锁核酸寡核苷酸在siRNA临床前生物分析中的应用 - ELISA试剂盒,酶免试剂盒,酶联免疫吸附试验, ELISA实验,ELISA,双抗体夹心法,科研蛋白,抗体,细胞系,武汉新启迪生物科技有限公司

摘要

尽管siRNA作为治疗剂具有极好的潜力，但是负责稳健的间接暴露 - 反应关系的机制尚未完全阐明。为了理解与强效活性相关的siRNA特性，需要对siRNA的处置进行表征。表征中的技术挑战是从生物样品中检测和定量siRNA。本文描述了锁定核酸（LNA）杂交 - 连接ECL ELISA，其设计用于siRNA的有义链和反义链的超灵敏定量，而与结构修饰无关。该测定法用于测量临床前物种中血清和组织匀浆中的siRNA。我们观察到siRNA从体循环中快速清除，这与组织内的长期积累形成对比。该测定还能够区分和量化来自RNA诱导的沉默复合物（RISC）和与治疗性siRNA相关的Argonaute 2（Ago2）的游离siRNA。我们利用正交方法LC-MS研究3'核酸外切酶对反义链代谢的活性。总之，我们已经证明LNA杂交 - 连接ECL ELISA是一种直接应用于在生物基质中无缝地测量siRNA治疗剂暴露的直接应用。

介绍

在过去的二十年中，RNA干扰（RNAi）已经成为沉默基因表达的有力途径1。在1998年，术语RNAi是指基因表达的翻译后沉默现象，其响应于将双链RNA（dsRNA）引入细胞2中而发生。2006年，Andrew Z. Fire和Craig C. Mello因双链RNA 3发现RNAi基因沉默而获得诺贝尔奖。RNAi领域迅速扩大，在细胞培养基因表达敲低中取得了新的成就4。现在可以利用RNAi技术进步以允许对几乎任何选择的靶基因的特异性功能抑制，允许更快速的功能性遗传表征.RNA抑制的天然机制由19-25个核苷酸的小的双链RNA分子介导。通常认为RNAi通过多步机制起作用5。当入口处的细胞，更长的双链RNA分子首先通过RNA酶酶，Dicer加工6，7，8。这种功能性二聚体含有解旋酶，dsRNA结合和PAZ（以piwi，argonaute和zwille蛋白命名）域9。前两个结构域对于双链RNA解旋和促进RNA相互作用是重要的。PAZ域的功能尚不完全清楚10。Dicer产生21-23个核苷酸的RNA片段，通常具有两个核苷酸3'末端突出端，称为siRNA（沉默RNA）。siRNA的沉默机制通过RNA诱导的沉默复合物（RISC）介导，其由21-23个核苷酸片段（siRNA）引导，识别互补序列，导致靶mRNA 11的切割和降解。利用这种机制，基因表达在转录后水平特异性地失活。

RNAi和siRNA合成化学的最新进展引起了对治疗性siRNA分子的兴趣。反义寡核苷酸（ASO）在治疗多种疾病方面取得了里程碑式的成就，包括神经疾病12，眼部疾病13和早期心血管疾病14。合成siRNA已被证实靶基因在体内对多个疾病领域，包括癌症15，16，17高胆固醇血症18，肝硬化19，呼吸道合胞病毒20，乙型肝炎21和人乳头瘤病毒22。许多合成的siRNA正在开发用于各种疾病。截至2018年8月，第一个siRNA治疗获得批准23。通过其他临床试验，预计更多基于核酸的疗法将很快进入市场。

递送和化学稳定性的改善显着改善了siRNA治疗的组织特异性靶向，细胞进入和持续效力。综合进步对疗效产生了巨大影响，从而降低了有效剂量。为了充分解决复杂基质中的暴露 - 响应关系，需要根据治疗候选物的结构和功能仔细选择生物分析方法平台。定量，高度特异性和灵敏的方法是在药物发现以及siRNA治疗剂的药物开发过程中确定药代动力学（PK）参数和药效学（PD）关系的要求。

已经报道了几种用于在哺乳动物细胞系和体内应用中定量siRNA的方法。已经开发了各种基于PCR的siRNA检测方法，包括引物延伸RT-PCR 24，茎环RT-PCR 25和竞争性定量PCR 26。然而，这些方法遭受耗时且昂贵的优化过程。辛格等人。是第一个描述锁定核酸（LNA）类似物的类似物，它们对互补的DNA和RNA都显示出前所未有的亲和力27。已经证明，单个LNA的掺入可以极大地增加与嘧啶相互作用的双链体稳定性28。在这里，我们开发了一种超灵敏的基于ELISA的测定，用于定量双链完整siRNA，用于体内药代动力学分析。该测定使用两种不同的锁核酸（LNA）修饰的DNA探针，分别用生物素（捕获标记）和地高辛（检测标记）进行5'和3'标记。该测定提供了易于使用的程序，同时从生物样品中提供高灵敏度和双链siRNA特异性。通过细胞内siRNA的定量和体内血清药代动力学证明了基于ELISA的测定的实用性，允许容易地评估化学修饰和各种递送系统的功效。

结果和讨论

LNA杂交连接ECL ELISA的设计

杂交的寡核苷酸三明治的整体设计是从以前出版的基于ELISA的测定法改性29，30。总结先前的测定设计，实施了两种基于DNA的寡核苷酸探针。一个用作捕获物，其3'生物素和5'9-mer突出端，另一个充当检测探针，其具有与捕获突出端和3'地高辛配基附着的互补碱基。在先前报道的工作中，测定结构遵循两步杂交 - 连接设计。简言之，将目标分析物变性并在溶液中与捕获探针杂交，随后通过抗生物素蛋白 - 生物素结合连接至平板。接下来，将检测探针与T4连接混合物混合，并在孵育后洗涤以除去任何未连接的检测探针。然后在氯化钠溶液中用S1核酸酶处理样品以切割任何截短的双链体。封锁后，

在这里，我们已经证明了在整个测定探针中应用LNA化学碱基修饰，酶促反应的重新加工以及将测定转移到电化学发光（ECL）平台的显着测定改进。图 1显示了测定示意图，表 1总结了先前公布的测定与本文报道的LNA应用ELISA之间的改进。

表1先前公布的测定与结合LNA核苷酸修饰的新测定之间的差异总结。

全尺寸表

在设计用于定量双链siRNA的优化探针时，LNA取代散布在捕获和检测探针中，分别针对80℃和69℃的理论解链温度（Tm）。重要的是要注意，避免了与成核切割位点相邻的LNA取代，以允许S1核酸酶可及性。此外，考虑到含LNA的探针的最佳杂交温度比理论Tm低30度，最终的经验确定52℃的最终杂交温度，反映LNA寡核苷酸制造商推荐比理论Tm低30度。正如预期的那样，将LNA定向掺入DNA寡聚体可显着提高探针对siRNA分析物的亲和力，因此，与先前公开的方法相比，分别将捕获和检测探针的最终测定浓度降低4倍和100倍。除了增加杂交探针对目标分析物的亲和力之外，还从LNA取代到地高辛配合的检测探针中获得了热稳定性的增加。此外，双链DNA的典型连接反应在18℃下进行过夜，而我们能够将该反应减少至37℃孵育1小时，从而进一步使总测定持续时间最小化。超越捕获和检测探针优化，进一步的分析改进包括鉴定ZnSO4作为实现最大S1核酸酶活性的理想辅因子。对于缓冲液和血清中的分析物峰值，我们在以下反应条件下观察到峰值核酸酶活性：室温下pH 5.5，持续30分钟。对于更复杂的基质，如组织匀浆，我们发现通过将培养温度从25°C提高到29°C，信噪比有了显着的提高。补充信息总结了金属辅助因子和pH对测定性能的影响。

最后，为了增强测定的整体动态范围，我们将方法从标准荧光板读数转移到Meso Scale Discovery（MSD）ECL平台。在核酸酶反应后，将与钌（II）三 - 联吡啶N-羟基琥珀酰亚胺标记缀合的抗地高辛配基检测抗体与样品一起温育。在DNA与LNA探针与抗地高辛检测的直接比较中，我们发现LNA修饰的添加显着提高了灵敏度（参见补充信息）。联合测定设计修改产生了一个测定，血清，肝和肾匀浆的动态范围为0.1-10,000 pM，检测水平（LOD）为1.0 pM（图 2））。最令人印象深刻的是，重新测定的分析能够在更短的时间内测量来自肝匀浆的siRNA分子，而不会改变测定灵敏度（表 1）。由于siRNA分子的双链性质和该测定的变性条件，可以针对有义链或反义链特异性地设计探针。尽管存在表征双链RNA的方法，例如天然质谱（MS）31，但这些方法的灵敏度不足以用于体内 siRNA的定量。。对于我们对任一链的测试，将样品均质化并且平行进行两种有义和反义测定。以这种方式，我们得出结论，重叠值对应于双链体形式的siRNA，并且值的差异对应于单链群体。

LNA探针的特异性

现在，对核糖或磷酸骨架进行的化学修饰常规地掺入siRNA分子中，以减轻血液和靶组织区室内的外切和内切核酸酶活性。话虽如此，文献中也很清楚，甚至完全化学修饰的寡核苷酸仍然在体内经历溶核活性32。与此一致，在存在合成代谢物的情况下测试我们的LNA捕获探针的特异性，所述合成代谢物被创建以模拟siRNA双链体的反义链的核酸外切降解。这些代谢物在所有核苷酸上的核糖上含有2'-O-甲基化学修饰，以测试探针对截短的寡聚物种的交叉反应程度。我们采用这种化学改性的唯一目的是在溶液中获得稳定性。以前发表的使用离体的努力大鼠肝匀浆模型证明3'-核酸外切酶主要负责介导相对于5'-核酸外切酶或核酸内切酶活性的反义寡核苷酸代谢; 因此，我们的工作集中于LNA探针与代谢产物的交叉反应性，所述代谢产物由反义链33的 3'末端剪切产生。为了确保啮齿动物正常转化为NHP核酸外切酶活性，我们进行了体外评估样品并看到3'-核酸外切酶活性的清晰翻译，形成最少的5'-代谢物（参见大鼠数据的补充信息）。3'n-1和n-2代谢物（分别指定为一个和两个核苷酸减少）显示出与全长反义链强烈一致的测定响应，EC50值为2.43nM（反义链的1.3倍））和3.36 nM（反义链的0.97倍），而3'n-3表现出显着的右移响应，EC50为13.3 nM（反义链的0.25倍）（图 2））。重要的是要注意，因为用3'n-1和n-2代谢物观察到LNA探针的交叉杂交，所以使用该方法可能过高估计全长反义链的排他性定量。无论如何，LNA ELISA能够捕获可能活性物种的全长反义物3'n-1和n-2的总群体，因为已经证明siRNA截短的物种仍能有效地加载RNA诱导的沉默复合物。并介导有效的mRNA靶标敲低34。

形成反义链的代谢物的表征在体内使用LC-MS

据报道，反义寡核苷酸治疗剂在血浆中经历生物转化35 ; 然而，与通过I期和II期药物代谢酶36进行生物转化的小分子药物不同，siRNA生物转化通过剪切核酸之间的磷酸二酯键或通过先天化学不稳定性发生。寡核苷酸代谢的许多报告已经描述了32，37，和在很大程度上采用耦合到离子阱质谱仪离子对反相色谱。最近，高分辨率质谱用于鉴定来自体外基质的代谢物。

在这项工作中，我们应用高分辨率精确质量测量来阐明来自非人类灵长类动物（NHP）的肝脏和肾脏组织的代谢物。精确质量离子检测的应用为代谢物鉴定提供了高度的信心。在探索性NHP研究中，动物每周一次皮下注射专利siRNA，持续四周，剂量为300mg / kg。来自非人灵长类肝脏匀浆样品的LC-MS数据得到的代表性提取离子色谱图如图3所示。。连续降解模式表明这些代谢物是双链体反义链上3'核酸外切酶活性的结果。目前，关于合成siRNA降解中涉及的RNA酶和/或核酸酶类型知之甚少，这是我们实验室研究的一个活跃领域。表 2列出了NHP肝脏和肾脏样品中完整反义链和代谢物的百分比。在NHP中，在组织中观察到的主要物种是完整的反义链。这确保了测定与通过LC / MS 在体内测量的观察到的分解代谢物一致。

表2通过LC / MS检测的NHP肝和肾样品中完整反义链和代谢物的百分比。ND =未检测到。

全尺寸表

观察到的所有其他代谢物均低于总药物相关物质的3％，因此被排除在进一步表征之外。该数据推断本文评估的siRNA分子在体内极其稳定，完全化学修饰的siRNA分子的已知特征，其有助于长时间的作用。在不同组织中观察到的合成siRNA的不同代谢物模式的鉴定提供了对稳定性和药代动力学性质的了解，在早期发现中理解代谢物模式可以导致设计更稳定，有效的分子。虽然LC / MS可以有效识别血浆和组织中的代谢物模式，但LC / MS的灵敏度限制了其适用性。因此，在大多数发现设置中，必须利用如本文所报道的更灵敏的测定（例如ELISA）来测量血浆和组织中的siRNA浓度。

来自非人灵长类动物的生物基质中的定量siRNA

首先在NHP中以0.1,1或10mg / kg的单个皮下（SC）剂量siRNA（每个给药组n = 6只动物）测定siRNA双链体的有义链和反义链的血清浓度 - 时间曲线。。有义链和反义链的峰值血清浓度（C max）与0.1至10mg / kg剂量成比例。对于所有三种处理，在给药后1小时观察药物的最大浓度（图 4，表 3和补充信息）。从血清隔室的总剂量的快速清除率和预期是符合先前公布的siRNA的药代动力学曲线与SC给药38，39。这暗示了固有的siRNA器官分布，这反映在观察到的分布体积中。此外，根据这些数据，我们可以推断siRNA双链体在NHP血清中保持完整，直至给药后约24至48小时，因为有义链和反义链浓度没有显着差异。有趣的是，反义链持续检测血清取样的整个持续时间（168小时），并由目前未知的机制介导，而有义链在超过48的所有时间点都低于检测限（0.3 ng / mL）。小时 - 与剂量无关。

表3反义链的药代动力学参数显示为平均值（SD）。AUCinf =从时间0到无穷大的浓度时间曲线下的面积; Cmax =最大血清浓度; t1 / 2 =终末半衰期; Tmax =最大浓度的时间; 浓度时间曲线下的AUClast面积从时间0到最后可测量的浓度; Vd / F分布量; SC =皮下。所有值都报告为3位有效数字，但Tmax除外，它被报告为中值。

全尺寸表

进一步开展这项工作后，我们研究了siRNA，特别是肝脏和肾脏的组织暴露水平，每7天以10 mg / kg的剂量进行4次SC剂量（图 4））。在给药后28天，分别在1,490和1,340ng / mg组织的肝脏中观察到相似浓度的有义和反义链。相反，有义链（711.3ng / mg组织）以几乎是反义链（11.8ng / mg组织）的60倍的浓度积聚在肾中。这种组织特异性二分法表明有义链与其对应物相比可具有更快的清除率，这可以通过包括多个组织时间点的更精细的药代动力学研究进一步阐明。此外，由于siRNA作用机制需要Ago2双链加载用于靶mRNA降解，我们然后定量与来自肝匀浆的催化RISC酶共免疫沉淀的有义链和反义链的量。 4C）40。在感觉（0.028ng / mg组织）和反义（0.027ng / mg组织）链Ago2负载之间未观察到显着差异，并且浓度与mir122（0.032ng / mg组织）相当。由于本研究中实施的高剂量范例导致酶的结合能力可能饱和，因此在这些多剂量条件下最有可能未观察到有义链裂解和从Ago2释放。此外，根据这些数据，我们观察到总的siRNA肝脏暴露，小于0.01％与Ago2结合。

方法

物料

使用MSD Gold Sulfo-Tag NHS-Ester缀合试剂盒（Meso Scale Diagnostics，Cat.R31AA-1）将绵羊多克隆抗洋地黄毒苷抗体（Roche，Cat.112222089001）与钌标记物缀合。如下制备标准品和样品缓冲液：10mM Tris-HCl [pH 8.0]和1mM EDTA。杂交缓冲液如下制备：60mM Na 2 PO 4 [pH 7.0，二元]，1M NaCl，5mM EDTA和0.02％吐温20.连接缓冲液如下制备：66mM Tris-HCL [pH 7.6]，10mM MgCl 2,10mM DTT，1mM ATP，5U / mL T4 DNA连接酶（Invitrogen，目录号15224041）。如下制备核酸酶缓冲液：3mM ZnSO 4,100mM NaCl和0.8U / μL S1核酸酶（Thermo Fisher，Cat.18001016）。冻干的寡核苷酸探针由Qiagen Inc.（Hilden，Germany）定制合成。如果没有说明，所有化学品和试剂均为分析级或更高级别。代谢物模拟的2OMe修饰的寡核苷酸（序列未显示）和miR122序列由Integrated DNA Technologies（Iowa，USA）定制合成。的100储备溶液 μ m的由在分子级水中重构制备。所有寡核苷酸探针，标准品和代谢物的序列如下所示。

miR122标准：5'- rUrGrG rArGrU rGrUrG rArCrA rArUrG rGrUrG rUrUrU rG -3'

miR122捕获探针：5'- TCG C + TC GTG CAA ACA + CCA TTG + TCA CAC + TCC A / 3Bio / -3'

反义捕获探针：5'- TCG C + TC GTG CAG + XXX XXX XX + X XXX X + XX CGA / 3Bio / -3'

感应捕获探针：5'- TCG C + TC GTG TCG + XXX XXX XX + X XXX X + XX CTG / 3Bio / -3'

检测探针：5'- CA + CGAG + CGA / 3Dig_N / -3'

r（碱基）：核糖核苷酸

+ （基数）：LNA修改

3Bio：与C6连接子的生物素缀合

3Dig_N：Digoxygenin（NHS酯类）

杂交 - 连接ELISA

将双链siRNA或单链对照掺入相对物种组织匀浆或血清基质中，标准曲线范围为2.6-166pM（0.04-2500ng / mL）。标准曲线和样品在样品缓冲液中以1:20稀释，并加入到96孔PCR板50的终体积 μ L.序列特异性捕获寡核苷酸加入到杂交缓冲液至50nM和50的终浓度 μL添加到缓冲液中的样品中。样品和捕获探针在以下条件下在热循环仪上杂交：90℃5分钟，52℃30分钟，最终保持在12℃。杂交后，将样品在室温下转移至MSD GOLD 96孔链霉抗生物素蛋白SECTOR PR板（Meso Scale Diagnostics，Cat.L13SA）30分钟。温育后，用1x洗涤溶液（KPL，Cat.50-63-00）洗涤板。检测寡核苷酸中以1nM加入连接缓冲液，并且将混合物在50加至板 μ在37℃升体积，随后温育一小时。洗涤后，50 μ向孔中加入L核酸酶缓冲液。对于所用序列，对于组织和血清样品，将板在37℃或室温下孵育30分钟。洗涤板，并用50温育1小时 μ升2 μ克/毫升钌标记的抗洋地黄毒苷抗体中的SuperBlock T20 TBS封闭缓冲液（赛默飞世，目录37536）。最后洗涤后，150 μ加入MSD读数缓冲液T（中尺度诊断，目录R92TD）的L与平板上读取MSD扇区S 600仪器（罗克维尔，MD，USA）。

杂交 - 连接样品制备

将组织样品在含有50mM Tris HCl，100nM NaCl，0.1％Triton X100和蛋白酶抑制剂混合物（Roche，Cat.11836170001）的裂解缓冲液中匀浆至终浓度为200mg / mL。在样品缓冲液中分别在5％组织匀浆（200mg / mL）或5％血清中进行组织或血清的进一步稀释系列。

LC-MS样品制备

在Phenomenex Clarity OTX SPE 96孔板（Cat.8E-S103-EGA）上使用优化的固相提取方案从大鼠和NHP肝匀浆中提取寡核苷酸。在使用之前，将SPE板用1mL甲醇调节并用1mL 50mM NaH 2 PO 4,2mM NaN 3,10mM K 2 EDTA水溶液（pH 5.5）平衡。将肝匀浆样品与1体积的10％（v / v）H 3 PO 4混合10分钟，然后与三体积的Phenomenex裂解加载缓冲液（目录号AL0-8579）混合，然后以低浓度加载到SPE板上。压力（约2 psi）。然后将SPE板用1mL 50mM NaH 2 PO 4,2mM NaN 3,10mM K 2 EDTA水溶液（pH 5.5）洗涤一次，1mL 50mM NaH 2 PO 4在50:50水：乙腈（pH 5.5）中洗涤四次，并且在20:80水中加入1 mL 50 mM甲酸铵：乙腈（pH 5。5）两次用0.5mL 100mM碳酸氢铵，10mM TCEP在50:40:10水：乙腈：THF（pH 9）中洗脱两次。然后将洗脱液在N 2下蒸发至约200℃ μ L用LC-MS分析。

LC-MS方法和分析

将样品在Agilent 1290上与Thermo Scientific Obritrap Fusion Tribrid质谱仪（Waltham，Ma）偶联进行LC-MS分析。130Ångstrm，1.7：色谱分离在Waters ACQUITY UPLC BEH寡核苷酸C18柱 μ为0.4毫升/分钟的流量m，2.1毫米×50mm的在80℃下。流动相A由15mM三乙胺（TEA），400mM六氟异丙醇（HFIP）的水溶液组成，流动相B由相同浓度的TEA和HFIP的甲醇溶液组成。每个样品（ 10μL）在柱上注射并分离，使用以下梯度：最初0.5分钟为2％B，然后在9.5分钟时线性梯度至50％B，然后在10分钟时另一线性梯度至95％B; 在接下来的2.5分钟内保持在95％; 然后在13分钟时降至2％B并保持2％1分钟。质谱仪在负离子模式下操作，喷射电压为-3000V，源破碎能量为60eV。扫描范围设置为600-2400 m / z，Obritrap分辨率设置为60 K.OMA中的寡核苷酸质量汇编（OMA）模块和寡核苷酸峰分析仪（OPA）免费软件包首先用于生成预测列表可能由全长siRNA构建体41形成的所有可能代谢物的m / z值。然后使用OPA模块分析代表性质谱数据文件以确认样品中实际观察到哪些代谢物。然后使用前三个最强电荷状态和每个电荷状态的前三个同位素产生处理方法，以计算每个观察到的代谢物的峰面积。

非人灵长类研究

所有非人灵长类动物研究均在Charles River Laboratories（Reno，Nevada）或MPI Research Inc.（Manatwan，MI）进行。根据美国农业部动物福利法案（9联邦法规，第1,2和3部分）并按照实验动物护理和使用指南中的描述饲养动物。研究在批准的IACUC方案下进行。对于血清暴露分析，6-10岁的雌性猴子以0.1,1.0和10mg / kg的剂量皮下给药。对于组织暴露分析，6-10岁的雌性猴子以10,50和200mg / kg每周一次给药，持续4周。在给药后28天取出尸检样品。使用WinNonLin非区室分析从0到24小时，从有义和反义血清浓度外推药代动力学参数。

Argonaute-2（Ago2）Pulldown

将均质化的组织（25mg / mL）在4℃以12,000×g离心10分钟以沉淀细胞碎片。然后将上清液加到25 μ升任一抗小鼠-或抗人抗体Ago2的珠（Wako Chemicals的，目录292-67301和292-66701），其分别为用500预洗涤两次 μ大号裂解缓冲液（ 50mM Tris HCl，100mM NaCl，0.1％Triton X100）。将样品与Ago2抗体珠一起温育过夜，同时在4℃温和旋转。温育后，珠用500洗涤三次 μ大号裂解缓冲液和免疫沉淀的蛋白用100洗脱 μ大号的QuantiGene Plex的裂解混合物（Affymetrix公司，Cat.10093）的同时在95℃下沸腾5分钟42。