G-CSF和GM-CSF改变囊性纤维化中发现的中性粒细胞功能 - ELISA试剂盒,酶免试剂盒,酶联免疫吸附试验, ELISA实验,ELISA,双抗体夹心法,科研蛋白,抗体,细胞系,武汉新启迪生物科技有限公司

摘要

考虑到这些受试者的肺部炎症的中性粒细胞负荷非常高，集落刺激因子（CSF）在囊性纤维化（CF）循环中性粒细胞中的作用尚未得到彻底评估。本研究的目的是评估不同临床条件下CF患者的粒细胞-CSF（G-CSF）和粒细胞 - 巨噬细胞-CSF（GM-CSF）水平，以及这些细胞因子如何影响中性粒细胞的激活和引发。在抗生素治疗前后（n = 19），在稳定CF患者（n = 21）和急性发作的CF患者的痰和血清样本中测量G-CSF和GM-CSF水平。在非CF中性粒细胞上测试CSF以研究它们对活性氧（ROS）产生，脱粒（CD66b，弹性蛋白酶，乳铁蛋白，MMP-9）和趋化性的影响。在CF患者中发现的浓度非常低（0.005-0.1ng / ml）时，两种细胞因子均抑制ROS产生，而较高浓度（1-5ng / ml）则发挥刺激作用。虽然CSF诱导弹性蛋白酶和MMP-9分泌，但乳铁蛋白水平仅通过G-CSF增加。GM-CSF抑制趋化性，但G-CSF增加趋化性。然而，当以低浓度一起存在时，CSF增加基础和fMLP刺激的ROS产生和趋化性。这些结果表明，在CF患者的肺外渗入之前循环中性粒细胞所面临的CSF水平可能会增强其导致气道损伤的功能。乳铁蛋白水平仅通过G-CSF增加。GM-CSF抑制趋化性，但G-CSF增加趋化性。然而，当以低浓度一起存在时，CSF增加基础和fMLP刺激的ROS产生和趋化性。这些结果表明，在CF患者的肺外渗入之前循环中性粒细胞所面临的CSF水平可能会增强其导致气道损伤的功能。乳铁蛋白水平仅通过G-CSF增加。GM-CSF抑制趋化性，但G-CSF增加趋化性。然而，当以低浓度一起存在时，CSF增加基础和fMLP刺激的ROS产生和趋化性。这些结果表明，在CF患者的肺外渗入之前循环中性粒细胞所面临的CSF水平可能会增强其导致气道损伤的功能。

介绍

囊性纤维化（CF）是一种威胁生命的疾病，是常染色体隐性遗传疾病中最致命的疾病。它是由CFTR（CF Transmembrane Conductance Regulator）蛋白的缺失/功能障碍引起的，在上皮细胞的质膜上表达。尽管CF的特征在于许多器官的功能障碍，但肺病是这些个体发病率和死亡率的主要原因。中性粒细胞为主的炎症反应是CF肺病的标志，也是机会性细菌病原体的肺部感染1。CFTR蛋白质是氯化物和碳酸氢盐通道，也是其他通道的调节剂，例如上皮钠通道（ENaC）。在CF气道中，其缺乏/功能障碍导致缺乏氯化物和碳酸氢盐分泌，加上过量的ENaC活性，增加的钠通量和来自管腔的水吸收，增厚和覆盖上皮的粘液的异常粘度，并最终废除粘液纤毛清除2。气道分泌物的酸化决定了抗菌肽3的功能丧失。细菌物种，如铜绿假单胞菌，趁着气道微环境的改变等由粘液穿透并创建其自己辩护免疫系统的攻击macrocolonies 4，5。因此，嗜中性粒细胞不断地被吸入CF气道并被激活。活性氧（ROS）的连续分泌与气道上皮细胞的损伤有关，而颗粒蛋白酶（如弹性蛋白酶）的分泌参与细支气管细胞外基质蛋白的降解，决定支气管扩张，从而进一步恶化粘膜纤毛清除率。金属蛋白酶（MMPs），特别是MMP-9，也是由中性粒细胞产生的，可能有助于基质分解和修复，从而导致CF气道的损伤和重塑。6。此外，中性粒细胞细胞毒性肽，颗粒酶，细胞外DNA和中性粒细胞胞外陷阱（NETs）与CF7中粘液堵塞和肺损伤增加有关。NETosis期间，嗜中性粒细胞释放解聚的染色质涂覆有弹性蛋白酶，髓过氧化物酶，以及其它细胞毒性蛋白酶粒状，从而延续严重的炎症表征CF肺病 8，9。促炎细胞因子（IL-1β和TNF-α）和化学引诱物（如IL-8和LTB 4）在CF气道环境中升高，特别是在急性发作期间，并且参与连续的中性粒细胞的外渗和激活。 10，11，12。CF气道中嗜中性粒细胞的吸引力最近归因于IL-23 / IL-17轴的高负荷，其发生在感染P的患者中。铜绿假单胞菌和经历肺恶化13，14，15。IL-17A和IL-17F上调气道上皮细胞中的粒细胞生成因子和CXC趋化因子，从而导致CF气道中的大量中性粒细胞流入13。在肺病的更晚期阶段，由于TH2主导的肺泡炎症和对革兰氏阴性菌感染的耐受性的偏向免疫反应，不利于保护性TH1反应，与预后不良有关16。

集落刺激因子（CSF）在中性粒细胞的存活和功能中的作用已得到公认。在CF，粒细胞-CSF（G-CSF）和粒细胞-巨噬细胞CSF（GM-CSF）已被发现在血清和痰中升高并与肺病负相关17，18，19。从机制上讲，GM-CSF参与由IL-17和TNF-α引起的气道中性粒细胞的积聚，可能是通过对中性粒细胞的募集和存活的影响20。此外，已经发现GM-CSF通过其他刺激物如LPS或C5a 21引发中性粒细胞的NET释放。

然而，尽管有这些发现，但尚未确定CSF在改变CF中循环中性粒细胞中的作用。在过去，我们对肺部中性粒细胞在肺部恶化的抗生素治疗前后的功能进行了深思熟虑的研究，发现氧化爆发和HVCN1（一种参与内体囊泡酸化的蛋白质通道）的表达被修改由抗生素疗法22，23。在本文中，我们的目的是量化一组稳定的CF患者的血清和痰CSF水平，并将其与急性发作的CF受试者进行比较，并阐明它们是否通过抗生素治疗进行了修改。此外，基于这些结果，我们研究了GM-CSF和G-CSF对各种中性粒细胞功能的影响，包括氧化爆发，脱颗粒和趋化性。我们选择在非CF中性粒细胞上进行该实验部分，以避免与CF中性粒细胞预先暴露于全身性炎症环境相关的偏倚，这已在这些患者中得到证实24。

结果

CF患者的临床特征

表1列出了在抗生素治疗前后稳定和急性患者的临床参数。与稳定患者相比，急性发作期患者的全身炎症值增加，如WBC（绝对计数），％中性粒细胞和C-反应蛋白（CRP）。抗生素治疗确定了WBC计数，％中性粒细胞和CRP水平的显着降低。与稳定患者相比，FEV 1作为呼吸功能的参数在急性加重患者中降低，并且在抗生素治疗后显示出非显着性增加。

表1本研究中涉及的CF受试者的临床参数。

全尺寸表

CFF患者的痰和血清中的CSF水平

对抗生素治疗前后稳定状态和急性发作期的患者进行痰液和血清标本中G-CSF和GM-CSF水平的分析，其浓度值见补充图 S1，见表 2。如补充图S1所示，在极低浓度下发现两种细胞因子的血清水平，并且在治疗前后稳定患者和急性患者之间没有显示出明显的差异。然而，GM-CSF水平低于G-CSF。对于痰液水平和两种细胞因子观察到非常相似的模式（补充图 S1）。数据见表 2表明，在稳定和急性（治疗前）条件下，G-CSF的痰液水平显着高于血清，而痰液和血清中的GM-CSF水平相似。在痰液中，治疗前稳定和急性患者之间的两种CSF水平相似，而治疗后患者与治疗前值相比，观察到降低的趋势。有趣的是，治疗前急性患者的血清G-CSF和GM-CSF水平低于稳定患者，治疗后有所增加，但两种情况均无显着差异。总体而言，这些数据表明血清中的CSF水平与痰液水平相反，并且抗生素疗程可能会改变它们。

表2痰和血清中的G-CSF和GM-CSF浓度。

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急性患者治疗前痰GM-CSF水平与WBC之间存在微弱但显着的正相关（r = 0.5694; P <0.05），稳定患者中痰G-CSF水平与FEV 1之间存在显着正相关（r = 0.4917; P <0.05）。

CSFs对ROS产生的影响

为了了解CF患者血清中观察到的CSF水平是否可以改变中性粒细胞功能，我们测试了CF患者中CSF血清浓度（0.005-0.1 ng / ml）对通过循环中性粒细胞从非CF产生的ROS产生的影响。个人。将嗜中性粒细胞与不同浓度的CSF一起温育，然后在一些实验中通过fMLP刺激。当嗜中性粒细胞仅与G-CSF或GM-CSF一起孵育时（图 1A），注意到对氧化爆发的双峰效应。在非常低的浓度（0.005ng / ml）下，氧化爆发被显着抑制，并且仍然观察到0.1ng / ml的减量但不显着。我们还测试了更高浓度的CSF（1-5 ng / ml），相反发现ROS产量显着增加（图。 1A）。在启动实验中，我。e。中性粒细胞首先与CSF孵育，然后与fMLP孵育，虽然存在一些差异，但仍发现了类似的双峰行为（图 1B）。G-CSF在最高浓度下没有显着增强作用，而GM-CSF仅在5ng / ml时发挥这种作用。由于两种细胞因子都存在于血清中，我们研究了G-CSF和GM-CSF对呼吸爆发的综合影响。因此，将低浓度（0.005和0.1ng / ml）的两种细胞因子作为直接刺激物或ROS产生的引物进行测试。如图1C所示当前存在的0.005或0.1ng / ml的两种细胞因子均对ROS水平产生刺激作用，这种作用在引发实验中得到证实（图 1D）。总体而言，这些数据表明，两种CSF的存在决定了在CF患者中发现的最低血清浓度（0.005-0.1ng / ml）中嗜中性粒细胞氧化爆发的刺激，当细胞因子引发中性粒细胞然后被细菌产物刺激时也是如此。

脑脊液对脱颗粒的影响

为了研究脱颗粒，我们分析了弹性蛋白酶作为初级颗粒的标记物（图 2）。fMLP显着增加弹性蛋白酶分泌（P <0.01）。在没有fMLP的情况下，G-CSF在0.005和5ng / ml时增加弹性蛋白酶水平（与未处理的细胞相比，P <0.01），而fMLP诱导的弹性蛋白酶水平仅增加0.1 ng / ml（ P <0.01）。当用作直接刺激时，GM-CSF以5ng / ml发挥刺激作用（P <0.05），当用于引发fMLP介导的反应时，GM-CSF以0.005ng / ml发挥刺激作用（P <0.05）。

作为二级（或特异性）颗粒的标志物，我们研究了CD66b和乳铁蛋白。CD66b是一种受体，其在特定颗粒的胞吐作用中水平增加25。尽管fMLP在中性粒细胞质膜上动员CD66（与未处理的细胞相比P <0.01），但是在fMLP存在或不存在的情况下，G-CSF和GM-CSF均未显着改变CD66b表达（图 3）。）。当用fMLP刺激中性粒细胞时，乳铁蛋白分泌显着增强（P <0.01）。而在没有fMLP的情况下，G-CSF能够在0.1,1和5 ng / ml的浓度下增加乳铁蛋白水平（分别为P <0.0001，P <0.05和P <0.0001），并且在0.1和5时在fMLP存在下的ng / ml（分别为P <0.05和P <0.0001），GM-CSF没有观察到效果（图 3）。

为了研究三级颗粒，我们测量了中性粒细胞上清液中MMP-9的水平（图 4）。fMLP显着增加MMP-9的分泌（P <0.01）。GM-CSF测定MMP-9的显着阳性分泌在0.1和5ng / ml之间，有或没有fMLP刺激（与各自对照相比，所有P <0.0001）。在没有fMLP的情况下，G-CSF在浓度为0.1和5ng / ml时显着增加MMP-9的分泌（分别为P <0.05和P <0.0001），而这种细胞因子仅增加了fMLP依赖的MMP-9分泌。最高浓度为5 ng / ml（P <0.0001）。

CSFs对趋化性的影响

在Transwell系统中测试CSF诱导趋化性。如图 5A所示，fMLP显着增加中性粒细胞的趋化性（P <0.0001），而GM-CSF和G-CSF对嗜中性粒细胞没有直接的趋化活性。为了解开“引发”效应，首先将嗜中性粒细胞与CSF孵育50分钟，然后使其沿fMLP梯度迁移。与仅fMLP相比，所有浓度的嗜中性粒细胞与GM-CSF的预孵育确定了趋化性的显着降低（图 5B）。相反，用G-CSF预活化的嗜中性粒细胞显示在所有浓度下趋化性增加（图 5B）。

当嗜中性粒细胞与两种细胞因子同时和以最低浓度温育时，或者当用作fMLP效应的直接激动剂或引物时，评估趋化性（图 5C）。有趣的是，当将两种细胞因子用作直接激动剂时，与用作单一药剂时相比，观察到对趋化性的增强作用（0.005和0.1ng / ml均P <0.05）。当用作引发剂时，趋化反应比fMLP诱导的增加，但效果是由单一细胞因子决定的平均值（图 5C）。然而，仅当用0.1ng / ml两种细胞因子引发嗜中性粒细胞时才获得显着性（P <0.05）。

讨论

以前，在稳定状态的CF患者的血清中测量GM-CSF和G-CSF水平，并且他们的比例确定患有慢性P的患者。绿脓杆菌感染与那些没有慢性感染17，18。尽管不能对这些研究中获得的结果与我们的结果进行直接比较，但几乎所有患者都是慢性感染S的。金黄色葡萄球菌，P。铜绿假单胞菌或乙。洋葱，本研究报道的CF患者CSFs水平与之前发现的相当吻合。在痰液中，G-CSF浓度高于GM-CSF浓度（表 2）。其他一些人已报道在痰更高水平的G-CSF，然后GM-CSF的13，19，虽然没有大的差异，通过我们本文报道。这些作者在CF患者的痰液中给予G-CSF和GM-CSF，而没有添加任何抗蛋白酶，正如我们在本文中所做的那样。虽然可以想象痰弹性溶解活性可以像其他众所周知的可溶性和细胞基质26那样切割CSF，但是需要深入的未来研究来解决该问题。NETs由于其蛋白酶含量27可以增强CSF降解，或者防止蛋白水解降解，这表明GM-CSF和G-CSF的痰稳定性差异应该在NETs存在下进行。

G-CSF的产生主要局限于单核细胞/巨噬细胞，成纤维细胞和内皮细胞，并且响应于细菌产物和炎症介质28而增强，例如TNF-α，一种在CF肺中高度产生的细胞因子，特别是在肺部恶化期间10。G-CSF表达通常感染过程中被诱导，导致高水平的全身（我。ê炎性流体在小鼠中，血液）和在本地29，30和在人类中31，32，33。另一方面，GM-CSF通常由肺泡巨噬细胞34局部产生，作为清除细菌的第一道防线35。它的主要功能似乎是调节表面活性物质的稳态，主要是调节巨噬细胞的活性和分化。我们的数据表明CF肺的慢性感染刺激G-CSF的产生而不是GM-CSF的产生。

G-CSF和GM-CSF是中性粒细胞的化学引诱物，并且可以在用几种试剂刺激后引发这些细胞增强的呼吸爆发活性。此外，两种细胞因子均增强中性粒细胞抗体依赖性细胞毒性（ADCC），粘附，吞噬作用和杀死微生物36。G-CSF和GM-CSF与中性粒细胞上的同源细胞表面受体结合，即。e。G-CSFR（由CSF3R编码）和GM-CSFR（由CSF2R编码）。虽然G-CSFR是同型二聚体受体，但GM-CSFR是异二聚体，其包含细胞因子特异性α亚基和对IL-3和IL-5受体也常见的βc亚基。两个G-CSF和GM-CSF是I型受体缺乏固有的催化活性，但触发JAK-STAT途径，SRC家族激酶的激活，和PI3K和MAPK途径37，38。含β-链的GM-CSF和同源二聚体G-CSF受体利用STAT2和STAT5或STAT3，但尚不清楚受体的特异性如何通过不同的JAK和STAT家族成员以及如何有限数量的JAK携带和STAT组件能够触发特定信号39。

这种复杂性反映在本文中获得的结果中。实际上，我们表明，作为单一刺激物测试的两种细胞因子对ROS产生具有相似的作用，但对脱粒和趋化性进行了不同的修饰。为了使这一结果更加复杂，当两种CSF与fMLP的直接激动剂或引发剂同时存在时，结果显示它们通过必须确定的效果增加ROS产生，可能通过重叠来实现信号通路。

在趋化性的情况下，以前的研究报告了不同的结果，一些证明G-CSF和GM-CSF作为趋化嗜中性粒细胞40，41，42，其他表示它们是趋化不利因素43，44。暴露的时间和CSF引发中性粒细胞的趋化剂可能是造成这些不同结果的原因。值得注意的是，所有这些研究都是通过使用单一CSF作为趋化剂进行的，实际上我们在这些条件下获得了类似的不同结果。然而，研究两种细胞因子的趋化性是当前存在的，据我们所知，这在以前没有进行，表明它们可以作为直接激动剂或用作引发剂时对中性粒细胞趋化性产生积极作用。

一旦吸引到气管，关键成功因素将有助于维持在炎症部位的嗜中性粒细胞，促进其生存45，46，和诱导它最需要的过氧化物产量。具体而言，在CF患者中发现的最低浓度（0.005-0.1ng / ml），CSF对呼吸爆发产生负面影响，而较高浓度增加ROS水平。有趣的是，已观察到GM-CSFR的信号转换开关。在浓度低至1 PM（0.014纳克/毫升），GM-CSF介导βC丝氨酸585磷酸化，导致14-3-3结合，PI3K活化，和造血细胞的存活，而在下午10点的浓度（0.14毫微克/毫升）或更多，GM-CSF介导的TyrβC 577磷酸化，Shc募集和PI3K激活，从而促进生存和增殖47。然而，在我们的实验条件下，中性粒细胞与低浓度的两种细胞因子的孵育增强了ROS的产生，这可以模拟更高的浓度。无论实验设置如何，这两种细胞因子直接发挥其作用，并且ROS水平的大小与用引发实验获得的相似，表明对于血液中性粒细胞的低CSF浓度，引发fMLP刺激并不重要。这种现象是否也发生在痰中性粒细胞中必须确定，但我们可以预期，由于细菌刺激的浓度应该在局部肺环境中更高，已经刺激的中性粒细胞应该对这些激动剂作出更多反应。加上当地CSF的综合效应，中性粒细胞应比血液更活跃，分泌更多的ROS。虽然这会增加中性粒细胞在非CF细菌感染期间的杀菌活性，但是这会产生更多的组织损伤而不是CF肺的益处，因为机会性CF细菌，如P。铜绿假单胞菌受藻酸外多糖保护。此外，GM-CSF为素数NET形成由其他刺激，例如LPS或C5a和嗜中性粒细胞ROS在它们的形成是隐含21。对这些考虑的一个警告是痰细胞因子水平，包括CSF，反映了肺部区域48的气道炎症的异质性，并且由于复杂的CF肺环境49，细菌衍生的产物也存在于痰中49。因此，痰液CSF水平可能是CF肺中局部G-CSF / GM-CSF浓度越高和越低的平均值，这意味着我们的结果应该在体内得到证实。通过探索不同的肺部区域（例如上肺叶和下肺叶）。最后，由于NETs与CF肺病进展相关，因此在CSF刺激后研究血液中性粒细胞中的NET将是有趣的。由于我们可以通过GM-CSF和G-CSF刺激之间的差异来理解我们的测定中颗粒酶的分泌，并且NETs或部分切割的NET片段可以隔离活性蛋白酶27，NETs的评估，具有较低和较高浓度的两者。同时呈现的CSF将允许获得关于已经在血液中的中性粒细胞活化的关键信息并且避免局部异质性的问题。这引起了对血液中性粒细胞的关注，作为CF肺病的可能的非侵入性标志物。

至于脱颗粒，我们发现G-CSF和GM-CSF能够通过中性粒细胞诱导弹性蛋白酶和MMP-9释放，浓度低至0.005-0.1ng / ml，而乳铁蛋白分泌仅通过G-显着增强。 CSF。如上所述，信号转导途径的差异可能产生不同的反应，但是这个问题已经在造血祖细胞中得到更深入的研究而在成熟的中性粒细胞中研究得更少，应该通过途径抑制剂或带有突变的中性粒细胞彻底研究这些途径使这些途径失活。。

中性粒细胞在用两种CSF刺激后对弹性蛋白酶和MMP-9的直接和启动作用可能对于感染的CF细支气管导致支气管扩张的基质分解和重塑的发病机制很重要50。中性粒细胞弹性已被确认为肺CF疾病的发作和早期发展的重要危险因素51，52。弹性蛋白酶在CF肺疾病的发病机理中的作用通过以下事实强调，这种蛋白酶已在CF肺疾病的几个关键特征包括气道炎症，杯状细胞化生和粘液分泌过多和气道壁的蛋白水解破坏牵连53，54，55，56，57，58，59。气道和血清/血浆MMP-9蛋白和活性示于CF中升高，并与呼吸功能和其下降率呈负相关60，61，62，63，64，65。此外，血浆MMP-9a与细菌感染有关65。虽然这不是CF气道分泌物中唯一发现升高的MMP，但这些发现突出了其在中性粒细胞介导的CF肺病进展中的可能作用。

G-CSF对未受刺激和fMLP诱导的乳铁蛋白释放具有增强作用，乳铁蛋白是先天免疫的铁螯合糖蛋白，并且代表气道分泌物的主要内源性抗微生物成分66。乳铁蛋白发挥多种功能如抑制微生物生长的，生物膜发展，和宿主细胞的细菌的侵袭67，68。此外，由于其已证实的抗炎活性，有人提出乳铁蛋白是一种重要的分子，用于中断CF 69中铁稳态失调，细菌感染和炎症的恶性循环。。因此，乳铁蛋白增加可能是发生高炎症时负反馈机制的一部分，如CF肺部，但其他研究必须验证这一假设。

虽然脱颗粒研究中的重复数目证实了数据的稳健性，但只有在中性粒细胞刺激同时存在两种细胞因子的情况下，才会分析严格相关的颗粒酶和NETosis的水平，才能作出结论性评论。这是正在进行的研究的重点。

总而言之，我们的数据强烈表明，循环的CSF刺激中性粒细胞显示出更高的趋化表型，并产生更多的ROS和颗粒酶。因此，一旦进入CF肺部，嗜中性粒细胞可能比保护气道免受感染更具破坏性。我们的数据显示G-CSF在CF患者的感染肺中比GM-CSF高产，并且它可能是促进进一步中性粒细胞活化然后更多损伤的因素。因此，它可能是抑制疗法的目标。

总之，在CF患者血清中发现的CSF水平通过调节ROS产生，蛋白酶脱颗粒和趋化性来改变循环中性粒细胞的行为。在这些结果的基础上，可以合理地假设，受这些水平的影响，循环的CF中性粒细胞在进入CF肺之前已经被激活。

患者和方法

耐心

在这项研究中，考虑了21名病情稳定的患者和19名急性发作的患者。恶化被定义为患者感知的症状恶化，包括咳嗽，痰液产生，呼吸困难增加，1秒内用力呼气量下降（FEV 1）与之前的最佳，体重减轻和发烧70相比。在抗生素治疗10天之前和之后研究急性发作的患者。稳定和急性患者的男性和女性之间的比例分别为11:10和6:13。患者年龄稳定为30.9±2.2，急性为30.0±2.9（平均值±SEM）。入院时，收集所有临床和实验室参数：白细胞计数，中性粒细胞百分比，CRP（mg / dl），FEV 1（预测性别和身高的百分比）和病原体定植。通过P将稳定的患者定植为单个或偶联。铜绿假单胞菌（n = 10），S。金黄色葡萄球菌（n = 8），B。菌（N = 3），非结核分枝杆菌（N = 1）和肠杆菌（N = 1），而急性患者呈现P。铜绿假单胞菌（n = 10），S。金黄色葡萄球菌（n = 4），非结核分枝杆菌（n = 5），E。大肠杆菌（N = 3），和乙。洋葱（n = 2）。大多数患者，我。Ë。在急性发作（89％）稳定的条件（95％）和17 20，被慢性感染，由国际准则成立71，72。该研究得到了Bari的Azienda Ospedaliera Universitaria“Policlinico”（第1373 / CE / 2012号）道德委员会的批准，并根据2013年修订的赫尔辛基宣言进行。获得成人研究受试者的书面知情同意书或父母和/或法定监护人的知情同意书，以获得18岁以下受试者的研究参与。

血液和痰液处理

收集血样并立即以1,590×g离心15分钟; 分离血清并储存在-80℃直至进行测定。同时，将自发咳出的痰液收集在无菌杯中并立即处理。将痰样品（0.5-2mL）以1：1-1：6稀释，用磷酸盐缓冲盐水（PBS），立即涡旋，然后以7000×g离心5分钟。立即取出每种上清液并在测定前在-80℃下等分储存。

测量痰和血清中的CSF水平

通过ELISA试剂盒（Invitrogen，Corporation，Camarillo，CA，USA）测量痰和血清样品中的G-CSF和GM-CSF水平。Hu GM-CSF试剂盒（目录号KHC2011）和Hu G-CSF试剂盒（目录号#KHC2031）的灵敏度分别为<3pg / ml和<20pg / ml。根据样品的初始稀释度将获得的值标准化。

一些样品低于测定的检测限：血清G-CSF（稳定= 1;治疗前= 1;治疗后= 2）; 痰G-CSF（稳定= 1;治疗前= 2;治疗后= 4）; 血清GM-CSF（治疗后= 1）; 痰GM-CSF（稳定= 2;治疗前= 1;治疗后= 1）。

中性粒细胞分离

嗜中性粒细胞来自健康人类供体的全血。简言之，通过葡聚糖沉降然后进行Ficoll-Hypaque密度梯度离心，在无LPS的条件下分离嗜中性粒细胞。将含有嗜中性粒细胞的下层相重悬浮于RPMI（Roswell Park Memorial Institute）培养基中，洗涤并通过低渗裂解除去污染的红细胞。使用针对CD16b的FITC缀合的小鼠单克隆抗体（Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA）通过BD FACScalibur（BD Biosciences，San Jose，CA，USA）的流式细胞术分析评估所得细胞群含有大于95％的成熟嗜中性粒细胞。，美国），用于1μg/ 1×10 6个细胞25。将无关小鼠FITC-缀合的单克隆抗体用作阴性对照。总共每次染色记录10,000个事件。通过台盼蓝排除试验评估中性粒细胞活力，活中性粒细胞> 98％。

中性粒细胞刺激

GM-CSF，G-CSF，TNF-α和N-甲酰甲硫氨酸 - 亮氨酰 - 苯丙氨酸（fMLP）购自Sigma-Aldrich（Milan，Italy）。将中性粒细胞（3×10 6 / mL）与G-CSF或GM-CSF一起孵育或用CSF引发50分钟，然后用1μMfMLP刺激。对于ROS测量实验，DMSO用作fMLP的阴性对照，TNF-α（50ng / ml）用作引发的阳性对照。在一些实验中，两种CSF以低浓度（0.005-0.1ng / ml）一起存在，作为fMLP的直接刺激剂或引发剂。

测量细胞内ROS

嗜中性粒细胞要么刺激或用的CSF刺激，用2μM温育1h 2 DCFH-DA（2'，7'-二氯二氢荧光二乙酸酯; Invitrogen）中10分钟，在PBS中洗涤两次，并暴露于1μMfMLP的。10分钟后，在终止刺激后30分钟内通过流式细胞术（BD FACScalibur）测量ROS介导的H 2 DCFH-DA 氧化成高度荧光的2'，7'-二氯荧光素（DCF）。总共每次染色记录10,000个事件。嗜中性粒细胞的控制（我。Ë。用DMSO孵育并用fMLP刺激的中性粒细胞分别产生160.5±14.4和207.0±17.1的细胞内荧光（MFI =平均荧光强度）（平均值±SEM; n = 18; Mann-Whitney U-检验：P <0.05）。。与研究样品获得的MFI计算为控制意味着（％我。ê，DMSO或fMLP的）。

中性粒细胞脱颗粒分析

中性粒细胞（7×10 6将细胞/ ml）与G-CSF或GM-CSF（0.005,0.1,1和5ng / ml）一起温育50分钟并评估未刺激或用1μMfMLP刺激5分钟。将上清液在-80℃下快速冷冻。通过酶联免疫吸附测定（R＆D System）评估颗粒蛋白（弹性蛋白酶，乳铁蛋白和MMP-9）的释放。作为二次颗粒脱粒的替代方法，研究了CD66b的膜表达。在刺激后将嗜中性粒细胞固定在4％（w / v）多聚甲醛中，并使用根据制造商使用的异硫氰酸荧光素（FITC）标记的小鼠抗人CD66b抗体（Miltenyi Biotec，Bologna，Italy）通过流式细胞术（BD FACScalibur）进行分析。说明。将不相关的FITC缀合的小鼠IgG1用作阴性对照。总计10，每次染色记录000个事件。数据表示为MFI。

趋

在Transwell插入物（Corning，3μm孔径）的上部隔室中添加嗜中性粒细胞（每个滤器1×10 6），而在下部隔室中，添加1μMfMLP，GM-CSF或G-CSF。2.5小时后，穿过插入物的嗜中性粒细胞在下部隔室中回收并通过流式细胞术（BD FACScalibur）定量，并且数据表示为在上部隔室中添加的总嗜中性粒细胞的百分比。在一些实验中，将嗜中性粒细胞与CSF预孵育50分钟，加入上部隔室并使其沿fMLP梯度迁移2.5小时。

统计分析

由于数据呈现正常或非正态分布值（Shapiro-Wilk），因此分别通过参数和非参数测试计算差异。临床参数，血清和痰中的CSF水平以及ROS水平显示非正态分布，因此使用Kruskall-Wallis方差分析（使用Dunn检验作为事后检验）和Mann-Whitney U检验进行配对比较。脱颗粒和趋化性数据呈现正态分布，因此我们使用ANOVA和Tukey的事后检验和Student t检验进行成对比较。通过计算Spearman的秩相关系数来进行相关分析。当P <0.05时，差异被认为是显着的。使用软件Prism 4（GraphPad Software，Inc.，La Jolla，CA，USA）进行分析。