TGFβ阻断自发性乳腺肿瘤中的IFNα/β释放和肿瘤排斥
I型干扰素（IFN）被重新发现为有效的抗肿瘤剂。通过DMXAA（5,6-二甲基x吨酮-4-乙酸）激活INterferon基因的STimulator（STING）可以诱导IFNα/β的强烈产生和移植的原发性肿瘤的排斥。在本研究中，我们讨论了用DMXAA靶向STING是否也导致自发性MMTV-PyMT乳腺肿瘤的消退。我们显示这些肿瘤对DMXAA诱导的消退是难以控制的。这是由于IRF3的磷酸化和随后的IFNα/β产生的阻断。在机制上，我们鉴定了在自发性肿瘤中丰富的TGFβ，作为限制DMXAA引起的IFN诱导的肿瘤消退的关键分子。最后，阻断TGFβ通过激活的MHCII +恢复IFNα的产生肿瘤相关巨噬细胞，并使STING激活诱导肿瘤消退。基于这些发现，我们提出通过包括阻断TGFβ的组合可以极大地改善I型IFN依赖性癌症疗法。
I型干扰素（IFN）α和β是具有抗肿瘤免疫力的巨大潜力的细胞因子。已经显示，内源性I型IFN构成了由先天细胞防御的第一道防线，促进不仅针对病毒而且针对癌细胞的适应性免疫应答1，2，3。事实上，I型IFN对免疫应答的调节可以以几种不同的方式发生。它通常涉及细胞因子和趋化因子（CXCL10，CCL3，CCL2和IL-15）的调节，它们能够促进各种免疫细胞亚群的募集，存活和活化，包括单核细胞，树突状细胞（DC），T细胞和NK细胞。此外，IFNα诱导MHC I的上调和DC分化的加速度，从而提高了T细胞的引发4，5。此外，IFNα/潜在β来抑制蛋白质翻译可以触发相互矛盾的信号导致的高度增殖的癌症或血管内皮细胞死亡6，7。
长期以来，I型IFN被广泛认为是一种广泛的免疫调节剂，可用于治疗癌症患者8年。然而，由于其在全身给药后的毒性，它不再常用。更好地理解I型IFN调节免疫应答的机制已经重新引起了对其使用的兴趣。最近，ER相关分子STING一直是旨在重新刺激肿瘤生态系统中I型IFN产生的几项研究的焦点。STING普遍表达并被源自病原体的细胞溶质核苷酸或细胞损伤后激活。特别是，已经表明STING可以感知内源性细胞溶质DNA并有助于抗肿瘤免疫9。特别地，合成的环状二核苷酸（CDN）注射的肿瘤内已显示通过内皮细胞中的肿瘤，接着是抗肿瘤特异性CD8的生成迅速引发IFNβ的表达+ T细胞和移植瘤的消退10，11。DMXAA（5,6-二甲基x吨酮-4-乙酸）具有激活STING和特异性破坏肿瘤脉管系统12的双重特性。一个腹膜内（ip）注射足以诱导初级移植瘤的消退，作为单一药剂或与疫苗接种13，14，15。与此一致，我们最近报道了DMXAA诱导的PyMT移植肿瘤的消退依赖于IFNα/β的产生以及T细胞与肿瘤部位的骨髓细胞的配合16。
总之，这些报道表明通过靶向STING途径在实体瘤中诱导I型IFN是一种有前景的治疗方法。然而，未知的是，是否足以诱导自发产生的实体瘤的排斥，因为在自发性肿瘤的发展过程中发生了多种抗性机制。特别是，肿瘤细胞的移植诱导局部与细胞死亡相关的急性炎症和免疫细胞浸润的引发17。相反，自发性肿瘤从逐渐暴露于慢性炎症的无菌微环境中出现，所述慢性炎症可能以不同的方式调节免疫细胞浸润。当在动物中发生自发性肿瘤时，在胸腺和外周形成的T细胞库产生低亲和力和无反应性肿瘤浸润性T细胞18。此外，已知慢性炎症如TGFβ的可溶性因子可抑制各种免疫效应细胞，调节骨髓细胞的分布，并促进调节性T细胞的出现。因此，尽管移植的肿瘤具有免疫抑制环境的一些元素，但是它们在数天或数周内的快速发展并未整合在发育数月期间在自发性肿瘤中发生的各种变化。在MMTV-PyMT肿瘤模型中，Ming Li等。描述了8周龄至20周龄转基因小鼠乳腺肿瘤中抑制性肿瘤相关巨噬细胞（TAM）亚群的逐渐积累19。与代表肿瘤微环境的主要成分的“M2样巨噬细胞”同化的这种TAM的密度与人类中各种癌症类型的不良预后相关20。相比之下，对人类肿瘤中髓样细胞区室的详细分析显示，具有M1样表型的TAM密度与某些癌症的良好预后相关21。与此一致，当类型的存在I型IFN适当刺激，例如，巨噬细胞可连同抗肿瘤CD8介导的抗肿瘤活性+ T细胞，至少在移植肿瘤模型16，22，23，24，25，26。因此，肿瘤微环境的性质和活化状态可能极大地影响治疗性治疗的结果。
在这项研究中，我们讨论了用DMXAA靶向STING是否可以诱导自发性MMTV-PyMT乳腺肿瘤的消退。我们将TGFβ鉴定为通过TAM损害I型IFN产生的关键因素，从而阻止肿瘤消退的诱导。
为了评估MMTV-PyMT小鼠（Spont-PyMT）中发生的肿瘤是否可以在DMXAA治疗后消退，如之前报道的移植PyMT小鼠（Trans-PyMT）16，当后肿瘤腹膜内（ip）注射DMXAA时，Spont-PyMT小鼠直径约6毫米（约2个月大的小鼠）。对于每只经处理的小鼠，随时间测量8-10个肿瘤的大小。图1a提供了在用DMXAA处理的一只Spont-PyMT小鼠中获得的随访的实例。在中央面板中，原始数据（每条曲线一个肿瘤）说明了一只小鼠的肿瘤大小的演变。在图1a的右侧面板中显示相同的数据，但每个肿瘤的大小相对于其在第0天的大小表示。该表示允许人们容易区分对DMXAA治疗有反应或不反应的肿瘤。图1b说明了在DMXAA或DMSO处理的小鼠组中获得的全局随访。总体而言，与对照小鼠相比，DMXAA仅减缓肿瘤生长，并且在DMXAA注射后5天，极少数小鼠（14％）在Spont-PyMT小鼠中显示出消退的肿瘤，而95％在移植的PyMT中显示（图1c）。
DMXAA不诱导Spont-PyMT肿瘤的系统性消退。一个 SPONT-PyMT小鼠在第0天治疗与DMXAA或DMSO之一腹膜内注射作为对照。对于每只经处理的小鼠，在每个时间点计算肿瘤大小相对于基线的变化（d0），并相对于d0处的大小表示。（a）中的图提供了在用DMXAA ip处理的一只小鼠中获得的测量值的实例，每个肿瘤具有一条曲线。该小鼠的所有肿瘤的平均曲线以蓝色显示。鼠标剪贴画由NB创建b每个黑色曲线对应于一个鼠标，并作为平均相对肿瘤变化对于该小鼠被计算（如图一）。组群中所有动物的平均曲线以红色（DMXAA）或橙色（CTRL）显示。指示肿瘤负荷的总体进展（灰色区域）或回归（粉红色区域）。Spont-PyMT小鼠： 来自9个独立实验的n = 30（DMXAA），n = 25（CTRL）。c与Trans-PyMT小鼠相比，这些Spont-PyMT小鼠代表平均具有回归，稳定或进展的肿瘤的小鼠的比例。Spont-PyMT小鼠：n = 30; Trans-PyMT小鼠：n = 26，分别从9到10个独立实验。d在Trans-PyMT小鼠中肿瘤内注射DMXAA或ML RR-S2 CDA诱导的肿瘤消退，但在Spont-PyMT小鼠中没有。Trans-和Spont-PyMT小鼠注射DMXAA（1×500μg，第0天）或ML RR-S2（3×50μg，第0,3和6天）或使用HBSS作为对照。蓝色箭头：注射天数。对于每个治疗组，显示了与基线（第0天）相比肿瘤体积的平均倍数变化。ML RR-S2组（Spont-PyMT小鼠n = 4; Trans-PyMT小鼠n = 10），DMXAA（Spont-PyMT小鼠n = 3; Trans-PyMT小鼠n = 10）和HBSS / DMSO（Spont-PyMT）小鼠n = 4; Trans-PyMT小鼠n = 6）。数据来自两个肿瘤模型的三个独立实验。源数据作为源数据文件提供
这种现象的一种解释可能是由于Spont-PyMT肿瘤和Trans-PyMT肿瘤的脉管系统的推定差异，DMXAA不能像Trans-PyMT那样接触Spont-PyMT肿瘤。为了避免这种潜在的问题，我们评估了当药物直接注射到肿瘤中时，两种不同的STING配体DMXAA或ML RR-S2 CDA是否可以诱导I型IFN途径的激活。注射后获得的结果证实了在DMXAA ip后获得的结果确实，它们的STING激动剂均未能在Spont-PyMT小鼠中诱导肿瘤消退，与在移植模型中观察到的形成鲜明对比（图1d）。
为了理解为什么DMXAA在这些Spont-PyMT小鼠中效率很低，我们检测了与Trans-PyMT相比，由Spont-PyMT肿瘤中的DMXAA引发的免疫应答。注射DMXAA后，浸润Spont-PyMT肿瘤的CD45 +免疫细胞的比例适度增加（活细胞的35％至50％，图2a ;补充图1）。这与DMXAA后Trans-PyMT肿瘤中测量的大量浸润形成鲜明对比（活细胞的22％至86％）。通过更详细地分析免疫细胞亚群，我们在两种模型中观察到DMXAA注射后24小时（35-40％的浸润细胞）的瞬时中性粒细胞（CD11b + Ly6G +）浸润。然而，TAM的人口（CD11b +Ly6C neg Ly6G neg F4 / 80 +）在注射DMXAA后持续存在于自发性肿瘤中，而在Trans-PyMT肿瘤中其迅速下降（图2b）。此外，与Trans-PyMT相比，Spont-PyMT肿瘤中单核细胞（CD11b + Ly6C 高 Ly6G neg F4 / 80 lo）和CD8 T细胞浸润分别保持两倍和五倍。
DMXAA在Spont-PyMT肿瘤中诱导弱免疫浸润。a在肿瘤解离后，通过流式细胞术测定处理前的Spont-PyMT或Trans-PyMT肿瘤中的CD45 +细胞（灰色圆圈）和腹膜内注射DMXAA后第1天至第8天的比例（黑色圆圈）。b显示了那些CD45 +细胞中嗜中性粒细胞，TAM，单核细胞和CD8 + T细胞的比例。对于第0天，Spont-PyMT n = 12和Trans-PyMT n = 30只小鼠，第1天Spont-PyMT n = 6且Trans-PyMT n = 12，第4天Spont-PyMT n = 9和Trans-PyMT n = 24和第8天Spont-PyMT n = 7和Trans-PyMT n = 10.数据来自每组小鼠的4-7次独立实验。结果表示为平均值±SEM。Tukey的多重比较测试。* p <0.05; ** p <0.01; *** p <0.001。源数据作为源数据文件提供
总之，这些数据表明，在Spont-PyMT肿瘤中注射DMXAA诱导了少量免疫细胞的募集，并且对肿瘤消退的影响比在移植的肿瘤模型中小得多。
由于DMXAA在Spont-PyMT小鼠中诱导弱免疫应答，我们测量了在处理小鼠的肿瘤中表达的细胞因子和趋化因子。DMXAA已知激活无处不适配器STING并随后触发通过NFκB，IRF3（pIRF3）的磷酸化，和STAT6，分别生产TNFα，IFNα/β和趋化因子的27，28。因此，我们在Spont-PyMT小鼠中注射DMXAA后不久在mRNA水平测量肿瘤微环境中表达的细胞因子。如图3a所示，Tnfα，Cxcl1，Ccl2和Ccl20的转录在Spont-PyMT肿瘤中上调，如在Trans-PyMT肿瘤中上调（补充图2a），尽管在两种肿瘤类型中倍数增加并不总是相似。引人注目的是，在自发性肿瘤模型中未检测到Ifnα和Ifnβ基因的mRNA水平显着增加（图3a），而这些基因在移植肿瘤中DMXAA处理后3小时至24小时高表达（补充图。图2a）。此外，由IFNαR信号传导介导的正反馈环通常允许进一步上调Irf7 mRNA和IFNα的产生。正如所料，与Trans-PyMT肿瘤相比，DMXAA后Spont-PyMT肿瘤中没有发生Irf7基因表达的上调（补充图2b）。
在Spont-PyMT肿瘤中缺乏I型IFN引发。一个 SPONT-PyMT小鼠腹腔注射DMXAA，然后3个小时或24小时后杀来衡量细胞因子mRNA水平和趋化因子在肿瘤。显示了与DMSO处理的（灰色菱形）小鼠相比，DMXAA处理的（黑色菱形）中的相对表达。每个点对应一个肿瘤。显示来自CTRL：n = 6只小鼠的累积数据和 来自三次独立实验的DMXAA：n = 6只小鼠。Tukey的多重比较测试。* p <0.05; ** p <0.01; *** p <0.001。b，c与注射PBS（CTRL）的小鼠相比，这些细胞因子/趋化因子的相对表达在（b）cGAMP（25μg）之后3小时在Spont-PyMT（灰色圆圈）和Trans-PyMT（空心圆）靶病变中测量。注射（Spont-PyMT小鼠：n = 3 CTRL和n = 3 cGAMP; Trans-PyMT小鼠：n = 5 CTRL和n = 13 cGAMP）或（c）LPS（50μgip ）注射（Spont-PyMT小鼠：n 来自三个独立实验的= 3 CTRL和n = 3LPS; Trans-PyMT小鼠：n = 5 CTRL且n = 10LPS）。在b和c，结果表示为平均值±SEM。源数据作为源数据文件提供
我们测试了在自发性PyMT小鼠中注射DMXAA后缺乏I型IFN产生是否是DMXAA特异性的。为此目的，我们使用另一种STING激动剂，即CDN 2'3'cGAMP药物。肿瘤内注射CDN 2'3'cGAMP也未能诱导Spont-PyMT肿瘤中Ifnα或Ifnβ基因的上调，而在Trans-PyMT肿瘤中也是如此（图3b）。此外，TLR4配体LPS（I型IFN的另一种诱导剂）在Trans-PyMT肿瘤中在3小时内诱导Ifnα，Ifnβ和TnfαmRNA水平，而在Spont-PyMT肿瘤中只有Tnfα被LPS上调（图3c））。
总之，这些数据显示Spont-PyMT小鼠在响应STING或TLR4刺激的I型IFN的产生中具有内在缺陷，这可以解释它们对DMXAA治疗的抗性。
为了鉴定I型IFN表达的诱导在哪个分子水平被阻断，我们接下来分析了参与STING激活途径的早期信号分子。IRF3（pIRF3）的磷酸化对于I型IFN产生是必需的。我们首先在DMXAA注射后3小时通过移植和自发肿瘤的肿瘤切片中的免疫荧光测量pIRF3。在DMXAA处理后，在Trans-PyMT肿瘤切片中检测到强烈的pIRF3标记（图4a，左图），包括在骨髓细胞（F4 / 80 +）和一些内皮细胞（CD31 +）中（图4b）。相比之下，在DMXAA处理的Spont-PyMT肿瘤的肿瘤切片中几乎检测不到pIRF3 +细胞（图4a），右图）。在肿瘤内注射DMXAA或ML RR-S2 CDA后获得了类似的结果（补充图3）。这些结果表明，由于pIRF3水平减弱，注射STING激动剂未能在Spont-PyMT小鼠的肿瘤生态系统的任何细胞类型中激活IFN途径。我们证实Spont和Trans-PyMT小鼠之间的Sting，Irf3和Irf7肿瘤内mRNA转录物没有差异（补充图4a）。此外，负责IRF3磷酸化的Tank结合激酶1（TBK1）在DMXAA处理后在两种肿瘤模型中被磷酸化（补充图4b）。这些结果与Tnf的上调一致注射DMXAA后α和趋化因子mRNA水平（图3a）表明导致I型IFN产生的信号传导途径在TBK1活化的下游被改变。
注射DMXAA后，在Spont-PyMT肿瘤中不存在IRF3磷酸化。一个 SPONT-PyMT小鼠和反式PyMT小鼠接受DMXAA之一腹膜内注射。3小时后，收集肿瘤并用抗-EpCAM（蓝色）和抗-pIRF3（红色）mAb染色肿瘤切片。显示了来自Trans-PyMT肿瘤（左）和Spont-PyMT肿瘤（右）的代表性图像。b在Trans-PyMT肿瘤中，一些pIRF3 +细胞（红色）是髓样（F4 / 80 +，绿色）或内皮细胞（CD31 +，黄色）。比例尺=50μm。该数据代表来自五个独立实验的三只Spont-PyMT和五只Trans-PyMT小鼠
总之，这些结果表明，尽管这两种模型基于相同的肿瘤细胞，但Spont-PyMT小鼠的肿瘤微环境对I型IFN产生的诱导具有抗性。该缺陷可能是由于IRF3磷酸化的阻断。
TGFβ常常累积在其中已知由巨噬细胞，包括IFNβ以抑制促炎细胞因子的肿瘤29。因此，我们检查了在向Spont-PyMT小鼠施用DMXAA后TGFβ是否参与受损的I型IFN产生。引人注目的是，TGF β的mRNA在未处理SPONT-PyMT肿瘤高得多的水平（〜七倍）比反式PyMT者（图中表达5A）。另外，如图5b所示，自发性肿瘤中的绝大多数细胞，而不是移植的细胞，显示核pSmad2 / 3表达，表明在这些肿瘤中通过TGFβR的活性信号传导。在p4 / 80 +骨髓细胞gp38 +中发现核pSmad2 / 3成纤维细胞和EpCAM +肿瘤细胞（图5c）。
TGFβ表达与Spont-PyMT肿瘤中的pSmad2 / 3相关。在肿瘤解离后立即在未处理的Spont-PyMT（灰色菱形）和Trans-PyMT（空心圆形）肿瘤中测量Tgfβ 的 mRNA水平。显示了相对于Trans-PyMT肿瘤归一化的相对表达。每个点对应一个肿瘤。来自Trans-PyMT小鼠的累积数据：n = 10和Spont-PyMT小鼠：n = 3.学生t检验。* p <0.05; ** p <0.01; *** p <0.001。b来自Spont-和Trans-PyMT-未处理小鼠的肿瘤切片用抗-EpCAM（蓝色）和抗-pSmad2 / 3（红色）Abs染色。C在Spont-PyMT肿瘤中，pSmad2 / 3 +细胞（红色）可以是骨髓细胞（F4 / 80 +，绿色），成纤维细胞（gp38 +，黄色）或肿瘤细胞（EpCAM +，蓝色）。注意，为清楚起见未叠加的第二和第三图像来自相同的图像场。图像代表Spont-PyMT：n = 3只小鼠; Trans-PyMT：n = 3只小鼠，来自每组小鼠的三次独立实验。在b和c中，比例尺=50μm。源数据作为源数据文件提供
因此，我们想知道抗TGFβ治疗是否会使Spont-PyMT小鼠对DMXAA更敏感。为了测试这一点，用抗TGFβ抗体处理Spont-PyMT小鼠4天，然后注射DMXAA，3小时后杀死，并在肿瘤切片中测量IRF3的磷酸化。如图6a所示，用体内抗TGFβ预处理小鼠使DMXAA在一部分细胞中诱导IRF3的磷酸化。这与当Spont-PyMT未用抗TGFβ处理时完全不存在DMXAA诱导的pIRF3相反，如图4a所示。在pIRF3 +细胞中，均为F4 / 80 +鉴定了骨髓细胞和肿瘤细胞（补充图5a）。此外，这种抗TGFβ中和在Spont-PyMT处理的小鼠中注射DMXAA后释放出Ifnα和Ifnβ基因的表达（补充图5b）。
阻断TGFβ允许DMXAA诱导的I型IFN产生和肿瘤消退。用抗TGFβ（第4天和第1天）处理的Spont-PyMT小鼠接受一次ip注射DMXAA。3小时后，收集肿瘤并用抗-EpCAM（蓝色）和抗-pIRF3（红色）mAb染色肿瘤切片。该图像代表 来自三个独立实验的n = 4种抗TGFβ处理的Spont-PyMT小鼠。比例尺=50μm。b通过流式细胞术分析来自Spont-PyMT小鼠的肿瘤，用抗TGFβ（黑色圆圈）或非β（灰色圆圈）和Trans-PyMT小鼠（空心圆圈）处理，以在TAM和单核细胞上表达MHCII。数据来自抗TGFβ处理的Spont-PyMT小鼠：n = 7; Spont-PyMT小鼠：n = 6或8; Trans-PyMT小鼠： 对于TAM或单核细胞，分别在7个独立实验中收集n = 12或21。结果表示为平均值±SEM。Tukey的多重比较测试。* p <0.05; ** p <0.01; *** p <0.001。c。对每只小鼠（8-10个肿瘤）合并来自抗TGFβ处理的Spont-PyMT小鼠的肿瘤，解离，并用磁珠分选F4 / 80 +细胞。用DMXAA（250μg/ ml，黑色圆圈）或不用（灰色圆圈）体外再刺激F4 / 80 +和F4 / 80 neg级分，并在过夜培养后通过ELISA在上清液中测量IFNα。结果表示为平均值±SEM。学生t测试。* p <0.05; ** p <0.01; *** p <0.001。d Spont-PyMT小鼠用DMXAA（第0天腹腔注射）或DMSO作为对照，用抗TGFβ（ip200μg），抗IFNαR（ip200μg）和/或用抗CD8（ip200μg）处理）第4天，第1天，第1天，第4天的腹肌。具有平均消退，稳定或进展的肿瘤的小鼠的比例如图1所示。DMSO处理的小鼠：n = 28; DMXAA处理的小鼠：n = 30; DMSO +抗TGFβ：n = 6; DMXAA +抗TGFβ：n = 9; DMXAA +抗TGFβ+抗-IFNαR：n = 6; DMXAA +抗TGFβ+抗CD8：n = 5.统计数据见补充表2。源数据作为源数据文件提供
要检查骨髓细胞在炎性细胞因子的初始DMXAA诱导的突发中的重要性16，30，我们DMXAA注射之前耗尽，这些细胞在体内。该实验证明髓样细胞确实负责I型IFN表达（补充图5b）。我们进一步分析了渗透抗TGFβ处理的Spont-PyMT肿瘤的骨髓细胞的比例和表型。在抗TGFβ处理的和未处理的Spont-PyMT肿瘤之间的细胞比例方面没有定量差异。在两种情况下，TAM是免疫浸润的主要骨髓细胞群（补充图5c）。然而，这些细胞存在质的差异。实际上，TGFβ阻断伴随着活化的MHCII +的加倍TAM与未治疗的小鼠相比，达到与Trans-PyMT肿瘤中观察到的频率相当的频率（图6b）。在Trans-PyMT中，少数浸润的单核细胞在抗TGFβ处理的小鼠中也主要是MHCII +。最后，我们从抗TGFβ处理的Spont-PyMT肿瘤中纯化免疫细胞，并测试F4 / 80 +细胞是否负责IFNα的产生。在用DMXAA体外刺激后，F4 / 80 +细胞部分产生比F4 / 80 neg部分大得多的IFNα （图6c）。此外，当MHCII + TAM亚群在体外用DMXAA分选和刺激时，它们倾向于产生比其MHCII neg更多的IFNα。 对应（补充图5d）。
总之，这些结果表明TGFβ阻断使得Spont-PyMT小鼠通过能够产生I型IFN的活化MHCII + TAM 促进乳腺肿瘤的浸润而对DMXAA刺激更敏感。
为了破译TGFβ可能干扰巨噬细胞中I型IFN产生的分子机制，我们转向用骨髓衍生的巨噬细胞（BMDM）进行的体外实验。分化1周后，将BMDM暴露于TGFβ过夜，并评估它们响应DMXAA磷酸化IRF3的能力。我们发现当用DMXAA刺激3小时时，TGFβ处理的BMDM明显丧失了磷酸化IRF3的能力（补充图6a，b）。据报道，细胞质中的组蛋白脱乙酰转移酶HDAC4可以抑制I型IFN的产生31，TGFβ可以刺激ROS依赖的HDAC4从细胞核输出32。因此，我们检查了TGFβ信号传导是否也可以改变巨噬细胞中HDAC4的亚细胞定位。在BMDM中，HDAC4主要是核（补充图6c）。相反，BMDM暴露于TGFβ过夜诱导分子大量转运至细胞质，如其在这些细胞中的均匀分布所示。此外，在TGFβ暴露期间抑制ROS产生减少了HDAC4的这种易位（补充图6c）并且在DMXAA刺激后恢复了IRF3的磷酸化（补充图6a，b）。
总之，这些结果表明TGFβ可通过触发易受影响其产生I型IFN的能力的巨噬细胞的分子变化而对DMXAA诱导的IFN表达具有间接作用。我们鉴定了ROS介导的HDAC4重定位作为一种分子机制，通过该机制，TGFβ可以特异性地干扰IRF3的磷酸化，从而调节这些细胞中的I型IFN应答。
我们终于想知道TGFβ阻断是否可以促进Spont-PyMT小鼠中DMXAA诱导的肿瘤消退。用抗TGFβ和DMXAA的组合处理小鼠，后者在抗TGFβ处理开始后4天腹膜内注射一次。在这些条件下，Spont-PyMT小鼠的肿瘤负荷在联合治疗后5天内减少（66％）或稳定（33％）（图6d）。该反应不依赖于CD8T细胞，但需要IFN信号传导，因为它在用抗-IFNAR抗体处理的小鼠中完全阻断（图6d）。总之，这些结果表明阻断TGFβ允许DMXAA诱导的肿瘤浸润性巨噬细胞产生I型IFN，并促进Spont-PyMT小鼠中的短暂肿瘤消退。
I型IFN具有促进各种免疫效应物的激活和募集的独特潜力，并且代表主要针对病毒的天然防御。IFN也有助于抗击癌症和令人鼓舞的成果已经在裸鼠移植瘤模型情况下获得了STING配体，能够触发IFNα/β生产10，16。然而，是否可以在自发性肿瘤中治疗性地诱导I型IFN的产生仍然是一个热点问题。在这里，我们提供了一个实例，其中自发性肿瘤微环境中的TGFβ积累在STING激活后阻断巨噬细胞产生IFNα/β，并有助于预防肿瘤排斥。可以通过抗TGFβ治疗克服该障碍。
与移植的PyMT小鼠中由DMXAA系统诱导的肿瘤消退形成鲜明对比16，我们在此报道Spont-PyMT肿瘤在STING激活后很少消退。免疫反应较弱与DMXAA诱导的肿瘤消退失败有关。自发性肿瘤中特别缺乏的是IFNβ和IFNα的产生，而不是免疫引诱趋化因子的产生。四种不同的I型IFN诱导剂（DMXAA，LPS，cGAMP和ML RR-S2 CDA）未能在这些自发性肿瘤中诱导IFNα/β的产生。这些结果表明自发性肿瘤发展出一些抑制IFN依赖性抗肿瘤免疫诱导的特征，这一假设促使我们在Spont-PyMT肿瘤模型中研究该途径的激活。
我们发现在Spont-PyMT小鼠中注射DMXAA后缺乏I型IFN mRNA与肿瘤细胞和免疫浸润细胞中肿瘤生态系统中IRF3磷酸化的显着缺陷相关。相反，保留了激活IRF3所必需的TBK1活化，表明STING / TBK1途径下游的特异性阻断。所述的转录干扰素形成 β基因，这是已知的由pIRF3同型二聚体或通过pIRF3 / pIRF7异二聚体来驱动，因此有可能阻止在早期阶段。此外，与Trans-PyMT肿瘤相比，DMXAA后Spont-PyMT肿瘤中没有发生Irf7基因表达的上调，这可能是缺乏pIRF3和IFNβ的直接后果。
已经在癌症患者33中报道了对IFNα的响应性降低，在体外用IFNα刺激后STAT1的磷酸化降低。我们的研究增加了一个关键因素：在某些肿瘤中，产生IFNβ和IFNα的能力也可能受到影响。该发现强调肿瘤中IFNα/β产生的缺陷可能源自STING / IRF3信号传导的早期阻断。这由某些肿瘤细胞，这可能导致从突变或该途径的表观遗传调控加起来公知的有缺陷的IFNα生产34，35，并且其提供的优点与致癌病毒的治疗性干预35。此处，STING激动剂在实体瘤中增强抗肿瘤反应的治疗潜力依赖于肿瘤微环境产生I型IFN的能力。Spont-PyMT乳房模型说明某些肿瘤可能对这种干预有抵抗力。
我们的数据进一步表明，在DMXAA治疗后，肿瘤微环境主要控制IFNα/β的产生。因此，Trans-PyMT肿瘤中的内皮细胞和大部分骨髓细胞在注射DMXAA后强烈磷酸化IRF3。这些结果与Demaria等人的早期报道一致。表明注射STING激动剂11后内皮细胞迅速产生IFNβ 。但请注意，在我们的实验中，内皮细胞不太可能是Demaria工作中提出的I型IFN的主要来源，但仅代表pIRF3 +的一小部分细胞，易产生IFNβ。因此，我们的数据共同表明，反式和Spont-PyMT小鼠产生I型IFN的不同能力存在于不同的肿瘤微环境中，主要存在于骨髓细胞中。
我们发现抗TGFβ处理允许DMXAA诱导IRF3的活化，IFNα/β的产生，并促进Spont-PyMT小鼠中的肿瘤消退。TGFβ是许多生理功能的基础，包括乳腺发育的调节。虽然它可以抑制细胞增殖（因此，最初的肿瘤生长），但TGFβ在其后期的负面作用中更为人所知。实际上，它抑制免疫效应功能，加速转移传播36，并且这种效应通过TGFβR信号传导途径中的频繁突变而扩增，从而允许肿瘤细胞逃避TGFβ抗增殖作用。毫不奇怪，高水平的TGFβ活性形式与几种晚期癌症的生存率低有关37。特别令人感兴趣的是，基质TGFβR信号传导中基质中pSmad2 / 3的密度与非小细胞肺癌的预后不良有关38。在Spont-PyMT小鼠中，TgfβmRNA水平高，并且在肿瘤生态系统的绝大多数细胞中观察到核pSmad2 / 3，表明TGFβ的细胞来源不太可能是独特的。我们还没有尝试鉴定TGFβ的来源，但众所周知，它可能由多种细胞类型分泌，包括巨噬细胞39和凋亡细胞40。在Trans-PyMT肿瘤中从未观察到大量TGFβ信号传导的这种迹象。
我们认为可能在Spont-PyMT小鼠和可能的其他自发性肿瘤小鼠中，TGFβ的主要作用方式是间接的。实际上，已经表明TGFβR信号传导参与促炎细胞因子的抑制和骨髓细胞的极化29。我们的研究为理解这些抑制作用提供了元素。实际上，我们已经描述了这样的情况：在STING配体的作用下，TBK1被磷酸化，而不是IRF3。以ROS依赖性方式观察TGFβ诱导的BMDM中HDAC4的细胞质重新定位是惊人的。这与先前在成纤维细胞中报道的一致32。HDAC4可能是TGFβ诱导效应的关键参与者。已经显示HDAC4可以通过与TBK1 /IKKε复合物31相互作用在IFNβ信号传导中发挥负反馈环。这种HDAC-TBK1相互作用可以解释TGFβ如何在TBK1和IRF3磷酸化之间引入阻断。其他机制可能影响TGFβ处理的巨噬细胞的反应性，如Smad2和Smad3的干扰，可直接抑制IRF3，导致IFNα/β产生减少41。与这些分子变化平行，我们发现对I型IFN诱导敏感的肿瘤，即Trans-PyMT或抗TGFβ处理的Spont-PyMT，被大多数产生更多I型IFN 的MHCII + TAM 渗透。比MHCII - TAM，在Spont-PyMT抗性肿瘤中占主导地位。与此一致，TGFβ在三阴性人乳腺肿瘤中的存在与浸润性浆细胞样DC的功能性弱点相关，用于产生I型IFN 42。我们的研究结果表明，TGFβ阻断可以重新编程抗肿瘤浸润性骨髓细胞。类似地，已显示阻断TGFβ信号传导促进抗肿瘤中性粒细胞的出现43。
许多研究已经提出了对TGFβ的原始作用的解释。他们中的许多处理TGFβ的直接免疫抑制作用（包括它们的调节性T细胞释放）T细胞44，45，46。其他归因于它朝向免疫表型骨髓细胞的极化29，或者其对癌症相关成纤维细胞的效果47，48，和T细胞的接触肿瘤细胞的能力，即使抑制的潜在分子机制仍不清楚。我们在此提出了另外的分子机制，通过该机制，TGFβ可以通过减弱IFNα/β的产生而在自发性肿瘤中发挥原始效应。
我们在此已经表明，抗-TGFβ治疗响应于在Spont-PyMT小鼠中注射的DMXAA，通过肿瘤浸润性巨噬细胞解锁I型IFN的产生。就DMXAA诱导的IRF3磷酸化和IFNα产生而言，这些处理的小鼠不完全等同于移植的小鼠，并且在两种肿瘤模型之间存在明显的其他差异，其没有理由都是TGFβ依赖性的。然而，这种组合治疗允许通过独立于CD8T细胞的机制使肿瘤瞬时消退。I型IFN与TNFα一起释放可能对肿瘤血管系统和肿瘤细胞的杀伤有直接影响49。已知肿瘤浸润性巨噬细胞在这些细胞因子的产生中起重要作用，并且我们之前已经证实了它们与CD8T细胞一起在DMXAA诱导的Trans-PyMT肿瘤消退中的作用16。我们提出在Spont-PyMT小鼠中抗TGFβ与DMXAA联合治疗诱导了先天性抗肿瘤反应。最后，抗TGFβ治疗后DMXAA诱导的自发性肿瘤消退是短暂的，表明最初的先天性反应应该通过促进内源性适应性抗肿瘤反应的治疗得到加强和延长。
在该研究中突出显示的TGFβ/ I型IFN干扰不仅对于活跃发育的STING激动剂，而且对于化学治疗剂如蒽环霉素也很重要，其中肿瘤消退与I型IFN特征50相关。在像乳腺肿瘤的肿瘤的情况下差到抗-PD-1 / PDL1关卡抑制剂，并且其中TGFβ和M2-如巨噬细胞是丰富的响应21，36，将有对使用抗TGFβ的三重组合的固体的理由，抗PD-1和第三伴侣，如STING激动剂或化疗。
通过在FvB / NCr1小鼠（Charles River实验室）上回交，将MMTV-PyMT转基因小鼠维持在Cochin Institute SPF动物设施中。移植的PyMT小鼠通过在8周龄FvB小鼠的乳腺中移植产生1×10 6个细胞，从MMTV-PyMT肿瘤制备的肿瘤细胞悬浮液中新鲜分离，通过机械和酶促解离DNase I（100μg/100μg/ ml） ml，Roche），释放酶（250μg/ ml，Roche）和透明质酸酶（1μg/ ml，Sigma）16。动物护理符合欧洲实验动物科学协会联合会动物试验和研究的所有相关伦理规定。所有程序均经巴黎笛卡尔大学法国动物实验和伦理委员会批准（CEEA 34,16-063）。选择样本大小以根据动物伦理规则的替换，减少和改进原则确保实验的再现性。
将具有6mm直径的肿瘤的小鼠接受单次腹膜内注射DMXAA（在DMSO中23mg / kg，从Sigma购买的＃D5817）或在PBS中的100μl50％DMSO作为对照。指定时，注射DMXAA（1×500μg）。腹膜内注射LPS（1×50μg），注射cGAMP（InvivoGen，1×25μg），3小时后处死小鼠。在第0,3和6天注射ML RR-S2 CDA（MedChem Express，3×50μg）。对于抗体治疗，200μg抗-IgG1（＃BE0083：克隆MOPC-21）或IgG2a（＃BE0089） ：克隆2A3）用于同种型对照和200μg抗TGFβ（＃BE0057：克隆1D11.16.8），抗IFNαR（＃BE0241：克隆Mar1-5A3），抗CD8（＃BE0004-1：克隆53）所有购自Bioxcell的抗-GR1（＃BE0075：克隆RB6-8C5）抗体在DMXAA处理后第3天至第6天每2天注射一次。在一些实验中，给小鼠喂食含有PLX3397或对照食物（Plexxikon Inc.，从第-2天到第1天）的食物以消耗巨噬细胞。DMXAA治疗后肿瘤大小的演变估计如下。对于每个肿瘤，它的大小当注射DMXAA时，相对于其在d0处的大小计算t。对于每只小鼠，计算其所有可测量肿瘤的平均值。DMXAA诱导的肿瘤大小变化的另一种表现始于DMXAA注射后第5天肿瘤负荷变化的快照，如上所述，并且对于该组中的所有小鼠汇集在三组中：肿瘤的整体进展当鼠标增加> 20％时的负担; 全球消退，如果肿瘤负荷减少> 30％，并在两者之间稳定。
通过机械和酶促解离制备的肿瘤细胞悬浮液（4×10 6）16在室温下20分钟内用活/死染色（蓝色荧光活性染料，＃L34962 Invitrogen）在96孔圆底板中染色。对于流式细胞术分析和分选，用抗-FcR阻断Fc受体（抗-CD16和CD32,5μg/ ml，Biolegend＃101339）。在PBS 2％FCS中洗涤两次后，用以下抗体（均以1：100使用）染色细胞：抗CD11b-BV421（＃562605），CD64-APC（＃558539），CD11c-PeCy7（＃557401） ，TCRβ-BV605（＃562840）和CD4-BV711（＃563050）均购自BD Pharmingen; 抗CD45-AF700（＃103128），Ly6C-APCCy7（＃128025），Ly6G-BV510（＃127633），F4 / 80 BV650（＃123149），CD206-PE（＃141706），IA / IE-BV785（＃ 107645）全部购自Biolegend，CD8-PerCPef710（＃46-0081-82）购自eBioscience。洗涤后，将细胞固定在1％PFA中，在4℃下保存，并在第二天获得LSR II或FORTESSA（BD Bioscience）。为了检测磷酸化蛋白，用DMXAA250μg/ ml刺激细胞悬浮液3小时，立即用PFA 4％固定，用90％冷冻甲醇透化，用1：100 pTBK1-PE（＃13498）抗体染色过夜（购自细胞信号传导），然后洗涤并进一步染色用于多色流式细胞术。
从FvB小鼠收集骨髓细胞。用注射器，用25G的针头将骨髓冲洗到带有DMEM的无菌培养皿中。然后，将细胞离心，重悬浮于补充有谷氨酰胺，30％L929条件培养基，20％FCS和2％P / S的DMEM中。培养5天后，将BMDM用于实验。将BMDM与TGFβ（Peprotech; 5ng / ml）在37℃下孵育过夜，有或没有ROS抑制剂N-乙酰半胱氨酸（ThermoFisher; 1nM）或未经处理。然后，在3小时内用DMXAA（Sigma;250μg/ ml）刺激或不刺激细胞，并通过免疫荧光分析。
用高碘酸盐 - 赖氨酸 - 多聚甲醛在4℃下将肿瘤块固定过夜。然后将肿瘤样品包埋在PBS中制备的5％低凝胶温度琼脂糖（VII-A型; Sigma-Aldrich）中。总共使用振动切片机（VT 1000 S; Leica）在冰冷的PBS 51浴中切割350μm切片。。表面标志物的免疫染色在37℃下进行15分钟，对F4 / 80-AF488（＃MCA497A647）或AF647（＃MCA497A488）特异性抗体均购自Bio Rad，EpCAM-BV421（＃563214），CD31-Biot（ ＃BD3371）来自BD Pharmingen或来自biolegend的Gp38-PE（＃127408）（均以1：100使用）。用来自BD Pharmingen的链霉抗生物素蛋白-PE（＃554061）显示CD31-Biot。对于额外的细胞内染色，将组织切片在4％PFA中固定（在室温下10分钟）并在4℃下用甲醇90％透化30分钟并用1:10 pIRF3-AF647（＃103275）或1：100染色过夜。 p-SMAD2 / 3（＃8685）均购自Cell信号传导。为了检测pSMAD2 / 3，用生命技术中1：200的山羊抗兔AF488（＃A11070）显示了初级抗pSMAD2 / 3 Ab。
使用配备有ORCA Flash4.0LT照相机（Hamamatsu）和25×0.95NA W物镜（Leica）的共焦旋转盘（CSU-X1; Yokogawa）直立显微镜（DM6000FS; Leica）获得肿瘤切片的图像。所有图像均使用MetaMorph 7成像软件（Molecular Devices）获得，并用Image J.进行分析。
对于BMDM的染色，在刺激后立即将细胞固定在PFA中4％，用90％冷冻甲醇透化，用来自Cell signaling的1:10 pIRF3-AF647（＃103275）或1：100 HDAC4（＃ab79521）染色过夜。来自Abcam。为了检测HDAC4，用来自生命技术的1：200山羊抗兔AF488揭示了初级抗HDAC4 Ab。BMDM的图像是在宽视场Nikon Eclipse显微镜上通过×20物镜，使用Eclipse TE2000，级联CDD相机（Photometrics）获得的。必须以3的分级获取pIRF3的图像，并且平均5个图像。在没有装箱的情况下获得HDAC4的图像。对于在背景扣除后对BMDM图像进行的pIRF3强度的定量，在每个条件下测量40-60个细胞的平均核强度。
根据制造商的说明，使用RNeasy Mini Kit（Qiagen）从切割的肿瘤中提取肿瘤RNA。使用Advantage的RNA反转录® RT用于PCR试剂盒（Applied Clontech公司）中，并通过RT-qPCR与LighCycler分析基因表达® 480实时PCR系统。使用的引物列表在补充表1中提供。
在Ficoll密度分离（来自Sigma的Histopaque-1093）之后，对从肿瘤细胞悬浮液中纯化的细胞进行IFNα产生的ELISA（来自Thermo Fisher的IFNα小鼠ELISA试剂盒），然后用抗-F4 / 80 MicroBeads UltraPure试剂盒（Miltenyi Biotec）纯化。基于补充图1中显示的门控，分离F4 / 80 +细胞或随后用ARIA III 分选MHCII +和MHCII 阴性 TAM亚群。然后用250μg/ ml DMXAA刺激细胞过夜或在剂量前不处理细胞。 IFNα在培养上清液中的作用
使用GraphPad Prism5软件分析数据以进行未配对的Student's t检验或单向ANOVA和Tukey检验以进行多重比较。对于体内治疗的统计分析，在估计对数倍数变化对数后，使用Python软件运行Kolmogorov-Smirnov检验。 个体的平均肿瘤体积 10（V 肿瘤 [5天] / V 肿瘤 [ t = 0]）。处理开始后第0天和第5天之间的小鼠。值≤0.05被认为是显着的。* p <0.05; ** p <0.01; *** p <0.001。
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