DMBT1对铜绿假单胞菌抽搐运动的抑制涉及其N-糖基化并且不能被清道夫受体富含半胱氨酸的细菌结合肽结构域赋予
糖蛋白DMBT1的清除能力有助于保护粘膜上皮免受微生物的侵害。DMBT1与多种细菌物种的结合涉及其保守的清道夫受体富含半胱氨酸（SRCR）结构域，其定位于16聚体共有序列肽SRCRP2。以前，我们发现DMBT1结合铜绿假单胞菌菌毛和抑制抽搐运动，一种菌毛介导的运动对毒力很重要。在这里，我们确定了抽搐运动抑制所需的分子特征。热变性DMBT1丧失了抑制抽搐运动的能力并显示出菌毛结合减少（~40％）。Lys-C消化的天然DMBT1的尺寸排阻色谱显示仅高Mw级分保留活性，表明含有重复SRCR结构域的N-末端参与糖基化SRCR-散布结构域（SID）。然而，单个或汇集的共有序列肽（SRCRPs 1至7）显示无活性且不结合铜绿假单胞菌。菌毛; 也没有重组DMBT1（aa 1-220）或另一种富含SRCR的糖蛋白CD163。DMBT1的酶促去-N-糖基化，但不是去-O-糖基化，降低了其抑制抽搐运动的能力（~57％），而没有减少菌毛结合。因此，DMBT1对铜绿假单胞菌抽搐运动的抑制涉及其N-糖基化，其菌毛结合能力不足，并且它不能由SRCR细菌结合肽结构域赋予，单独或与其他未连接的SRCRP混合，表明另外DMBT1介导的粘膜防御机制。
DMBT1（在恶性脑肿瘤1中删除）是一种~340kDa糖蛋白，首先从唾液中分离，属于高度保守的清道夫受体富含半胱氨酸（SRCR）蛋白超家族，并参与粘膜先天免疫1。从N末端，DMBT1含有由SID（SRCR-散在结构域）分开的13个高度同源的SRCR结构域。A 14 个 SRCR结构域来自其他13由CUB（C1R /的C1s UEGF BMP1）结构域，另一个其中的14分离分离个域从形成C末端的ZP（透明带）结构域2，3。DMBT1唾液凝集素（DMBT1 SAG）已经显示进行交互，和凝集，若干革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌，除铜绿假单胞菌4，5，6，7，8。类似地，泪液DMBT1显示结合金黄色葡萄球菌，但不结合铜绿假单胞菌9。变形链球菌和许多其他细菌（例如金黄色葡萄球菌，大肠杆菌和幽门螺杆菌）的 DMBT1结合涉及SRCR结构域，并且特异性定位于命名为SRCRP2 3的DMBT1的16个氨基酸的共有序列肽。
DMBT1在多个组织和体液中表达，并可以进行，在特定地点影响其功能的修改1，9。事实上，有由于可变剪接和翻译后修饰的群体内不同的人类DMBT1等位基因和不同同种型在不同组织1，4，10，11，12。在唾液衍生DMBT1 SAG，〜分子质量的25％是由于糖基化作用（〜10％为N-糖基化，和〜15％O-糖基化）13，14。
以前，我们发现泪液DMBT1和从唾液中纯化的DMBT1通过抑制铜绿假单胞菌的抽搐运动对粘膜组织起保护作用15。细菌抽搐运动是由IV型菌毛（T4P）16的伸展和收缩驱动的革兰氏阴性细菌常用的表面相关运动。在铜绿假单胞菌中，T4P是主要由PilA亚基17组成的聚合物。移动所需的伸展和缩回由ATPases PilB，PilU和PilT 18提供动力。在以前的研究中，我们显示了铜绿假单胞菌细胞侵袭后，抽搐突变体在宿主细胞出口处有缺陷，体外角膜上皮细胞穿过受损19，受损小鼠角膜中的毒力降低20。与这些结果一致，在上述研究15中，纯化的DMBT1 在体外穿过多层培养的上皮细胞抑制铜绿假单胞菌，并且在角膜感染的鼠模型中降低铜绿假单胞菌毒力。还显示DMBT1可结合来自铜绿假单胞菌的提取的菌毛，表明菌毛相互作用参与抽搐抑制。
鉴于抽动运动对铜绿假单胞菌毒力20的重要性，我们试图进一步了解DMBT1抑制抽搐运动的机制，与菌毛结合的关系，以及是否涉及SRCR结构域。我们报告了使用纯化的唾液DMBT1（DMBT1 SAG），酶消化的片段和合成的DMBT1共有序列肽（SRCRP1-7）的结构 - 功能研究，旨在鉴定介导该宿主防御铜绿假单胞菌的分子结构域和特征。
以前，我们发现从人唾液中纯化的DMBT1可以抑制铜绿假单胞菌（PAO1）的抽搐运动，也可以与提取的菌毛结合15。为了确定这些活性是否是热稳定的，将纯化的唾液糖蛋白DMBT1在95℃下煮沸10分钟。这种蛋白质变性处理消除了DMBT1对抽搐运动的抑制（通过抽搐速度测量）（图 1A），表明糖蛋白构象对于这种活性是重要的。此外，抗PilA斑点印迹及其定量分析表明，与未处理的DMBT1相比，煮沸的DMBT1与提取的菌毛结合的能力降低（~40％）（图 1B，C））。尽管热变性后菌毛结合的减少在统计学上不显着，但数据表明DMBT1与菌毛蛋白的结合在其天然构象中是最佳的。
煮沸的DMBT1不抑制铜绿假单胞菌抽搐运动。将DMBT1（100ng /μL）在95℃加热10分钟以使蛋白质变性。（A）煮沸的DMBT1对铜绿假单胞菌 PAO1抽搐速度失去抑制活性。数据显示为来自三个独立实验的每个样品的平均值±SEM。单因子方差分析与Tukey的事后分析，**** P <0.0001; ns，不重要。（B）使用抗PilA抗体的点免疫印迹测定法显示在与来自PAO1的含有菌毛的提取物孵育40分钟后PAO1菌毛与DMBT1（500ng）或煮沸的DMBT1（500ng）的结合。来自PAO1（S-PAO1）的稀释菌毛提取物或其pilA突变体（S-PAO1- ）的类似稀释提取物pilA :: Tn）作为对照（参见方法），单独使用PBS。显示了两个独立实验的代表性实验。（C）来自图B中所示的点免疫印迹测定的点强度的定量。数据显示为来自每个样品的三次测量的平均值±SEM。使用Dunn的多重比较进行Kruskal-Wallis检验，* P <0.05; ns，不重要。
为了进一步研究不同DMBT1结构域在抑制铜绿假单胞菌抽搐运动中的作用，用内切蛋白酶Lys-C酶促消化纯化的唾液DMBT1。其他人已经表明DMBT1含有位于C-末端区域3的 10个赖氨酸残基。因此，除了几个较小的片段外，Lys-C消化还应产生含有大多数SRCR结构域和SRCR散布结构域（SID）的大片段（图 2A）。Lys-C内切蛋白酶消化的DMBT1保留了对铜绿假单胞菌抽搐运动的抑制（图 2B）。在天然缓冲液条件下Lys-C消化的DMBT1的尺寸排阻色谱显示出预期的分级模式（图2）。 2C）。测试在天然缓冲条件下获得的每种Lys-C消化的DMBT1级分对铜绿假单胞菌抽搐运动的抑制。只有组分1，预计含有组合的高分子量SRCR / SID结构域（aa 1-1812）的片段，以及完整的DMBT1，抑制细菌抽搐运动（图 2D），表明DMBT1的SRCR / SID组分是需要的，并且表明通过Lys-C消化产生的C末端区域的较小片段是无效的。
在天然条件下被Lys-C消化的DMBT1抑制铜绿假单胞菌抽搐运动。（A）具有14个清道夫受体富含半胱氨酸（SRCR）结构域，2个CUB结构域和Zona Pellucida（ZP）结构域的人唾液DMBT1的示意图，显示内切蛋白酶Lys-C切割位点（红线）。（B）Lys-C消化的DMBT1（100ng /μL）相对于DMBT1对照对培养4小时和24小时后的铜绿假单胞菌菌株PAO1的菌落大小的影响。双向ANOVA与Tukey的多重比较，ns，不重要。（C） Lys-C消化的DMBT1的尺寸排阻色谱分离。级分1含有高分子量片段（包括aa 1-1812）。（D）菌落大小在不同级分的Lys-C消化的DMBT1中孵育4小时和24小时后的铜绿假单胞菌。只有第1部分抑制铜绿假单胞菌抽搐运动，类似于DMBT1。双向ANOVA与Tukey的多重比较，ns，不重要。
Lys-C消化的DMBT1的级分1应该包含由组合的多个SRCR / SID结构域组成的高分子量片段（aa 1-1812）。因此，测试了跨越DMBT1 SRCR结构域3的共有序列的一系列定制合成肽（SRCRP）。实际上，SRCRP2先前已被证明参与细菌结合3。然而，所测试的每种基于SRCR共识的肽（SRCRP 1-7）对铜绿假单胞菌抽搐运动没有影响（图 3A，B），并且当合并这些肽时没有观察到抑制（图 3A， B）。还证实（合并的）SRCR肽（1-7）不结合菌毛（图 3C）。对照实验证实先前的发现SRCRP2引起链球菌属的凝集/聚集。（此处显示使用化脓性链球菌）3，但不是铜绿假单胞菌（图 3D）。如前所述15，纯化的唾液DMBT1抑制铜绿假单胞菌抽搐运动（图 3A，B），但不引起细菌凝集/聚集（图 3D）。因此，将铜绿假单胞菌暴露于DMBT1 SRCR结构域的共有序列（尽管是片段）不足以抑制抽搐运动，或结合提取的菌毛，支持我们先前的假设15 DMBT1对铜绿假单胞菌抽搐运动的抑制涉及与其他细菌物种相比不同类型的细菌细胞相互作用 3。
SRCR结构域共有序列肽不抑制抽搐运动。定制合成的肽SRCRPs 1-7（在含有10mM CaCl 2的TBS中稀释200ng /μL ）对4小时后铜绿假单胞菌菌株PAO1的（A）抽搐速度和（B）菌落大小的影响。数据显示为平均值±SEM。实验一式三份进行，使用单因素方差分析和Dunnett多重比较检验确定显着性。*** P <0.001，** P <0.01。没有一种肽显示出与TBS（具有10mM CaCl 2）对照相比的显着差异。（C）使用抗PilA抗体的点免疫印迹测定显示PAO1菌毛与纯化的DMBT1（400ng）的结合，但不与合并的SRCRP 1-7（400ng）结合。将来自PAO1（S-PAO1）的稀释的菌毛提取物或来自其pilA突变体（S-PAO1 - pilA :: Tn）和PBS的稀释的菌毛提取物用作对照。（D）凝集测定显示纯化的唾液DMBT1和共有序列肽SRCRP2，凝集/聚集化脓性链球菌（上图）如前所示19，但不是铜绿假单胞菌（下图），与TBS对照（参见方法） 。
由于Lys-C消化的DMBT1的级分1也含有N末端区域（尽管是含有多个SRCR / SID的大片段的一部分），因此由DMBT1的N-末端结构域组成的重组截短肽（Met1-Ser 220） ）（图 4A）进行了测试。然而，该重组N-末端肽对抽搐运动没有影响（图 4B），并且不结合菌毛（图 4C）。
重组DMBT1（Met1-Ser220）对铜绿假单胞菌抽搐运动没有影响。（A）重组截短的人DMBT1（NP_004397.2）（Met 1-Ser 220）的示意图，显示在DMBT1的一级序列中，具有9个清道夫受体富含半胱氨酸（SRCR）结构域，2个CUB结构域和透明带（ZP）域。（B）截短的DMBT1（100ng /μL）对铜绿假单胞菌菌株PAO1在4小时后的抽搐速度的影响。PAO1- pilA :: Tn作为阴性对照。使用Tukey多重比较检验的单因素方差分析，**** P <0.0001。（C）使用抗PilA抗体的点免疫印迹测定显示提取的PAO1菌毛与DMBT1（500ng）的结合，但未截短的DMBT1（500ng）。来自PAO1（S-PAO1）的菌毛提取物，来自pilA突变体（S-PAO1 - pilA :: Tn）的提取物（均在PBS中稀释1/500）用作对照，以及单独的PBS。
还测试了CD163的抑制作用，因为它是SRCR-超家族的成员（图 5A）。此外，这种质膜糖蛋白在单核细胞和巨噬细胞上表达，并作为细菌的受体起作用，导致促炎细胞因子21的表达。然而，结果显示重组人CD163对铜绿假单胞菌抽搐运动没有影响（图 5B，C），尽管结构上有相当大的相似性，即。多个SRCR / SID区域，到DMBT1。
糖蛋白CD163不抑制铜绿假单胞菌 PAO1抽搐运动。（A）与人唾液DMBT1相比，在HEK 293细胞（BioVision，Inc。）中表达的CD163的示意图。（B） CD163（200 ng /μL）对处理4小时后铜绿假单胞菌 PAO1的抽搐速度的影响（单向ANOVA与Tukey多重比较，ns，无显着性），和（C）对4小时后的菌落大小的影响和24小时。PAO1- pilA :: Tn作为阴性对照。使用双向ANOVA与Tukey的多重比较确定显着性，ns，不显着。
已经确定抑制抽搐运动存在于含有N末端区域和组合SRCR / SID结构域（aa 1-1812）的Lys-C消化的DMBT1的高分子量级分中，但没有发现对DMBT1的单个SRCR肽的活性或我们研究了具有相似SRCR组成的蛋白质是否涉及翻译后修饰。由于DMBT1是高度糖基化的蛋白质2，我们假设糖基化参与抽搐抑制。为了测试这一点，在天然条件下用含有N-糖苷酶PNGase F，O-糖苷酶，神经氨酸酶，外切糖苷酶β1-4半乳糖苷酶和β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的去糖基化酶混合物消化DMBT1以除去所有N-连接的和简单的O-连接的聚糖，以及一些复杂的O-连接聚糖（见方法）。去糖基化后，与天然DMBT1对照相比，DMBT1显示出对铜绿假单胞菌抽搐运动的抑制活性显着降低，如通过抽搐速度（P <0.001，图 6A）和集落大小（ 24小时后P <0.001，图 6B）所测量的。）。在24小时检查菌落大小数据表明DMBT1的完全O-和N去糖基化使其抑制抽搐运动的能力降低~41％（图 6B）。然而，如点免疫印迹测定所示，去糖基化的DMBT1仍与菌毛结合（图 6C，D）。这些结果表明DMBT1的糖基化参与抑制铜绿假单胞菌抽搐运动。然而，观察到减少DMBT1介导的抽搐抑制与菌毛结合的任何减少无关，这表明可能涉及其他（或其他）机制。
DMBT1糖基化参与抑制铜绿假单胞菌抽搐运动。去糖酶消化DMBT1对（A）铜绿假单胞菌PAO1 4h后抽搐速度的影响，以及（B）铜绿假单胞菌 PAO1在4h和24h后的集落大小。数据显示为来自三个独立实验的每个样品的平均值±SEM。使用单向ANOVA（图A）或双向ANOVA（图B）测定显着性，各自用Tukey的多重比较，**** P <0.0001; *** P <0.001; * P <0.05; ns，不重要。（C）用抗PilA抗体的点免疫印迹测定显示在去糖基化消化后PAO1菌毛与纯化的DMBT1（400ng）持续结合。来自PAO1（S-PAO1）的菌毛提取物，来自pilA突变体（S-PAO1 - pilA :: Tn）的提取物（均在PBS中稀释1/500）用作对照，以及单独的PBS。（D）使用来自图C中所示的点免疫印迹测定的ImageJ定量点强度。数据显示为来自每个样品的重复测量的平均值±SEM。确定的显着性使用Kruskal-Wallis检验与Dunn的多重比较，* P <0.01; ns，不重要。
我们接下来通过选择性靶向O-连接的和N-连接的部分来研究DMBT1糖基化连接的类型是否重要。在天然条件下用O-聚糖靶向酶混合物（O-糖苷酶，神经氨酸酶，外切糖苷酶β1-4半乳糖苷酶和β-N-乙酰葡糖胺酶）研究O-糖基化参与DMBT1抑制抽搐活性。DMBT1和脱氧糖基化DMBT1在抽搐抑制方面没有显着差异（图 7A，B））。使用与细菌（24至48小时）和/或更高浓度的去糖基化酶（数据未显示）的更长孵育时间获得相同的结果。根据制造商的（Biolabs）文献，这种酶的组合可能不会去除所有O-连接的寡糖，但应该在天然条件下去除许多常见的寡糖结构。由于变性的DMBT1丧失了对抽搐运动的抑制作用（图 1A），变性的脱-O-糖基化不能用于完全去除O-连接的聚糖。然而，结果表明简单的O-糖基化不参与DMBT1抑制铜绿假单胞菌抽搐运动。
DMBT1的O-糖基化不会有助于抑制细菌抽搐运动。（A）O-去糖基化酶混合物消化的DMBT1 在4小时后对铜绿假单胞菌 PAO1的抽搐速度的影响。将DMBT1（100 ng /μL）用O-去糖基化酶（O-糖苷酶，神经氨酸酶，半乳糖苷酶和N-乙酰基 - 氨基葡萄糖苷酶）的混合物在37℃下在天然糖基缓冲液（50mM磷酸钠，pH 7.5）中消化2天。 ）去除DMBT1的复杂O-糖基化。用相同体积的糖缓冲液稀释的PBS和DMBT1作为对照。（B）在4小时和24小时后，O-去糖基化酶混合物消化的DMBT1对铜绿假单胞菌 PAO1的菌落大小的影响。（C）不同消化后DMBT1对铜绿假单胞菌 PAO1细胞在4h和24h后大小的影响。将DMBT1（100ng /μL）用神经氨酸酶（去唾液酸化糖苷酶），半乳糖苷酶或N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（两种外切糖苷酶）在37℃下在糖缓冲液（50mM乙酸钠，0.5mM CaCl 2，pH5.5）中消化2小时以除去唾液酸残基和DMBT1的其他复杂糖基化。用相同体积的糖缓冲液稀释的PBS和DMBT1作为对照。数据显示为来自三个独立实验的每个样品的平均值±SEM。使用单向ANOVA（图A）或双向ANOVA（图B）测定显着性，各自用Tukey的多重比较，**** P <0.0001; ns，不重要。
为了研究复杂的DMBT1 O-糖基化是否可能参与抽搐运动抑制，DMBT1在不同（更优）的消化缓冲液（50 mM醋酸钠，0.5 mM）中用神经氨酸酶，β1-4半乳糖苷酶或β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶消化。 CaCl 2，pH 5.5）。然而，尽管β1-4半乳糖苷酶似乎具有一些作用，但DMBT1的这些复杂的脱-O-糖基化处理对其抑制抽搐运动的能力都没有显着影响（图 7C）。因此，数据表明DMBT1的复合O-糖基化也不是抑制抽搐运动所必需的。
纯化的DMBT1也用PNGase F消化，以除去天然缓冲液中的N-连接聚糖。与DMBT1相比，DMBT1的去-N-糖基化酶处理显着降低了其抑制铜绿假单胞菌抽搐运动的能力（图 8A，B）。在24小时检查菌落大小数据表明DMBT1的去-N-糖基化使其抑制抽搐运动的能力降低~57％（图 6B）。因此，与未处理的DMBT1相比，DMBT1去-N-糖基化降低抽搐运动抑制活性的程度与非特异性去糖基化所观察到的相似（如果不大于）（图 6A，B））。因此，这些数据表明DMBT1的N-糖基化参与抑制抽搐运动。然而，与PBS-酶对照相比，去-N-糖基化的DMBT1仍然显示出对抽搐运动的显着抑制（图 8A，B），表明DMBT1的N-糖基化仅部分参与抽搐抑制活性和其他分子特征。也是必需的。此外，与天然DMBT1类似，去-N-糖基化的DMBT1仍然与菌毛结合（图 8C，D），表明需要额外或代替直接菌毛相互作用的因子。
DMBT1抑制铜绿假单胞菌抽搐运动涉及其N-糖基化。在天然糖质缓冲液（50mM磷酸钠，pH7.5）中，通过PNGase F（不含甘油）在37℃消化DMBT1（100ng /μL）2天，以除去DMBT1的N-糖基化。用相同体积的天然糖基缓冲液稀释PBS和DMBT1，用相同体积的PNGase处理的PBS作为对照。（A） 4小时后，PNGase F消化的DMBT1对铜绿假单胞菌PAO1 抽搐速度的影响。（B） PNGase F消化的DMBT1对铜绿假单胞菌菌落大小的影响PAO1在4小时和24小时后。数据显示为来自三个独立实验的每个样品的平均值±SEM。使用单向ANOVA（图A）或双向ANOVA（图B）测定显着性，各自用Tukey的多重比较，**** P <0.0001; *** P <0.001; ** P <0.01; ns，不重要。（C）使用抗PilA抗体的点免疫印迹测定，显示即使在PNGase F消化后PAO1菌毛与纯化的DMBT1（400ng）的结合。来自PAO1（S-PAO1）的菌毛提取物，来自pilA突变体（S-PAO1 - pilA :: Tn）的提取物（均在PBS中稀释1/500）用作对照，以及单独的PBS。（d）使用来自图C中所示的点免疫印迹测定的ImageJ定量点强度。数据显示为来自每个样品的重复测量的平均值±SEM。确定的显着性使用Kruskal-Wallis检验与Dunn的多重比较，** P <0.01; ns，不重要。
先前，我们发现，该糖蛋白DMBT1在人泪液，以及从人唾液中，抑制抽搐蠕动纯化铜绿假单胞菌，因此通过人角膜上皮细胞防止细菌遍历体外，并在角膜感染的鼠模型中降低疾病15。在这里，我们专注于确定如何唾液DMBT1（DMBT1 SAG）使用结构 - 功能研究抑制抽搐运动。结果表明，通过热变性消除了唾液DMBT1抑制抽搐运动的能力，这与降低与纯化菌毛的结合相关。结果还表明，Lys-C消化DMBT1对抽搐抑制没有影响，Lys-C消化后活性存在于高分子量级分中。此外，对于定制合成的个体或合并的SRCR-共有序列肽，重组N-末端DMBT1，以及富含SRCR-SID的糖蛋白CD163，未观察到对抽搐抑制的影响。然而，使用DMBT1的酶促去糖基化的实验表明，抽搐运动的抑制部分地但显着地与N-糖基化相关，但不与O-糖基化相关，
热变性唾液DMBT失去抑制铜绿假单胞菌抽搐运动的能力的发现表明结构构象对于这种活动是重要的。实际上，结果与我们之前使用含有DMBT1的泪液的结果一致，后者在热变性15后也失去了对抽搐运动的抑制作用。除了结构构象的丧失之外，热变性后抑制活性的丧失可包括通常结合细菌配体的DMBT1部分的损害。实际上，热变性确实导致DMBT1与铜绿假单胞菌的菌毛提取物结合减少。热变性还可能导致DMBT1相关分子的丧失，其介导或帮助介导抽搐抑制。然而，在我们之前的研究中，纯化的唾液DMBT1的质谱分析未显示任何已知的DMBT1相关的先天防御分子15，表明这种可能性不太可能。
用Lys-C消化唾液纯化的DMBT1，然后进行大小排阻层析，表明唾液DMBT1的SRCR / SID结构域对于抑制铜绿假单胞菌抽搐运动是必需的，即。N末端的高Mw片段（aa 1-1812）。该结果与先前的研究一致，其中Lys-C消化唾液DMBT1显示变形链球菌的结合与SRCR / SID结构域3相关。在该研究和随后的研究中，一系列定制合成的肽一起跨越唾液DMBT1的SRCR结构域的109个氨基酸共有序列，用于鉴定特定的细菌结合区域。SRCR介导的变形链球菌的DMBT1结合许多其他细菌，例如金黄色葡萄球菌，大肠杆菌和幽门螺杆菌，特异性定位于命名为SRCRP2的16个氨基酸的肽，甚至更具体地定位于11个氨基酸的最小细菌结合区域（DMBT1病原体结合位点）3，22。然而，在我们的研究中，SRCRP2不抑制铜绿假单胞菌抽搐运动，也不抑制菌毛提取物。对照也证实SRCRP2可以凝集链球菌属。如前所示3，但不是铜绿假单胞菌。此外，代表SRCR结构域共有序列的其他区域的其他SRCR肽均不具有单独或合并的任何作用。当然，这些发现并不排除SRCR结构域参与DMBT1介导的对铜绿假单胞菌抽搐运动的抑制，例如。可能需要使用具有与SRCR结构域共有序列不同的序列的肽。或者，SID域本身可能是必需的，或者桥接一系列SRCR域。例如，含有一个SRCR和其相邻SID的一半的DMBT1的N-末端结构域的区域结合HIV-1 gp-120以发挥抗病毒作用23。此外，类似的分子与DMBT1具有多个连接的SRCR结构域，例如。CD163在组织巨噬细胞上表达，也结合多种不同的细菌，引发促炎介质21的释放。然而，重组N-末端DMBT1（aa 1-220）和重组CD163都不会对铜绿假单胞菌抽搐产生任何影响，它们也不会结合菌毛提取物。同样，这并不排除DMBT1的N-末端结构域与多个SRCR结构域及其各自的SID参与抑制铜绿假单胞菌。抽搐的动力。然而，这些集体研究结果确实表明该机制涉及DMBT1-细菌细胞相互作用，其与报道的许多其他革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌不同，至少它不能被SRCR细菌结合肽结构域赋予。单独使用，或与其他共有序列肽混合（尽管未连接）。
Lys-C消化的DMBT1的高Mw级分的活性可能反映了残留的未消化的DMBT1的存在，因为将未消化的天然DMBT1与其他高Mw片段分离非常困难，并且热变性消除了其抽搐抑制活性。 。然而，即使存在残留的DMBT1，也不会改变上述结论，即抽搐运动抑制的机制可能涉及不同类型的DMBT1与铜绿假单胞菌的相互作用。比报道的其他细菌。此外，Lys-C消化的DMBT1的较小Mw级分缺乏活性确实表明Lys-C消化产生的C末端片段本身不足以抑制抽搐。反过来，该发现表明抽搐抑制不涉及DMBT1的两个CUB结构域和ZP结构域。
唾液DMBT1的酶促去糖基化确实导致抽搐运动的部分减少，这似乎与去除N-糖基化残基特异性相关（DMBT1对细菌抽搐速度的影响减少约46％，并且效果减少约57％）关于细菌菌落大小）。虽然只是部分减少抽搐抑制作用，但数据显示DMBT1的N-糖基化对于抑制铜绿假单胞菌抽搐运动是重要的。N联糖基被称为是用于一般的蛋白稳定性和动态临界24，25，26。实际上，N-聚糖的精确位置对于活性24是重要的。这可能有助于解释为什么CD163，一种含有细菌受体蛋白的SRCR / SID与DMBT1非常相似，含有许多N-聚糖，不会抑制铜绿假单胞菌的抽搐。对于呼吸道粘膜液衍生的DMBT1（gp-340），有14个潜在的N-连接糖基化位点2，其中只有4个位于Lys-C消化后形成的DMBT1的N-末端片段内。然而，尽管我们的数据暗示DMBT1（aa 1-1812）的SRCR / SID结构域在抽搐运动抑制中，并且在Lys-C消化后没有获得C末端DMBT1级分的影响（图 2）），C末端N-糖基化（1813-2413之间的9个位点）也可能发挥作用。有趣的是，而不是特定于DMBT1，撕裂蛋白的N-聚糖已经参与介导其结合到临床眼的分离株铜绿假单胞菌27。因此，需要进一步研究以确定哪个DMBT1 N-糖基化位点对于抽搐抑制表型是重要的。
虽然糖基化差异（例如，在唾液酸乐[路易斯]抗原）已经从泪液，唾液，和呼吸DMBT1（GP-304）的不同的同种型之间注意到流体28，29中，我们先前指出，唾液酸基勒（路易斯DMBT1同种型之间）抗原的差异将不会参与，因为两个泪液和唾液DMBT1抑制抽搐蠕动，但表达不同的唾液酸-乐抗原15。此外，唾液酸-乐抗原连接由O-糖基化至泪液和唾液DMBT1 29，30，而在本研究中，DMBT1的酶促脱-O-糖基化并不影响其的抑制铜绿假单胞菌抽搐蠕动。
虽然去-N-糖基化降低了DMBT1抑制抽搐的能力，但与PBS相比仍然存在显着抑制，表明DMBT1的其他组分也有助于抽搐抑制。由于DMBT1的热变性导致完全丧失活性（图 1），因此这些其他机制也是热敏感的。然而，考虑到去-N-糖基化和一般去糖基化之间的抑制水平的相似性（图 8B与图 6B），以及缺乏特异性去-O-糖基化的作用（图 7B），表明这些其他机制抽搐抑制与DMBT1分子结构的其他方面有关。
在我们之前的研究中，DMBT1抑制抽搐运动的能力与提取的细菌菌毛的结合相关，表明参与抑制机制15。然而，在本研究中，两个观察结果削弱了这种相关性; （1）热变性DMBT1保留菌毛结合（变性后约60％），尽管活性完全丧失，和（2）去-N-糖基化对菌毛结合没有影响，但抑制活性减少~57 ％。因此，DMBT1可以结合铜绿假单胞菌菌毛没有抑制抽搐运动。以前的研究表明，DMBT1（gp-340）可以将细菌菌毛与各种结果结合起来。例如，pili介导的A组链球菌与gp-340的结合与细菌聚集和防止细菌粘附相关31。相反，pili介导的B组链球菌与表面固定化gp-340的结合被提出作为宿主定植机制，而流体相gp-340（可能是宿主防御）的细菌聚集是菌毛独立的5。因此，我们的研究结果并不排除pili结合参与DMBT1介导的抑制作为宿主防御的抽搐运动，但表明这种活性不能通过单独结合菌毛来实现。或者，DMBT1与之结合铜绿假单胞菌菌毛可以从抽搐蠕动抑制，无论是有助于宿主防御服务一个完全独立的功能通过一个附加的机构或甚至细菌发病如果情况允许，例如。在隐形眼镜下。用于抑制DMBT1其他潜在机制绿脓杆菌抽搐蠕动可能涉及基因表达的在弼CHP通路控制IV型菌毛生产和抽搐蠕动解除管制32，33。虽然我们之前的研究表明基因cyaB，chpB和pilK不是DMBT1介导的抽搐抑制所必需的15，该途径中的其他基因仍可能受到影响。DMBT1也可能与参与菌毛伸出或缩回的其它蛋白质相互作用（例如，ATP酶PilB，PilT和毗卢或化学感受蛋白PilJ）34，35，36，其可能损害抽搐蠕动。因此，DMBT1-菌毛相互作用在抑制铜绿假单胞菌抽搐运动中的作用可能是复杂的，并且理解它们可能需要进一步的深入研究。
总之，本研究的结果增加了我们对DMBT1介导的铜绿假单胞菌抽搐运动抑制的理解，这有助于防止表面上皮的粘膜液防御，有助于防止细菌穿过粘膜上皮，形成表面相关的生物膜，以及引起疾病病理。数据显示人唾液DMBT1（DMBT1 SAG）的抑制机制是热敏感的，这表明分子构象是重要的，并且DMBT1 N-糖基化而非O-糖基化有助于约50％或更多的抽搐抑制活动。结果还表明，唾液DMBT1可以结合铜绿假单胞菌菌毛没有抑制抽搐运动，这表明如果涉及菌毛结合，其他机制可能会发挥作用。尽管如此，唾液DMBT1基于共有序列的肽缺乏抽搐抑制活性，并且尽管存在酶促脱-O-糖基化，但仍存在抽搐抑制活性，这表明所涉及的机制不同于DMBT1介导的防御机制。其他细菌病原体。
铜绿假单胞菌菌株PAO1用于该研究。细菌在胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）平板（37℃，16小时）上生长以获得“草坪”培养物。将缺乏菌毛并因此抽搐运动的菌毛蛋白突变体PAO1- pilA :: Tn 37用作阴性对照，并在具有四环素（60μg/ mL）的TSA上生长。我们之前已经验证了这种突变体15。抽搐运动试验涉及在Twitching Motility Gellan Gum（TMGG）培养基上生长细菌（0.8 g结冷胶，0.4 g胰蛋白胨，0.2 g酵母提取物，0.2 g NaCl，0.1 g MgSO 4 ·7H 2 O，在100 mL H 2 O中）在37℃下在加湿室中指定不同的时间，并如前所述15。对于DMBT1纯化和凝集测定（见下文），我们使用在脑和心脏输注肉汤中于37℃生长的化脓性链球菌（ATCC19615）（过夜）。
使用加利福尼亚大学伯克利分校人类受试者保护委员会批准的方案从健康志愿者（4名受试者）获得人唾液。该研究遵循了赫尔辛基宣言的原则，并根据美国联邦指导方针和规定进行了研究。从所有受试者获得知情同意，并且每个受试者都被告知研究的性质和潜在后果。首先通过离心（3,800×g，10分钟）澄清收集的唾液。为了纯化DMBT1我们使用的方法先前描述7，38。首先将澄清的唾液在PBS中稀释50％。S. pyogenes如上所述生长，也通过离心（3,800×g，5分钟）收集，然后用PBS洗涤3次。将细菌浓度调整至~5×10 9将CFU / mL，等体积的细菌悬浮液和稀释的唾液混合并孵育（37℃，1小时）。通过离心（3,800×g，5分钟）收集细菌，并用PBS洗涤3次。使用含有EDTA（5mM）的PBS（1.5mL）在室温（RT）下释放结合的蛋白质（5分钟）。离心细菌培养物（15,000×g，5分钟）后，将上清液通过0.22μm过滤器，并对PBS（4℃，过夜）透析（Slide-A-Lyzer透析盒，Thermo Fisher，NY）。 。将透析的洗脱液在PBS（pH7.4）中平衡的Superose 6 10/300 GL柱（GE Healthcare，CA）上进行凝胶过滤层析。收集空隙体积的洗脱液并用作纯化的DMBT1（来自唾液）。用微BCA蛋白质测定试剂盒（Thermo Scientific，IL，USA）测量DMBT1浓度。
使用显微镜载玻片测定法39测量抽搐运动性，其具有先前描述的修改15。如上所述培养细菌，并将TMGG培养基在无菌气流（BSL2 Biosafety Cabinet）中干燥20分钟。然后，将5μLDMBT1，PBS或其他溶液滴加到TMGG培养基上直至被吸收。然后使用无菌牙签将细菌接种到TMGG培养基上。将玻璃盖玻片置于培养基上以形成“间隙”空间。将载玻片孵育4小时（37°C）后，使用具有60×油浸物镜的Nikon ECLIPS Ti显微镜，通过差分干涉对比（DIC）显微镜以10秒间隔捕获延时视频（5分钟）。 37°C。
为了计算抽搐速度，将群体前缘的抽搐距离除以时间，如前所述15。图像J用于测量细菌从5分钟视频的第1-31帧行进的距离。在每个视频中跟踪10个细菌，每组一式三份进行。
如下制备菌毛提取物：将铜绿假单胞菌 PAO1悬浮于PBS（OD 600为~10）中，通过涡旋混合（3分钟），离心（15,000×g，20分钟）并收集上清液。向上清液中加入MgCl 2（终浓度为100mM）后，将上清液在4℃下保存过夜。第二天，将离心剂离心（15,000×g，20分钟），将沉淀重悬于PBS（500μL）中，形成含有菌毛的提取物。PAO1- pilA :: Tn通过相同的过程制备阴性对照提取物。如前所述15进行点免疫印迹测定。首先，将PBS中的2μLDMBT1（250ng /μL或200ng /μL，后一浓度同样有效）点在硝酸纤维素膜（0.2μm孔径，BioRad）上。包括PBS对照以及来自PAO1（阳性对照）或pilA突变体（阴性对照）的菌毛提取物。通过在PBS中稀释提取物（1/500）来制备后一种对照。干燥后，将膜用BSA（5％）在室温下封闭1小时，用PBS洗涤5分钟，然后与未稀释的PAO1的PAO1菌毛提取物在室温下孵育40分钟。用PBS洗涤5次后，用抗PilA一抗（1：5000），然后用山羊抗兔HRP-缀合的二抗（1：5000）探测膜。用AlphaView FluoChem HD2软件测量点强度。
根据制造商的说明书，使用内切蛋白酶Lys-C（New England BioLabs）在天然条件下消化DMBT1的赖氨酸残基的羧基侧。然后，将50μL纯化的DMBT1（200 ng /μL）与10μLLys-C消化溶液（100 ng /μL），10μLPBS和2μLLys-C溶液（20 mM Tris-）一起孵育。 HCL缓冲液，pH 8.0）在37℃下保持16小时。通过尺寸排阻色谱分离样品。将AKTAmicro系统与Superose 6 10/300 GL柱（GE Healthcare）一起使用，在PBS（pH 7.4）中洗脱。通过在进样阀和馏分收集器之间使用短长度为0.15 mm内径的管道，使峰展宽最小化。将消化的DMBT1注射到柱上，收集级分（250μL）。通过280nm处的UV吸光度检测蛋白质。根据蛋白质峰合并洗脱的级分，并使用~3kDa截止滤器（Millipore）浓缩。然后评估分数对抽搐运动的影响。
基于DMBT1的氨基酸序列，如前所述3定制合成跨越DMBT1 SRCR结构域的共有序列（SRCRP1至7）的一系列肽。将肽在Tris缓冲盐水（TBS）中稀释至200ng /μL，pH = 7.5，补充有10mM氯化钙，并如上所述测试对细菌抽搐运动的影响。对于点免疫印迹，如上所述将2μL（400ng）SRCRPs 1-7点在硝酸纤维素膜上。
如前所述进行凝集测定3。将化脓性链球菌和铜绿假单胞菌（PAO1）悬浮于TTC（含有0.1％吐温20和1mM Ca 2+的 Tris缓冲盐水）至~5×10 8 CFU / mL的浓度。然后，将150μL细菌与150μL的SRCRP2溶液（200ng /μL在Tris缓冲盐水[TBS]中，含有10mM Ca 2+）在96孔板中混合，然后在37℃下孵育2小时。凝集后，将10μL细菌转移到显微镜载玻片上。将细菌热固定，然后用结晶紫溶液染色，并用光学显微镜检查。单独缓冲液（含有10 mM Ca 2+的 TBS））和纯化的DMBT1（200ng /μL）用作对照。
人重组CellExp TM CD163获自BioVision，Inc。（Milpitas，CA，USA）。由于糖基化，重组蛋白报道的Mw为135-140kDa。为了在实验中使用，将CD163重悬于PBS中至终浓度为200ng /μL。如上所述测试对铜绿假单胞菌抽搐运动的影响。
去糖基化酶混合物（Biolabs）用于在天然条件下消化DMBT1。对于每种酶（PNGase F，O-糖苷酶，神经氨酸酶，β1-4半乳糖苷酶，β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶），使用5μL制备酶混合物，并在37℃下与20μL纯化的DMBT1（250 ng /μL）一起孵育。 °C 48小时。对于复杂的脱-O-糖基化，将25μL纯化的DMBT1（200 ng /μL）与10X glycobuffer 2（2μL），酶混合物（神经氨酸酶，β1-4半乳糖苷酶，β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶和O-糖苷酶）一起孵育。 ）（各5μL）在37℃下保持2小时。为了去除N-连接的聚糖，将15μL纯化的DMBT1（200 ng /μL）与10X glycobuffer 2（3μL），PNGase F（5μL）和H 2 O（7μL ）在37°C 下孵育48 h 。
除非另有说明，否则数据表示为平均值±平均值的标准误差（SEM）。使用双向ANOVA和Tukey的多重比较进行事后分析，或使用单向ANOVA与Tukey或Dunnett的多重比较，评估多组之间差异的显着性。使用Dunn多重比较的Kruskal-Wallis检验用于非参数数据。P值小于0.05被认为是显着的。
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