K63连接泛素化调节RIPK 1激酶活性以防止胚胎发生和炎症过程中的细胞死亡

受体相互作用蛋白激酶1(RIPK 1)是通过其激酶活性调节细胞死亡的关键因子。然而，对其激酶活性的调控仍不甚清楚。在这里，我们生成Ripk 1K376R/K376RLys(K)63连接的RIPK 1泛素化受损的敲入小鼠。敲入小鼠表现出早期胚胎死亡，这是由于TAK 1介导的抑制RIPK 1激酶活性和形成更多的TNFR 1复合物II所致的大量细胞死亡所致。Ripk 1K376R/K376R细胞对肿瘤坏死因子α的反应。虽然TNFR 1缺乏症延迟了致命性，但伴随着RIPK 3和Caspase 8的缺失完全阻止了胚胎的死亡。Ripk 1K376R/K376R老鼠。值得注意的是，Ripk 1K376R/-小鼠存活，但发生严重的全身炎症，主要由RIPK 3依赖的信号通路驱动，说明RIPK 1的Lys 376残基上的K63连接泛素化也参与了炎症过程。我们的研究揭示了K 376上K63连接泛素化调节RIPK 1激酶活性以控制细胞死亡程序的机制。

受体相互作用蛋白激酶1(RIPK 1)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，在调节细胞存活或细胞死亡的各种免疫信号通路中起着至关重要的作用。1..它在肿瘤坏死因子受体1(Tnfr 1)信号通路中的作用已被广泛研究。2..TNFR 1信号通路的激活可以调节两个相反的下游事件，包括形成介导核因子-κB(NF-κB)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)激活的tnfr 1复合物I(Complex I)。3,4,5，并形成TNFR 1复合物II(复合物II)，介导细胞凋亡或坏死，导致细胞死亡。6,7,8,9..RIPK 1激酶活性是调节复合物Ⅰ向复合物II转变的关键，但对RIPK 1激酶活性的调控尚不清楚。

已有研究报道RIPK 1磷酸化可调节RIPK 1激酶活性。IκB激酶α/β(IKKα/β)复合物直接磷酸化复合物I中的RIPK 1，保护细胞免受RIPK 1激酶依赖的死亡。抑制IKKα/β可增强RIPK 1激酶活性，促进复合物II的形成10..另一种激酶MK 2可在S 321和S 336处直接磷酸化RIPK 1，抑制RIPK 1激酶依赖的死亡，MK 2磷酸化RIPK 1，抑制RIPK 1激酶活性，抑制R11,12,13..最近的一项发现报道了tbk 1(坦克结合激酶1)和ikkε磷酸化RIPK 1来防止ripk 1依赖的细胞死亡。14..因此，RIPK 1的磷酸化与其激酶活性和功能转变有关。

RIPK 1的泛素化状态也参与调节其功能转变。RIPK 1中显示了几种泛素化，包括K11-、K48-、K63-和MET 1-连接泛素化。15..细胞凋亡抑制蛋白-1(CIAP 1)和细胞凋亡蛋白2(CIAP 2)是rIPK 1修饰K63连接泛素化的直接E3连接酶。16,17,18..RIPK 1的K63连接泛素化是肿瘤坏死因子-肿瘤坏死因子(TNF-α，TNF-α)诱导NF-κB活化所必需的，同时也能抑制细胞死亡。19,20,21..线性泛素链组装复合物(LUBAC)能将MET 1连接的泛素化链与ripk 1结合，促进NF-κB的活化。22,23..缺乏LUBAC组分可增强RIPK 1激酶活性，促进复合物II的形成24,25..其他e3泛素连接酶，包括核心炸弹-2(MIB 2)和Hect结构域以及含有kankyrin重复序列的E3连接酶1(HACE 1)也与RIPK 1介导的细胞死亡有关。26,27..此外，去泛素酶参与了RIPK 1的活化调控。例如，a20可以介导ripk 1上k63连接泛素化链的断裂。28，CYLD可以在RIPK 1上同时切割K63和MET 1泛素化链。29,30..最近的一项研究报告，abin-1通过将met 1连接的泛素化与k63连接的去泛素化连接来调节ripk 1的激活，这表明不同泛素化链之间对ripk 1激活的调控存在串扰。31.

我们和其他人曾报道过，人RIPK 1中的Lys 377(K 377)是ripk 1中k63连接泛素化的残基，在小鼠ripk 1中被保守为K 376。19,20..在本研究中，我们通过生成k63连接泛素化来确定k63连接泛素化在ripk 1上的生理功能。Ripk 1K376R/K376R敲开老鼠。这些敲入的老鼠由于严重的细胞死亡而表现出早期的胚胎死亡。我们阐明了K63连接的泛素化在RIPK 1的K 376上促进肿瘤生长因子-β活化激酶1(TAK 1)介导的抑制RIPK 1激酶活性的分子机制。本研究揭示了RIPK 1在K 376上的K63连接泛素化在胚胎发生和全身炎症过程中的生理功能和分子机制。

Ripk 1 K376R/K376R小鼠胚胎致死

为了确定k63连接泛素化在ripk 1上的生理功能，我们生成了Ripk 1K376R/K376R用CRISPR-Cas9技术敲入小鼠，也产生了一株RIPK 1基因敲除(KO)小鼠，其中RIPK 1在中间结构域的翻译停止在D 367处(如图所示)。1A)。结果表明，RIPK1-KO小鼠因多器官细胞死亡和严重炎症而具有围产期致死性。32,33..出乎意料，Ripk 1K376R/K376R小鼠在1个月大时不能被检测到(如图所示)。1B)，这表明Ripk 1K376R/K376R老鼠可能会胚胎致死。确定确切的胚胎阶段Ripk 1K376R/K376R小鼠死亡后，我们分析了不同胎龄的胚胎。在E9.5~E11.5之间没有发现明显的形态学差异。Ripk 1K376R/K376R和Ripk 1+/+胚胎(图1.1C)。然而，从E12.5，Ripk 1K376R/K376R与之相比，胚胎变小，形态异常。Ripk 1+/+胚胎(图1.1C)。.的数目Ripk 1K376R/K376R胚胎在E13.5和NO时显著减少。Ripk 1K376R/K376R胚胎可观察到E14.5(补充图)。1)。苏木精和伊红(H&E)染色结果显示Ripk 1K376R/K376R胚胎主要在E12.5的肝脏区观察到(见图)。1D)。末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记(TUNEL)染色进一步分析表明：Ripk 1K376R/K376R胚胎中TUNEL阳性细胞多于TUNEL阳性细胞。Ripk 1+/+胚胎，尤其是肝脏切片中的胚胎，表明肝脏细胞大量死亡(见图)。1E)。始终如一，Ripk 1K376R/K376R胚胎也有更多的Caspase 8-阳性区域(如图所示)。1F)。此外，炎症细胞因子和趋化因子，包括趋化因子配体1(Cxcl 1)、cxcl 2、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子(α)、干扰素-β(IFN-β)和干扰素-γ均显著升高。Ripk 1K376R/K376R胚胎(图1.1g)。总的来说，这些数据表明Ripk 1K376R/K376R小鼠在E13.5左右死亡是由于细胞过度死亡和严重炎症所致。

Ripk 1K376R/K376R突变导致胚胎死亡。a生成策略的示意图概述Ripk 1K376R/K376R和Ripk 1−/−小鼠采用CRISPR-Cas9技术。KD，激酶结构域；ID，中间结构域；DD，死亡域；Rhim，RIP同型相互作用基序。b杂交后代小鼠(1个月龄)的统计分析Ripk 1K376R/+老鼠。c以E9.5~E13.5(刻度BAR，1μm)为标记基因型的胚胎代表图像。d胚胎的苏木精和伊红(H&E)染色(左，标尺，500μm)和肝脏切片(右，鳞条，100μm)在E12.5。eE12.5(标尺，100μm)肝切片TUNEL染色的显微图像和统计结果；Ripk 1+/+胚胎，n=3；Ripk 1K376R/K376R胚胎，n=3)。fE12.5(刻度棒，50μm)3种不同区域Caspase 8卵裂胚胎的显微图像和统计结果；Ripk 1+/+胚胎：n=3；Ripk 1K376R/K376R胚胎：n=3；RIPK 3−/−Caspase 8−/−胚胎：n=3)。gE12.5时胚胎匀浆炎性细胞因子和趋化因子表达的qRT-PCR分析。数据平均为±S.E.M。(Ripk 1+/+胚胎：n=3；Ripk 1K376R/K376R胚胎：n=3)。统计学意义是用两尾不成对的方法来确定的。t测试，*P < 0.01; ***P < 0.001, ****P < 0.0001

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Ripk 1 K376R/K376R突变促进细胞凋亡和坏死

为了进一步研究其确切的分子机制，我们从E11.5野生型(WT)和小鼠胚胎成纤维细胞(Wt)中分离出永生化的小鼠胚胎成纤维细胞(Mef)。Ripk 1K376R/K376R胚胎。我们还生成了Ripk 1−/−E11.5胚胎的MEF。虽然RIPK 1的一个截短片段在Ripk 1−/−补充图2A)，它不能与RIPK 3(补充图3)交互。2B)，指示此截断的RIPK 1的空函数。自Ripk 1K376R/K376R由于大量细胞死亡，胚胎在E13.5左右死亡，我们假设Ripk 1K376R/K376RMEFs对肿瘤坏死因子(α)诱导的细胞死亡更敏感。单凭肿瘤坏死因子α的刺激，Ripk 1K376R/K376RMEFs显示更高水平的细胞死亡和caspase 3活性，甚至高于Ripk 1−/−MEFs(图1.2A和补充图。2C)。此外，肿瘤坏死因子α加环己酰亚胺(CHX)敏化Ripk 1K376R/K376RMEFs对细胞死亡有抑制作用，而caspase抑制剂zVAD.fmk对细胞死亡无抑制作用。2B)。肿瘤坏死因子α/chx/zvad可独立于caspase诱导坏死，ripk 1激酶抑制剂nec-1可完全阻断caspase引起的细胞死亡。Ripk 1K376R/K376RMEFs(图1.2B)，提示RIPK 1中K376R突变通过RIPK 1激酶活性引起细胞对坏死的敏感性。而且，通过刺激肿瘤坏死因子α/chx，Ripk 1K376R/K376R细胞具有较高的Caspase 3活性，说明细胞凋亡较多。2C).

Ripk 1K376R/K376R突变使细胞对凋亡和坏死敏感。a永生化细胞死亡Ripk 1+/+, Ripk 1K376R/K376R，和Ripk 1−/−用免疫组织化学方法检测不同时间点肿瘤坏死因子(α)对MEFs的影响。b永生化细胞死亡Ripk 1+/+, Ripk 1K376R/K376R，和Ripk 1−/−不同刺激剂作用5h后，用SyoxGreen法测定MEFs的活性。T，TNFα；C：环己酰亚胺；Z：zVAD.fmk；N：坏死抑素-1。cCaspase 3活性Ripk 1+/+, Ripk 1K376R/K376R，和Ripk 1−/−用DEVD-AMC荧光法测定不同刺激剂处理5 h的永生化MEFs.d–h Ripk 1+/+, Ripk 1K376R/K376R，和Ripk 1−/−用肿瘤坏死因子(α)治疗永生化MEF(d)，肿瘤坏死因子α/CHX(e)，α/zVAD.fmk(f)，或α/smac仿制品(g, h对坏死抑素-1进行预先处理或不处理，并对细胞裂解物进行Westernblotting分析。在……里面a–h，α，20 ng/ml；CHX：10μg/ml；zVAD.fmk，20μM；Smac仿制品，5μM；Necrostatin-1，10μM。a–c，数据平均为±S.E.M。(n=每个基因型3个独立细胞样本)。统计学意义是用两尾不成对的方法来确定的。t测试，N.S.，P>0.05，*P < 0.01, ***P < 0.001, and ****P < 0.0001

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接下来，我们研究了细胞死亡机制对肿瘤坏死因子α诱导的细胞死亡的影响。Ripk 1K376R/K376RMEFs。类似于缺乏RIPK 1的MEF，Ripk 1K376R/K376R肿瘤坏死因子(α)刺激后MEFs产生的Caspase 3比WT对照组更多(如图所示)。二维空间)，建议Ripk 1K376R/K376R突变可促进肿瘤坏死因子α诱导的细胞凋亡。肿瘤坏死因子α/CHX处理不仅可诱导更多的Caspase 3/8在Ripk 1K376R/K376RMEFs也能诱导更高水平的磷酸化混合谱系激酶样假激酶(MLKL)，这是一种坏死的生物标志物(图)。2E)。以往的研究表明，RIPK 1在S 166上的磷酸化可诱导RIPK 1激酶活性，并进一步促进下游rIPK 3和MLKL的磷酸化，激活RIPK 1依赖的坏死。34,35..刺激肿瘤坏死因子α/zVAD后，S 166上RIPK 1磷酸化和MLKL磷酸化均显著增加。Ripk 1K376R/K376RMEFs(图1.2F)。这些磷酸化事件可以完全防止使用NEC-1(图1)。2F)。Smac是一种线粒体蛋白，可以释放到胞浆中，促进caspase在细胞色素中的活化。c/apaf-1/caspase 9通路36..与上述结果一致，Ripk 1K376R/K376R在SMAC模拟物加肿瘤坏死因子α刺激的条件下，MEFs表现出更多的Caspase 3/8断裂和RIPK 1的磷酸化。2G)。有趣的是，nec-1能显著抑制caspase 3的活性和细胞死亡。Ripk 1K376R/K376RMEFs(图1.2B，c，h和补充图。二维空间RIPK 1激酶活性可能与诱导细胞凋亡和凋亡有关。综合起来，这些数据清楚地表明Ripk 1K376R/K376R突变促进RIPK 1依赖的凋亡和坏死。

Ripk 1 K376R/K376R突变增强RIPK 1激酶活性

已有研究表明，Lys(K)377残基是人RIPK 1中主要的K63泛素化位点。为了证实Lys(K)376残基是否是小鼠RIPK 1中的K63泛素化位点，我们检测了RIPK 1在MEFs中的K63泛素化水平。在α刺激下，WT RIPK 1的k63连接泛素化水平增加，但Ripk 1K376R/K376R突变显著降低了K63连接的RIPK 1泛素化(图1)。3A和补充图。3A)，对RIPK 1(补充图1)的MET 1连接泛素化链没有影响。3B)。由于RIPK 1在配合物I中的K63连接泛素化作用可以作为插入位点，以进一步诱导nf-κB的激活，因此我们研究了复合物I的形成，并发现：Ripk 1K376R/K376R突变可显著降低复合物I中Nemo、A20、TAK 1和MK 2的生成，而不影响cIAP 1和Tradd(肿瘤坏死因子受体1型相关死亡域)的形成。3B)。自Ripk 1K376R/K376R突变破坏了复合物I的形成，随后我们检测了NF-κB的激活，发现p65易位在Ripk 1K376R/K376RMEFs(图1.3C)。我们还检测到了几个NF-κB-靶向基因的表达，它们的表达水平均较低。Ripk 1K376R/K376R补充图3C).

Ripk 1K376R/K376R突变增加了RIPK 1激酶的活性。a永生化Ripk 1+/+, Ripk 1K376R/K376R，和Ripk 1−/−MEFs用肿瘤坏死因子α(20 ng/ml)处理。用K63管分离得到K63泛素化蛋白，并用westernblot分析.b用抗国旗树脂免疫沉淀肿瘤坏死因子-rscRipk 1+/+和Ripk 1K376R/K376R用α(100 ng/ml)对永生化MEFs进行一定时间的处理.免疫复合物用免疫印迹法检测。c核提取物Ripk 1+/+, Ripk 1K376R/K376R，和Ripk 1−/−用肿瘤坏死因子α(20 ng/ml)处理永生化MEF，用免疫印迹法检测p65和增殖细胞核抗原(PCNA)抗体。d Ripk 1+/+和Ripk 1K376R/K376R以标记的IκBα-SR稳定表达的永生化MEF，用α(40 ng/ml)刺激不同时间。免疫组化法检测细胞死亡情况。e, f复合物II用RIPK 1抗体免疫沉淀。e)或RIPK 3抗体(f)在Ripk 1+/+, Ripk 1K376R/K376R，和Ripk 1−/−用TZ处理指定时间的永生化MEF(e)或TZ(f)。免疫复合物用免疫印迹法检测。T，TNFα(20 ng/ml)，S，Smac模拟物(1μM)，Z，zVAD.fmk(1μM)。g Ripk 1+/+和Ripk 1K376R/K376R以标记TAK 1/TAK 1或TAK 1-∆N表达的永生化MEF，用α(20 ng/ml)加zVAD.fmk(10μM)刺激不同时间。用免疫印迹法检测细胞裂解物。h细胞死亡Ripk 1+/+和Ripk 1K376R/K376R用不同刺激剂处理5 h的永生化MEFs，用SyoxGreen阳性率测定。T：TNFα(20 ng/ml)，Z：zVAD.fmk(10μM)，TAK1i：TAK 1抑制剂(5 0 0μM)，Ikki：IKK抑制剂(5μM)，MK2I：Mk2抑制剂(2μM)。在……里面d, h，数据平均为±S.E.M。(n=每个基因型3个独立细胞样本)。统计学意义是用两尾不成对的方法来确定的。t测试，N.S.，P>0.05，*P < 0.01, ***P < 0.001, and ****P < 0.0001

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由于NF-κB活化可通过诱导抗凋亡基因表达而抑制细胞死亡，这可能是其严重细胞死亡的原因之一。Ripk 1K376R/K376RNF-κB活性降低导致细胞凋亡。因此，我们在MEFs中表达了IκBα超抑制子，可以完全阻断IκBα的降解，抑制NF-κB的活化(附图)。三维空间)。然而，我们发现Ripk 1K376R/K376RMEFs对肿瘤坏死因子(α)诱导的细胞死亡更为敏感。三维空间和补充图。3E)，指示增加的细胞死亡Ripk 1K376R/K376RMEFs不仅是由于其NF-κB活化缺陷所致.RIPK 1激酶活性升高Ripk 1K376R/K376RMEFs(图1.3BRIPK 1激酶活性可介导复合物I向复合物II的转变，因此，我们推测RIPK 1的K63连接泛素化可能直接阻止复合物II的形成。与我们的假设一致，Ripk 1K376R/K376R突变增强了RIPK 1与FADD、Caspase 8或cFLIP(FADD样IL-1β转换酶)抑制蛋白的相互作用。3E)。我们还可以观察到S 166上磷酸化的RIPK 1水平升高。Ripk 1K376R/K376RMEFs(图1.3E)。此外，Ripk 1K376R/K376R突变增加了RIPK 1的磷酸化，促进了RIPK 1和RIPK 3在坏死细胞中的相互作用。3F).

与以前的研究一致，ripk 1缺乏导致tfα-导致TRAF 2和cIAP 1的丢失。37,38然而，RIPK 1的K 376突变对TRAF 2和cIAP 1的稳定性没有影响。2D，f)。由于TAK 1可以通过直接磷酸化RIPK 1或诱导IKKα/β和MK 2磷酸化RIPK 1来抑制RIPK 1激酶活性。10,11,12,13,39，我们假设TAK 1可能参与RIPK 1的激活。Ripk 1K376R/K376R细胞。我们发现只有TAK 1的过表达才能抑制RIPK 1激酶的活性。Ripk 1K376R/K376R补充图3F)，但TAK 1/TAK 1复合物或TAK 1活性突变体(TAK 1-∆N)高表达40可显著降低RIPK 1激酶活性。第三代)。此外，只有TAK 1抑制剂或IKK抑制剂才能减少WT和WT之间细胞死亡和RIPK 1激酶活性的差异。Ripk 1K376R/K376Rmfs，尽管mk2抑制剂在WT和wt中都能增加细胞死亡。Ripk 1K376R/K376RMEFs(图1.3H和补充图。3G-I)。同样，组分活性IKKβ(IKKβ-CA)过表达，而MK 2不抑制RIPK 1激酶活性。Ripk 1K376R/K376R补充图3J，k)。此外，TAK 1和RIPK 1之间的相互作用在Ripk 1K376R/K376R补充图3L)，说明RIPK 1 K 376泛素化的缺失阻止了TAK 1的招募。RIPK 1的K 376突变也抑制了TAK 1下游MAPK的激活(附图)。三米)。这些结果提示RIPK 1的K376R突变主要通过抑制TAK1-ikk轴活性来抑制RIPK 1激酶的活性。RIPK 1在K 376上的K63连接泛素化不仅通过激活复合物I促进NF-κB的活化，而且调节TAK1-ikk活性，抑制RIPK 1激酶活性，从而阻止复合物II的形成，从而抑制细胞死亡。

依赖于TNFR 1的信号部分导致致命性。

研究表明，TNFR 1的消融延迟了，但无法挽救Ripk 1−/−小鼠32,33,41..自Ripk 1K376R/K376R突变促进肿瘤坏死因子α诱导的细胞死亡，我们确定了tnfr 1缺乏对Ripk 1K376R/K376R老鼠。类似于Ripk 1−/−Tnfr1−/−老鼠，Ripk 1K376R/K376RTnfr1−/−老鼠出生在孟德尔频率(补充图)。4A)，但也在出生后12天左右死亡(如图所示)。4A)。值得注意的是，Ripk 1K376R/K376RTnfr1−/−小鼠在10天左右出现严重的全身炎症，并表现出体型缩小和器官变小，包括胸腺和心脏(图1)。4B和补充图。4B)。组织学染色显示Ripk 1K376R/K376RTnfr1−/−小鼠肝区浸润炎性细胞较多，皮肤表皮厚度明显增加(图二)。4C)。我们还可以观察到更多的Caspase 3和浸润的免疫细胞在皮肤切片。Ripk 1K376R/K376RTnfr1−/−老鼠比老鼠Ripk 1K376R/+Tnfr1−/−老鼠(图1.4D和补充图。4C)。同时，皮肤分化标记物的表达水平也显著提高。Ripk 1K376R/K376RTnfr1−/−老鼠，暗示Ripk 1K376R/K376R突变促进细胞死亡，以进一步调节皮肤炎症(图一)。4E)。此外，caspase 3和cd11b在肝区也有更多的表达。Ripk 1K376R/K376RTnfr1−/−老鼠(图1.4F)。有趣的是，Ripk 1−/−Tnfr1−/−小鼠表现出与小鼠几乎相同的表型。Ripk 1K376R/K376RTnfr1−/−小鼠(附图)4D-g)，表明RIPK 1的K376R突变与TNFR 1信号传导阻断引起炎症的RIPK 1缺乏症相似。

TNFR 1缺乏症部分延迟了Ripk 1K376R/K376R老鼠。a杂交幼仔的存活曲线Ripk 1K376R/+Tnfr1−/−老鼠。b具有代表性的宏观图像Ripk 1K376R/K376RTnfr1−/−和Ripk 1K376R/+Tnfr1−/−小白鼠在P5和P10。c肝及皮肤切片的H&E染色Ripk 1K376R/K376RTnfr1−/−和Ripk 1K376R/+Tnfr1−/−小白鼠在P11(标度棒，50μm)，并根据H&E结果定量表皮厚度(Ripk 1K376R/+Tnfr1−/−老鼠：n=4；Ripk 1K376R/K376RTnfr1−/−老鼠：n=4)。d, eF4/80、CD11b和Caspase 3(鳞片条，50μm)的免疫组化染色(英文)d)或免疫荧光染色的Loricrin，K10，K14(标尺，100μm)(e)在皮肤切片中Ripk 1K376R/K376RTnfr1−/−和Ripk 1K376R/+Tnfr1−/−小白鼠在P11。f肝组织CD11b和Caspase 3的免疫组织化学染色Ripk 1K376R/K376RTnfr1−/−和Ripk 1K376R/+Tnfr1−/−小白鼠在P11(鳞片，50μm)。g用P11位点检测血中AST和ALT。Ripk 1K376R/+Tnfr1−/−老鼠：n=4；Ripk 1K376R/K376RTnfr1−/−老鼠：n=4)。h用P11位点检测肝匀浆中的细胞因子。n=4只不依赖生物的小鼠)。i人脾细胞Ly6G和CD11b染色的流式细胞术及统计结果Ripk 1K376R/K376RTnfr1−/−和Ripk 1K376R/+Tnfr1−/−小白鼠在P11(Ripk 1K376R/+Tnfr1−/−老鼠：n=6；Ripk 1K376R/K376RTnfr1−/−老鼠：n=6)。CD11b+Ly6G+细胞鉴定为中性粒细胞。在……里面c, g–i，数据平均为±S.E.M。统计学意义是用两尾不成对的方法来确定的。t测试*P < 0.05, ***P < 0.001, and ****P < 0.0001

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肝损伤是IKKβ-或Nemo缺乏小鼠胚胎致死性的关键原因之一，后者存在NF-κB激活缺陷。42,43..因此，我们检测了作为肝损伤标志的天冬氨酸转氨酶/丙氨酸转氨酶(AST/ALT)的水平。血清AST/ALT显著升高Ripk 1K376R/K376RTnfr1−/−老鼠(图1.4G)。IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性细胞因子均在肝、肺组织中表达。Ripk 1K376R/K376RTnfr1−/−老鼠(图1.4H和补充图。4H)。最后，我们分析了脾脏中免疫细胞的组成。脾细胞总数，CD4+T细胞，CD8+脾T细胞和B细胞明显减少。Ripk 1K376R/K376RTnfr1−/−老鼠，暗示Ripk 1K376R/K376R突变可以促进TNFR 1独立通路中的细胞死亡，从而进一步影响免疫细胞的发育(附图)。4I)。然而，炎症性CD11b+细胞大量增加(见图)。4I)，这与观察到的炎症表型是一致的。Ripk 1K376R/K376RTnfr1−/−老鼠。除肿瘤坏死因子α外，rIPK 1还参与了TLRs和干扰素诱导的信号转导过程。44,45..我们发现Ripk 1K376R/K376RMEFs对脂多糖或干扰素γ诱导的细胞死亡更为敏感(附图)。5A，b)。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)和Fas配体(FasL)诱导的细胞死亡Ripk 1K376R/K376R补充图5C-E)。这些数据表明，tnfr 1介导的信号是导致胚胎死亡和炎症的部分原因。Ripk 1K376R/K376R老鼠。

细胞死亡是致命性和炎症的罪魁祸首。

研究细胞死亡信号是否导致了Ripk 1K376R/K376R小鼠，我们交叉RIPK 3-和Caspase8-双KO小鼠Ripk 1K376R/K376R老鼠。这个Ripk 1K376R/K376RRIPK 3−/−Caspase 8−/−小鼠生存能力强，生育能力强，与小鼠的形态无明显差异。Ripk 1K376R/+RIPK 3−/−Caspase 8−/−较少的控制(如图所示)。5A)，说明RIPK 3和Caspase 8的双重缺乏症可挽救细胞死亡。Ripk 1K376R/K376R老鼠。H&E染色结果显示肝脏无炎症，皮肤厚度正常。5B)。Caspase 3不存在，浸润的免疫细胞之间无明显差异(P>0.05)。Ripk 1K376R/K376RRIPK 3−/−Caspase 8−/−老鼠和Ripk 1K376R/+RIPK 3−/−Caspase 8−/−较少的控制(如图所示)。5C和补充图。6A)。此外，获救的小鼠皮肤发育正常，如K14，K10和氯菊酯染色所示。5D)。血清AST、ALT和肝脏炎性细胞因子的表达均在正常水平(图1)。5E，f)。我们还分析了脾脏中免疫细胞的组成，结果表明：+T细胞，CD8+T细胞，B细胞，CD11b+细胞和中性粒细胞(CD11b)+Ly6G+)获救小鼠与小白蚁对照组之间无显着性差异(图二)。5G和补充图。6B)。然而，只有RIPK 3缺乏才能挽救Ripk 1K376R/K376R小鼠(附图)6C)。这些数据表明，阻断RIPK 3依赖的坏死和caspase 8依赖的凋亡，可以完全防止致死性和全身炎症的发生。Ripk 1K376R/K376R老鼠。

共删除RIPK 3和Caspase 8完全救援Ripk 1K376R/K376R老鼠。a具有代表性的宏观图像Ripk 1K376R/K376RRIPK 3−/−Caspase 8−/−和Ripk 1K376R/+RIPK 3−/−Caspase 8−/−小白鼠在P40。b肝及皮肤切片的H&E染色Ripk 1K376R/K376RRIPK 3−/− Caspase 8−/−和Ripk 1K376R/+RIPK 3−/−Caspase 8−/−小白鼠在P40(刻度棒，50μm)，从H&E结果微观定量表皮厚度(Ripk 1K376R/+RIPK 3−/−Caspase 8−/−老鼠：n=4；Ripk 1K376R/K376RRIPK 3−/− Caspase 8−/−老鼠：n=4)。c, dF4/80、Ly6G和Caspase 3(鳞片，50μm)的免疫组织化学染色c)或免疫荧光染色的Loricrin，K10，K14(标尺，100μm)(d)在皮肤切片中Ripk 1K376R/K376RRIPK 3−/−Caspase 8−/−和Ripk 1K376R/+RIPK 3−/−Caspase 8−/−小白鼠在P40。e用P40位点检测肝匀浆中的细胞因子。Ripk 1K376R/+RIPK 3−/−Caspase 8−/−老鼠：n=4；Ripk 1K376R/K376RRIPK 3−/− Caspase 8−/−老鼠：n=4)。f血中AST和ALT的测定以P40位点为标记基因型(P<0.05)。Ripk 1K376R/+RIPK 3−/−Caspase 8−/−老鼠：n=4；Ripk 1K376R/K376RRIPK 3−/− Caspase 8−/−老鼠：n=4)。g人脾细胞Ly6G和CD11b染色的流式细胞术及统计结果Ripk 1K376R/K376RRIPK 3−/−Caspase 8−/−和Ripk 1K376R/+RIPK 3−/−Caspase 8−/−小白鼠P40(Ripk 1K376R/+RIPK 3−/−Caspase 8−/−老鼠：n=4；Ripk 1K376R/K376RRIPK 3−/− Caspase 8−/−老鼠：n=4)。CD11b+Ly6G+细胞鉴定为中性粒细胞。在……里面b, e–g，数据平均为±S.E.M。统计学意义是用两尾不成对的方法来确定的。t测试，N.S.，P>0.05

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Ripk 1 K376R/−小鼠出现严重的全身炎症

Ripk 1K376R/K376R小鼠胚胎致死，这就限制了我们进一步研究RIPK 1在体内的K63连接泛素化的生理功能。令人惊讶的是，当穿越Ripk 1+/−小白鼠Ripk 1K376R/+老鼠，我们有生存能力Ripk 1K376R/−老鼠。Ripk 1K376R/−小鼠按孟德尔比断奶(补充图)。7A)，但在出生后出现严重的全身炎症，其特征是皮炎、广泛的脾肿大和体型缩小(如图所示)。6A和补充图。7b-d)。严重炎症Ripk 1K376R/−小鼠可以在不同的阶段造成死亡(图一)。6B)。此外，组织学染色显示，Ripk 1K376R/−小鼠肝脏有大量淋巴细胞浸润，皮肤表皮明显增厚。6C)。皮肤切片免疫组织学染色显示Caspase 3高水平，提示细胞凋亡较多，浸润免疫细胞大量增加。Ripk 1K376R/−老鼠(图1.6d和补充图。7E). Ripk 1K376R/−K10、K14和氯菊酯的表达水平升高，提示小鼠有异常的皮肤损害(图5)。6E)。此外，我们在血清中检测到较高水平的AST，并增加了肝脏中的炎性细胞因子，表明严重的肝损伤和炎症Ripk 1K376R/−小鼠(附图)7F)。虽然脾细胞总数相当，但我们观察到CD4明显减少。+T细胞，CD8+脾脏T细胞、B细胞和大量中性粒细胞增多Ripk 1K376R/−小鼠，证实了严重的全身炎症Ripk 1K376R/−老鼠(图1.6f和补充图。7g).

Ripk 1K376R/−小鼠自发发炎。a具有代表性的宏观图像Ripk 1K376R/−和Ripk 1K376R/+小白鼠P 150。b生存曲线Ripk 1K376R/−和Ripk 1K376R/+老鼠。c肝及皮肤切片的H&E染色Ripk 1K376R/−和Ripk 1K376R/+小白鼠P 150(刻度棒，50μm)，用H&E结果对表皮厚度进行显微定量。Ripk 1K376R/+老鼠：n=4；Ripk 1K376R/−老鼠：n=4)。d, eCaspase 3、CD11b和F4/80(鳞片，50μm)的免疫组织化学染色d)或免疫荧光染色的Loricrin，K10，K14(标尺，100μm)(e)在皮肤切片中Ripk 1K376R/−和Ripk 1K376R/+小白鼠P 150。f人脾细胞Ly6G和CD11b染色的流式细胞术及统计结果Ripk 1K376R/−和Ripk 1K376R/+小白鼠P 150(Ripk 1K376R/+老鼠：n=4；Ripk 1K376R/−老鼠：n=4)。CD11b+Ly6G+细胞鉴定为中性粒细胞。g细胞死亡Ripk 1+/+, Ripk 1K376R/+, Ripk 1K376R/K376R, Ripk 1−/−，和Ripk 1K376R/−用不同刺激剂处理5 h的永生化MEFs，用SyoxGreen阳性率测定。误差条代表平均±S.E.M。每个基因型的三个独立细胞样本的数据。T：肿瘤坏死因子(α)；C：环己胺(CHX)；Z：zVAD.fmk；N：坏死抑素-1。h, i Ripk 1+/+, Ripk 1K376R/K376R，和Ripk 1K376R/−用肿瘤坏死因子α/CHX(h)或肿瘤坏死因子α/zVAD.fmk(i)在指定的时间内，用所指示的抗体对细胞裂解物进行Westernblotting分析。在……里面g–i，肿瘤坏死因子α，20 ng/ml；CHX：10μg/ml；zVAD.fmk，20μM；坏死抑素-1，10μM。c, f, g，数据平均为±S.E.M。统计学意义是用两尾不成对的方法来确定的。t测试*P < 0.05, **P < 0.01 and ****P < 0.0001

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Ripk 1K376R/K376R突变可促进细胞死亡，并进一步导致胚胎死亡，以及Ripk 1K376R/−小鼠只有半个K376R突变等位基因Ripk 1K376R/K376R老鼠。因此，我们建议Ripk 1K376R/−突变降低了对细胞死亡的敏感性。Ripk 1K376R/K376R突变，由于RIPK 1激酶活性降低。与我们的假设一致，Ripk 1K376R/−MEFs对肿瘤坏死因子α诱导的细胞凋亡和坏死的敏感性高于WT对照组，但对细胞死亡的敏感性低于WT对照组。Ripk 1K376R/K376RMEFs(图1.6g和补充图。7H)。WESTERNBLOTTING分析结果表明，Ripk 1K376R/−MEFs具有较低水平的Caspase 3裂解和MLKL磷酸化，尤其是RIPK 1激酶活性较低。Ripk 1K376R/K376RMEFs(图1.6h，我和补充图。7i，j)。排除截断的RIPK 1在Ripk 1K376R/−老鼠，我们还产生了另一种Ripk 1−/−老鼠(由KD-Ripk 1−/−在此过程中，RIPK 1在激酶结构域的Valine 42(V42)处停止翻译，无法检测到RIPK 1在KD-Ripk 1−/−补充图8a，b). KD-Ripk 1K376R/−小鼠表现出类似的表型Ripk 1K376R/−小鼠(附图)8C-f)。这些结果表明，Ripk 1K376R/−与对照组相比，小鼠在细胞死亡相对减少的情况下发生了严重的全身炎症。Ripk 1K376R/K376R老鼠。

肿瘤坏死因子α主要驱动Ripk 1 K376R/−小鼠

探讨TNFR 1介导的信号在炎症反应中的作用Ripk 1K376R/−老鼠，我们Ripk 1K376R/−Tnfr1−/−老鼠。这个Ripk 1K376R/−Tnfr1−/−小鼠存活正常，无明显炎症特征(图二)。7A)。体重下降，皮肤表皮增厚，肝或皮肤大量淋巴细胞浸润，肝脏损伤严重，Caspase 3蛋白裂解水平升高，皮肤分化指标恢复正常。Ripk 1K376R/−Tnfr1−/−老鼠(图1.7b，c和补充图。9A-d)。虽然大部分炎症征象消失了，但中性粒细胞的吸收略有增加，CD4减少。+脾T细胞Ripk 1K376R/−Tnfr1−/−老鼠(图1.7D和补充图。9E)。提示TNFR 1缺乏症不能完全缓解炎症反应。Ripk 1K376R/−老鼠。接下来，我们生成了Ripk 1K376R/−RIPK 3−/−Caspase 8−/−老鼠。这些小鼠的所有炎症特征均恢复到正常水平，包括中性粒细胞增生和CD4。+T细胞数(图1.7e-g和补充图。10A-f)。值得注意的是，我们发现Ripk 1K376R/−RIPK 3−/−小鼠无明显炎症Ripk 1K376R/−RIPK 3−/−Caspase 8−/−(补充图。11A-d)，表明RIPK 3依赖的信号通路主要触发炎症Ripk 1K376R/−老鼠。综上所述，这些数据支持了我们的结论，即肿瘤坏死因子α诱导的细胞死亡是导致全身炎症的主要原因。Ripk 1K376R/−老鼠。

TNFR 1介导的细胞死亡触发炎症Ripk 1K376R/−老鼠。a具有代表性的宏观图像Ripk 1K376R/−Tnfr1−/−和Ripk 1K376R/+Tnfr1−/−小白鼠在P40。b肝及皮肤切片的H&E染色Ripk 1K376R/−Tnfr1−/−和Ripk 1K376R/+Tnfr1−/−小白鼠在P40(刻度棒，50μm)，从H&E结果微观定量表皮厚度(Ripk 1K376R/+Tnfr1−/−老鼠：n=4；Ripk 1K376R/−Tnfr1−/−老鼠：n=4)。c皮肤切片Caspase 3、CD11b和F4/80的免疫组织化学染色Ripk 1K376R/−Tnfr1−/−和Ripk 1K376R/+Tnfr1−/−小白鼠在P40(鳞片，50μm)。d人脾细胞Ly6G和CD11b染色的流式细胞术及统计结果Ripk 1K376R/−Tnfr1−/−, Ripk 1K376R/−Tnfr1+/−，和Ripk 1K376R/+Tnfr1−/−小白鼠P40(Ripk 1K376R/+Tnfr1−/−老鼠：n=4；Ripk 1K376R/−Tnfr1+/−老鼠：n=4；Ripk 1K376R/−Tnfr1−/−老鼠：n=4)。CD11b+Ly6G+细胞鉴定为中性粒细胞。e具有代表性的宏观图像Ripk 1K376R/−RIPK 3−/−Caspase 8−/−和Ripk 1K376R/+RIPK 3−/−Caspase 8−/−小白鼠在P40。f肝及皮肤切片的H&E染色Ripk 1K376R/−RIPK 3−/−Caspase 8−/−和Ripk 1K376R/+RIPK 3−/−Caspase 8−/−小白鼠在P40(刻度棒，50μm)，从H&E结果微观定量表皮厚度(Ripk 1K376R/+RIPK 3−/−Caspase 8−/−老鼠：n=4；Ripk 1K376R/−RIPK 3−/−Caspase 8−/−老鼠：n=4)。g人脾细胞Ly6G和CD11b染色的流式细胞术及统计结果Ripk 1K376R/−RIPK 3−/−Caspase 8−/−和Ripk 1K376R/+RIPK 3−/−Caspase 8−/−小白鼠P40(Ripk 1K376R/+RIPK 3−/−Caspase 8−/−老鼠：n=4；Ripk 1K376R/−RIPK 3−/−Caspase 8−/−老鼠：n=4)。CD11b+Ly6G+细胞鉴定为中性粒细胞。在……里面b, d, f, g，数据平均为±S.E.M。统计学意义是用两尾不成对的方法来确定的。t测试，N.S.，P>0.05，*P < 0.01, ***P < 0.001 and ****P < 0.0001

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细胞死亡和炎症是两个密切相关的过程，RIPK 1是细胞死亡和炎症过程中的关键介质。由罕见的纯合突变引起的RIPK 1缺陷可导致人类严重的免疫缺陷、关节炎和肠道炎症。46..TAK 1介导的抑制RIPK 1激酶活性与遗传危险因素协同促进神经炎症47..了解RIPK 1激酶活性的实际调控，将有助于设计治疗某些临床疾病的新策略。48,49..本研究直接证明RIPK 1在K 376残基上的K63连接泛素化能直接抑制RIPK 1激酶活性，抑制细胞死亡。令人惊讶的是，Ripk 1K376R/K376R小鼠在E13.5左右死亡，明显早于RIPK1-KO小鼠.这表明RIPK 1的K63连接泛素化功能比RIPK 1的适配器功能更为关键。Ripk 1K376R/−老鼠能活得比Ripk 1K376R/K376R小鼠RIPK 1激酶活性相对下降，进一步表明RIPK 1激酶活性对调节细胞死亡至关重要(附图)。12)。TNFR 1-缺乏只延迟了Ripk 1K376R/K376R小鼠，但ripk 3/caspase 8共缺失完全阻止了小鼠的致死性和炎症反应。Ripk 1K376R/K376R老鼠。这表明ripk 1的k376r突变也促进了tnfr 1非依赖性的细胞死亡途径，但进一步的研究仍需进一步阐明tffr 1非依赖性途径在致死性调控中的作用。Ripk 1K376R/K376R老鼠。

RIPK 1的K63连接泛素化为TAK 1/TAB复合物和NEMO的合成提供了对接位点，进一步激活了NF-κB信号通路。50,51..失去NF-κB激活途径关键成分的小鼠胚胎致死.例如，IKKβ-或nemo缺陷小鼠由于严重的肝脏退化而胚胎致死。42,43，而HOIP和HOIL-1缺乏则导致RIPK 1依赖的内皮细胞死亡，导致妊娠中期胚胎死亡。24,25..在我们Ripk 1K376R/K376R小鼠，我们可以观察到大量细胞死亡在肝脏区域，这是类似于IKkβ-或尼莫缺乏的小鼠。42,43..RIPK 1 K376R突变为什么会选择性地促进胎肝细胞死亡，这将是一个有趣的问题。根据我们的结果，降低NF-κB活化并不是增强细胞死亡的确切原因。Ripk 1K376R/K376R与以前的发现不同19,20..同样，肠上皮细胞特异性消融术以NF-κB不依赖的方式促进细胞死亡和炎症，抑制ripk 1激酶活性可预防炎症。52..进一步的研究需要评估增强的NF-κB活化是否能挽救Ripk 1K376R/K376R老鼠在体内。

我们发现RIPK 1在K 376上的K63连接泛素化通过调节TAK 1/IKK轴活性而抑制RIPK 1激酶的活性。与我们的结论一致，最近的发现表明TAK 1可以直接磷酸化或招募IKKα/β来磷酸化RIPK 1，从而抑制ripk 1的激活，而不依赖于NF-κB的激活。10,39..Mk 2是TAK 1的另一个下游激酶，也可能抑制RIPK 1激酶的活性。11,12,13..虽然我们观察到复合物I中MK 2的吸收减少，MK2磷酸化程度降低Ripk 1K376R/K376R与TAK 1和IKK抑制剂不同的是，mk 2抑制剂仅能弱地增强肿瘤坏死因子α/zVAD诱导的WT细胞死亡。Ripk 1K376R/K376R细胞。这些结果表明，K 376上RIPK 1的泛素化主要是通过激活TAK 1/IKK来抑制RIPK 1激酶的活性。

以前的研究表明cIAP 1/cIAP 2可以将K63连接的泛素化链与RIPK 1结合，并且cIAP 1/2−/−小鼠于E10.5死亡53..同样，Ripk 1K376R/K376R小鼠在E13.5左右死亡，证实K 376上RIPK 1的K63连接泛素化对细胞存活至关重要。最近的一项研究报道，另一种E3连接酶Parkin也能介导K 376上RIPK 1的K63连接泛素化，从而促进NF-κB的活化。54..此外，Peli1还可以介导K115上rIPK 1的k63连接泛素化，并以激酶依赖的方式参与死亡过程中的泛素化。55..因此，RIPK 1可以在不同的位点和不同的E3连接酶上产生K63连接的泛素化链。此外，ripk 1的k11-和met 1连接泛素化在tnfr 1-mef-κb活化中具有信号传导作用。56,57..有趣的是，k63-和met 1连接的泛素化在RIPK 1激活过程中存在串扰。31..因此，不同的泛素化类型和调节RIPK 1的E3连接酶使RIPK 1泛素化状态的生理功能识别变得复杂。通过生成Ripk 1K376R/K376R小鼠，我们定义了RIPK 1功能之前意想不到的调节环，K63连接的K 376上的RIPK 1泛素化可以调节RIPK 1激酶的活性，从而促进胚胎的发生和炎症过程。这些见解可能为探索抗炎症和癌症的临床治疗提供进一步的理论依据。

小鼠

里克1K376R/K376R采用CRISPR-Cas9技术制备小鼠突变模型。简单地说，设计了一个单一的引导RNA(SgRNA)，其目标是RIPK 1的K 376周围的DNA区域和相应的供体结构(包含K到R突变)(见补充表)。1)。为了防止sgRNA导向的Cas9切割突变的RIPK 1基因位点，我们还在供体中构建了几个同义突变。在C57BL/6小鼠受精卵中注射sgRNA和Cas9 mRNA。川崎-Ripk 1−/−同样的过程，CRISPR-Cas9技术也产生了小鼠。校正后的小鼠用基因组PCR和DNA测序进行基因分型(见补充表)。2)。WT-C57BL/6小鼠、TNFR1KO小鼠、RIPK 3小鼠和Caspase8-KO小鼠从Jackson实验室购买并在该设施中繁殖。所有小鼠都被安置在清华大学特定的无病原体动物设施中。所有的小鼠实验都是按照机构指南和清华大学动物保护和使用委员会批准的协议进行的。

抗体和试剂

抗RIPK 1(3493)、磷酸-RIPK 1(31122)、Caspase 3(9664)、Caspase 3(9665)、裂解Caspase 8(9429)、Caspase 8(4790)、尼莫(2685S)、MK 2(3042)、Lys63泛素抗体(5621)、A 20(5630)、cFLIP(56343)和cIAP 1(4952)的抗体是从细胞信号技术购买的，抗RIPK 1(610459)和FasL(554255)的抗体是从BD生物科学购买的；antibodies against RIPK3(sc-374639)，IκBα(sc-1643)，TRADD(sc-7868)，FADD(sc-6036)，and p65(sc-109)were purchased from Santa Cruz Biotechnology；antibodies against phospho-RIPK3(ab222320)，phospho-MLKL(ab196436)，and MLKL(ab67942)were purchased from Abcam；antibodies againstβ-tubulin(BE0025-100)，secondary horseradish peroxidase(HRP)-conjugated anti-rabbit(BE0108-100)，or anti-mouse antibodies(BE0107-100)were obtained from Easy Bio；antibody against Flag(M20008)was purchased from Abmart；重组小鼠肿瘤坏死因子(α)来源于R&D(410-MT-010)。K63-管(串联泛素结合实体)(UM 604)和M1管(UM 206)是从Lifesensors购买的。ChX(C-6255)、坏死抑素-1(N 9037)、IKK抑制剂(T 1452)和TAK 1抑制剂(O 9890)从Sigma购买。Mk2抑制剂(4279/10)来源于苏格拉底生物科学。从Beyotime获得了zVAD.fmk(C 1202)。从Selleckchem中获得SMAC-拟BV 6(S 7597).标志-mtnfα(膜相关)(ALX-522-009-C 050)和TRAIL(BML-SE722-0100)是从恩佐生命科学公司购买的.eFluor-450结合抗小鼠B 220(48-0452-80)、apc-cy7结合抗小鼠CD45.2(47-0454-82)和V 500-共轭细胞活力染料(65-0866-18)来自eBioscience；fITC-共轭抗小鼠Ly6G(551460)、fITC-cyc结合抗小鼠CD 19(553785)和percp-anine5.5结合抗小鼠CD4(560782)抗体来自bd生物科学；apc-cdc 11b(101211)和PE结合抗小鼠(100734)抗体来自BioLegend。Westernblotting抗体采用500倍或1000倍稀释，流式细胞仪采用200倍稀释。

细胞培养

HEK293T(从ATCC购买)和MEF细胞在Dulbecco改良Eagle‘s培养基(DMEM)中培养，培养液中添加10%胎牛血清、非必需氨基酸、丙酮酸钠、青霉素和链霉素。所有细胞均在37℃和5%CO条件下培养。2.

细胞感染

共转染表达质粒(lenti-iκBα-sr-bsd，lenti-sv 40-T-bsd，lenti-tak 1-fla-bsd，lenti-tab1-α-bsd，lenti-tak 1-α-bs△用包装质粒(psPAX 2和pMD2.G)将N-旗帜-BSD、Lenti-ikkβ-CA-Fag-BSD(pMD2.G)导入HEK293T细胞。48 h后收集病毒上清液，将目的细胞与上清在聚乙烯存在下孵育8~12h，病毒感染后用新鲜培养基代替病毒上清液。24h后用杀虫素筛选感染细胞。采用Westernblotting法测定感染效率。

MEF的产生与永生化

Ripk 1+/+, Ripk 1K376R/+, Ripk 1K376R/K376R, Ripk 1K376R/−，和Ripk 1−/−原代MEF来源于E11.5胚胎。取胎盘、卵黄囊、头部和暗红色器官后，用0.25%胰蛋白酶切取胚胎，消化20 min。然后，通过在消化后的胚胎上、下穿插，获得单细胞悬浮液。传代第3~5代，原代MEFs感染SV40T表达慢病毒，使原代MEFs永生化。

定量实时PCR

用TRIzol(Invitrogen)提取总RNA，SuperScript III(Invitrogen)反向转录。采用PowerSYBR绿色PCR主混合(Genestar)进行定量实时PCR(qRT-PCR).转录本的数量与甘油醛3-磷酸脱氢酶的含量相符.为了保证单个产品的放大，运行了熔化曲线。使用的引物列在补充表中3.

细胞死亡与Caspase 3活性分析

前一天，MEF以每口井10，000人的速度在96井板中进行了重复播种.第二天，用指示化合物预处理细胞60 min，然后在5μM SytaGreen(Invitrogen，S 34860)或20μM ac-DEVD-MCA(Enzo LifeScience，ALX-260-031-M005)存在下，用指示浓度的mtnf刺激细胞。用荧光星Omega荧光平板阅读器，用485 nm或360 nm(ac-DEVD-MCA)激发滤光片，520 nm发射滤光片，或460 nm激发滤光片(ac-DEVD-MCA)，每隔1小时测定一次系统绿光强度和Caspase 3活性。细胞死亡百分率为诱导荧光−本底荧光/最大荧光−本底荧光×100。利用TritonX-100进行细胞全透性，获得最大荧光.所有细胞死亡和Caspase 3激活数据均为平均±S.E.M。三个独立的实验。

Westernblotting、免疫共沉淀和泛素化试验

细胞在裂解缓冲液(50 mm HEPES，pH7.4，150 mm NaCl，1%NP-40，1mm EDTA)中溶解，含1mm原代戊酸钠，1mm氟化钠，1mm苯甲基磺酰氟(PMSF)和蛋白酶抑制剂混合物(Roche)。细胞裂解液经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后，转移到聚偏二氟乙烯膜上。用原抗体和HRP结合的次级抗体对膜进行序列检测。用ECL底物(Pierce)观察膜上的特异性条带。源数据文件中提供了原始的印迹。

对复合物I和复合物II免疫沉淀，用冷磷酸盐缓冲液(PBS)清洗15 cm培养皿中的细胞，然后在裂解缓冲液(30 mm Tris-HCl，pH7.4，120 mm NaCl，2mm EDTA，2mm KCl，10%甘油，1%Triton X-100)中溶解，其中含有1mm原尿酸钠、1mm氟化钠、1mm PMSF和蛋白酶抑制剂混合物(Roche)。细胞裂解液在4℃下旋转30 min，经18，000×离心后于4°C澄清。g蛋白裂解10 min，用抗体结合珠免疫沉淀。对于配合物I，使用抗标记M2珠(A 2220；Sigma)；对于配合物II，使用RIPK 1抗体加蛋白A/G琼脂糖。微球在裂解缓冲液中洗涤4次，样品在10μ、1.5×SDS负载染料中煮沸洗脱。然后对输入和免疫沉淀样本进行SDS-PAGE分析。

泛素化实验采用RIPA裂解缓冲液(50 mm Tris，pH7.4，150 mm NaCl，1 mm EDTA，20 mm)对细胞进行泛素化实验。N-乙基马来酰亚胺，1%TritonX-100)。溶菌物在1%(体积/体积)SDS存在下立即煮10 min，然后用裂解缓冲液稀释，直至SDS浓度降至0.1%。用抗K63泛素抗体免疫印迹分析免疫沉淀。

管净化

在特定的刺激下，冰冷pbs洗涤的MEF(1×10)7在6 M尿素裂解缓冲液(100 mm Tris-HCl，pH8.0，0.15 M NaCl，5 mm EDTA，1.5mm MgCl)中收获。2、1%TritonX-100、罗氏完全蛋白酶抑制剂Cocktail、1mm NEM)和液氮冷冻闪蒸。解冻后的裂解液在4℃下离心30 min，用稀释缓冲液(不含尿素)稀释至1ml，将尿素带入3M，然后加入K63管或M1管，然后在4℃下孵育2h，然后用国旗树脂孵育3h。在100 mM Tris-HCl，pH8.0，0.15 M NaCl，5 mM EDTA，0.05%NP-40的洗涤缓冲液中4×洗涤后，用还原变性westernblot样品缓冲液洗脱结合蛋白。

流式细胞术分析

从脾脏中分离出淋巴细胞。红细胞裂解液溶解红细胞。采用单细胞悬液对细胞表面标记进行标准染色.门控策略如图所示。13，数据采集用FACSAriaⅡ型细胞学仪(BD)进行。流式细胞仪数据用FLOJO软件进行分析。

组织学和免疫荧光

组织病理学分析：将皮肤及其他器官固定在4%多聚甲醛溶液中，按标准程序处理，石蜡包埋，切片。5微米厚切片进行H&E、免疫组织化学和免疫荧光染色。采用F4/80(Ceville)、Ly6G(Ceville)、CD11c(Ceville)、CD3(Ceville)、CD 45(Ceville)、K10(AbCAM)、K14(AbCAM)、氯霉素(AbCAM)、裂解Caspase 3(CST)和裂解Caspase 8(CST)抗体。TUNEL染色采用Apoptag试剂盒(EMD微孔)。应用ImageJ软件评价阳性细胞占总区域的比例。

血清ALT和AST的测定

室温离心，取上清液。血清标本冷冻于液氮中，保存于−80°C，用南京建城生物工程研究所研制的C 010-2微板试剂盒测定血清ALT和AST水平。

细胞因子测定

用ELISA试剂盒(EBioscience)检测血清或器官匀浆中的细胞因子.所有样品一式三份，按照制造商的协议进行测量。

统计

除另有说明外，本文的所有数值均为平均值±S.E.M.。所有实验至少重复三次，本文的结果具有代表性。统计显着性用双尾未配对计算。t使用GraphPad棱镜软件进行测试。统计显着性是基于P价值。注：P>0.05；*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.0001.

报告摘要

有关研究设计的进一步资料，可参阅自然研究报告摘要链接到这篇文章。

作者声明，支持本研究结果的数据可在本文件及其补充信息文件中查阅。图中的源数据。1e-g，2阿-h，3阿-h，4C，G-I，5b，e-g，6c，f-i，7b，d，f，g和补充图。2A-d，3早上，4呃，我，5A-E，6b，7f-j，8b，d，9A，D-e，10d-f，11A、c、d作为源数据文件提供。