摘要
TRAF3是一种多功能细胞内衔接蛋白，具有多种特定于背景的作用。由于在几种类型的B细胞癌中观察到TRAF3的丧失，TRAF3缺乏在B细胞中独特地增加存活并增加转化的风险。在这里，我们报告了TRAF3抑制B细胞存活的新机制。我们发现TRAF3缺陷与小鼠原代B细胞和人恶性B细胞系中促存活激酶Pim2的诱导有关。Pim2的增加与NF-κB2活化无关，但随着STAT3表达或功能的抑制而改善。TRAF3缺乏还导致c-Myc蛋白水平的Pim2依赖性增加，并且与c-Myc泛素化减少有关。TRAF3缺陷的原代B细胞对Pim抑制剂SGI-1776和TP-3654诱导的细胞死亡不太敏感。有趣的是，具有低TRAF3表达的人恶性B细胞系对Pim抑制诱导的细胞死亡更敏感。TRAF3缺陷型B细胞和B细胞肿瘤系与c-Myc抑制剂的联合治疗增强了它们对Pim抑制的敏感性，表明可能的治疗策略。因此，TRAF3抑制Pim2介导的B细胞存活轴，其可以是治疗B细胞恶性肿瘤的潜在靶标。
介绍
适配器信号蛋白肿瘤坏死因子受体（TNFR） -相关因子3（TRAF3）显示细胞和多种信号传导途径的特定于上下文的调节，具有鲜明的后果在不同细胞类型1，2。小鼠中的全生物Traf3缺失导致新生儿死亡，证明了TRAF3在关键生物功能中发挥的关键作用3。当Traf3的遗传丢失局限于小鼠B细胞谱系时（B- Traf3 - / -只小鼠），这些小鼠显示从显着增强的B细胞存活，包括在所有次级淋巴器官的B细胞的积累，以及自发生发中心发生和自身抗体的产生而产生的击打表型4，5。随着B- Traf3 - / -小鼠的年龄增长，大多数发展为B细胞淋巴瘤，这与其增强的B细胞存活允许突变积累最终增加转化可能性的预测一致6。重要的是，TRAF3的遗传丢失在人类中也与B细胞恶性肿瘤有关。据报道，弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）和多发性骨髓瘤的〜20％的> 15％的含有损失和/或失功能突变TRAF3 7，8，9，10。另外，人B细胞肿瘤中的TRAF3缺乏可能是由翻译后修饰引起的。我们最近表明，爱泼斯坦 - 巴尔病毒（EBV）编码的致癌蛋白潜伏膜蛋白1（LMP1），通过其TRAF3的高亲和力结合，可以隔离TRAF3远离调节细胞中的其他促存活途径，产生小鼠和人DLBCL细胞系中TRAF3缺陷表型11。因此，TRAF3是重要的B细胞肿瘤抑制因子。
TNF家族成员B细胞活化因子（BAFF）对正常B细胞的存活至关重要。通过BAFF受体（BAFFR）发信号的关键部分是丝氨酸 - 苏氨酸激酶NF-κB诱导激酶（NIK）的激活。NIK在激活促存活的非经典NF-κB2途径中起关键作用。TRAF3通常抑制NIK活化，作为介导NIK多泛素化和蛋白酶体介导的降解的蛋白质的细胞质复合物的一部分。BAFFR信令新兵这种复杂的膜，在这之后TRAF3本身变得聚泛素化和降解12，13。缺乏TRAF3的B细胞不再需要BAFF信号存活，并显示NF-κB2因子p52和RelB 2的组成型核定位。然而，随后发现，T细胞，树突状细胞和缺乏巨噬细胞TRAF3也显示组成型NF-κB2活化，但示出了细胞存活没有增加14，15。在B细胞中，TRAF3的降解对于NF-κB2途径16的活化也不充分也不是必需的。因此，TRAF3通过多种机制，包括促存活蛋白Mcl-1的转录的抑制调节B细胞存活17，和B细胞的葡萄糖代谢的抑制18。
先前的基因表达分析比较了正常和TRAF3缺陷的B细胞与WT和TRAF3缺陷的T细胞相比，以鉴定B细胞中与其独特增强的存活相关的TRAF3调节的靶标17。该分析揭示了TRAF3 - / - B细胞中鼠淋巴瘤（Pim）2中激酶前病毒插入的增加。的PIMS是一个转录调节的，组成型活性的丝氨酸/苏氨酸激酶家族组成的Pim1，Pim2的和PIM3的19。PIM2在人类MM细胞中过表达，并且需要为他们的增殖和存活20，21。Pim2抑制也促进B淋巴瘤细胞的死亡22。
我们在此显示TRAF3的缺失足以诱导B细胞中Pim2的上调。通过删除NIK没有减弱这种增加。与野生型（WT）B细胞相比，缺乏TRAF3的B细胞对生化Pim2抑制更敏感并且对磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（PI3K / Akt）途径的抑制剂更具抗性。人BCL和MM细胞系中TRAF3的低表达与较高的Pim2蛋白水平相关，并且对Pim2抑制剂介导的细胞死亡的易感性降低。有趣的是，B细胞TRAF3缺陷也导致c-Myc蛋白水平的Pim2依赖性升高，而c-Myc mRNA没有变化; 这与c-Myc多泛素化减少有关。缺乏TRAF3的B细胞对c-Myc表达的抑制具有抗性，但对c-Myc活性的抑制敏感。c-Myc的抑制也增强了响应Pim2抑制剂的细胞死亡。这些发现将Pim2鉴定为B细胞中增强存活的重要介质，其与几种相关的促活性分子机制相协调。因此，Pim2调节的途径在TRAF3缺陷的B细胞恶性肿瘤中提供了有希望的潜在治疗靶标。
结果
TRAF3介导的B细胞Pim2表达调节
为了确定TRAF3缺陷型B细胞（TRAF3 - / -）超级存活所涉及的途径，我们进行了微阵列分析，比较了TRAF3 - / -小鼠B细胞的基因表达与野生型同窝对照的基因表达（ WT）17。我们还比较基因表达的TRAF3 - / - B细胞与TRAF3 - / -从条件性敲除小鼠的T细胞，因为这些T细胞不具有增强的存活1，14。与WT B细胞或TRAF3 - / - T细胞相比，TRAF3 - / - B细胞中Pim2基因表达增加。确认微阵列数据，TRAF3 - / -当通过RT-PCR检查时，与WT B细胞相比，B细胞具有6倍高的Pim2 mRNA表达（图 1a）。与WT B细胞相比，TRAF3 - / - 中的Pim2蛋白也增加（图 1b）。有趣的是，TRAF3缺陷特异性调节Pim2同种型，因为Pim1和Pim3的表达没有变化（补充图 1）。
TRAF3介导的小鼠原代B细胞和人MM和BCL细胞系中Pim2表达的调节。（a）通过RT-PCR测定WT和TRAF3 - / - B细胞中的Pim2 mRNA水平。将数据标准化为GAPDH，并使用比较Ct方法测定倍数变化。图描绘了平均值±SEM（N = 3只小鼠）。使用非配对t检验来评估统计学显着性的差异（** p <0.01）。（b）WT和TRAF3的全细胞裂解物（WCL）- / -用Western印迹（WB）分析B细胞的蛋白质表达。图描绘了平均值±SEM（N =来自2次独立实验的8只小鼠）。首先将样品归一化至β-肌动蛋白上样对照，然后归一化至平均WT归一化值。使用Welch校正的非配对t检验来评估统计学显着性的差异（* p <0.05）。（c，d）用WB测定所示人MM（c）和DLBCL（d）细胞系中TRAF3和Pim2的相对水平。显示了来自3（c）和6（d）独立实验的代表性印迹。图中（c）表示Pim2 /肌动蛋白的相对水平除以所示MM细胞系的TRAF3 /肌动蛋白（N = 3）。（d）中的图描绘了平均值±SEM。（c，d）先前已在NM 23的博士论文中提出。Wilcoxon符号秩检验用于评估统计学显着性的差异（* p <0.05; N = 6）。
我们在小鼠原代B细胞中的观察结果使我们预测B细胞肿瘤中的TRAF3蛋白水平将影响它们的Pim2蛋白的相对水平。我们检查了3种人源MM衍生细胞系（OPM2，LP1和RPMI8226），并观察到它们的相对TRAF3和Pim2蛋白水平之间的反相关（图 1c）。在DLBCL衍生的人细胞系中，与TRAF3阳性BJAB细胞相比，OCI-Ly7细胞具有不可检测的TRAF3蛋白和增加的Pim2表达（图 1d）。图 1c，d先前在NM 23的博士论文中提出。尽管我们预计肿瘤细胞中存在多种可能影响Pim2表达的基因改变，但我们的结果表明TRAF3可能是抑制正常和恶性B细胞中mRNA和蛋白质水平的Pim2表达的重要调节因子。最近在引言中描述的补充发现强化了这一结论，即表达LMP1的人BCL细胞系，其强烈地结合和隔离TRAF3，也显示TRAF3缺陷表型，包括升高的Pim2蛋白10。
TRAF3缺失对Pim2靶磷酸化的影响
Pim2对丝氨酸-112促凋亡BAD蛋白的磷酸化抑制细胞死亡24。激酶P70-S6（P70-S6K），S6核糖体蛋白（S6），和4E-BP1，参与蛋白质的翻译，也Pim2的磷酸化的目标，并促进细胞存活的调节25，26。在TRAF3 - / -小鼠B细胞中Pim2（一种组成型活化激酶）的表达增加导致其已知靶标BAD 27，p70-S6K，4E-BP1和核糖体蛋白S6的表达增强（图 2a-e）），以及这些蛋白质的磷酸化（活性）形式。在4EBP1和S6的情况下，磷酸化形式也有选择性增加，高于总量的增加。这些结果表明增加的Pim2蛋白伴随着缺乏TRAF3的B细胞中Pim2活性的增加。
TRAF3缺失对Pim2靶磷酸化的影响。（a）用WB分析WT和TRAF3 - / - B细胞的全细胞裂解物的蛋白质表达。每条泳道代表一只单独的小鼠。（b - e）将p-BAD S112，p-p70S6K T389，p-4E-BP1 T37 / 46或p-S6核糖体蛋白S235的相对水平首先归一化为β-肌动蛋白上样对照（上排）或总量BAD，p70S6K，4E-BP1或S6（底行）然后达到平均归一化WT值。图表描绘了平均值±SEM。在（b - d）中使用非配对t检验，在（e）中使用Mann Whitney检验来评估统计学显着性的差异（* p <0.05，** p <0.01; N = 4）。
TRAF3和Pim2对c-Myc稳定性和水平的影响
转录因子c-Myc的经常被在B细胞肿瘤发生牵连28，29，并且是潜在的治疗靶。此外，myc转基因小鼠中的前病毒标记显示Pim2是一种协同致癌基因，可驱动淋巴瘤形成30。Pim2直接磷酸化丝氨酸329上的c-Myc，导致c-Myc蛋白稳定并增强细胞转化31。因此，我们研究了TRAF3缺陷型B细胞是否也显示c-Myc表达和/或翻译后修饰的改变。TRAF3缺陷的B细胞c-Myc蛋白表达增加，而c-Myc mRNA没有增加（图 3a，b））。用siRNA抑制Pim2表达减弱了TRAF3 - / - B细胞中c-Myc表达的水平（图 3c）。尽管Pim2和c-Myc的绝对水平的小鼠间变异性导致差异，但总体上没有达到统计学显着性，当Pim2表达降低时c-Myc的明显下降趋势在所有样品中是一致的。c-Myc蛋白的稳定性受K48连接的多泛素化32的调节。在没有TRAF3的情况下，升高的c-Myc蛋白水平与c-Myc的K48连接的多泛素化的减少相关（图 3d ;之前在NM 23的博士论文中提出））。这些发现表明B细胞中TRAF3的缺失导致细胞c-Myc蛋白增加，这需要在TRAF3缺乏下游增强的Pim2表达，并且与c-Myc K48连接的泛素化减少有关。
在没有TRAF3的情况下，Pim2调节c-Myc稳定性。（a）用WB分析WT和TRAF3 - / - B细胞的WCL 以进行c-Myc表达。图描绘了平均值±SEM（来自3个独立实验的N = 11）。使用非配对t检验来评估统计学显着性的差异（* p <0.05）。（b）用RT-PCR测定WT和TRAF3 - / - B细胞中的c-Myc mRNA水平。将数据标准化为GAPDH，并使用比较Ct方法测定倍数变化。图表示平均值±SEM（N = 3只小鼠）。学生t检验用于评估差异的统计学显着性。（NS =不重要）。（c）TRAF3 - / -用siRNA乱序对照或靶向Pim2的siRNA转染B细胞。24小时后，用WB分析WCL中的Pim2和c-Myc表达。图描绘了Pim2或c-Myc表达/β-肌动蛋白上样对照并标准化为siRNA对照。配对t检验用于评估统计学显着性的差异（N = 3）。（d）在从WT和TRAF3 - / - B细胞中免疫沉淀c-Myc后，用WB测定K48连接的多泛素化。印迹是3个独立实验的代表。（d）先前在NM 23的博士论文中提出。
为了确定Pim2的这种增加是否是B细胞特异性，我们检查了从T细胞特异性TRAF3 - / -小鼠中分离的T细胞14。在微阵列分析中，TRAF3 - / -和WT T细胞中的Pim2 mRNA没有显着差异17。有趣的是，与WT T细胞相比，TRAF3 - / -T细胞中Pim2蛋白表达增加，尽管这种差异无统计学意义。T细胞的c-Myc蛋白表达与TRAF3状态无关（补充图 2）。
STAT3对TRAF3缺陷型B细胞中Pim2增加的依赖性
如上所述，TRAF3促进NIK的降解。在没有TRAF3的情况下，NIK累积并促进NF-κB2途径的激活（综述于1）。NIK的B细胞特异性缺失显着降低总体B细胞存活并抑制NF-κB2活化33。因为BAFF介导的Pim2诱导是NF-κB2依赖性的34，我们测试了NIK对驱动TRAF3缺陷的B细胞的Pim2表达增加的要求。有趣的是，缺乏TRAF3缺陷的B细胞中的NIK不会影响升高的Pim2（补充图 3 ;之前在NM 23的博士论文中提出）。以前，已经表明，当缺失NIK时，TRAF3缺陷的B细胞仍显示出增强的存活35，表明存在由TRAF3调节的NIK非依赖性，促存活途径。
STAT3激活增加在两个血液和实体瘤Pim2的表达21，36，37。TRAF3通过募集磷酸酶PTPN22 38抑制IL-6受体下游的STAT3活化。因此，我们研究了TRAF3 - / - B细胞中Pim2表达增加与STAT3激活水平之间的关系。在用STAT3抑制剂Cucurbatacin I 39处理后，TRAF3 - / - B细胞中的Pim2蛋白降低至WT水平（图 4a）。在TRAF3 - / - B细胞中用siRNA部分抑制STAT3表达导致Pim2蛋白的类似减少（图 4b））。我们早期的研究表明TRAF3在IL-6结合后与IL-6R结合，并将PTPN22募集到该受体以减少IL-6介导的STAT3磷酸化。然而，IL-6处理没有进一步增加TRAF3 - / - B细胞中的Pim2水平（数据未显示），表明TRAF3不通过IL-6R途径调节Pim2介导的稳态存活。我们的结果显示TRAF3缺乏维持STAT3活化下游的Pim2表达增加并且独立于NF-κB2活化。
STAT3抑制对TRAF3缺陷B细胞的影响。（a）用指定浓度的STAT3抑制剂Cucurbatacin I处理TRAF3 - / - B细胞16小时。通过WB从WCL分析p-STAT3 Y705和Pim2的表达。印迹是3个独立实验的代表。将Pim2 /β-肌动蛋白上样对照标准化为WT值。图表显示平均值±SEM（N = 3）。使用非配对t检验来评估统计学显着性的差异（* p <0.05，** p <0.01）。（b）TRAF3 - / -用靶向STAT3的对照或siRNA转染B细胞。24小时后，通过WB分析WCL中的Pim2和STAT3表达。图描绘了STAT3或Pim2表达/β-肌动蛋白上样对照并标准化为siRNA对照的平均值。配对t检验用于评估统计学显着性的差异（* p <0.05，** p <0.01，N = 5）。
TRAF3状态对B细胞对Pim抑制剂易感性的影响
PIM2是用于B细胞存活是重要的，并已被建议作为用于治疗B细胞的潜在目标恶性肿瘤22，27。为了确定Pim2抑制是否诱导TRAF3缺陷B细胞的死亡，我们在用两种不同的Pim激酶抑制剂：SGI-1776 40和TP-3654 41处理24小时后测试B细胞存活。虽然异构体限制的Pim2抑制剂目前尚未获得，但Supp。图 1表明在缺乏TRAF3的B细胞中其他Pim同种型的表达没有增加。WT和TRAF3 - / - B细胞中的Pim抑制导致细胞死亡增加，这与Pim2在B细胞存活中的重要性一致（图 5a，b）。TRAF3- / -原代B细胞对两种抑制剂介导的细胞死亡具有相对更强的抵抗力，与其升高的Pim2激酶水平一致。
TRAF3对小鼠原代B细胞和人MM和DLBCL细胞系中激酶抑制易感性的影响。（a，b）用指定剂量的Pim抑制剂处理每孔1×10 6个 B细胞的脾B细胞24小时。通过PI排除确定活力。百分比存活率计算为针对每种基因型标准化为DMSO媒介物处理的样品的抑制剂处理的样品的平均存活率。图表显示用SGI-1776（a）或TP-3654（b）处理的活细胞百分比的平均值±SEM 。图表代表3次独立实验（N = 4）。使用未配对的Student's t检验来评估统计学显着性的差异（* p <0.05，** p <0.01）。（c，d）用指定剂量的SGI-1776处理MM（c）和DLBCL（d）细胞系（5×10 3 /孔）24小时。通过PI排除确定活力。图表显示归一化为DMSO载体对照的细胞的活力百分比的平均值±SEM。使用未配对的Student's t检验来评估来自3（c）或7（d）独立实验的统计学显着性的差异（* p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001）。
我们接下来希望检测具有不同水平的TRAF3蛋白的人肿瘤衍生的B细胞系对Pim2抑制的相对敏感性（图 1）。虽然具有升高的Pim2的原代TRAF3 - / - B细胞抵抗这种抑制，但是有充分证据表明肿瘤可以依赖于促进生长和存活的异常升高的蛋白质，这种现象被称为“癌基因成瘾” 42。与这种依赖性一致，与表达较高TRAF3的LP1和OPM2 MM细胞系相比，TRAF3 低 RPMI8226 MM细胞系对Pim2抑制更敏感，且抑制剂浓度较低（图 5c，d））。TRAF3缺陷的OCI-Ly7 BCL细胞在中间抑制剂浓度下比TRAF3 高 BJAB BCL细胞对SGI-1776诱导的死亡更敏感（图 5d）。
c-Myc和Pim2的组合抑制对缺乏TRAF3的B细胞存活的影响增加
抑制c-Myc表达是治疗c-Myc驱动的恶性肿瘤的潜在治疗策略; c-Myc的是在MM最常失调基因43，44。在DLBCL中，5％至14％的肿瘤具有c-Myc重排或基因扩增45。该药物抑制JQ1溴区包含蛋白，因为这些可以促进c-Myc基因的表达，并已示于治疗人类的MM和DLBCL承诺46，47。为了测试靶向Myc是否可以降低TRAF3缺陷B细胞的存活率增加，我们用c-Myc抑制剂JQ1或10058-F4 处理WT或TRAF3 - / - B细胞，后者是c-Myc介导的抑制剂。转录活性48。用任一c-Myc抑制剂的组合治疗增强了Pim抑制剂SGI-1776在TRAF3 - / -小鼠原代B细胞（图6a，b）和TRAF3缺陷型人MM细胞系RPMI8226中的杀伤作用（图 6）。 6c，d）。由于Pim抑制剂的使用受到其在较高剂量41下的心脏毒性作用的限制，这些结果表明Pim2和c-Myc表达的组合靶向可能是有益的，并且允许较低剂量的Pim抑制剂是有效的。
联合抑制c-Myc和Pim2对缺乏TRAF3的B细胞存活的影响。（a，b）TRAF3 - / -每孔1×10 6个 B细胞的脾B细胞用指定的组合处理或用JQ1 10058-F4处理SGI-1776 24小时。（c，d）用指定的SGI-1776与JQ1 10058-F4的组合处理人MM衍生的RPMI8226细胞系（1×10 5细胞/孔）24小时。使用PI排除确定活力，并归一化至DMSO载体对照。图描绘了细胞活力百分比的平均值±SEM（N = 3）。
讨论
据透露，在这之后TRAF3起着稳态生存的克制强大的B细胞特异性作用2，4，它已成为明显的是，这个角色TRAF3使得它的一个重要的肿瘤抑制B细胞恶性肿瘤，特别是MM和BCL 9。因为所有TRAF3缺陷细胞类型的表型的显着成分是NF-κB2途径的组成型激活49通常认为增强的NF-κB2活化是必要的，足以解释TRAF3如何发挥其对B细胞存活的抑制作用。然而，许多后续研究提供证据表明，额外的TRAF3调节的促存活途径，独立于NF-κB2，对TRAF3如何抑制B细胞存活作出重要贡献（综述1,2）。因此，我们已经致力于鉴定这些途径，因为它们的表征不仅增强了对基本TRAF3功能的理解，而且对于选择最有效的B细胞恶性肿瘤疗法具有重要意义。
我们在此呈现的结果显示，B细胞TRAF3的缺失导致组成型活化的促存活激酶Pim2的诱导，并且其下游靶标BAD，p-70S6K，S6和4E-BP1的表达和活化增强（图 7）。 。有趣的是，TRAF3 - / - B细胞的Pim2增加不会随着NIK的丧失而减弱，这表明在这些细胞中，Pim2水平在TRAF3缺陷的B细胞中增强，而与NF-κB2活化无关。我们的结果还进一步说明了TRAF3缺陷可以促成和增强B细胞恶性肿瘤发病机制的多种方式。NF-κB2需要WT B细胞的体内平衡33但是在TRAF3缺陷的B细胞中，可以独立于NF-κB2维持某些致癌程序。这可能潜在地使TRAF3缺陷的B细胞充当肿瘤复发和对增殖靶向化疗的抗性的储库，以及其他致癌突变的积累。
在TRAF3足够和缺乏的B细胞中Pim2调节的模型。在TRAF3足够的细胞中，TRAF3抑制STAT3磷酸化，导致Pim2蛋白减少。在不存在TRAF3的情况下，STAT3磷酸化和Pim2蛋白增加，导致c-Myc蛋白稳定化，并且Pim2靶BAD，p70S6K，4E-BP1和S6的磷酸化增加。
在缺乏NIK（NF-κB2途径的起始激酶）的情况下，TRAF3缺陷的B细胞维持其升高的Pim2表达，因此我们寻求其他上游途径介导由TRAF3缺乏引起的Pim2增加。我们在此观察到TRAF3缺陷型B细胞中STAT3的组成型磷酸化，并显示TRAF3缺陷型B细胞中STAT3表达或功能的抑制降低了Pim2升高。因此，正常B细胞中的TRAF3至少部分地通过抑制STAT3的活化来抑制Pim2表达，并且通过这样做抑制B细胞稳态存活，而与IL-6R的直接结合无关。有趣的是，STAT3在MM患者的骨髓B细胞中经常具有组成型活性50，而TRAF3缺乏被认为是MM肿瘤发生的早期事件51。
在癌基因的功能交替的c-Myc一直被牵连打在BCL和MM的发病机制中起重要作用44。此外，c-Myc的蛋白表达的增加与患者预后较差与DLBCL，独立的其他预后因素相关联45，52。大部分（29％至47％）的DLBCL具有c-Myc的高蛋白表达，有趣的是，它高于c-Myc基因易位的发生率45。这表明在DLBCL的一些病例中，c-Myc蛋白通过诸如翻译后修饰的替代机制而增加，而不是纯粹来自遗传改变。c-Myc具有许多转录靶点，对细胞增殖和生长有广泛的影响。因此有趣的是，由TRAF3缺失介导的Pim2的增加也影响了c-Myc的B细胞水平。与Pim2中mRNA指导的增加不同，c-Myc的这种升高是在蛋白质调节水平上实现的，通过降低TR243缺陷型B细胞中c-Myc的K48连接多聚泛素化，导致更大的c-Myc蛋白。稳定性。本结果首次证明了我们对Pim2介导的B细胞c-Myc在翻译后水平介导的增强的认识。此外，c-Myc具有促凋亡功能45。由Pim2表达增加介导的额外促存活途径，例如抑制促凋亡BAD蛋白的活性，可有助于抵消缺乏TRAF3的B细胞中c-Myc的促细胞凋亡功能，从而使其显着增强的活力。
与缺乏TRAF3的B细胞相比，缺乏TRAF3的T细胞没有增加的生存力，并且尚未报道TRAF3的丢失与T细胞恶性肿瘤相关5。TRAF3 - / - T细胞确实具有构NF-κB2激活，我们和其他人在审查迄今为止所有TRAF3缺失的细胞类型已经看到了功能4，5，15。在这里，我们发现TRAF3 - / - T细胞在Pim2蛋白中有适度的趋势增加。TRAF3 - / - T细胞不具有STAT3表达或活化的增加，表明另一种机制是造成这些T细胞中Pim2增加的原因53。一个可能的解释是TRAF3 - / -与WT小鼠54相比，小鼠具有增加的调节性T细胞（Tregs），并且与常规T细胞相比，Tregs具有增加的Pim2表达，这是由于FoxP3表达增加55。在未来的研究中进一步探索这一途径将是有趣的。
我们的发现总结在TRAF3介导的B细胞中Pim2和c-Myc调节的建议模型中（图 7）。这些结果对于选择最有效的途径抑制剂用于治疗TRAF3缺陷的B细胞恶性肿瘤具有意义，无论是由TRAF3基因的改变还是翻译后蛋白质减少引起的。虽然TRAF3水平与肿瘤来源的B细胞及其原代细胞对应物中的Pim2表达呈负相关，但TRAF3的低表达增加了对人恶性B细胞中Pim抑制的易感性，与对原代B细胞中Pim抑制剂的抗性相反。这与“癌基因成瘾”一致，其中肿瘤可以依赖于促进生长和存活的异常升高的蛋白质42。先前已经用白血病56中的癌基因c-Myc和BCR-ABL证实了癌基因成瘾。TRAF3缺陷肿瘤可能比TRAF3足够的肿瘤更可能依赖于Pim2活性。因此，抑制Pim2可以是选择性靶向TRAF3缺陷型B细胞肿瘤的策略。由于心脏毒性引起的治疗窗口狭窄，Pim抑制剂SGI-1776在I期临床试验中失败19。在这里，我们表明，添加c-Myc抑制剂增强了低剂量SGI-1776介导的TRAF3杀伤- / -B细胞; 在10058-F4的情况下，当两种药物组合时，甚至最低剂量的SGI-1776也有效杀死了70-90％的缺乏TRAF3的B细胞。因此，这两种蛋白质的组合靶向可以在治疗缺乏TRAF3的B细胞恶性肿瘤中具有有益效果。
在小鼠和人B细胞中，TRAF3的缺失导致存活表型增强。MM和BCL 中TRAF3缺失的频繁关联，以及可能影响另一组B细胞恶性肿瘤的TRAF3翻译后丢失的机制，表明这种损失使B细胞易于转化，肿瘤发生，并可能对常规细胞产生耐药性。化疗，因为TRAF3缺乏选择性地增强B细胞存活而不改变增殖4。因此，常规化学疗法的药物，其中许多增强DNA损伤，不会杀死TRAF3缺陷的B细胞，但可能使它们具有额外的转化突变。因此，重要的是要充分了解TRAF3调节B细胞存活的多种方式以及这些途径如何相互作用以最有效地治疗B细胞恶性肿瘤。
材料和方法
老鼠
用Cd19 -Cre（B- Traf3 - / -）小鼠饲养的Traf3 flox / flox小鼠与C57BL / 6背景进行广泛回交，如前所述4。用Cd4 -Cre（B- Traf3 - / -）小鼠繁殖的Traf3flox / flox小鼠和之前广泛回交到C57BL / 6背景上的先前描述14。Map14k - / -（又称聂- / - ）小鼠最初是由罗伯特·施雷伯博士（华盛顿大学，圣路易斯，MO）产生57由David Parker博士（俄勒冈州波特兰市俄勒冈健康科学大学）提供。所有2-4小时的小鼠用于所有实验。将所有小鼠维持在无特定病原体的条件下，并根据爱荷华大学动物护理和使用委员会批准的动物方案，根据国立卫生研究院指南使用。在此处呈现的实验中使用相似数量的雄性和雌性小鼠。
小鼠原代细胞分离和培养
如先前报道的，通过阴性选择纯化脾B细胞4。简而言之，根据制造商的方案，使用磁珠试剂盒（Miltenyi Biotec，Auburn，CA）或小鼠B细胞分离试剂盒（STEMCELL，Vancouver，Canada），通过抗CD43 Ab介导的阴性选择分离B细胞。用小鼠T细胞分离试剂盒（STEMCELL）通过阴性选择纯化小鼠脾脏pan-T细胞。将细胞维持在含有10μM2-β-巯基乙醇（Sigma Aldrich，St.Louis，MO）的RPMI 1640培养基（Life Technologies，Grand Island，NY）中，10％热灭活的FBS（Atlanta Biologicals，Atlanta，GA，美国），2mM L-谷氨酰胺（Life Technologies）和100U / ml青霉素 - 链霉素抗生素（Life Technologies）。这被称为B细胞培养基（BCM10）。
细胞系
将所有细胞系维持在BCM10中。人源MM衍生的细胞系包括OPM2 58，LP1 59和RPMI8226 60。使用的人DLBCL系是BJAB 61和OCI-Ly7 62。小鼠B细胞淋巴瘤系A20.2J 63用于补充材料的实验中。
抗体和试剂
免疫印迹中使用的抗体（Abs）包括抗磷酸化BAD（S112），抗BAD，抗磷酸化p70S6K（T389），抗p70S6K，抗-4E-BP1（T37 / 46），抗-4E-BP1和抗c-Myc，并购自Cell Signaling Technology（Danvers，MA）。抗TRAF3（H122）Ab来自Santa Cruz Biotechnology（Dallas，TX），抗小鼠肌动蛋白Ab来自Sigma（St.Louis，MO）。抗Pim2和抗β-肌动蛋白Abs来自Thermo Fisher（Waltham，MA）。兔抗K48多聚泛蛋白Ab购自Abcam（Cambridge，MA）。HRP缀合的山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔Ig抗体来自Jackson ImmunoResearch Laboratories（West Grove，PA）。Cucurbatacin I购自Santa Cruz Biotechnology。SGI-1776由David Bearss博士（犹他大学，盐湖城，UT）慷慨提供，或从ApexBio（德克萨斯州休斯顿）购买。TP-3654也是Bearss博士的礼物。10058-F4来自Tocris（英国布里斯托尔）。JQ1购自Cayman Chemical（Ann Arbor，MI）。
生存力测定
脾B细胞以0.5-1×10 6 / ml 培养。细胞用DNA染料碘化丙啶（PI）染色，％活细胞用PI阴性群体的％确定，通过荧光检测分析，使用Accuri C6流式细胞仪（BD Bioscience，San Jose，CA）。用FlowJo软件（FlowJo LLC，Ashland，OR）分析数据。
实时PCR（RT-PCR）
用RNeasy提取试剂盒（Qiagen，Gaithersburg，MD）提取来自小鼠原代B细胞的RNA，并使用SuperScript III聚合酶（Invitrogen，Carlsbad，CA）合成cDNA。在ABI PRISM 7900序列检测系统（Applied Biosystems，Grand Island，NY）上进行RT-PCR。引物购自Applied Biosystems（Pim2为Mm00454579_m1，c-Myc为Mm00487804_m1，Pim1为Mm00435712_m1，Pim3为Mm01308047_g1，GAPDH为Mm99999915_g1）。使用比较Ct方法64分析表达数据并标准化为GAPDH表达。
免疫沉淀
用含有无EDTA的Mini Complete蛋白酶抑制剂（Roche）和100ug /的IP Lite裂解缓冲液（0.5％Triton X，40mM Tris，100mM NaCl，1mM CaCl 2）裂解20-30×10 6个细胞/样品。mL DNase I（Roche）。为了测定K48遍在蛋白化，裂解缓冲液补充有20mM N-乙基马来酰亚胺（Sigma）。将裂解物与Ab一起在4℃下与c-Myc一起温育过夜，同时不断搅拌。用蛋白质G Dynabeads（Life Technologies）沉淀免疫复合物，洗涤并重悬于SDS-PAGE上样缓冲液中并加热至95℃10分钟。
用siRNA转染小鼠B细胞
按照先前针对原代T细胞65描述的方案，使用电穿孔转染B细胞。Pim2和STAT3siRNA购自Santa Cruz Biotechnology。5-10×10 6细胞重悬于100微升2S电穿孔缓冲液（5mM的KCl，15毫摩尔MgCl细胞2，15mM的HEPES，150mM的钠2 HPO 4 /的NaH 2 PO 4 pH 7.2的和50mM琥珀酸钠）。加入300pmol siRNA并使用Nucleofector II电穿孔系统（Lonza，Basel，Switzerland）用X-001程序电穿孔细胞。将细胞重悬浮于不含抗生素的20％FBS补充的BCM中，并在48或24小时后通过WB分析。
统计分析
未配对的双尾学生t检验用于评估大多数实验的统计学显着性差异。使用配对的双尾学生t检验来评估成对样本组的统计显着性。韦尔奇校正的非配对t检验是比较不等方差的群体。Mann-Whitney检验用于非正态分布的独立样本。Wilcoxon符号秩检验用于评估非正态分布的配对样本的统计学显着性。统计详情列于每个图的标题中。使用GraphPad Prism（GraphPad Software，San Diego，CA）制备统计分析和图表。（NS =不显着，* p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001，**** p <0.0001）。