早期诱导C /EBPβ表达作为类固醇反应性结肠炎的潜在标志物
氢化可的松免疫调节在结肠炎管理中的确切机制尚不清楚。虽然并非没有限制，但其抑制病理学和快速改善患者临床结果的能力是关键。我们有兴趣确定治疗反应性的早期标志物，以确定患者对治疗无效。使用寄生虫感染Trichuris muris在AKR / J小鼠中诱导慢性Th1驱动的结肠炎。感染后35天，隔天用小剂量的氢化可的松（2mg / kg /）ip处理小鼠。在感染后第45天在全身和组织水平评估对治疗的反应。进行组织病理学，基因和蛋白质分析以确定细胞因子和转录谱。类固醇处理的小鼠中的结肠转录谱显示出一小部分T细胞相关基因，特别是C /EBPβ，CD4，IL7R和STAT5a的显着上调。尽管下游细胞因子IFNγ，TNFαIL-17和IL-10中的转录或蛋白质产生均未发生变化，但氢化可的松处理显着降低了结肠病理学并将结肠长度恢复至初始水平。正如所料，类固醇治疗慢性肠道炎症产生显着的免疫抑制作用，其特征在于组织学改善。低剂量氢化可的松诱导与T细胞维持和调节相关的一部分基因的显着上调，包括C /EBPβ。这些数据表明，C /EBPβ的增强表达可能是证明对氢化可的松治疗的免疫调节反应的早期标志物的子集之一，可能通过稳定Treg功能。这些观察结果有助于我们了解类固醇治疗后的免疫状况，提供治疗应答者和氢化可的松治疗难以治疗的潜在标志物。这些数据表明，C /EBPβ的增强表达可能是证明对氢化可的松治疗的免疫调节反应的早期标志物的子集之一，可能通过稳定Treg功能。这些观察结果有助于我们了解类固醇治疗后的免疫状况，提供治疗应答者和氢化可的松治疗难以治疗的潜在标志物。这些数据表明，C /EBPβ的增强表达可能是证明对氢化可的松治疗的免疫调节反应的早期标志物的子集之一，可能通过稳定Treg功能。这些观察结果有助于我们了解类固醇治疗后的免疫状况，提供治疗应答者和氢化可的松治疗难以治疗的潜在标志物。
皮质类固醇的给药是许多炎性疾病的既定一线治疗，尽管它们的精确作用机制尚不清楚，并且功效可变且不可预测。透壁肠道炎症由先天性和适应性免疫细胞浸润和促炎细胞因子1的积累引起。效应CD4的相互作用+ T-辅助细胞（例如，T ħ 1和T ħ 17），嗜中性粒细胞和巨噬细胞可以破坏肠稳态和上皮完整性，以沉淀和延续炎症2，3，4，5，6，7。
在个性化医疗的发展时代，理想的情况是充分了解每种治疗方法的作用机制，以使治疗与个体疾病的生物模式相匹配。IBD患者的大约20％是难治的皮质类固醇治疗，虽然遗传因素已被确定与治疗反应8，9仍有没有鉴定的生物标记以监测治疗或预测的响应。已知巨噬细胞，中性粒细胞和淋巴细胞都在类固醇抗性中起作用，粒细胞/单核细胞吸附单采血液成分可用于这些患者的非药物干预10。
通过更好地了解类固醇治疗后发炎肠道中的局部蛋白质和基因反应，关键因素可能被确定为无反应的潜在标志物。此外，更好地了解增强粘膜愈合的调节机制可能会产生新的治疗方法，并有助于克服治疗失败。
在这项研究中，我们研究了结肠炎期间结肠免疫表型如何响应皮质类固醇治疗。我们选择研究皮质类固醇治疗在慢性结肠炎小鼠模型中的作用11。鉴于NICE指南推荐使用类固醇治疗以在最初的病例中诱导患者缓解或在过去12个月内发生一次恶化，我们选择这种轻度至中度模型而不是更常用的DSS诱发的结肠炎，因为感染引起的T调节细胞和上皮细胞的数量保持完整。研究的关键参数是免疫基因表达，细胞因子蛋白表达，病理学和总体临床结果。
从感染后第35天用T给予氢化可的松。muris，当慢性炎症确立。在所有感染的AKR / J中都观察到持续的蠕虫负担（193 +/- 28，图 1A）; 免疫抑制不会引起蠕虫排出。在治疗之前，观察到感染组之间没有显着的体重差异，尽管预期的感染组显示出与幼稚小鼠相比显着的体重减轻（ANOVA，p <0.0001，图 1B）。类固醇治疗的小鼠在治疗期间显示出一些体重减轻恢复，尽管这并不显着（图 1B）。
类固醇干预改善了感染T的AKR / J小鼠的结肠表型和体重。muris。AKR / J感染 300T。murisova，并在感染后45天进行研究。从隔天第35天开始施用类固醇。（A）感染组的蠕虫负荷没有显着差异（ANOVA p = 0.51）。（B）在第35天开始治疗之前，两种感染组与初始AKR相比显示出显着的体重减轻（ANOVA，p <0.0001）。类固醇治疗引发显着的体重减轻恢复。（C）通过类固醇治疗改善感染后观察到的结肠缩短。（D.）实验组中的肉眼可见的结肠外观表明未治疗和T中的生物学差异（缩短，更多水肿，缺乏摄入）。muris感染AKR。数据表示为平均值±SD。每组n = 5。数据代表两个独立的实验。
组之间的肉眼可见的结肠外观表现出明显的差异。如所预期的，在未处理的感染小鼠中观察到改变的粪便颗粒，总体炎症变化（水肿，结肠组织结构）和结肠缩短（图 1C，D）。第45天的结肠缩短通过类固醇治疗部分解决（p = 0.006）。在组织学上，在所有感染组中观察到轻度至中度炎症变化，包括透壁组织水肿和白细胞浸润（淋巴细胞，巨噬细胞，中性粒细胞），突出的粘膜和粘膜下反应性淋巴样聚集体，以及结肠隐窝增生和肥大（图 2））。经类固醇处理的AKR / J小鼠显示组织学改善（p = 0.0047），这是由于水肿较少，细胞浸润减少和杯状细胞数量维持（数据未显示）。
氢化可的松干预显着改善T中的组织学结肠炎评分。缪里斯在第45天PI（H＆E，比例尺=200μm）左右感染的小鼠。（A）幼稚小鼠的正常结肠组织。（B，C）在T后观察到腔和粘膜蠕虫和透壁结肠炎症变化。AKR / J小鼠的muris感染。在感染小鼠的类固醇治疗后，发现肌层水肿减少（双头箭）伴有粘膜下水肿和隐窝增生的减少（C）。（D.）量化粘膜结构，溃疡，隐窝脓肿，杯状细胞耗竭，细胞浸润和组织水肿的组织学评估。类固醇治疗后，结肠炎严重程度显着降低。数据表示为平均值+/- SD，代表两个独立实验，每组n = 5。
用T 体外再刺激MLN细胞。缪里斯特异性排泄/分泌（ES）抗原天45后感染。每1×10 6个细胞的细胞因子产生如图3所示 。在测定的细胞因子中，在类固醇治疗组中仅IL2显着上调（p <0.01）。有趣的是，在类固醇治疗的小鼠中MLN细胞数量显着减少，因此考虑了净细胞因子的产生。在测量的细胞因子中，IFN1和IL13的产生与细胞数成比例地降低，尽管这不显着（数据未显示）。
氢化可的松治疗显着上调抗原特异性IL2产生。响应于T的肠系膜淋巴结（MLN）细胞因子分析。muris感染和类固醇治疗。用T 体外刺激MLN细胞。muris特异性E / S抗原24小时。通过细胞因子珠阵列分析上清液。类固醇治疗后IL-2（p = 0.003）显着升高。对于个体小鼠表达数据，并且作为平均值±SD（n = 5个幼稚和感染组，n = 4感染+类固醇组）。
在第35天和第45天感染AKR / J之间，阵列基因之间没有统计学差异，除了两个基因：Stat3（第45天变化+1.55倍; p = 0.006）和Stat5a（第45天变化+1.52倍; p = 0.043）（图 S1）。如前所示11，12，13，结肠基因表达天真的小鼠和那些患有慢性之间显著不同Ť。muris诱导的炎症，证明显性T H 1免疫应答（例如IFNα增加20倍，TNFα与初始相比增加12倍，图 4）。
改变T之间关键基因的调控。缪里斯感染的和类固醇治疗组。在第45天甾体治疗与未治疗T之间，适应性免疫应答基因的结肠表达的倍数变化。muris-感染小鼠，并牛逼。缪里斯氢化可的松治疗后感染小鼠。根据感染的未治疗小鼠相对于幼稚的表达的倍数变化对倍数变化进行排序。
T之间关键基因的调节改变。肿瘤感染和类固醇治疗组也显示在图 4中。类固醇治疗后的倍数变化相对于感染的群组表示。类固醇治疗表明T H 1 适度减少（与感染小鼠相比，IFNg基因表达减少约1.79倍），尽管这并不显着。然而，所有在类固醇治疗后具有显着倍数变化的基因（10％的测定，均被上调）与T细胞稳态和维持相关（上图，图 4））。例如，IL7r和下游信号传导分子STAT5a均显着上调（分别为+2.58（p = 0.01）和+2.03（p = 0.01））。类似地，ICOS也被上调（+1.82倍变化，p = 0.03），已知促进CD4 hi iTreg 的诱导和扩增（CD4 + 4.12倍变化，p = 0.05）14。IL-27（+ 2.51倍变化，p = 0.03）已被证明通过增加IL-10的产生来减少小鼠的结肠炎15和由视黄酸诱导的基因Cebpb（C /EPBβ）可以增强和稳定Foxp3炎症期间在Treg细胞表达16，17（+1.62倍变化，p = 0.02）。有趣的是，尽管类固醇治疗已被证明可抑制Th17细胞的发育，但我们未发现IL-17家族成员有任何显着变化（0.14 <p <0.45）。类似地，IL6也未改变（p = 0.33）。
鉴于在类固醇治疗后与T细胞调节相关的因子的表达升高，通过免疫组织化学定量Foxp3 +细胞。与幼稚小鼠相比，所有感染组中的结肠foxp3 +细胞显着增加（p = 0.003）（图 5）。然而，在用氢化可的松处理10天后，感染后第45天在治疗或未治疗的感染组之间未发现统计学差异。
氢化可的松干预不会增加T结肠组织内的Foxp3 +细胞。muris感染的老鼠。对结肠冷冻切片进行细胞内Foxp3的免疫组织化学染色（每组n = 5）。（A）显示代表性显微照片（x200放大倍数）。阳性细胞染成棕色（箭头）。（B）在所有感染组中检测到Foxp3 +细胞的增加（数据表示为平均值±SEM）。在类固醇治疗后未发现Foxp3 +细胞数量的显着差异（p = 0.61）。数据代表一个实验。
我们以前曾表明，牛逼。muris诱导的T H 1驱动的结肠炎是研究慢性结肠炎症的高度可预测的模型11。在这里，我们选择研究氢化可的松治疗，这是一种用于研究下游免疫效应的慢性炎症疾病的关键治疗药物。这种模式在治疗的情况下的优点是治疗不影响感染的结果本身，因为所有实验组怀着相同的感染或蠕虫负担。
尽管存在相同且持久的抗原损伤，但在类固醇治疗后10天观察到体重稳定和肠长度的部分恢复。组织学轻度至中度透壁结肠炎在类固醇治疗中显示出显着改善，表明如预期的那样开始免疫抑制。尽管在重新刺激整个淋巴结后IFNα和IL13细胞细胞因子分泌保持不变，但在类固醇治疗组中IL2显着增加，表明有利于T细胞存活和分化的环境，并且已显示保护Th1和Treg细胞。从糖皮质激素诱导的细胞凋亡18。重要的是，在IL-17家族成员的转录中没有观察到显着变化，特别证明IL-17和IL-17F的支持数据对糖皮质激素抑制具有抗性19。
基因转录的局部变化高度指示T细胞功能增强。影响T细胞应答的明显候选者如CD4，CD28，IL7r，STAT5a和CD401g是一些显着上调的少数基因（9/89测定）。Cebpb或CCAAT /增强子结合蛋白β（C /EBPβ）的上调特别有趣。C /EBPβ已经知道，以响应被上调皮质醇一些时间20和在各种基因的反式激活与STAT5合作21，22，23。C /EBPβ是已知参与在多种细胞类型的分化和增殖，包括树突细胞和巨噬细胞24，25，26，27。失调经常与增加的炎症反应相关的28，29，和许多研究已证实C /EBPβ是在维持T细胞和haemopoetic隔室的动态平衡是至关重要的。最近，柯林斯等人。图16显示C /EBPβ在Foxp3 + T细胞功能中起重要作用; 来自C /EBPβ缺陷小鼠的Treg 在体外具有降低的IL-10分泌和降低的抑制T细胞增殖的功能能力。此外，来自C /EBPβ缺陷型小鼠的T细胞在体内诱导更严重的结肠炎。
值得注意的是，鉴于与诱导Treg细胞相关的几个基因的显着上调，可能预期下游细胞因子和相关生长因子的显着变化。先前已经表明糖皮质激素治疗小鼠可以上调调节基因，如TGFα和foxp3 30虽然使用了更高的当量剂量（20 mg / kg对比我们研究中使用的5 mg / kg）。然而，在小儿等效剂量的氢化可的松10天后，未观察到IFN1，TNFα，TGFβ，IL10和IL22基因的显着变化。尽管分别对调节/炎症基因的上调或下调趋势，尽管观察到病理学显着减少，但这些基因没有达到显着性。值得注意的是，Colonic Foxp3 +细胞数不受类固醇干预的影响，最近的研究结果证实了这一观察结果，而foxp3 + Tregs的总数不会影响Tregs在系统中的总体致耐受作用。这可能是各种类型的重新分布，类似于在感染期间动员foxp3 +细胞而不影响整体功能30。
总之，这些数据表明，在低剂量氢化可的松治疗的早期阶段，通过上调几种增强调节功能的T细胞相关基因来实现免疫抑制。有趣的是，这些数据还证明了显著转录变化是已知由较长期的或较高剂量氢化可的松治疗，如IFNι，IL-4，IL-13，IL-10的影响的基因的上游31和TNFα。这些观察结果证实了以前的研究已经表明，糖皮质激素处理诱导的免疫抑制和可以恢复的Treg功能32，33，34尽管迄今尚未描述相关的转录谱。我们建议在氢化可的松治疗期间增强C / EBP-β的表达，表明T细胞反应性，并且可以区分早期无反应者和将从长期糖皮质激素治疗中受益的那些35。此外，这种早期的调节标记可能有助于确定个体患者的最低治疗剂量。
曼彻斯特大学的所有实验和程序均由曼彻斯特大学伦理审查委员会（UREC）和内政部动物程序监察局批准。所有实验均根据1986年“内政部科学程序法”（2013年1月修订）进行。
将6至8周龄雄性AKR / J小鼠（Harlan Olac，Ltd.，UK）饲养在无特定病原体的条件下，自由获取食物和水。将小鼠置于曼彻斯特大学的24℃温度控制环境中，12小时光照/黑暗循环并自由获取食物和水。
收获鞭虫寄生虫并如前所述36提取和维持其卵子。感染AKR / J小鼠接受300胚Ť。缪里斯鸡蛋在蒸馏水中通过灌胃。在感染后第35天建立结肠炎。
所有实验在感染后第35或45天结束。从感染后第35天开始隔天，腹膜内（100μl腹膜内）给予氢化可的松（Solu-cortef，Pharmacia Ltd.，UK）。给予类固醇的剂量相当于对活动性儿科克罗恩病（2mg / kg，QDS）的推荐。
在整个实验过程中监测粪便外观，体重和健康状况。对于所有小鼠，在感染后第35天或第45天进行表型分析，如文中详述。在尸体解剖时采集血清样品，肠系膜淋巴结（MLN）和肠。取出结肠并从回盲肠瓣到直肠边缘测量。分离紧邻回肠 - 盲肠瓣膜0.5cm的完整结肠组织用于RNA提取（AllProtect，Qiagen，UK）。对于组织学，取近端升结肠的0.5cm全结肠节段并固定在中性缓冲福尔马林中。将另外0.5cm的上行结肠组织快速冷冻用于免疫组织化学。评估剩余的大肠组织的蠕虫负荷。37。
将样品固定在中性缓冲的福尔马林中，在石蜡中处理，并用H＆E染色5μm切片。将载玻片随机化并使其失明。临床胃肠组织病理学家盲目地解释粘膜结构，细胞浸润，肌肉增厚，隐窝脓肿的存在或不存在，杯状细胞耗竭和溃疡的评估（补充表 S1）。使用SPOT™成像解决方案相机和Advanced SPOT软件（Diagnostic Instruments Inc.，USA）捕获图像后，使用Image J软件（http://rsbweb.nih.gov/ij）测量结肠隐窝长度和肌肉厚度（μm）。 ）。
在尸检时，立即将MLN转移至洗涤缓冲液（补充有2％FCS和5ml青霉素/链霉素100×（100U / ml青霉素，100μg/ ml链霉素）的RPMI 1640培养基），并在当天无菌条件下分离细胞。收获。将细胞洗涤两次，然后在完全培养基（补充有：10％FCS，5ml（2mM）L-谷氨酰胺和5ml青霉素/链霉素100×的RPMI 1640培养基）中再悬浮。1×107个细胞/ ml刺激，一式三份，用任一50微克/毫升T.缪里斯寄生虫排泄分泌（ES）抗原36，37或2.5μg/ ml Con A（Sigma-Aldrich）并培养（37℃，5％CO 2,24小时）。收集上清液并储存在-20℃直至分析。将血清储存在-20℃直至分析。使用FlowCytomix TM Mouse Kits Th1 / Th2 / Th17 / Th22 13 plex Kit（eBiosciences，UK）和另外的IL-12（p70）FlowCytomix TM Mouse Simplex Kit（eBiosciences，UK）测量MLN和血清细胞因子蛋白。FlowCytomix™Pro 2.4软件（eBiosciences，UK）用于数据分析。
在4℃下在1.0ml AllProtect溶液（Qiagen，UK）中储存24小时后，小心地清除结肠组织中的任何腔内容物，并将组织储存在-20℃直至处理。使用Lysing Matrix D管（MP Biomedicals）和FastPrep -24匀浆器（MP Biomedicals）（4.0M / sec）匀浆单个结肠组织样品（20mg）。根据制造商的说明书（Qiagen，UK），使用AllPrep®DNA/ RNA /蛋白质柱试剂盒从上清液中提取RNA。在最初的基因组DNA消除步骤（SABiosciences）之后，根据制造商的说明书使用1μg总RNA和RT 2 First Strand Kit（SABiosciences，USA）合成cDNA 。将cDNA储存在-20℃。
对于基因表达分析，根据制造商的说明，始终使用用于自身免疫和炎症的小鼠T H 17（PAMM-073A）RT 2 Profiler TM PCR阵列（SABiosciences，USA）。有关89种分析基因的完整表格可在http://www.SABiosciences.com上获得。五步循环程序用于推荐的实时和熔解曲线计算（SABiosciences），并使用Bio-Rad MyIQ™PCR检测系统（Bio-Rad IQ5光学系统软件，版本2; Bio-Rad Laboratories）进行定量分析。公司©）。ΔΔC 吨 PCR阵列数据分析，即并入基因组DNA污染和反转录的杂质，使用的SABiosciences门户网站（http://www.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php）分析研究样本和组之间的相对基因表达数据。确定治疗对慢性T的影响。相对于感染后第45天未处理的对照，分析了睾丸诱导的结肠炎，类固醇治疗组的结肠基因表达的倍数变化（图 4）。
对于冷冻切片的加工，将5μm的升结肠切片固定在4％多聚甲醛（4℃，10分钟）中，并淬灭内源性过氧化物酶活性（0.064mg / ml叠氮化钠，1.54U / ml葡萄糖氧化酶和1.8 mg / ml D-葡萄糖，Sigma-Aldrich）在37℃下20分钟。
对于Foxp3检测，所有洗涤均在0.1％皂苷/ PBS中进行。用10％山羊血清（Sigma-Aldrich; 1小时，RT）封闭非特异性结合位点。然后封闭内源抗生物素蛋白和生物素结合位点（Vector Laboratories，Peterborough，UK）。将样品与纯化的大鼠抗小鼠FoxP3（FJK-16s，eBiosciences，San Diego CA .;2μg/ ml，1小时，RT）孵育，然后与生物素化的山羊抗大鼠IgG二抗（Santa Cruz Biotechnology，Inc）孵育。 。，CA .;2μg/ ml，1小时，RT。）。使用抗生物素蛋白 - 生物素辣根过氧化物大分子酶复合物试剂盒（Vectastain®ABB试剂盒，Vector Laboratories; 30分钟，RT。），然后加入3,3'-二氨基联苯胺（DAB）过氧化物酶底物（Vector Laboratories）。 。切片在Harris的苏木精中复染。
在x400放大倍数下评估阳性染色细胞的数量。随机化和盲化后，对每个切片重复计数一式三份，数据表示为每个样品的平均值。
使用GraphPad PRISM版本5.00（GraphPad Software，Inc。）进行统计分析，具有ANOVA和未配对的学生t-测试后事后分析。数据表示为平均值±平均值的标准误差
|
|
