 1 K 376的路径。有趣的是，RIPK 3的消融拯救了Tnfr1−/−Ripk1K376R/K376R小鼠，下游信号介导的致死性表型依赖于RIPK 3。最近的研究表明，RIPK 3除了介导死亡外，还具有更多的功能，因此还需要进一步研究MLKL在这一信号通路中的作用。

通过改变肿瘤坏死因子-α的泛素化状态，RIPK 1可以传递有利于生存或死亡的信号。RIPK 1 K376的种系突变导致胚胎在E12.5时死亡，这是通过删除RIPK 1 K 376而防止的。Tnfr1尽管Tnfr1−/− Ripk 1K376R/K376R小鼠出生后死于RIPK 3介导的炎症反应。值得注意的是，需要一个RIPK 1副本来防止FADD/RIPK 3或FADD/MLKL依附杀伤力Ripk 1K376R/K376R小鼠，可能与RIPK 1激活阈值有关(补充图)。5)。这些遗传证据提供了对RIPK 1泛素化在体内功能的全面了解，而泛素化对胚胎发育和免疫稳态都是必不可少的。

重要的是，这些发现可以帮助解释一些似乎自相矛盾的结果，从以前报道的基因研究。此外，最近的一项研究强调了RIPK 1在与免疫缺陷、关节炎和肠道炎症相关的人类疾病中的作用，证实了RIPK 1在人体免疫系统中的作用。52..因此，ripk 1泛素化在调控肿瘤坏死因子-α介导途径以外的特定信号通路中的潜在作用，将为人类相关疾病和荷瘤小鼠提供新的治疗机会。K376R突变可以用来探讨RIPK 1泛素化在多种人类疾病模型中的作用。

方法

小鼠

小鼠被安置在一个特定的无病原体(SPF)设施中。RIPK 3−/−, FADD+/−和MLKL−/−,和伊夫纳−/−鼠标线在前面已经描述过了。41,53..Ripk 1K376R/+和Ripk 1+/−小鼠采用CRISPR-Cas9突变系统(生物射线实验室有限公司，上海)。老鼠Ripk 1K376R突变结构对应于以下基因组位置(NC_000079.6)chr 13：34027834-34027836。Ripk 1K376R/+小鼠基因分型引物：5‘CCATCTCCAGCCCCTA和5’TGCACTCAATTCCACGA扩增690 bp的DNA片段进行测序。Ripk 1+/−利用sgRNA(5‘-GACCTAGACAGCGGGCTT-3’)的CRISPR-Cas9突变系统，在第2外显子编码区缺失101 bp。Ripk 1+/−小鼠基因分型引物(RIPK1-F：5‘-GGTACTTTGGGAGTGAGG-3’和RIPK 1-R：5‘-CAGCAATCATGCTTCTG-3’)扩增430 bp野生型，329 bp敲除DNA片段。如有要求，将提供补充资料。在本研究中使用的所有小鼠已经回溯到C57BL/6背景上超过8代。动物实验是按照中国科学院上海生物科学研究所营养与健康研究所动物保护与利用机构委员会指导方针进行的。

试剂

Smac模拟物、环己酰亚胺和脂多糖是从Sigma购买的。TNF-α和z-VAD分别来自R&D(明尼阿波利斯，MN，美国)和CalBiochem(美国加利福尼亚州阿纳海姆).坏死抑素-1是从恩佐生命科学(亚历克西斯，美国)购买.采用以下抗体进行免疫沉淀实验：RIPK 1(1：2000，BD生物科学，610459)，RIPK 1(1：2000，细胞信号技术，3493P)，p-RIPK 1(1：1000，元俊英实验室的礼物)，RIPK 3(1：5000，Prosci，2283)，p-RIPK 3(1：1000，1：1000)，RIPK 3(1：5000，Prosci，2283)，P-RIPK 3(1：1000)。Abcam，ab195117)，Caspase-8(1:2000，Enzo Life Science，ALX-804-447-C100)，MLKL(1:2000，Abgent，ap14272b)，p-MLKL(1:1000，Abcam，ab196436)，ß-actin(1:5000，Sigma，A3854)，Tublin(1:5000，Sigma，T6199)，IkBα(1:2000，Cell Signaling Technology，9242S)，p-IkBα(1:1000，Cell Signaling Technology，9246S)，p-ERK(1:2000，Cell Signaling Technology，9101S)，ERK(1:2000.Cell Signaling Technology，9102S)，p-p38(1:2000，Cell Signaling Technology，9211S)，p38(1:2000，Cell Signaling Technology，9228S)，p-p65(1:2000，Cell Signaling Technology，3033S)，p65(1:2000，Cell Signaling Technology，4764S)，p-JNK(1:1000，Cell Signaling Technology，9251S)，JNK(1:2000，Cell Signaling Technology，9252S)，PARP(1:2000，Cell Signaling Technology，9542S)，Caspase-3(1:1000，Cell Signaling Technology，9662S)，TBP(1:2000，Cell Signaling Technology，44059S)，FADD抗体来自张建科实验室(1：2000，ThomasJefferson大学)。用细胞效价-GLO试剂盒(Promega)测定细胞活力。

细胞株

小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)在Dulbecco改良的Eagle培养基(HyClone，SH 30243.LS)中加入10%胎牛血清(HyClone，SH 30084.03)、1%青霉素(100 IU/ml)/链霉素(100μg/ml)和2mm L-谷氨酰胺(5%CO2)，于37°C原代培养。Ripk 1+/+和Ripk 1K376R/K376R从E11.5小白蚁胚胎中分离出MEFs。取头部和内脏组织，每胚用4 ml Tripsin/EDTA溶液(Invitrogen，25200072)孵育1h，再加入等量培养液，反复灌流。原代MEFs在含15%FBS的高糖DMEM中培养.在永生化过程中，采用脂质体2000(Invitrogen，11668019)，根据厂家的指示，将SV 40小+大T抗原表达质粒(Addgene，22298)转染MEFs。

细胞存活试验

细胞存活率用CellTiter-Glo发光细胞活力检测试剂盒(Promega，G 7572)测定，发光用微板发光计(Thermo Science)记录。

免疫印迹和免疫沉淀

在不同时间点取细胞，用PBS洗涤，用含100 mm DTT的1×SDS样品缓冲液溶解。细胞裂解液经12，000×离心10 min后清除。g，用BCA试剂盒(ThermoScience，23225)定量，然后与SDS样品缓冲液混合，在95℃下煮5 min。样品经SDS-PAGE分离后，用110 v转移到PVDF膜上，用化学发光基质(Thermo Science)检测蛋白质。免疫沉淀RIP 1细胞用裂解缓冲液(Tris-HCl 20 mm(pH7.5)、NaCl 150 mm、EDTA 1mm、EGTA 1mm、TritonX-100 1%、甘油10%、蛋白酶抑制剂鸡尾酒、焦磷酸钠2.5mm、β-甘油1mm、Navo)溶解。41mm，亮肽1μg/ml)。细胞裂解液与1μg的RIP 1抗体孵育3h(BD生物科学，610459)。用35μ1的G-琼脂糖微球在端部搅拌一夜(4°C)后，用裂解缓冲液对琼脂糖进行三次洗涤。免疫沉淀在SDS中变性，进行SDS-PAGE，免疫印迹。在NP-40缓冲液(Tris-HCl 20 mm(pH7.5)，NaCl 120 mm，EDTA 1mm，EGTA 1mm，NP-40 0.5%，甘油10%，蛋白酶抑制剂鸡尾酒，焦磷酸钠2.5mm，β-甘油磷酸盐1mm，Navo)中提取免疫共沉淀复合物I。41mm，亮肽1μg/ml)，用100 ng/ml TNF-α-标志刺激后(ENZO生命科学，ALX-522-009-C050)。细胞裂解液用标记珠(Sigma，A 2220)孵育4h，用NP-40缓冲液洗涤3次。免疫沉淀在SDS中变性，进行SDS-PAGE，免疫印迹。所有印迹的未处理扫描作为补充图提供。6在补充资料.

MLKL寡聚检测

细胞经TZ或TSZN处理后，立即用2×DTT(pH6.8)125 mm、SDS 4%、甘油20%、溴酚蓝0.02%裂解。用SDS-PAGE法分离细胞总裂解液，转染PVDF膜，用MLKL抗体进行免疫印迹。

流式细胞术

从小鼠胸腺、脾脏和淋巴结中分离淋巴细胞。本研究采用抗小鼠CD3(1：1000，eBioscience，11-0031-82)，CD4(1：1000，eBioscience，47-0042-82)，CD8(1：1000，Biolegend，100732)，B 220(1：1000，eBioscience，12-0452-83)，Gr-1(1：1000，eBioscience，12-5931-83)，CD11b(1：1000，eBioscience，17-0112-83)的抗体进行流式细胞术分析。用荧光结合抗体(1×PBS，3%BSA，1mM EDTA，0.1%NaN 3)将淋巴细胞悬液在冰上染色半小时。染色后，用PBS冲洗两次，立即用流式细胞仪(FACS Aria III，BD生物科学)分析。

RT-PCR

根据制造商的指示，用Trizol试剂(LifeTechnologies)提取总RNA。定量后，1μg总RNA反向转录为互补DNA(TAKARA)。在ABI 7500实时荧光定量PCR仪上，用SYBR Green实时PCR仪对所指示基因的转录水平进行定量RT-PCR。引物序列如下。MCP-15‘-AGGTGCCCACAAGACTGTA-3’和5‘-ATGTCTGGACCCATTTTCT-3’；A205‘-CTCAACGAGATTCCATGAAG-3’和5‘-CCTGTTAGTTCGAGGCATGT-3’；ICAM-15‘-CTTGTAGAGTGACTGA-3’和5‘-GCTGAAAAGTTGTAGACTG-3’；IκBα5‘-GATCCCCAGGTGAGG-3’和5‘-GCAATTTTTGGCTGGTTGG-3’；IRF 15‘-CAGAGAAAGAGAAGAAGAAAGC-3’和5‘-CACACGGGAGAGGCTGG-3’；伊-1b5‘-CCACTGGTACATCAGCAC-3’和5‘-TCTGCTTTCATTCACGAAAGG-3’；CCL 25‘-TGAATGTGATTGACCCGT-3’和5‘-AAGGCATCATCCGAGTC-3’；CXCL 1：5‘-CAAGAGATCCAGAGCTTGAAGGT-3’和5‘-GTGTATATGACTTCGGTTTGG-3’；IFNG5‘-螨虫-3’和5‘-TGAGCTCATTGAATGTGG-3’；

统计分析

本文提供的数据是至少三个独立实验的代表性结果。用学生的数据评价数据的统计意义t用GraphPad棱镜软件进行测试和统计计算。

报告摘要

有关研究设计的进一步资料，可参阅自然研究报告摘要链接到这篇文章。

数据可用性

提交人声明，本研究中提供的所有数据均在数字和数据中提供。补充资料档案。图中的源数据。3一个,4A，E，5b，f，g，6d，7E，f和补充无花果1B, 2E,f作为源数据文件提供。支持这项研究的其他数据可在合理要求下从相应的作者处获得。