CD36配体对视网膜炎症的免疫代谢调节 - ELISA试剂盒,酶免试剂盒,酶联免疫吸附试验, ELISA实验,ELISA,双抗体夹心法,科研蛋白,抗体,细胞系,武汉新启迪生物科技有限公司

摘要

在视网膜下炎症中，活化的单核吞噬细胞（MP）在视网膜病变的进展中起关键作用。关于导致视力损害的光感受器损失所涉及的机制知之甚少。研究由光氧化应激诱导的视网膜损伤，我们观察到分化群36（CD36）缺陷小鼠具有较少的视网膜下MP积聚和减弱光感受器变性。此外，用CD36选择性氮杂肽配体（MPE-001）治疗减少野生型小鼠中视网膜下活化的MP积累并保留光感受器层并通过视网膜电图以CD36依赖性方式评估。氮杂肽通过减少促炎标志物调节视网膜下活化的MP的转录组。在孤立的MP中，MPE-001诱导CD36-Toll样受体2（TLR2）寡聚复合物的解离，降低核因子-κB（NF-κB）和含有3（NLRP3）炎性体激活的NLR家族pyrin结构域。此外，MPE-001引起活化MP中的有氧代谢转变，涉及过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPAR-γ）激活，其反过来减轻炎症。因此，PPAR-γ抑制阻断了MPE-001对由活化的MP引起的光感受器细胞凋亡的细胞保护作用。通过改变活化的MP代谢，MPE-001降低免疫应答以减轻随后的炎症依赖性神经元损伤，其特征在于各种视力威胁的视网膜疾病。降低核因子-κB（NF-κB）和含有3（NLRP3）炎性体激活的NLR家族pyrin结构域。此外，MPE-001引起活化MP中的有氧代谢转变，涉及过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPAR-γ）激活，其反过来减轻炎症。因此，PPAR-γ抑制阻断了MPE-001对由活化的MP引起的光感受器细胞凋亡的细胞保护作用。通过改变活化的MP代谢，MPE-001降低免疫应答以减轻随后的炎症依赖性神经元损伤，其特征在于各种视力威胁的视网膜疾病。降低核因子-κB（NF-κB）和含有3（NLRP3）炎性体激活的NLR家族pyrin结构域。此外，MPE-001引起活化MP中的有氧代谢转变，涉及过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPAR-γ）激活，其反过来减轻炎症。因此，PPAR-γ抑制阻断了MPE-001对由活化的MP引起的光感受器细胞凋亡的细胞保护作用。通过改变活化的MP代谢，MPE-001降低免疫应答以减轻随后的炎症依赖性神经元损伤，其特征在于各种视力威胁的视网膜疾病。PPAR-γ抑制阻断了MPE-001对活化MP引起的光感受器细胞凋亡的细胞保护作用。通过改变活化的MP代谢，MPE-001降低免疫应答以减轻随后的炎症依赖性神经元损伤，其特征在于各种视力威胁的视网膜疾病。PPAR-γ抑制阻断了MPE-001对活化MP引起的光感受器细胞凋亡的细胞保护作用。通过改变活化的MP代谢，MPE-001降低免疫应答以减轻随后的炎症依赖性神经元损伤，其特征在于各种视力威胁的视网膜疾病。

介绍

炎症是退行性视网膜疾病的关键组成部分，与潜在的病理机制无关1。涌入，活化和单核吞噬细胞（MP;包含单核细胞，小胶质细胞和巨噬细胞的积累2）进入视网膜下的空间原因附带组织损伤1，3。随之而来的炎症级联反应是感光细胞的进行性视力威胁的疾病，包括视网膜色素变性，糖尿病性视网膜病和年龄相关性黄斑变性，最终死亡积分4，5。在这种情况下，受损组织产生与损伤相关的分子模式（DAMPS），激活Toll样受体（TLRs）6，7上调和持续释放促炎细胞因子和趋化因子，这些细胞因子和趋化因子繁殖成慢性炎症，导致视网膜色素上皮细胞（RPE）和光感受器 8的退化。

在MP的膜表面上，分化簇36受体（CD36）的簇与TLR2 / 6异二聚体组装体9共表达。各种碎屑，包括氧化的脂质的清除剂8，10，11，CD36已经显示出，以维持由二酰基甘油引发TLR2 / 6信号12，和以调节TLR2依赖性巨噬细胞引起的炎症13。在激活TLR2 / 6-CD36复合物的典型途径后，MyD88募集激活IRAK4，其结合并磷酸化IRAK1。随后形成的IRAK1-TNF受体相关因子6（TRAF6）复合物包含转化生长因子β激活激酶（TAK1）14。TAK1反过来通过IKK复合物磷酸化激活NF-κB，以及丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）P38和c-Jun N-末端激酶（c-JNK），促进各种转录因子的激活，包括AP-1和细胞因子产生14，15。值得注意的是，由我们设计的生长激素释放肽-6（GHRP-6，H-His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-OH）的氮杂肽类似物表现出体外低微摩尔CD36结合亲和力。，具有高选择性，并且通过MP产生抑制一氧化氮与TLR2激动剂成纤维细胞刺激脂肽刺激的（R-FSL-1）16。为了减轻退行性视网膜疾病的治疗发展，现在已经使用药理学和遗传学方法阐明了CD36的作用。在视网膜下炎症的小鼠模型中，CD36氮杂肽调节剂[azaY 4] -GHRP-6（MPE-001）已经过评估，发现它是一种新型治疗原型，具有独特的作用方式，可以减少由相关的光氧化应激引起的光感受器损伤。MPE-001显着降低视网膜下空间的MP浸润和炎性细胞因子谱，并保持光感受器结构的完整性和功能。MPE-001的作用是CD36依赖性的。以前所未有的方式，MPE-001通过减弱炎性体级联来调节MP的炎症特征。由于MP表型受细胞代谢调节17我们测试并发现MPE-001引起M1型MP的代谢途径从糖酵解状态向有利于氧消耗的转变，其反过来改变了含有3（NLRP3）表达的NLR家族pyrin结构域。因此，CD36配体（例如MPE-001）的免疫代谢调节为抑制退行性眼病的慢性炎症提供了有希望的新方法。

结果

MPE-001抑制视网膜下炎症并在体内防止光感受器变性

CD36氮杂肽配体MPE-001对视网膜下的炎症的作用通过视网膜下MP浸润的分析，使用RPE的IBA-1染色从蓝色光激发的C57BL / 6J野生型铺片（WT，CD36调查+ / +）和CD36 - / -小鼠（分别为n = 6和3只小鼠/组）（图 1A，B）。相对于其未照射的对应物，在蓝光攻击的CD36 + / +小鼠中观察到视网膜下IBA-1 +细胞的显着增加（图 1A，C）。与媒介物处理的CD36 + / +小鼠相比，用MPE-001处理的蓝光攻击的CD36 + / +小鼠中，在视网膜下的IBA-1 +细胞积累显着降低了60％（图 1A，C））。MPE-001处理的小鼠中的IBA-1 +细胞积累等于在CD36 - / -小鼠中观察到的值（图 1A-C）。此外，MPE-001在CD36 - / -小鼠中无效，表明由蓝光暴露诱导并由MPE-001减轻的视网膜下炎症是CD36依赖性的。

视网膜下的炎症和光感受器变性之间的关系被很好地建立18，19，20，21。MPE-001对MP浸润到视网膜下空间的抑制作用促使进一步研究氮杂肽CD36配体MPE-001在蓝光攻击小鼠中保持光感受器完整性的能力。胶质纤维酸性蛋白（GFAP）22，23被上调响应于MP激活，并且可被用于索引视网膜变性。GFAP主要在CD36 + / +和CD36 - / -小鼠的视网膜内层中表达（图 1D，E））。WT小鼠的蓝光暴露导致光感受器变性由较薄的外核层（ONL）证实，其功能相应减少由较低的a波和依赖的b波视网膜电图幅度证实，以及整个GFAP表达增加。视网膜（图 1D-M）。施用于蓝光攻击的WT小鼠的MPE-001保留了光感受器ONL厚度，恢复了a-和b-波振幅，并且将GFAP表达降低至与未照射的CD36 + / +小鼠中观察到的值相当的值。因此，蓝光诱导的光感受器损伤涉及CD36。

在CX3C趋化因子受体1（CX3CR1）缺乏与视网膜下MP积累与衰老和相关联的曝光光18，19，20，24，25。使用CX3CR1缺陷小鼠（CX3CR1 - / -）作为视网膜下炎症模型，CX3CR1 gfp / gfp / CD36 + / +暴露于蓝光增加了视网膜下空间IBA-1 +细胞的丰度，降低了ONL厚度用蓝光照射的小鼠CX3CR1 gfp / gfp / CD36 - / -小鼠（n = 3-4只小鼠/组），与蓝光对CD36 + / +和CD36 - / -小鼠的作用平行（图3）。 S1A，B）。用MPE-001 处理暴露于蓝光的未处理的CX3CR1 gfp / gfp / CD36 + / +小鼠显着降低（58％）视网膜下MP和小胶质细胞浸润，减少GFAP表达并保持ONL厚度（图 S1A，B）。相反，蓝光对GFAP表达和ONL变性的影响不受CX3CR1 gfp / gfp / CD36 - / -小鼠MPE-001处理的影响（图 S1B），进一步说明了CD36在有害视网膜炎症和损伤中的作用。，以及MPE-001的药理功效。

MPE-001下调活化的MP的炎症标志物并减少体内的光感受器变性

激光捕获显微切割用于确定在用MPE-001处理的小鼠中与ONL和RPE之间的区域（图2A，绿线描绘的区域）中的炎性标记物的mRNA水平与载体处理的对照小鼠相比（n = 3）。 -4只小鼠/组）。MPE-001处理小鼠的iNOS，IL-12和IBA-1 mRNA表达分别显着降低65％，56％和47％; 而MPE-001增强了抗炎IL-10 mRNA（图 2A）。相应地，与对照小鼠相比，用MPE-001处理的动物的RPE扁平支架分别显示62％和45％的iNOS + / F4 / 80 + - 和IL-12 + / IBA-1 +染色细胞数量减少（图。 2B，C，E）。此外，MPE-001引起CD206的表达增加，CD206是抗炎（M2样）MP的表面标志物（图 2D，E）。与促炎国会议员的降低一致，随后进行的ONL结构（图的保存 1F）26，27 MPE-001防止被视锥段的退化和S-视蛋白（图2的错误定位，。 2F，G）; 它还减少了暴露于蓝光照射的WT小鼠的光感受器中的细胞凋亡（图 2H，I）。

MPE-001 在体外减少TLR2介导的促炎细胞因子和趋化因子释放，并防止光感受器变性

与辅因子蛋白结合的Toll样受体（TLR）在触发炎症反应的先天免疫中起着至关重要的作用28。的CD36，TLR2如/ 6异二聚体的共受体，增强在其激动剂，的存在下，TLR2信号途径，如二酰化脂蛋白LTA和R-FSL1 29，30，31。当通过特异性配体刺激后，TLR2 / 6-CD36复合物触发NFκB和的MAPK（P38和JNK），其引起在MPS中的炎症反应的激活13，29。另一方面，TLR2 / 1异二聚体可以独立于共同受体CD36 29而被激活。在来自CD36 + / +和CD36 - / -小鼠的纯化的系统性MP（腹膜）中研究了CD36在MPE-001对TLR2介导的炎症的减轻作用中的作用，其用IFNγ刺激以诱导促炎表型。的MPE-001到CD36-TLR2信号传导途径的选择性为使用一组选择性TLR的激动剂表现出29，30，31：R-FSL1和LTA为TLR2 / 6 32，33，用于TLR2 pgLPS / 4 34，PAM3CSK4为TLR2 / 1 35和TLR4的LPS 36。在通过TLR激动剂（n = 3-4 /组）刺激4小时后，通过ELISA在WT巨噬细胞的上清液中测定促炎细胞因子和趋化因子。MPE-001减弱了由R-FSL1，LTA和pgLPS诱导的肿瘤坏死因子-α（TNFα），白细胞介素-6（IL-6），CC基序趋化因子配体2（CCL2）和IL-12的分泌增加（图。图3A-d ，表 S1）。来自CD36 - / -小鼠的MP 对TLR2 / 6兴奋剂的反应较弱且对MPE-001无反应（图 3E）。MPE-001对PAM3CSK4和LPS引起的炎症因子分泌无效（图 3A-D）。MPE-001对来自WT小鼠的MP中R-FSL1炎性细胞因子分泌的功效是时间和剂量依赖性的（图 3F-J））。在人单核细胞中也观察到MPE-001对R-FSL-1诱导的细胞因子分泌的类似作用（图 S2A-C）。因此，当其与共同受体CD36结合时，MPE-001降低由TLR2特异性激动剂引发的促炎细胞因子和趋化因子释放。这些数据首次表明MPE-001可通过作用于其共同受体CD36来调节TLR2介导的炎症。

炎症相关的感光损失的部分原因是活化的国会议员（即共表达TLR2和CD36）招募进入视网膜下的空间20，37，38，39。为了离体测试这种机制，我们通过用IFNγ和TLR2激动剂R-FSL1刺激在'幼稚'小鼠骨髓来源的MP（BMDM）中诱导促炎表型。R-FSL1刺激和未刺激的BMDM面对神经视网膜外植体的光感受器层孵育（图 3K））。通过测量每节的TUNEL阳性细胞（n = 3-4 /组）来量化光感受器细胞凋亡的程度。与暴露于未刺激的BMDM的光感受器层相比，暴露于R-FSL1刺激的BMDM的光感受器层显示出显着的细胞凋亡（图 3L），后者通过用MPE-001预处理神经视网膜外植体而被阻断（图 3L）。

MPE-001通过破坏TLR2-CD36相互作用干扰TLR2信号传导

在蓝光暴露的WT小鼠的视网膜下MP上观察到TLR2-CD36的共定位（图 4A，B）。相应地，还以MyD88相关方式在腹膜MP的脂筏中发现了R-FSL1诱导的TLR2-CD36和TLR2 / TLR6的共定位（图 S3D，E）。使用FRET，我们进一步探索了MPE-001对CD36 / TLR2相互作用的影响。在全身（腹膜）（图 4C）和RAW MP（图 S3A），TLR2和CD36分别用荧光供体Cy3和受体Cy5标记。通过测量光漂白后的能量转移来研究MPE-001的作用（n = 3-4个独立实验）。（荧光）能量转移效率的增加表明在用R-FSL1刺激后全身和RAW MPS的膜上CD36和TLR2之间的快速关联（白色箭头）。在两种类型的MP中，MPE-001减弱了R-FSL1诱导的Cy3和Cy5之间的能量转移效率（图 4D和S3B），表明CD36和TLR2之间的物理相互作用被破坏。MPE-001改变的CD36 / TLR2相互作用干扰下游信号传导，使用蛋白质印迹降低IRAK4，IKKαβ，P65 NF-κB，JNK和p38的磷酸化作用。 4E和S3C）。MPE-001对关键转录因子P65 NF-κB的作用已经通过基于定量ELISA的测定验证（图 4F）（n = 3 /组）。然而，MPE-001对用R-FSL1刺激的CD36 - / - MP的下游信号传导没有影响（图 4E，F和S3C）。CD36依赖性吞噬作用也不受MPE-001的影响（图 S4）。

MPE-001降低NLRP3炎性体

据报道，CD36配体的细胞内成核会引发炎性体激活40。我们接下来研究了MPE-001减轻炎症小体途径的CD36依赖性TLR2 / 6刺激的能力。在IFNγ引发的腹膜巨噬细胞中，用R-FSL1（n = 3-4 /组）刺激TLR2 / 6时诱导的IL-1β分泌与NLRP3，pro-caspase1和caspase1的表达增加相关，所有这些都被减弱通过MPE-001（图 5A-F，表 S2），强调IL-1β的关键光感受器细胞毒性作用如报道41。在用R-FSL1刺激的和未刺激的BMDM（n = 3 /组）的条件培养基温育的视网膜外植体上再次研究炎性体产生的IL-1β在诱导光感受器细胞毒性中的作用（图 5G）。来自这些R-FSL1刺激的MP的条件培养基诱导感光细胞层中凋亡细胞数量的增加，其被抗IL-1β抗体以及MPE-001减弱（图 5G，H）。

在暴露于蓝光（n = 3 /组）的WT小鼠体内进一步研究CD36调节剂MPE-001对NLRP3-炎性体的作用。MPE-001抑制蓝光诱导的NLRP3，裂解的caspase-1和pro-IL-1β的表达增加（图 5I-M）。共聚焦显微镜分析表明在视觉组织中亚视网膜F4 / 80 + MP，半胱天冬酶-1和IL-1β的共定位（图 5N，Suppl。图 S5）。MP激活物通过MPE-001（图衰减 5N），以其另一抗炎作用是一致的（图 1 - 3）。

MPE-001的有氧代谢转变有助于减弱促炎性MP激活

为了确定MPE-001的抗炎CD36依赖性作用机制是否影响MP极化，使用未分化和分化的BMDM（n = 3-5 /组）进行实验。BMDM被极化为经典激活的促炎（M1分化的BMDM）和抗炎M2表型42。MPE-001不改变M0和M1分化的BMDM中M1标记CD86的表达，也不改变相同细胞类型中M2标记FIZZ1的表达（图 6A）; 使用腹膜MP进行类似的观察（图 S5A）。另一方面，促炎因子，特别是iNOS，TNFα，CCL-2和IL-12，在M1样分化的BMDM中被MPE-001减弱（图 6A，F）），与小鼠腹腔巨噬细胞（图3A-D）和人单核细胞（图 S2）中的观察结果一致。考虑到MPE-001减少了促炎因子的表达并改变了一些MP极化标记物（如CD206）的表达（图 2D，E），我们通过改变其他过程如新陈代谢来询问CD36是否会影响MP活性。值得注意的是，CD36可以抑制MP迁移43，44通过诱导过氧化物酶体增殖物激活受体γ的表达/活化（PPAR-γ），和相关的炎症应答45，46，这又增强了β氧化47。用MPE-001治疗引起M1分化的BMDM（但不是M0，也不是M2分化的BMDM）显示PPAR-γ，肝X受体-α（LxRα），过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1-α 的总体增加。（PGC-1α），信号转导和转录激活因子-6（STAT-6），CCAAT-增强子结合蛋白β（C /EBPβ）和环氧合酶-2（COX-2）基因表达（图 6B，基因阵列）如图 S5D所示）。PPAR-γ/ PGC-1α的诱导，线粒体生物发生和功能的主要调节因子，表明MPE-001可以促进MP中的氧化代谢。为了进一步了解MPE-001诱导的代谢变化，我们研究了从不同MP亚型中提取的GC-MS 29代谢物。代谢物的热图分析揭示了在用MPE-001处理后M1和M2亚型之间的强烈差异以及从M1到M0样亚型的强烈转变（图 6C）。实际上，使用两个主要成分的无监督PCA分析显示，除了用MPE-001处理的对照M0和M0之外，每个MP亚型形成明显不同且不重叠的组（n = 3 /组）。尽管氮杂肽MPE-001对M0-亚型MPs代谢没有影响（图 6D），MPE-001深刻影响M1亚型MP的代谢物谱，因为这些细胞表现出与（未处理的）M1亚型和M2亚型MP不同的模式，表明MPE-001处理导致M1亚型MP转向类似M0的亚型，与生物能量代谢的变化一致，如线粒体呼吸的变化所反映的（图 6E）。用MPE-001处理M1分化的BMDM导致糖酵解减少，表现为乳酸和磷酸二羟丙酮（DHAP）浓度明显减少（n = 3 /组）（图 6D））。通过生物能量测定进一步验证了这一发现，表明MPE-001处理M1分化的BMDM诱导了OCR / ECAR比率的显着增加，这是线粒体氧消耗率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）的指标（图 6E）），表明糖酵解减少和线粒体氧化磷酸化增加（n = 3-5 /组）。实际上，与未处理的强烈解偶联的M1亚型MP相比，用MPE-001处理的M1亚型MP几乎使呼吸增加一倍以支持ATP合成（图 6E））。再次，我们在腹膜MP中证实了这些观察结果，因为MPE-001增加了PPAR-γ，PGC-1α和氧化磷酸化酶的表达，表明其对M1分化的BMDM中ATP产生的生物能量重编程的影响（图 S5B，C））。已于MP生物能执行使用选择性抑制剂GW9662 PPAR-γ的抑制来评估PPAR-γ/ PGC-1α的MPE-001调制的关键作用（连同LXRα）47，以及对炎症轮廓45，46。PPAR-γ抑制消除了MPE-001诱导的M1分化BMDM中OCR / ECAR比率的增加（图 6E））并阻断相应的抗炎作用，包括MPE-001抑制NLRP3表达（n = 3-4 /组）（图 6F，G）。PPAR-γ抑制的组合作用抵消了MPE-001对光感受器（n = 3 /组）的抗细胞凋亡活性（图 6H）。总的来说，研究结果表明，氮杂肽MPE-001对CD36的调节引起TLR2介导的炎症的干扰，并改变MP代谢，后者反过来调节常见NLRP3途径的活性。

老年受试者的炎性视网膜疾病中的视网膜下MP显示出与光诱导的小鼠炎症中观察到的相似的CD36和TLR2表达谱。

来自健康老年人捐献者和患有年龄相关性视网膜炎症的患者的人视网膜用IBA-1染色。在RPE扁平支架中检查它们的视网膜下骨髓细胞（用罗丹明鬼笔环肽反染色，图 S6B，C），并与来自蓝光照射的小鼠的视网膜进行比较（图 S6A）。在患有炎性眼病的老年人供体的视网膜中发现的免疫细胞积累与在暴露于蓝光照射的小鼠中观察到的相当（图 S6A，C）。RPE扁平支架在所有视网膜下IBA-1 + MP中显示CD36（图 S6D）和TLR2（图 S6E）的表达。RPE的萎缩与IBA-1 +的积累相关MPs（图 S6C放大）与来自没有视网膜下炎症的老年供体的RPE细胞的规则形状形成对比（图 S6B放大）。

讨论

炎症过程在各种视网膜疾病的发病机制中发挥关键作用48。虽然补体系统的调节已经引起了对退行性视网膜疾病（例如年龄相关性黄斑变性）的治疗的显着的当代关注49，但是由MP驱动的抑制慢性炎症的替代策略值得进一步研究以解决组织损伤的潜在原因。神经细胞死亡，例如光感受器和视网膜神经节细胞所见，通常是通过TLR模式识别和细胞内信号传导激活MP来刺激编码促炎细胞因子的基因9的结果。。已经假定TLR2促炎功能由于炎症和氧化应激而促成RPE凋亡8。考虑到它们在退行性视网膜疾病病理学中的重要作用，TLR信号通路已成为减轻MP驱动的炎症的有希望的靶标; 然而，直接TLR抑制和拮抗作用具有迄今已在临床有限的成功设置50，51。或者，与TLR结合并调节其活性的辅因子蛋白代表了破坏其信号传导的未探索手段。研究CD36的调节剂，我们已经鉴定了结合该辅因子蛋白并因此干扰TLR2信号传导的氮杂肽配体MPE-001。在这里，我们提供了MPE-001的作用模式的机制见解。结合CD36的疏水区域后52，53MPE-001破坏MP36细胞膜上CD36和TLR2 / 6异二聚体之间的相互作用，随后通过减弱相关的光氧化应激触发的促炎级联来扰乱下游信号传导。同时，MPE-001通过PPAR-γ诱导增强MP的代谢率，这反过来通过与TLR2途径的共同NLRP3连接有助于抑制炎症。消除炎症可保持光感受器的完整性（见图7中的示意图）。

B类清道夫受体CD36首先被鉴定为参与能量代谢的脂肪酸转运蛋白54，并且后来涉及TLR依赖性炎症反应和在MP 40中以炎性体激活为特征的无菌炎症。现已显示选择性氮杂肽CD36配体MPE-001调节MP中TLR2 / 6异二聚体和下游信号传导的激活，导致促炎细胞因子和趋化因子释放减少，并减少MPs的流入，激活和积累。视网膜下腔，通常缺乏免疫细胞24。MPE-001治疗的后果包括导致RPE和光感受器层退化的炎症减弱55，如在体内蓝光暴露的小鼠中所证明的。MP3-001的功效在CX3CR1缺陷的鼠模型中得到进一步证实，其中CX3CR1的缺失加速了组织损伤和视网膜变性，这是由于暴露于光氧化损伤后视网膜中单核吞噬细胞的存在增加20。通过减少促炎细胞因子水平和单核吞噬细胞募集，MPE-001表现出细胞保护作用，防止感光体的损失，和暴露于模拟慢性炎症光氧化应激条件后保留显著视网膜功能56。此外，MPE-001调节炎性体的细胞质成分的组装并降低视网膜下MP中的IL-1β释放。尽管已显示CD36作为非调理性吞噬受体57起作用，并且在MPs 58中与TLR4在细菌内吞作用和吞噬作用中配合，但MPE-001选择性地干扰TLR2刺激而不改变MP吞噬功能。MPE-001保留先天免疫应答的方式提示CD36与TLR2相互作用的选择性偏向变构调节; 这些组合的观察结果在来自不同来源的MP中是一致的，包括在人单核细胞中。

CD36-TLR2相互作用在介导炎症和随后的神经毒性中的作用为治疗干预提供了新的靶标。原型MPE-001破坏了用荧光探针标记的CD36和TLR2蛋白之间的结合，如通过观察到与TLR2激动剂R-FSL-1结合时引起的能量转移的减少所证明的。因此，正常TLR2信号通路是由MPE-001中断通过TLR2的各种下行信号的减少的磷酸化所证明59，60。

细胞特异性应答可以由CD36介导，其与多个配体和结合配偶体相互作用：例如，TLR异二聚体，β1和β2整联蛋白61，以及四跨膜蛋白62，以激活NF-κB，NLRP3，Src / Lyn / Fyn，MAPK和TGFβ。信号通路。在多个CD36脂质相关的配体，分别示出氧化磷脂促进TLR4 / 6依赖的先天免疫反应的活化63，64。氧化低密度脂蛋白的结合与炎性细胞因子表达的上调和炎性体刺激有关，可触发促IL-1β和NLRP3激活40。在与CD36结合后，MPE-001通过配体如二酰基肽激动剂R-FSL1对TLR2 / 6-CD36复合物活化的调节作用降低IL-1β释放。MPE-001对TLR2依赖性炎症过程和无菌炎症的调节作用均通过NLRP3激活介导。作为TLR2的共同受体，CD36激活AP-1并触发促炎细胞因子的基因转录，主要通过激活c-Jun N末端激酶（JNK）和P38 58。我们的结果表明，氮杂肽MPE-001通过降低激活的MP中JNK和P38的磷酸化来降低AP-1活化。

视网膜下空间和许多其他组织中的MP被表征为驻留和入侵病理引发的炎症类型。类似于其中已表征Th1和Th2细胞的适应性免疫系统，MP还基于其细胞因子产生进行细分42。由DAMP激活的MP是促炎，抗血管生成和潜在的神经毒性。由抗炎细胞因子（例如IL-4）刺激的那些显示出促血管生成特性，促进吞噬作用并且是抗炎的。然而，表型MP的频谱比传统具体标记M1更广泛和M2亚型65，66。的MPs炎症轮廓也受代谢率，使得抑制糖酵解或氧化磷酸化变造分别M1或M2活化67，68。CD36影响代谢途径。CD36调节剂增强氧化LDL的流入，并分别通过ABCA1 / G1转运蛋白通过PPAR-γ依赖性过程流出胆固醇69。PPAR-γ抑制（拮抗）增强糖酵解代谢途径70，71，刺激氧化磷酸化72，并同时增强抗炎细胞因子减少过多CD36诱导的促炎性行动73。我们的体外和体外研究结果体内同意这些概念，揭示CD36氮杂肽配体通过影响TLR2-炎性体途径发挥抗炎作用，并通过影响PPAR-γ途径改变代谢率以增加氧消耗。因此，MPE-001通过抑制CD36向某些途径（特别是NF-κB-炎性体）的信号传导和激活其他途径（特别是PPAR-γ-PGC1α）起作用，这与我们报道的其他CD36配体的偏向信号传导作用一致16，69。

MPE-001在减少炎症和IL-1β释放中的作用可能超过MP 74，并延伸至表达CD36和炎性体组分的其他细胞，例如RPE和脉络膜内皮75。值得注意的是，在人RPE变性的晚期，NLRP3-炎性体激活和IL-1β水平升高与氧化应激相关，氧化应激导致脂质过氧化终产物如4-羟基壬烯醛和羧乙基吡咯75。考虑到IL-1β释放引起视网膜下视网膜积聚，导致视网膜锥形变性导致视力恢复21，MPE-001降低IL-1β释放的可能性可用于预防地理萎缩中视锥细胞的丢失21与本文所作的观察一致。此外，体内 MPE-001治疗后视网膜下MPs中促炎性诱导型一氧化氮合酶和IL-12表达的下调也伴随着抗炎IL-10表达的增加，这可能进一步抑制NLRP3的表达，炎性体组装和caspase-8激活76。

总之，我们首次表明MPE-001（CD36的选择性氮杂肽配体）可以特异性调节CD36-TLR2相互作用和PPAR-γ/ PGC-1α的诱导。因此，MPE-001减轻炎症和随后的神经毒性，这是在退行性视网膜外和视网膜下疾病中经常观察到的后果。考虑到视网膜下炎症伴有活化MP的积聚在老年人患者的视网膜中普遍存在，并且在受到光氧化应激的小鼠中反映，调节剂如MPE-001提供了作为治疗靶向CD36受体以减轻慢性MP的新型原型。威胁视力的疾病中的驱动性炎症，例如色素性视网膜炎，糖尿病性视网膜病和年龄相关性黄斑变性。

材料和方法

抗体和试剂

针对磷酸-P65（3033），磷酸-JNK（4668），磷酸-P38（9211），磷酸-IRAK4（11927），磷酸-IKKαβ（2697），总JNK（9252），P38（9212），总IRAK4的抗体（4363），总IKKβ（2678），TLR2（13744），TLR6（12717）和MyD88（4283）购自Cell Signaling Technology（Danvers，MA，USA）。针对总P65（sc-8008）的抗体来自Santa Cruz Biotechnology（Dallas，TX，USA）。针对APC / Cy7抗小鼠F4 / 80（123117）和PerCP / Cy5.5抗小鼠CD80（104721）的抗体购自Biolegend（San Diego，CA，USA）。针对CD36的抗体（NB400-145）来自Novus Biologicals（Littleton，CO，USA）。针对Flottilin1（ab41927），IL-1β（ab9722），CD36（ab800080），CD36（ab125116），F4 / 80（ab6640），总OXPHOS啮齿动物鸡尾酒（ab110413），PGC-1α（ab54481）和PPAR-γ的抗体（ ab209350）来自Abcam（英国剑桥）。针对TLR2的抗体（mab-mtlr2）来自Invivogen（San Diego，CA，USA）。针对TLR2的抗体（orb191498）来自Biorbyt（Cambridge，United Kingdom）。针对IBA-1（019-19741）的抗体来自Wako（Neuss，Germany）。针对PE-IL-12（C17.8）的抗体来自eBiosciences（San Diego，CA）。抗GFAP（Z0334）来自Dako Agilent（Santa Clara，CA，USA）。罗丹明鬼笔环肽（00027）来自Biotium（Scarborough，Ontario，Canada）。荧光素花生凝集素（PNA）（FL-1071）来自Vector Laboratories（Burlingame，CA，USA）。来自Millipore Sigma（Oakville，ON，CA）的针对Opsin-blue（AB5047）的抗体。AlexaFluor 488-，594-缀合的第二抗体来自Invitrogen（Carlsbad，CA，USA）。AlexaFluor 647-缀合的二抗来自New England Biolabs（Ipswich，CA，USA）。4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）和GW9662（M6191）来自Sigma-Aldrich（Saint-Louis，MO，USA）。针对iNOS（PA3-030A）和West Femto化学发光底物（PI-34095）的抗体来自Thermo Scientific（Waltham，MA）。辣根过氧化物酶（HRP） - 缀合的第二山羊抗兔IgG来自Jackson Immunoresearch，West Grove，PA，USA）。rmIFNγ（575306），rmM-CSF（576406），APC / Cy7抗小鼠F4 / 80（123117），Brilliant Violet 421抗小鼠IA / IE（107631），PE / Cy5抗小鼠CD86（105015），PE抗小鼠CD206（141705）和TruStain fcX（抗小鼠CD16 / 32）（101319）来自Biolegend（San Diego，CA，USA）。能量供体Cy3（ab188287）和能量受体Cy5（ab188288）来自Abcam（Cambridge，United Kingdom）。成纤维细胞刺激性脂肽（R-FSL-1）来自EMC microcollections GmbH（Tübingen，Germany）。来自金黄色葡萄球菌，Pam3CysSerLys4（Pam3Csk4）和牙龈卟啉单胞菌（pgLPS）的脂磷壁酸（LTA）来自Invivogen。脂多糖（LPS）来自E.Coli（0111：B4）和ATP（FLAAS-1VL）来自Sigma-Aldrich（Oakville，ON，Canada）。单核细胞分离试剂盒（130-100-629）来自Miltenyi Biotec（Auburn，CA，USA）。针对TNFα（88-7324），IL-6（88-7391），CCL2（88-7391），IL-12（88-7121）和IL-1β（88-7013）的ELISA试剂盒来自eBiosciences（San Diego， CA，USA）。针对NFκBp65/ RelA（85-86083）的总/磷酸化InstantOne TM ELISA来自eBiosciences（San Diego，CA，USA）。蛋白酶和磷酸酶抑制剂（PI88666，PI88667）和二辛可宁酸蛋白质测定（PI23223，PI23224）的鸡尾酒片剂来自Pierce Biotechnology（Waltham，MA，USA）。鼠IL-4（214-14）和IL-13（210-13）来自Peprotech Inc.（Rocky Hill，NJ，USA）。

人的眼睛

老年人（77岁和79岁）的眼睛来自加拿大眼库。人体临床方案和知情同意书由CHU Sainte-Justine伦理委员会批准，并遵守赫尔辛基宣言的原则。用4％多聚甲醛（PFA）将眼睛固定4小时，并在含有Hank's平衡盐溶液HBSS（Invitrogen）的培养皿中解剖。取出眼睛后部（角膜，晶状体），将前部切成5片，准备平放。

动物

C57B1 / 6J背景上的Cx3cr1 GFP / GFP和CD36 - / - Cx3cr1 GFP / GFP小鼠品系是Florian Sennlaub博士（Institut de la vision，INSERM，Paris，France）的慷慨馈赠77。如前所述78产生CD36 - / -小鼠及其同窝仔（CD36 + / +）对照。除非另有说明，否则将小鼠圈养并在12小时：12小时光照/黑暗循环下保持在局部动物设施中。

蓝光照明模型

将3至4个月大的小鼠暴露于蓝色LED灯（Yescom USA，Inc。）5天，照度为6000勒克斯，而没有先前的暗适应。对于瞳孔扩张，每天将2％的眼用阿托品溶液（Alcon）施用于双眼。sc给予MPE-001（289nmol / kg）。在连续7天蓝光照射后24小时。在蓝光曝光期结束时，将小鼠维持12:12小时光照：黑暗循环3天，然后处死。

小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养

通过使用10mL Dulbecco's改良Eagle培养基（DMEM）细胞培养基洗涤12周龄C57BL / 6J和CD36 - / -雄性小鼠的腹膜腔来收获未刺激的腹膜巨噬细胞。根据制造商的说明，使用单核细胞分离试剂盒（Miltenyi，130-100-629）通过耗尽非靶细胞纯化腹膜巨噬细胞。流式细胞术分析表明细胞群含有98％以上的F4 / 80 + CD80 +细胞。将纯化的腹膜巨噬细胞接种于含有10％胎牛血清（FBS）和20ng / mL干扰素γ（IFNγ）的DMEM中，37℃，5％CO 2中丰富的气氛。48小时后，用PBS洗涤细胞两次以除去IFNγ和FBS。然后通过在刺激之前与含有0.2％牛血清白蛋白（BSA）的DMEM孵育2小时，将腹膜巨噬细胞断开FBS。

骨髓来源的MPs（BMDM）

从8-12周龄C57BL / 6小鼠的股骨和胫骨中分离BMDM。将骨头切成两半并放入0.6mL穿孔的微量离心管中。将试管放入含有200μlDMEM的2mL微量离心管中，并以6000g离心2分钟。将骨髓悬浮于DMEM / 10％FBS中，并在巨噬细胞集落刺激因子（mrM-CSF; 40ng / mL）存在下培养细胞7天并培养7天。流式细胞术分析表明细胞群含有98％以上的F4 / 80 + CD80 +细胞。然后用IL-4和IL-13（20ng / mL）刺激BMDM 48小时用于M2分化，或用R-FSL1（300ng / mL）和IFNγ（20ng / mL）刺激M1分化。M0（未刺激的细胞），M1或M2 BMDM用10 -7处理或不处理24小时 M MPE-001和/或10 -6 M PPAR-γ抑制剂（GW9662）。

通过ELISA，细胞因子和细胞内信号分子活化测定

将从WT或CD36 - / -小鼠纯化的腹膜巨噬细胞（2.5×10 5）接种在48孔板上。腹膜巨噬细胞暴露于氮杂肽MPE-001（10 -8，10 -7，10 -6M）或载体0或2小时，然后用300 ng / mL R-FSL1,1μg/ mL LTA（TLR2 / 6选择性激动剂），100 ng / mL Pam3Csk4（TLR2 / 1选择性激动剂）刺激，1μg / mL pgLPS（TLR2 / 4选择性激动剂）和100ng / mL LPS（TLR4 / 6选择性激动剂）。在2,4或24小时后除去细胞上清液。用Ready-SET-GO ELISA试剂盒（eBiosciences）测定细胞上清液中的TNFα，IL-6，CCL2和IL-12水平。根据制造商的说明，一式三份测量所有样品。使用InstantOne TM ELISA（eBiosciences）分别在用R-FSL1刺激10,30或360分钟后，在细胞裂解物上记录NFκBp65/ RelA，JNK1 / 2和p38MAPK的信号分子磷酸化。根据制造商的说明，一式三份测量所有样品。

蛋白质印迹

对于体外分析，从腹膜巨噬细胞（3×10 6）中提取蛋白质，接种于6孔板中，用氮杂肽MPE-001（10 -7 M）或载体处理，并用300 ng / mL R-FSL1刺激。 5,30或360分钟。用于体内分析从暴露于或未暴露于蓝光的小鼠的RPE /脉络膜中提取蛋白质，并用或不用MPE-001处理。用PBS洗涤细胞和组织，然后在冰冷的放射免疫沉淀测定（RIPA）缓冲液（150mM NaCl，50mM Tris-HCl，1％Triton X-100,0.2％SDS，50mM NaF，2mM）中裂解30分钟。 EDTA，pH = 7.4）含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂（Pierce Biotechnology）。将细胞和组织裂解物在4℃下以10,000g离心30分钟。通过BCA测定（Pierce Biotechnology）测定上清液的蛋白质浓度。将等量（30μg）蛋白质提取物与Laemmli缓冲液混合，在95℃加热5分钟，在7.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）上分离并电泳转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（Bio- Rad Laboratories）用于免疫印迹。将膜在室温下在含有5％BSA的150mM NaCl和10mM Tris-HCl，0.05％Tween 20，pH 7.6（Tris缓冲盐水吐温20，TBST）中温育1小时，并在TBST中短暂洗涤，然后孵育过夜。在4°C时与一抗（P65，磷酸-P65，JNK1 / 2，磷-JNK1 / 2，P38，磷酸-P38，IRAK4，磷酸-IRAK4，IKKαβ，磷酸-IKKαβ，NLRP3，Caspase-1，IL- 1β或pro-IL-1β均以1：500vol：vol）使用。针对P65，JNK1 / 2，P38和β-肌动蛋白的抗体用作内部对照。洗涤步骤后，将印迹在室温下与以1：5000vol：vol（Jackson Immunoresearch）稀释的HRP缀合的第二抗体温育1小时。使用ChemiDoc MP成像系统（Bio-Rad Laboratories），通过使用West Femto化学发光底物（Thermo Scientific）的增强化学发光（ECL）检测免疫印迹条带。使用ImageLab 5.2软件（Bio-Rad Laboratories）进行图像分析。

CD36-TLR2在脂筏中的共定位

将腹膜巨噬细胞（10 7）置于培养皿中（10mm 2用TLR2激动剂（R-FSL1,300ng / ml）或载体刺激5分钟。将细胞在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂（Pierce Biotechnology）的1mL RIPA缓冲液（150mM NaCl，50mM Tris-HCl，1％Triton X-100,50mM NaF，2mM EDTA，pH7.4）中裂解1小时。在冰上。将细胞裂解物与等量的5％蔗糖在RIPA中混合，并置于离心管的底部，然后进行蔗糖密度梯度。将样品用1ml 40％，1mL 30％，2mL 25％，2mL 20％，2mL 15％和2mL 10％蔗糖覆盖在RIPA中，然后以100,000g离心16分钟。 h在4°C。从梯度的顶部温和地除去级分（1mL），并进行离心过滤Microcon（Millipore，MRCPRT010），膜标称分子量限度（NMWL）为10kDa，用于蛋白质浓缩和脱盐。向每个级分中加入N-辛基葡糖苷（25mM）以溶解脂筏，并通过SDS-PAGE分析每个级分的等同部分，并使用一抗进行免疫印迹：抗CD36（NB400-145），抗TLR2，抗MyD88。，抗Flottilin1或抗TLR6，均以1：500 vol：vol使用。在洗涤步骤后，将印迹在室温下与HRP缀合的第二抗体（1：5000vol：vol，Jackson Immunoresearch）一起温育1小时。如上所述，通过ECL检测条带。将印迹在室温下与HRP缀合的第二抗体（1：5000vol：vol，Jackson Immunoresearch）一起温育1小时。如上所述，通过ECL检测条带。将印迹在室温下与HRP缀合的第二抗体（1：5000vol：vol，Jackson Immunoresearch）一起温育1小时。如上所述，通过ECL检测条带。

IL-1β和NLRP3蛋白质测定

将腹膜巨噬细胞（1.5×10 6）接种在12孔板中的DMEM / 10％FBS中过夜。用含有0.2％BSA的DMEM将细胞从FBS断奶2小时，然后用MPE-001（10 -7 M）或载体处理，并用300ng / mL R-FSL1刺激4小时。在刺激结束前30分钟，向细胞中加入10μMATP以刺激IL-1β分泌。回收上清液，通过ELISA（eBiosciences，88-7013）测量IL-1β的量。通过蛋白质印迹分析在细胞裂解物上评估NLRP3，pro-Caspase-1，Caspase-1和pro-IL-1β蛋白质水平。

荧光共振能量转移（FRET）

将腹膜巨噬细胞（10 6）或鼠RAW 264.7 MP（4×10 5）在含有10％FBS的DMEM中在圆形15mm盖玻片上接种过夜。用含有0.2％BSA的DMEM将细胞从FBS断奶2小时。用MPE-001处理细胞（10-7M）并用TLR2激动剂R-FSL1（300ng / mL）刺激5分钟。根据制造商的说明，将TLR2（Biorbyt，orb191498）和CD36（Abcam，ab800080）抗体分别与能量供体Cy3（ab188287）和能量受体Cy5（ab188288）染料偶联，然后以1：1的混合物加入到固定细胞中。供体/受体标记的抗体。孵育期后，用PBS洗涤细胞3次，并使用抗褪色试剂（Molecular Probes＃P36941）固定在显微镜载玻片上。使用共聚焦显微镜LSM-700（Zeiss，Oberkochen，Germany）和受体光漂白法评估FRET效率。

视网膜组织制备和免疫荧光染色

将人和小鼠眼睛固定在4％PFA中并使用30％蔗糖冷冻保护。将它们包埋在最佳切割温度（OCT）化合物（Leica，Wetzlar，Germany）中，在液氮中冷冻，并储存在-80℃。在低温恒温器（Leica CM 3050 S）中切割冷冻切片（10μm厚）并将其固定在明胶包被的载玻片上用于免疫荧光分析。对于扁平安装，将人眼和小鼠眼睛在室温下在4％PFA中固定15分钟并在角膜缘切开; 前段被丢弃。收集由神经视网膜/ RPE /脉络膜/巩膜复合体组成的后眼杯，并小心地从RPE /脉络膜/巩膜上分离神经视网膜以分别制备用于实验。

对于免疫荧光，用含有0.1％Triton x100和10％FBS或5％BSA（封闭缓冲液）的PBS溶液处理中央视网膜切片，神经视网膜和RPE /脉络膜扁平支架45分钟。将样本在4℃下与在封闭缓冲液中稀释的一抗孵育过夜。使用多克隆兔抗CD36（Novus Biologicals，NB400-145），单克隆小鼠抗CD36（Abcam，ab125116），单克隆小鼠抗TLR2（Invivogen，mab-mtlr2），多克隆兔抗TLR2（Biobyt， orb191498），多克隆兔抗IBA-1，单克隆大鼠抗F4 / 80（Abcam，ab6640），多克隆兔抗iNOS，大鼠抗小鼠IL-12 PE，多克隆兔抗GFAP，多克隆兔抗Opsin - 蓝色抗体。RPE细胞用罗丹明鬼笔环肽（Biotium，00027）和锥形光感受器用荧光素花生凝集素染色。使用相应的第二抗体：AlexaFluor 488-，594-缀合的抗体和647-缀合的抗体来显示第一抗体，并且用DAPI对切片进行复染色。视网膜切片分析仅在视网膜中央进行，排除周边视网膜。使用共聚焦显微镜（Olympus FluoView 1000，Richmond Hill，ON，Canada）分析中央视网膜切片和扁平支架。将所有免疫染色重复至少三次，并且省略一抗的染色用作阴性对照。并用DAPI复染切片。视网膜切片分析仅在视网膜中央进行，排除周边视网膜。使用共聚焦显微镜（Olympus FluoView 1000，Richmond Hill，ON，Canada）分析中央视网膜切片和扁平支架。将所有免疫染色重复至少三次，并且省略一抗的染色用作阴性对照。并用DAPI复染切片。视网膜切片分析仅在视网膜中央进行，排除周边视网膜。使用共聚焦显微镜（Olympus FluoView 1000，Richmond Hill，ON，Canada）分析中央视网膜切片和扁平支架。将所有免疫染色重复至少三次，并且省略一抗的染色用作阴性对照。

MP和视网膜外植体孵育

在有或没有MPE-001（10 -7 M）的情况下，BMDM分别用300ng / mL R-FSL1和20ng /mLIFNγ未处理或共刺激24小时。研究PPAR-γ在MPE-001对活化MP诱导的光感受器细胞凋亡中的作用，PPAR-γ抑制剂（10 -6）将M）（GW9662）加入用MPE-001处理24小时的BMDM中。除去培养基，用新鲜的DMEM / 10％FBS培养BMDM 24小时，并将上清液用作条件培养基（CM）。从12-16周龄的C57BL / 6J小鼠眼睛产生神经视网膜外植体。小心地将神经视网膜从RPE /脉络膜/巩膜上分离，与CM一起孵育18小时，或者在如上一节所述制备的BMDM的DMEM中孵育。为了揭示在CM诱导的光感受器细胞凋亡中释放的IL-1β的作用，将CM与150ng / mL的抗IL-1β中和抗体（Abcam，9722）在室温下孵育或不孵育15分钟。刺激18小时后，小心地移除外植体，并使用末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）测定进行凋亡细胞的检测。

在视网膜下空间中定量激活的MP

在来自对照和照射的小鼠的平坦支架上计数IBA-1染色的RPE细胞，每天注射0.9％NaCl或MPE-001（289nmol / kg）。细胞数表示为每mm 2的IBA-1阳性细胞的平均数。

光感受器层厚度的定量

每只眼睛至少三个中央视网膜冷冻切片（具有视神经）用于测量感光体层的厚度。每个中央视网膜切片进行12次测量，在视神经的确定距离处进行。使用ImageJ软件（http://imagej.nih.gov/）进行层厚度分析。使用统计分析程序（Prism软件版本5.01; GraphPad软件）整合曲线下面积。

激光捕获显微切割

将眼摘出并立即包埋在OCT化合物中并在液氮中快速冷冻。在MembraneSlide 1.0 PEN无核酸酶载玻片（Zeiss）上分析矢状切片（20μm）。用Zeiss Palm Microbeam激光显微镜系统Observer Z1（Zeiss，Oberkochen，Germany）激光显微切割中央视网膜切片。视网膜切片分析仅在视网膜中央进行，排除周边视网膜。将分离的视网膜mRNA转录成cDNA用于定量实时PCR分析。

TUNEL分析

将神经 - 视网膜扁平支架在4％PFA中固定30分钟，用PBS洗涤，在冷冻乙酸中后固定30分钟，并用PBS洗涤。将神经 - 视网膜平坦支架和视网膜冷冻切片用0.1％柠檬酸钠和0.1％triton在冰上透化2分钟，并用PBS洗涤。使用原位细胞死亡检测试剂盒（Roche）在37℃在潮湿的室中在黑暗中将样品与末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）和荧光素-dUTP一起温育60分钟。通过用PBS洗涤载玻片三次来终止反应。细胞核用DAPI复染。使用共聚焦显微镜（Olympus FluoView 1000，Richmond Hill，ON，Canada）分析样品。

视网膜电图

在配备有ColorDome Ganzfeld刺激器（Diagnosys LLC，Lowell，MA）的Espion ERG Diagnosys装置上从WT和年龄匹配的CD36 - / -小鼠记录视网膜电图（ERG ）。将小鼠暗适应过夜，并用含有氯胺酮（100mg / kg）和甲苯噻嗪（20m / kg）的混合物的水溶液腹膜内麻醉。使用阿托品和去氧肾上腺素使瞳孔扩张。将一滴甲基纤维素置于角膜表面上以防止角膜脱水。使用加热的水垫将小鼠体温维持在37℃。

使用角膜DTL Plus电极（Diagnosys LLC）测量闪光暗视ERG。将电极放置在角膜表面上。前额上的针电极用作参比电极。将另一个针接地电极插入尾部皮肤。在以下增加的光强度下，从黑暗适应的动物的两只眼同时刺激暗视反应：0.5,1.0,3.0和10.0坎德拉*秒/米2（cd * s / m 2）。将10个波形响应平均，刺激间隔（ISI）为5秒（0.5 cd * s /m²）或20秒（1,3和10 cd * s /m²）。所有程序均在昏暗的红光照射下在暗室中进行。用Espion软件（Diagnosys LLC）测量主要ERG组分的幅度和潜伏期。以3.0cd * s / m 2的最佳光强度记录ERG结果。从基线到初级负峰值测量ERG a波振幅，并且从a波波谷到第四个正峰值的最大值测量b波振幅。

生物能学

用MPE-001处理或不处理的极化M0或M1-BMDM，或从MPE-001或NaCl处理的小鼠分离的腹膜巨噬细胞以2.5×10 5接种在海马板中。将MPE-001直接注射到M1-BMDM上的海马板上。用XF-24细胞外通量分析仪（Seahorse Bioscience，North Billerica，Billerica，MA，USA）分析氧消耗速率（OCR）和细胞外酸化速率（ECAR）的实时分析。未耦合呼吸（质子泄漏）代表对寡霉素处理不敏感的总呼吸的一部分（1μM）。通过从总呼吸中减去质子泄漏反应来计算耦合呼吸，并且表示与ATP合成偶联的反应。在这些实验中，非线粒体呼吸的贡献也被减去。

通过GC-MS定量代谢物

处理后，将6孔板中铺板的MP用9g / L NaCl溶液（4℃）冲洗3次，用1.2mL干冰冷却的80％MeOH淬灭，并储存在-80℃。使用bioruptor（Diagenode，Denville，NJ，USA）在最高设置下通过超声处理样品10分钟，脉冲和休息时间为30秒。通过离心清除样品，并且800ng D 27加入吡啶中的肉豆蔻酸作为内标。将上清液在设定为-4℃的真空泵浓缩器（Labconco，Kansas City，MO，USA）中干燥过夜。将沉淀重悬于10mg / mL甲氧基胺盐酸盐/吡啶中，并在70℃下进行甲氧基化30分钟，并用N-叔丁基二甲基甲硅烷基-N-甲基三氟乙酰胺（MTBSTFA）+ 1％t-BDMCS在70°下甲硅烷基化1小时。 C。内标和衍生化试剂来自Millipore Sigma（Oakville，ON，CA）。在配置有DB-5MS + DG（30m×259μm×0.25μm）毛细管柱（Agilent，Santa Clara，CA，USA）的5975℃GC-MS中以不分流模式注射样品（1μL）。入口温度设定为280℃，载气为氦气。设定流速以在17.94分钟锁定内标洗脱。四极杆设定在150℃，GC-MS接口设定在285℃。烘箱程序在60℃下开始1分钟，然后将温度以10℃/分钟升高至320℃。烘烤温度为320°C（10分钟）。以扫描模式获取数据并且未显示饱和度。测量的所有代谢物均使用真实标准（Sigma Millipore）进行验证。使用化学工作站软件（Agilent）进行数据分析。通过用D的那些校正定量离子的峰面积来获得相对代谢物浓度使用化学工作站软件（Agilent）进行数据分析。通过用D的那些校正定量离子的峰面积来获得相对代谢物浓度使用化学工作站软件（Agilent）进行数据分析。通过用D的那些校正定量离子的峰面积来获得相对代谢物浓度27-肉豆蔻酸，并通过将该比率除以与配对的BMDM板相关的平均蛋白质含量，从而提供具有任意单位的数据。主成分分析（PCA）与MetaboAnalyst 4.0进行79，80个从2个独立的实验中获得的使用数据，每个具有2-3个独立培养物BMDM进行。在生成PCA图（包含2个主要成分）之前，数据在MetaboAnalyst中上载为.csv文件。

定量实时PCR

使用Nano RNA芯片在2100生物分析仪上运行RNA以验证其完整性。用DNA酶处理总RNA，并使用具有ds DNase（Thermo Scientific）的Maxima First Strand cDNA合成试剂盒进行逆转录。使用来自Roche的Universal Probe Library（www.universalprobelibrary.com）设计的测定法测定基因表达），当没有可用的探针时，设计了SYBR Green试验。对于所有qPCR测定，进行标准曲线以确保测定的效力在90％和110％之间。对于UPL测定，使用Taqman Advanced master mix（Life Technologies），2μM每种引物和1μM相应的UPL探针进行qPCR反应。对于SYBR green测定，进行解链曲线以确保仅扩增单个产物，并使用Fast SYBR Green Master Mix（Wisent）和2μM的每种引物进行qPCR反应。使用Viia7 qPCR仪器（Life Technologies）检测扩增水平，并在95℃下以20秒的初始步骤编程，然后在95℃下进行40秒，在60℃下进行20秒。相对表达式（RQ = 2- ΔΔCT使用Expression Suite软件（Life Technologies）计算，并使用甘油醛3-磷酸脱氢酶（Gapdh）和肌动蛋白β（Actb）进行标准化。

流式细胞术

将极化的M1或M0 BMDM（10 6 /孔）与MPE-001（10 -7 M）一起温育24小时。然后用冷PBS洗涤细胞两次，并在4℃下用抗小鼠CD16 / 32孵育10分钟。然后将细胞在4℃下与抗小鼠APC / Cy7-F4 / 80（1：100），BV421-MHCII（1：400）和PE-Cy5-CD86（1：800）一起温育30分钟。 FACS缓冲液。对于PE-CD206，使用Cytofix / cytoperm缓冲液在4℃下进行细胞内染色20分钟。用FACS缓冲液洗涤细胞三次，然后在冰上用4％PFA固定15分钟，并使用Canto II流式细胞仪（Becton，Dickinson，Franklin Lakes，NJ）通过流式细胞术分析。

吞噬作用测定

通过先前描述的修改的方案评估吞噬作用81。简言之，将微球（羧酸盐修饰的FluoSpheresTM，偶联至黄绿色荧光，2μm，F8827，Invitrogen）用pH9.0的1％BSA溶液在37℃预涂覆30分钟。在用于测定之前，用PBS将涂覆的白蛋白微球洗涤三次。将偏振的M1-BMDM（10 6 /孔，在6孔板中）与涂覆的微球以50个珠子/ 1个细胞（50/1比率）的比例在37℃或4℃下孵育90分钟。最终体积为2 mL完全培养基。MPE-001（10 -6 在加入微球之前30分钟将M）加入细胞中。然后用冷PBS洗涤细胞两次，在冰上用4％PFA固定15分钟，并使用Canto II流式细胞仪（Becton，Dickinson，Franklin Lakes，NJ，USA）通过流式细胞术分析。

统计分析

结果表示为平均值±SEM。用未配对的学生t检验计算统计学显着性以比较2个条件。使用单向ANOVA和Student-Newman-Keuls（SNK）事后检验对正常分布的数据进行组间比较。基于P值设定统计学显着性：* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001。所有实验重复至少3次。使用GraphPad Prism 7.0软件进行统计学分析。

研究批准

所有实验程序均由机构动物伦理委员会严格按照加拿大动物保护协会指南和美国国立卫生研究院出版的实验动物使用指南批准。人体临床方案和知情同意书由CHU Sainte-Justine伦理委员会批准，并遵守赫尔辛基宣言的原则。在登记研究之前，从所有受试者获得签署的知情同意书。