分泌IL-4的工程化巨噬细胞肺移植对C57BL / 6J小鼠急性肺损伤的疗效 - ELISA试剂盒,酶免试剂盒,酶联免疫吸附试验, ELISA实验,ELISA,双抗体夹心法,科研蛋白,抗体,细胞系,武汉新启迪生物科技有限公司

分泌IL-4的工程化巨噬细胞肺移植对C57BL / 6J小鼠急性肺损伤的疗效

摘要

急性肺损伤（ALI）和急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是呼吸衰竭的主要原因，但目前，这些疾病尚无有效的药物治疗。肺泡巨噬细胞在ALI的急性/初始阶段和慢性/解决阶段中起关键作用，使其成为潜在的治疗靶点。白细胞介素-4（IL-4），一种Th2细胞因子，不仅直接抑制巨噬细胞中促炎因子的分泌，而且还驱使巨噬细胞进入抗炎和组织重塑M2型。然而，IL-4在体内的短半衰期阻碍了其对疾病治疗的影响。在该研究中，建立了分泌IL-4（M-IL-4）的巨噬细胞并用于通过肺巨噬细胞移植（PMT）治疗ALI。结果显示，在肺M-IL-4移植后小鼠肺中检测到高水平的IL-4和M2巨噬细胞标记物。此外，PMT通过减少肺部炎症，减轻组织损伤，减少肺泡巨噬细胞坏死细胞死亡和降低ALI小鼠的死亡率来改善治疗效果。这些结果表明了一种有效的基于巨噬细胞的蛋白质给药策略，并首次证明了PMT在ALI治疗中的可行性和有效性。

介绍

急性肺损伤（ALI）和它的严重的形式，称为急性呼吸窘迫综合征（ARDS）1，通过直接肺损伤和从如败血症，创伤和大手术条件导致间接的全身炎症反应引起的1，2。ALI或ARDS以及未能解决持续的炎症会增加幸存者的死亡率和发病率3。尽管有大量的研究，以了解ALI和ARDS的发病机制，没有有效的药物治疗已报告4，5。ALI的特征是肺泡屏障破坏和肺部炎症6。在ALI动物模型中已经识别出两个炎症反应阶段。急性/初始阶段的特征在于局部血管舒张，毛细血管通透性增加和炎性介质（包括组胺，血清素和前列腺素）的释放。与此相反，慢性/分辨相位由白细胞的浸润和吞噬细胞中鉴定出7，8。

肺泡巨噬细胞在ALI 9的两个阶段都起着关键作用。在急性期，肺泡巨噬细胞极化为经典（M1）激活表型，引发炎症反应，促进中性粒细胞浸润和组织损伤10。经典活化或M1巨噬细胞表达高水平的促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α），白细胞介素-6（IL-6），IL-1β和干扰素-γ（IFN-γ），对病原体消除起着重要作用11。相反，解析期的肺泡巨噬细胞表现出替代（M2）激活表型，分泌抗炎因子如IL-10，IL-1ra和转化生长因子β（TGF-β），并有助于炎症消退和组织重塑11，12。因此，抑制急性期肺泡巨噬细胞的M1激活，促进解析期的M2激活可能是一种有效的治疗策略 13。

细胞因子IL-4以STAT6依赖性方式诱导针对蠕虫感染和巨噬细胞M2极化的宿主防御反应14。据报道，IL-4治疗可降低死亡率并加速ALI 15的消退。在一些研究中，IL-4与抗IL-4抗体复合以延长其生物利用度，使其在小鼠中的半衰期从0.5小时延长至24小时; 然而，一个IL-4气管内复杂的注射过每天要执行15，16。IL-4由活化的Th2淋巴细胞，嗜碱性粒细胞和肥大细胞分泌，但不是由巨噬细胞17分泌。在这项研究中，我们建立了连续分泌IL-4的巨噬细胞，并发现单肺动脉巨噬细胞移植（PMT）对ALI小鼠具有改善的治疗效果。移植了分泌IL-4的巨噬细胞的小鼠的死亡率，肺部炎症和组织损伤减少。PMT已被证明是治疗肺部疾病的有效方法18 ; 然而，其对ALI的影响尚未见报道。我们的研究为ALI治疗和巨噬细胞移植的应用提供了可行的策略。

结果

建立分泌IL-4的巨噬细胞

基于巨噬细胞在肺动态平衡中的作用及其强大的分泌潜能，我们构建了组成型表达和分泌IL-4的巨噬细胞，以作为稳定的IL-4来源。使用鼠单核细胞/巨噬细胞系RAW264.7和骨髓衍生的巨噬细胞（BMDM）建立分泌IL-4的巨噬细胞（M-IL-4）和对照巨噬细胞（M-Con）的培养物。M-IL-4上清液中的IL-4水平在细胞培养物中增加，48小时后达到634.25（±20.45）pg / mL。同时，M-Con上清液中的IL-4水平在三个时间点几乎检测不到（图1a）。M-IL-4移植小鼠，注射IL-4的小鼠和磷酸盐缓冲盐水（PBS）注射的小鼠的肺中的IL-4水平也在不同的时间点（1,3,6,12， 24和48小时）。结果表明IL-4注射给小鼠6小时后IL-4水平显着下降。相反，M-IL-4移植小鼠的水平在12小时前增加，并在48小时内维持相对较高的水平（图1b）。这些结果表明，工程化巨噬细胞移植应该是体内可行和持续的IL-4来源。

M2驱动能力和M-IL-4的抗炎作用

我们试图确定M-IL-4是否可以在体外和体内驱动巨噬细胞的M2极化。与直接IL-4处理一致，用M-IL-4上清液处理的BMDMs 在mRNA和蛋白质水平上表达M2标记物（Arg-1，Ym-1和Fizz-1）的程度更大（图2a，b））。M-IL-4还显着增加小鼠中Arg-1，Ym-1和Fizz-1的表达。M-IL-4治疗组中Arg-1或Fizz-1表达比IL-4或PBS治疗组高约6或7倍（图2c ; Arg-1，P） <0.001; Fizz-1，P <0.05）; M-IL-4治疗组中的Ym-1表达比IL-4治疗组高约两倍（图2c ; Arg-1，P <0.05）。另外，控制BMDM中M2极化的STAT6信号传导途径被M-IL-4上清液激活（图2d）。我们还确定了M-IL-4的抗炎作用。相比与M-精读上清液处理的BMDM，表达TNF-α，[116] ，和IL1B与M-IL-4上清液处理的BMDM LPS处理（图后显著降低2E，P <0.001）。这些结果表明M-IL-4可以抑制其他巨噬细胞中的M1活化，并通过分泌IL-4在体外和体内促进M2极化。

M-IL-4移植可减轻肺损伤

为了清楚地揭示肺损伤的程度和M-IL-4治疗的效果，分别采用显微CT扫描和HE染色。在LPS施用后0.5小时移植M-IL-4或M-Con细胞。捕获每只小鼠的一个三维图像以分析6,12,24和48小时后全肺的内部炎症反应（在每个时间点每组n = 8）。总体而言，用LPS攻击的小鼠的肺随时间发展出更多的炎症（图3a并且显然，M-IL-4基于获得的图像减少肺部炎症的面积。当整个左肺用于组织病理学时，右肺用于评估LPS注射后6,12,24和48小时的湿 - 干（W / D）重量比。与PBS组相比，在所有处理的小鼠中注射LPS后48小时肺炎症加重（图4a）; M-IL-4移植减少了肺部炎症的程度，与微CT扫描的结果一致。此外，M-IL-4移植在6,12,24和48小时导致肺W / D比率在统计学上显着降低（图3b）在LPS注射后，在处理的小鼠中比在PBS对照小鼠中。然而，M-Con移植组的W / D比值也较低，M-Con移植组与LPS注射组之间无显着差异（P > 0.05）。为了量化肺损伤，我们确定了M-IL-4移植对LPS诱导的肺损伤指数的影响。事实上，LPS注射后6,12,24或48小时，M-IL-4移植小鼠肺损伤指数的组织学评分显着低于PBS治疗小鼠（P <0.01）（图。图4b）。M-Con移植组与PBS组肺损伤指数差异无统计学意义（P > 0.05）。

图3：微计算机断层扫描和湿/干比显示分泌IL-4（M-IL-4）的鼠巨噬细胞的移植减轻了小鼠的肺损伤。

图4：组织病理学观察和肺损伤评分表明，分泌IL-4（M-IL-4）的小鼠巨噬细胞的移植减少了小鼠的肺损伤。

M-IL-4移植减弱了LPS诱导的肺部炎症

先前的一项研究表明，肺泡巨噬细胞在LPS诱导的肺部炎症细胞积聚中起主要作用19。我们想知道在ALI小鼠中，MAL-4或M-Con移植后6小时BAL细胞中的单核细胞，粒细胞和肺泡巨噬细胞以及BALF中的促炎细胞因子是否存在差异。分离BAL细胞并通过流式细胞术分析CD11b + Ly6C +（单核细胞），CD11b + Ly6G +（粒细胞）和CD11b 低 CD11C hi（肺泡巨噬细胞）。结果显示LPS滴注后BAL细胞中单核细胞和粒细胞的百分比增加（图5a，b）而M-IL-4细胞显着降低单核细胞和粒细胞的百分比（P <0.01）。M-Con细胞也显着降低粒细胞百分比（P <0.01，图5b）。与PBS对照组相比，LPS滴注后6小时肺泡巨噬细胞的百分比降低（图5c），并且M-IL-4移植组中肺泡巨噬细胞的减少率低于LPS + PBS组（P） <0.05，图5c）。接下来，我们检查了LPS是否可以诱导肺泡巨噬细胞坏死以及M-IL-4是否可以减少AM坏死。7AAD用于检测CD11b 低CD11C hi中的坏死细胞（肺泡巨噬细胞）细胞群。在LPS施用后，肺泡巨噬细胞经历坏死细胞死亡增加，并且M-IL-4细胞和M-Con细胞均显着减少坏死细胞死亡（P <0.01，图5d）。从M-IL-4细胞中减少的坏死细胞死亡比M-Con细胞更显着（P <0.05，图5d）。此外，LPS增加BALF中促炎细胞因子（TNF-α，IL-6，IL-1β）的分泌; 然而，M-IL-4移植没有显着降低BALF中TNF-α，IL-6和IL-1β的水平（图6a）。）。这些数据表明M-IL-4可以减轻LPS诱导的肺部炎症，这可能与炎症细胞浸润减少和肺泡巨噬细胞死亡有关。

图5：分泌IL-4（M-IL-4）的鼠巨噬细胞的移植减少了炎性细胞的浸润和肺泡巨噬细胞的死亡。

为了阐明M-IL-4在体内的抗炎作用，我们将M-IL-4细胞移植到小鼠的肺中并评估肺炎症因子。M-IL-4移植在给药后6小时没有显着改变TNF-α，IL-6和IL-1β分泌的分泌（图6b），但在24和48小时后显着降低其分泌物（图6b）。6c）。同时，M-IL-4移植导致BALF蛋白水平显着降低（图6d）。这些结果表明M-IL-4具有抗炎活性并且可以在体内维持具有M2表型的肺巨噬细胞。

M-IL-4移植显着改善了ALI小鼠的存活率

最后，我们研究了M-IL-4移植是否可以提高ALI小鼠的存活率。与LPS暴露后的对照小鼠相比，M-IL-4移植的小鼠显示其存活率显着改善（图6e ; 62.5％对12.5％，62.5％对7.5％，P <0.05）。这些结果表明M-IL-4移植在ALI中具有治疗效果。

讨论

由于巨噬细胞对ALI的起始和消退至关重要，因此它们是ALI的潜在治疗靶点。在这项研究中，我们建立了表达和分泌IL-4（一种抗炎细胞因子）的工程化巨噬细胞，并发现单个PMT对ALI小鼠具有改善的治疗效果。据我们所知，这是首次报道巨噬细胞移植在ALI治疗中的应用。

虽然直接和重复IL-4治疗已被证明作为用于ALI的有效治疗方法20，21，22，PMT具有显著优点。一方面，PMT中只需要一次气管内注射。然而，在直接IL-4细胞因子治疗中，必须重复注射，这可能导致气管损伤，并可能导致新的肺部感染。由于移植巨噬细胞M2表型的功能，它们可以直接消除炎症，促进组织修复23 ; 因此，ALI的急性期可以提早终止，并且在移植后立即开始解决阶段。这种快速切换阶段将有利于ALI恢复。

当病原体被清除时，肺部炎症不会立即终止，并且由外来抗原或宿主衍生的警报引起的促炎信号可能不会持续。事实上，肺部炎症的消退和恢复组织稳态是一个积极的，紧密协调的过程，它可以逆转炎症反应开始所涉及的所有步骤并诱导反调节机制23。工程化的RAW264.7细胞可分泌IL-4，其可诱导巨噬细胞的M2极化14。一些研究表明，更多的M2巨噬细胞可以诱导肺纤维化24，气道高反应性25和肿瘤细胞迁移26。RAW264.7细胞来自BALB / C，因此我们将它们移植到C57BL / 6J小鼠中。我们希望工程化的RAW264.7细胞最终被异质排斥排除。

我们研究的局限性包括缺乏最小有效细胞剂量，最大耐受剂量或LPS注射后移植的最佳时间点。此外，移植细胞的位置和动态变化仍然是未解决的问题; 因此，需要进一步的研究来确认工程巨噬细胞的精确药代动力学和耐久性。此外，持续的IL-4暴露会有害; 因此，应在未来的调查中制定和实施诱导表达系统和/或关闭策略。最后，应采用M-IL-4加IL-4治疗策略来解释细胞移植缺乏即时性并改善细胞因子治疗的不可持续性。

材料和方法

动物和模特

雌性，健康的C57BL / 6J小鼠（7-8周龄，无特定病原体）购自北京华富康生物科技有限公司（北京，中国）。实验使用中国军事医学科学院动物护理和使用委员会（中国北京）批准的方案进行。

如在以前的研究中进行的15，27，28，29，将小鼠用气管暴露之前腹膜内氯胺酮（220毫克/千克）麻醉。ALI小鼠模型由脂多糖（LPS，L2880; Escherichia coli 055：B5; Sigma-Aldrich，St.Louis，USA）诱导。简而言之，在气管内给小鼠施用LPS（15,20mg / kg小鼠体重，在PBS中稀释，50μL），同时对照小鼠气管内施用50μL无菌PBS。

细胞培养

通过分离和冲洗胫骨和股骨，从6至8周龄的C57BL / 6J小鼠获得原发性BMDM。用补充有10％FBS，30％L929条件培养基（LCM）和1％青霉素/链霉素（pen / strep）的DMEM（Gibco）培养BMDM。在我们的实验室中保守的鼠巨噬细胞RAW264.7细胞在含有10％FBS和1％pen / strep的RPMI 1640培养基中培养。将BMDM和RAW264.7细胞在37℃，5％CO 2湿润气氛中保持。先前将RAW264.7细胞移植到小鼠体内以治疗神经退行性疾病30。

载体构建体和慢病毒转染

将表达小鼠IL-4的慢病毒构建体克隆到pCDH载体（SBI）中。IL-4 cDNA获自国家生物技术信息中心。用包装质粒将慢病毒载体转染到293T细胞中2天，并将病毒颗粒用于感染RAW264.7细胞和BMDM。通过在含有2μg/ mL嘌呤霉素的培养基中培养细胞2天来进行选择。将具有IL-4的RAW264.7细胞标记为M-IL-4，将非IL-4细胞标记为M-Con。

全肺匀浆RNA分离

将全肺组织在PBS（g / v = 1:10）中匀浆，并使用RNAprep纯组织试剂盒（Tiangen，中国）根据制造商的方案使用200μL肺匀浆分离总RNA。使用PrimeScript TM RT Master Mix（Takara，Japan）将总RNA用于合成cDNA。

实时PCR分析

通过Agilent Mx3005P qPCR系统（Agilent，USA）上的逆转录酶PCR（RT-PCR）检测靶基因表达（tnf-α，IL6和Il1b）。将靶基因表达水平标准化为持家基因β-肌动蛋白，并使用2- ΔΔCT方法计算倍数变化。

用于实时RT-PCR的引物是：tnf-α，正向5'-GACCCTCACACTCAGATCATC-3'和反向5'-GAACCTGG GAGTAGATAAGG-3'; Il6，正向5'-TGAACAACGATGATGCAC TTGC-3'和反向5'-GTACTCCAGAAGACCAGAGGAAAT-3'; Il1b，正向5'-CTCCATGAGCTTTGTACAAGG-3'和反向5'-TGCTGATGTACCAGTTGGGG-3'; 和β-肌动蛋白，正向5'-TTGTTAC CAACTGGGACG-3'和反向5'-CCAGAGGCATACAGG GAC-3'。

ELISA

使用市售的小鼠TNF-α，IL-6和IL-1βELISA试剂盒（R＆D Systems Inc.，Minneapolis，MN，USA）测量来自全肺匀浆上清液的细胞因子水平。实验重复三次，结果以平均值表示。

支气管肺泡灌洗液分析

如先前所述小鼠进行支气管肺泡灌洗（BAL），以收集BAL液（BALF）31。暴露气管并用导管插管。用无菌PBS将全肺灌洗三次，体积为0.8mL /清洗; 平均而言，灌洗后回收的液体大于80％。将BALF在4℃下以3000rpm离心20分钟，收集上清液并在-80℃冷冻以使用BCA蛋白质测定试剂盒（Tiangen，中国）和细胞因子水平（TNF-）测定总蛋白质。根据制造商的方案，α，IL-6和IL-1β）。BAL细胞用于分析细胞类型。

流式细胞术

通过70-μm细胞过滤器（Biologix Group Limited）分离BAL细胞。用PBS洗涤并用PBS中的0.5％牛血清白蛋白重悬后，用流式细胞术抗体染色细胞，以根据制造商的说明检测CD11b（eBioscience），CD11C（eBioscience），Ly6C（eBioscience）和Ly6G（eBioscience）。另外，7AAD用于检测坏死细胞。使用FACS Aria II流式细胞仪（BD Biosciences）获取数据，并使用FlowJo软件（版本7.6）分析结果。

蛋白质印迹分析

使用RIPA缓冲液提取蛋白质，并使用BCA蛋白质测定试剂盒（Tiangen，China）定量总蛋白质。在12％SDS-PAGE凝胶上分离等量的蛋白质，并在与第一抗体，抗Arg-1（Cell Signaling Technology，USA），抗YM-孵育之前转移到PVDF膜（PALL，USA）上。 1（Cell Signaling Technology，USA）和抗GAPDH（Santa Cruz Biotechnology，USA）在4℃下12小时（在封闭溶液中以1：1000稀释的抗体）。在1×TBST缓冲液中洗涤三次后，将印迹与辣根过氧化物酶缀合的山羊抗兔抗体或辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠抗体（1：2000; Jackson Immuno Research，USA）在25℃温育1小时。 ℃，重新洗涤，然后使用ECL化学发光试剂盒（Thermo Fisher Scientific，USA）显色。

组织病理学观察和肺损伤评分

通过显微CT扫描（Quantum FX Demo，PerkinElmer-Caliper LS，MA，USA）和苏木精 - 伊红（HE）染色进行小鼠肺炎症的形态学分析。将肺的整个左下叶固定在4％甲醛中性缓冲溶液中48小时，在梯度乙醇系列中脱水，包埋在石蜡中，并切成5-μm切片。然后将这些切片用HE染色用于组织病理学分析。

两位对治疗方案不知情的病理学家被邀请使用以下组织学特征来评估肺损伤的严重程度：水肿，充血和充血，中性粒细胞边缘化和组织浸润，肺泡内出血和碎片，以及细胞增生。评分系统用于评定肺损伤的程度。

每个特征被评为缺席，轻度，中度或严重，并被分配从0到3的得分。计算每只小鼠的总得分27。

肺W / D重量比

清除右肺的上叶并称重以获得湿重。然后将切片置于80℃的烘箱中24小时以测量干重。计算W / D重量比以评估组织水肿1。

统计分析

所有值均以平均值±SE报告。如所示进行参数或非参数测试。通过对数秩Mantel-Cox检验评估Kaplan-Meier存活曲线。当在一个时间点比较两组时，将学生t检验用于所有其他分析，或者当在一个时间点比较多个组时，使用单向ANOVA和Tukey的事后检验。P <0.05用作显着性的临界点; * P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001。