抽象
当脂质流入和产生超过肝脏利用/输出甘油三酯的能力时，就会出现肝脏脂肪变性。肥胖促进脂肪变性，其特征在于瘦蛋白抗性。瘦素在肝脏脂质处理中的作用通过以下观察突出显示：重组瘦素通过未知机制逆转脂质营养不良的低瘦弱症患者的脂肪变性。由于瘦蛋白主要通过CNS信号传导起作用，我们在这里检查瘦素是否在一系列立体定位输注实验中通过大脑调节肝脏脂质通量。我们证明脑瘦素通过促进肝脏甘油三酯输出和减少从头脂肪生成而不依赖于热量摄入来防止脂肪变性。Leptin的抗脂肪变性作用在背侧迷走神经复合体中产生，需要肝脏迷走神经支配，当绕过血脑屏障时，它们被保存在高脂肪饮食喂养的大鼠中。因此，CNS瘦蛋白通过脑 - 迷走神经 - 肝轴保护免于异位脂质积聚，并且可以是改善肥胖相关脂肪变性的治疗策略。
介绍
脂肪性肝病与糖尿病和肥胖有关，代表了代谢综合征的肝脏表现1。虽然非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的完整病理生理学仍未完全了解，但通常认为脂肪变性是一个关键的起始事件。当脂质流入和产生的总和超过肝脏利用或输出甘油三酯（TG）的速率时，肝脏脂质积聚。由于TGs被包装成极低密度脂蛋白（VLDL）后出血，因此血浆中TG的主要载体，肝VLDL颗粒的正确产生和分泌是预防脂肪变性和NAFLD的关键先决条件。这个过程的生理重要性说明了遗传消融2，3和药理学抑制 4微粒体甘油三酯转运蛋白（MTP），VLDL组装的限速酶，导致肝脏脂肪变性。载脂蛋白B（ApoB）是VLDL颗粒的主要结构成分，并且其缺失，无论是由于遗传缺陷 5还是用反义寡核苷酸 6的药理学干预，同样导致肝脏脂质积累。因此，VLDL输出到穿梭TG进入脂肪组织代表肝脏过量脂质的关键处置机制，从而避免过度的异位脂质沉积和脂毒性。
严重的肝脏脂肪变性也是全身性脂肪代谢障碍的一个标志，这是一种以缺乏脂肪组织为特征的综合征7。Leptin是一种主要由脂肪细胞分泌的脂肪因子，在患有脂肪营养不良的患者中显着减少。值得注意的是，用重组瘦素替代疗法有效地逆转肝脂肪变性，即使脂肪组织量不恢复8，9。除了低瘦素血症外，瘦素抵抗也是一种常见于肥胖状态的疾病，似乎是肝脏甘油三酯积聚和脂肪变性的主要驱动因素10。其主要作用机制占瘦素作用的抗脂肪肝作用尚未明确界定，但一些人认为，瘦素替代通过改善饮食过量仅仅提高了脂肪肝8，11。这种观点最近受到证据表明，瘦素治疗可改善肝脏脂质含量，主要与脂肪营养不良患者的卡路里消耗减少无关12。如果是这样，肝VLDL输出的刺激代表了瘦蛋白作用的潜在抗脂肪变性机制，其尚未被彻底研究。
在轻度脂肪变性中，肝脏可以通过加速肝脏TG输出来在一定程度上补偿过量的能量供应13，但VLDL分泌平稳并且进展为NAFLD，这表明促进肝脏脂质储存的内源性信号逐渐超过驱动肝脏脂质输出的那些。VLDL分泌可以通过脑和自主神经系统进行调节14，15，16，17，18。我们最近表明，这种信号可以通过大脑中的胰岛素作用诱导。直接向中枢神经系统（CNS）输送胰岛素可促进肝脏脂质输出并防止NAFLD 19，尽管这个反对对肝细胞通过受体的直接胰岛素效应，这导致抑制肝VLDL分泌的19，20，21。因此，高胰岛素血症系统性22，23和长效胰岛素类似物与肝特异性24导致肝脂肪变性。这些研究结果表明，脑肝间干扰的不平衡可能在肝脏TG保留和脂肪变性中起重要作用，导致NAFLD的发展。
由于瘦素主要通过通过在大脑中表达的特异性受体的信号作用25，26和由于脂肪代谢障碍瘦素替代抵消脂肪肝，我们推测瘦素，如胰岛素，可促进肝脏脂质出口，并通过在中枢神经系统表达的受体从NAFLD保护。这一观点得到进一步支持，ob / ob小鼠体内瘦素注射缺乏功能性瘦素基因，肝脏脂质含量较低27和缺乏功能性瘦素受体基因的db / db小鼠患有脂肪肝增大28。外周注射瘦素通常不能在肥胖或糖尿病人体内诱导临床上显着的厌食和降低葡萄糖的作用29，30由于其瘦蛋白抗性。瘦素抗性已部分归因于对跨越血-脑屏障（BBB）瘦蛋白转运的能力有限，从而在大脑中的瘦素浓度未能与肥胖相关的增加的循环血浆水平成比例地上升 31，32。然而，瘦素的厌食作用可至少部分地通过直接输注瘦素肥胖啮齿类动物救出到脑室，其穿过BBB绕过有限瘦蛋白转运 33，34。瘦素对肝脏脂肪变性的可能的脑依赖性而不是直接模式也可能解释了肝脏特异性敲除瘦素受体的小鼠中观察到的正常肝脏脂质含量。28。因此，将瘦蛋白直接递送至CNS可能避免潜在的瘦素转运蛋白缺陷，其在肥胖症中逐渐发展。
在本研究中，我们报告了雄性Sprague Dawley（SD）大鼠的一系列急性和慢性研究，证明CNS瘦蛋白信号传导既促进肝脏TG输出又降低肝脏从头脂肪生成。我们显示肝脏脂质含量的减少与体重和热量摄入的差异无关，并且我们提供证据表明瘦素直接递送至CNS时瘦素对肥胖的作用在肥胖中得以保留。这些结果将瘦蛋白鉴定为通过对大脑的作用有效抵消肝脏脂肪变性的循环肽，并且表明穿过BBB的瘦蛋白转运受损是肥胖相关的NAFLD发展的潜在关键因素。
结果
ICV瘦素激活MBH，PVN和DVC中的STAT3
探索脑瘦蛋白对肝TG分泌信令的影响，雄性SD大鼠分别装有立体输注插管靶向3 次脑的脑室。根据实验方案，从手术中恢复后，禁食和自由活动的大鼠脑室内（ICV）输注瘦素（图 1a））。ICV瘦素输注激活瘦蛋白受体信号级联反应，通过信号转导物和转录激活因子（STAT）3在几个脑室周围脑区域（即下丘脑中下丘脑（MBH），室旁核）的蛋白质裂解物中进行磷酸化评估。下丘脑（PVN）和背侧迷走神经复合体（DVC）。在所有三个检查的脑区域中，脑瘦蛋白在Tyr705处增加STAT3磷酸化2至3倍。（补充图 1a和b）。在4小时急性ICV瘦素输注期间，组间血浆瘦素水平相似（补充表 1）），提示循环瘦素对肝脏的可比直接作用。在ICV瘦蛋白输注4小时后未观察到肝STAT3或STAT5磷酸化的变化（补充图1c和d），进一步支持了这一观点 。
脑瘦素信号传导增加肝脏TG分泌并减少肝脏脂肪变性。一个用于急性ICV输注瘦素实验协议。b血浆TG累积在ICV瘦素/车辆输注大鼠一个泰洛沙泊弹丸注射后（瘦素：1微克/小时; Ñ ≥12每组）。c VLDL分泌率由图1b中描绘的斜率计算 。d急性ICV瘦素/载体输注实验180分钟时血浆样品中ApoB100和ApoB48的Western印迹。Ë从图1的Western印迹分析的定量。 1D（Ñ ≥7每组）。F慢性ICV瘦素/载体实验的方案。克体重和ħ肝脏脂质含量评估由1（：0.3微克/天瘦素）后慢性ICV瘦素/车辆输注28天H-MRS。我从在实验结束时收集慢性瘦素/车辆输注后血浆的ApoB-100和ApoB48的Western印迹分析。j图1i中 Western印迹分析的定量 （ 每组n = 8）。k慢性ICV瘦素/载体输注28天后肝脏脂质含量与基线相比的相对变化。l慢性ICV瘦素受体拮抗剂实验方案。米在用阻断ICV的肽瘦蛋白受体拮抗剂（Leptin受体拮抗剂：6μg/天; 每组n = 5）阻断内源性瘦蛋白信号传导28天期间，通过1 H-MRS 评估肝脏脂质含量的相对变化。所有数据均为±SEM; * p <0.05; ** p <0.01; 通过双尾学生t检验与车辆组比较; 开放圈子：ICV车辆; 黑色方块：ICV瘦素除（m）：ICV瘦素受体拮抗剂外
ICV瘦素可增强肝脏TG分泌，减少脂肪变性
我们接下来通过颈静脉导管注射泰洛沙泊推注后研究肝脏TG分泌。Tyloxapol阻断VLDL水解，从而阻止VLDL颗粒的清除，从而使所有新合成的VLDL在血浆中产生。由于在肠道中产生的乳糜微粒不是禁食> 4小时的动物血浆TG的重要来源，因此血浆中TG的逐渐积累可以计算肝脏VLDL分泌率15。急性ICV瘦素输注使肝脏甘油三酯输出增加约30％（图 1b，c）与载体输注（人工脑脊髓液; ACSF）相比。与增加的VLDL颗粒产生率一致，血浆中的ApoB100增加了20％。大鼠肝细胞也产生ApoB48，其在急性ICV瘦蛋白输注后也被上调（图 1d，e）。瘦素诱导的TG动员不依赖于血浆葡萄糖水平（补充图2a），胰岛素，游离脂肪酸，游离甘油和酮体（补充表 1）的差异 ，以及短期内VLDL分泌率的升高（4小时）瘦素输注不足以导致最终肝脏脂质含量立即可检测到的变化（补充图 2b））。为了评估，脑瘦素信号传导的慢性刺激是否会在较长时间段内影响肝脏脂质含量，我们接下来连续输注ICV瘦素或载体4周（图 1f中的方案）。使用触发动物呼吸的局部1 H-磁共振波谱（1 H-MRS）在麻醉的大鼠中非侵入地测量肝脏脂质含量，该方法允许在体内连续非侵入性评估肝脏脂肪。通过与Folch提取后的常规TG测量相比较，成功地证实了该方法的有效性（补充图 2c））。为了通过瘦素诱导的食物摄入和体重减少来排除间接作用，对照大鼠进行热量限制以获得两组中的匹配体重曲线（图 1g ;补充图 1d和e）。与急性瘦素输注反应中观察到的肝脏TG分泌增加相一致，与体重匹配的载体对照相比，连续一个月的ICV瘦素输注使肝脏脂质含量降低约30％（图 1h和补充图 2f））和增加循环ApoB100水平（图 1i，j）。ApoB100作为VLDL分泌的间接量度，因为每个VLDL粒子含有一个ApoB100分子。与基线相比，瘦素暴露的动物肝脏脂肪损失是对照大鼠的两倍（图 1k），表明瘦素诱导的肝脏脂肪减少只有一半可归因于其厌食作用引起的体重减轻。长期瘦素处理的动物必须摄取稍多的食物（补充图 2d）以匹配对照的体重，很可能是因为瘦素增加了能量消耗35。值得注意的是，慢性瘦素输注不仅改善了肝脏TG含量，还降低了循环游离脂肪酸，甘油三酯，总酮体，胰岛素和葡萄糖水平，表明代谢健康和胰岛素敏感性以不依赖于体重的方式得到改善（补充表） 1）。相反，通过注入瘦素受体拮抗剂阻断大脑中的内源性瘦素信号（LPR拮抗剂;图协议 1升）导致肝脂肪变性（图 1米），而不在体重和食物摄入（补充图变化 2克-I ）。LpR拮抗剂缺乏orexigenic作用可能是因为与其他研究相比，我们使用了更低剂量的LpR拮抗剂36。
瘦素对肝脏脂质代谢的影响是由脑介导的
除了脑之外，肝细胞还表达瘦蛋白受体37，尽管这些主要是短的同种型38，其缺乏长形式所涵盖的全范围信号传导所需的细胞内结构域。为了排除ICV注入瘦素进入体循环的渗漏通过对肝细胞的直接作用影响肝脏脂质含量，我们重复慢性输注实验，输入先前在ICV实验中使用的瘦素剂量通过植入腹膜的渗透微型泵（图 2a）。腹腔注射（IP）瘦素对肝脏脂质含量（图2b），食物摄入量，体重没有影响 （补充图 3a-c））和循环葡萄糖或脂质（补充表 2）。此外，我们使用他莫昔芬诱导型瘦素受体敲除（LpRΔPER）对禁食小鼠进行了泰洛沙普输注研究（图 2c），并将其与年龄匹配的他莫昔芬注射对照进行比较。在该Rosa26 Cre表达小鼠品系中，他莫昔芬在外周组织中删除LpR，但不以足够的量穿过BBB以引起CNS 26中LpR的丧失。我们发现外周LpRs的这种特异性减少（肝脏中约70％;补充图 3f）不影响肝脏TG分泌（图 2d，e），体重或循环葡萄糖（补充图 3d和e））表明外周瘦蛋白受体在控制肝脏VLDL分泌中不重要。该发现与先前的报告一致，未能检测到这些小鼠的代谢表型26。
瘦素对肝脏脂质代谢的影响是集中介导的。一个在大鼠慢性IP瘦素输注协议（瘦素：0.3微克/天;在ICV实验中使用的相同的剂量;图 1F）。b IP瘦蛋白/载体输注28天后的肝脏脂质含量（ 每组n = 5）。c在他莫昔芬诱导型LpRΔPER和对照小鼠中进行泰洛沙泊输注实验的方案。d在6小时禁食的LpRΔPER和对照（每组≥7）中，在泰洛沙泊推注后血浆TG积累。e肝脏VLDL分泌率由图2d中的斜率计算 。所有数据均为±SEM; 通过双尾学生t检验在瘦素和对照之间未观察到显着差异; （b）开放圈子：知识产权车辆; 黑色方块：IP瘦素; （d，e）空心圆圈：控制; 黑色方块：他莫昔芬诱导型瘦素受体敲除（LpRΔPER）小鼠
CNS瘦蛋白抑制肝脏从头脂肪生成
为了更好地了解ICV瘦素诱导的肝脏TG动员增加的分子机制，我们分析了4小时ICV瘦素注射动物肝脏中微粒体甘油三酯转运蛋白（MTP）的蛋白质表达。MTP是VLDL装配中的限速酶，其与蛋白质二硫键异构酶（PDI）形成异二聚体，并且与增加的TG通量一致，我们观察到其肝脏表达的适度但显着的增加（图 3a）。）。除了促进TG分泌外，CNS瘦素还可通过抑制肝脏从头脂肪生成来减少肝脏脂质。为了支持这种可能性，急性和慢性瘦蛋白输注均降低了肝脏中蛋白质表达以及脂肪酸合成酶（FAS）的酶活性。乙酰辅酶A羧化酶（ACC）仅在慢性脑瘦素暴露后才下调。（图 3a-f）。由于FAS是一种用于从头脂肪生成的限速酶，这些数据表明脑瘦素也能够减少肝脏从头脂肪生成。与此假设一致，ICV瘦素输注4周后收获的肝组织脂肪酸谱显示肝脏脂质物种普遍减少（图 3g））。单个脂质种类的测定允许计算指示SCD1 39活性的肝硬脂酰辅酶A去饱和酶1（SCD1）指数，SCD139 是用于形成单不饱和脂肪酸的限速酶。大鼠中ICV瘦素显着降低SCD1指数（图 3h），与之前的研究报道ICV瘦素注射小鼠的肝SCD1活性降低40。与上述研究结果一致表明肝脏从头脂肪生成减少，我们观察到ICV瘦素输注2周后新合成的肝脏三酰基甘油酯（TAG）物种显着减少，同时应用氘代水后检测到（D 2）O）和通过质谱分析以评估体内从头脂肪生成（图 3i，j）。血浆TAG富集与脂质物种和治疗组的肝脏TAG富集显着相关，表明血浆TAG反映了肝脏脂质的产生（补充图 2m）。总肝脏TAG含量降低，我们还检测到肝脏二酰基甘油（DAG）显着降低（图 3k，1）。这些发现与体重变化无关; ICV瘦素输注2周后，与体重匹配的对照相比，累积食物摄入量相似（补充数据 2j-l））。因此，脑瘦蛋白不仅通过增加肝脏VLDL分泌而且通过抑制肝脏从头脂肪生成来降低肝脏TG含量。
CNS瘦蛋白抑制肝脏从头脂肪生成。一个 Western印迹对FAS，ACC，MTP和从急性ICV输注瘦素实验（图肝脏PDI 1A）。b Western印迹的定量从图分析。 图3a（Ñ 每组≥7）。Ç急性ICV瘦素/车辆输注后肝FAS活性（Ñ 每组≥6）。d来自慢性瘦蛋白/载体输注实验的肝组织裂解物的Western印迹分析（图 1f）。e图3d中 Western印迹分析的定量 。f慢性瘦素/载体输注后的肝脏FAS活性（ 每组n = 8）。g在慢性瘦素或载体输注后第28天收获的肝组织的脂肪酸谱（ 每组n = 8）。h SCD1活性指数由图3g中脂肪酸谱的18：1（油酸）/ 18：0（硬脂酸）的比例计算 。i用于饮用水中6％D 2 O的慢性2周输注实验的方案。Ĵ脂肪酸从头合成（DNL）的三酰基甘油酯（TAG）在2周内慢性ICV瘦素或媒输注（的后收获肝脏组织中测量物种Ñ 每组≥5）。在图 3g和j中，数据描述为相对于媒介物注入的动物的％变化。ķ，升肝TAG（k）和DAG（L）的含量（Ñ ≥每组5）。所有其他数据均为平均值±SEM; * p <0.05; ** p <0.01; 通过双尾学生t检验，与载体组相比，*** p <0.001 ; 开放圈子：ICV车辆; 黑色方块：ICV瘦素
需要肝迷走神经支配以减少脂肪变性
因为有证据表明，中枢神经系统通过交感和副交感神经系统调节肝脏脂质代谢17，41，接下来我们问其自主神经系统的分支输送从大脑到肝脏瘦素受体信号。我们进行了肝脏特异性交感神经切除术和肝脏分支迷走神经切断术，并测试了是否保留了慢性ICV瘦素的作用（方案描述于图 4a）。由于肝脏的显微外科交感神经切除术即使在有经验的手中也具有一些可重复性问题，并且由于邻近的胆管和血管结构的创伤可能会复杂化42，我们使用6-羟基多巴胺（6-OHDA）门静脉推注，这是一种专门针对交感神经元和纤维的神经毒素。先前在猫中进行的类似研究表明6-OHDA 43具有高的首过效应。基于剂量研究（补充图 4a），我们选择了一种剂量，可以将肝去甲肾上腺素水平可靠地降低90％，对肝外部位的影响最小（补充图 4b和c）。然而，选择性肝交感神经切除术不影响ICV瘦素降低肝脏脂质含量（图 4b）或循环TGs的能力（补充表 3））。由于对照组的食物限制，这些结果获自具有相当体重的大鼠组（补充图 4d-f）。与肝脏特异性交感神经切除术的效果相反，肝支迷走神经切断术完全消除了ICV瘦素对肝脏脂质含量的影响（图 4c ;补充图 4g-i），表明迷走神经传递了瘦素信号。大脑到肝脏。接下来我们检查了在急性情况下是否也可以观察到这种效应（图 4d中的方案）。与慢性输液实验一致，ICV瘦素丧失了增加肝脏TG分泌的能力（图 4e，f））并且在进行肝迷走神经切断术的大鼠中减少肝脏FAS活性（补充图 4m）。循环水平的葡萄糖，胰岛素和瘦素不受影响（补充图 4j和补充表 3），后者证实瘦素没有从脑进入外周循环。
ICV瘦素需要完整的迷走神经支配以调节肝脏脂质代谢。选择性肝交感神经切除术（Sx）或迷走神经切断术（Vx）后慢性ICV瘦素/载体输注研究的研究时间表。b，c ^选择性肝交感神经术后肝脂含量（Ñ ≥每组4只）（b）和肝脏迷走神经切断（Ñ ≥每组4只）（ç后连续ICV瘦素/车辆输注28天）（瘦素：0.3微克/天）。d研究接受4小时ICV瘦素/载体输注的肝迷走神经切断术大鼠中的泰洛沙普输注研究的时间表和方案。Ë的IV推注泰洛沙泊后血浆甘油三酯的逐渐积累（Ñ 每组≥3）。f从图4e所示的斜率计算VLDL分泌率 。克等离子增加TG水平以下的靶向4小时瘦素/车辆输注直接进入mediobasal丘脑后泰洛沙泊丸药（MBH; ñ 每组≥5）。h VLDL分泌率由图4g中的斜率计算 。我等离子体增加TG水平以下的靶向4小时瘦素/车辆输注后一个泰洛沙泊丸直接进入背侧迷走神经复合体（DVC）。j从图4i中的斜率计算的VLDL分泌率 （Ñ 每组≥3）。所有数据均为±SEM; * p <0.05; ** p <0.01; 如果没有用括号表示，则与车辆组相对 双尾学生t检验不显着; 开放圈子：车辆; 黑色方块：瘦素; 向下的绿色三角形：ICV车辆加肝Sx; 向上的紫罗兰色三角形：ICV leptin加肝Sx; 向下的蓝色三角形：ICV车辆加肝Vx; 向上的红色三角形：ICV leptin加肝Vx
DVC中的瘦蛋白受体调节肝脏脂质代谢
我们接下来检查了哪个脑区介导了脑瘦素的抗脂肪变性作用。虽然MBH已知参与对食物摄取，葡萄糖和脂质代谢CNS-瘦素介导的作用44，45，急性立体瘦素输注直接进入使用中所描绘的相同的协议的MBH图 1a中没有影响肝VLDL分泌（图 4g，h）。这与我们之前关于CNS胰岛素作用19的研究结果一致，提示MBH不是CNS中参与控制肝脏TG分泌的关键解剖区域。由于传出迷走神经运动神经元起源于DVC，这是一个可能参与调节CNS调节VLDL分泌17的脑区域，我们接下来检测了在泰洛沙泊输注研究中立体定位双侧输注瘦素直接进入DVC。实际上，DVC瘦素输注再现了ICV输注到第三脑室的效果（图 4i，j），表明DVC中瘦素受体的刺激引发调节肝脏脂质代谢的迷走神经信号。系统性瘦素和葡萄糖水平在DVC和MBH输注实验中均未受影响（补充图 4k和1）; 补充表 4）。
ICV瘦素在肥胖症中保持了抗脂肪变性作用
已经证明大脑瘦蛋白信号传导降低了代谢健康大鼠食物中的肝脏脂质含量，我们接下来在代谢攻击的大鼠中检查了这些效应。肥胖通常会导致瘦素抵抗和高瘦素血症，这与外周给予瘦素以改善代谢控制有关46。然而，至少在啮齿动物中，ICV瘦蛋白施用部分恢复CNS瘦蛋白信号传导的代谢作用，表明瘦蛋白的BBB转运减少有助于瘦蛋白抗性33。我们在慢性ICV瘦素输注之前和期间给雄性SD大鼠喂食60％高脂饮食（HFD）4周（图5a中描述的方案） ）。由于我们认为引起瘦素抵抗的脂肪量较高，我们将每日ICV瘦素剂量增加了3倍。同样，通过限制性喂养方案匹配载有媒介物的对照大鼠的体重（补充图 5a-c）。在这些条件下，与对照组相比，ICV瘦素的肝脏脂质含量减轻30％，与食物喂养对照相比几乎相当于肝脏TG含量（补充图 2f），表明ICV瘦素的抗脂肪变性作用是很大程度上保留了（图 5b）。与之前的实验一样，ICV瘦素输注显着抑制了肝脏从头脂肪生成中涉及的关键蛋白的表达（图 5c，d））。值得注意的是，在慢性ICV瘦蛋白输注的HFD喂养的大鼠中，通过在MBH和DVC的活组织检查中在Tyr705处的STAT3磷酸化评估的瘦蛋白信号传导被保留（补充图 5d和e）。然而，当急性注射IP时，瘦素不能分别在DVC和MBH中诱导STAT3磷酸化（补充图 5f和g），这表明外周注射的瘦蛋白在肥胖状态下没有充分转运穿过BBB。总体而言，这些数据表明ICV递送的瘦蛋白激活CNS中的STAT3信号传导并且即使在肥胖状态下也保持其抗脂肪变性作用。
讨论
在这里，我们证明大脑瘦素信号传导增加TG输出并减少大鼠肝脏中的从头脂肪生成，其在几周内降低肝脏脂质含量，而不依赖于体重和食物摄入的变化，并且没有任何伴随的高甘油三酯血症。在中枢神经系统内，DVC似乎是调节瘦素对肝脏脂质代谢影响的关键部位，这取决于肝脏的副交感神经支配（图 6）。）。因此，我们的研究表明，瘦蛋白作为生理信号起作用，通过脑 - 迷走神经 - 肝脏轴起作用以保护生物体免于肝脏中的异位脂质积累。在这方面，必须指出的是，虽然是在老鼠和人类之间的肝脏的交感神经支配模式相当大的差异，胆碱能神经纤维分布显示在这两个物种非常相似的模式是非常重要的47，48。因此，我们推测，这一新特点的监管途径，使对脂肪肝与下瘦素治疗，直到现在还常常被归咎于瘦素引起厌食和体重减轻脂肪代谢障碍的受试者改善作出了重要贡献8，11。因为最近的研究声称通过严格控制脂肪代谢障碍患者的热量摄入仍然可以改善肝脏脂肪变性12，本研究提供了一种潜在的机制，通过这种机制，瘦素可以改善肝脏脂肪变性，超过其对食欲和体重的良好特征性影响。由于我们仅针对啮齿动物模型记录了这一点，因此需要进一步研究以评估该机制是否也适用于人类。对健康人和患有脂肪营养不良的患者进行的研究检查肝脏VLDL分泌也将为重组瘦素作为治疗肥胖相关NAFLD的新药的潜在用途提供关键证据，目前还没有临床有效的治疗方法。
建议的CNS瘦素在调节肝脏脂质代谢中的作用模型。白色脂肪细胞分泌的瘦蛋白保护肝脏免于异位脂质积聚和脂毒性。瘦素通过血脑屏障到达大脑，通过背侧迷走神经复合体中的信号传递来增加TG分泌并减少肝脏从头脂肪生成，其中传出迷走神经运动神经元位于其中。这些中枢介导的瘦素效应需要完整的肝迷走神经支配，并且当瘦素直接施用于脑中时在HFD条件下保存。
尽管存在外围瘦素受体，瘦素的代谢作用似乎通过脑中主要介导25，28。然而，有报道称，瘦素直接调制脂质代谢中分离的大鼠肝脏，尽管有些矛盾的结果，从瘦素诱导的积累肝脂质的消耗49，50。最终，我们不能完全排除瘦素在肝脏中的直接作用对全身给药后的瘦素作用有贡献，但在我们的研究中，我们没有检测到瘦素全身输注时对肝脏脂质含量的慢性影响（IP）（图 2a，b））。当以相同剂量集中给药（ICV）时，我们看到肝脏脂质含量显着降低，而与体重或饮食的差异无关（图 1g和5b）。加上急性瘦素输注ICV或直接进入DVC引起的VLDL分泌率增加20-30％（图 1b和4i），我们的研究结果表明脑依赖性瘦素作用具有临床重要作用。关于肝脏脂质处理。支持这一结论，小鼠模型与脑中正常LPR的表达，但降低了LPR表达在肝或在整个周边（如在我们的研究中提出）的开发没有明显的表型脂肪变性26，28并且在泰洛沙普输注研究期间显示未改变的VLDL分泌速率（图 2d）。与此相反，遗传模型具有破坏的脑瘦蛋白如在db / db小鼠和神经元LPR敲除小鼠信令，例如，具有扩大的脂肪肝26，28。因此，在我们的研究中，阻断脑中的内源性瘦素信号传导导致肝脏脂质积累（图 1m）。总之，所有这些发现强烈地主张中枢介导的瘦素效应，并且充其量是肝脏LpRs在肝脏脂质代谢调节中的微小贡献。由于我们发现只有慢性瘦素输注到脑室空间导致肝脏脂质含量的可测量变化，我们认为瘦素主要与体脂肪储存成比例分泌，而非长期调节肝脏脂质含量。分钟控制新陈代谢，如在禁食到喂食过渡期。这个概念是由瘦素水平仅适度在人类中通过饲喂，空腹或昼夜节律调节的发现支持51，52。
除了脂质出口和脂肪酸从头合成，瘦素也与在各种组织，包括肝脏增加β氧化相关53，54。虽然我们尚未直接测量肝脏β-氧化，但缺乏大脑瘦素诱导的过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）α肝蛋白表达的变化，这被认为是瘦素介导的脂质氧化的重要调节因子54，但并不建议在我们的实验装置中肝脏β-氧化的主要作用（补充图 6a和b）。此外，循环酮体显着减少50％，并且ICV瘦素输注不会改变脂质衍生的循环长链酰基肉碱，这种情况通常在受到刺激的β-氧化情况下增加，如空腹和HFD喂养55，也反对肝脏脂质氧化的增加（补充表 1和补充图 6c和d）。其他报道了可比较的结果，并显示当胰岛素缺乏型1型糖尿病的高血糖模型中全身输注瘦蛋白时，酮生成被抑制56。我们的研究表明慢性CNS瘦素浓度非常低（比56年使用的全身输注低50倍））在正常血糖，正常胰岛素状态下也减少酮生成，而与体重差异无关，再次突出了CNS在瘦素作用中的关键作用。
我们进一步观察到经历慢性ICV瘦素输注的大鼠中循环血浆瘦素的减少，其在常规饲料和HFD下均发生，尽管在治疗和对照动物中体重相当（补充表 1和5）。这种反应可能是由ICV瘦素引发的特定脂肪量减少所致，这明显超出了通过食物限制进行体重匹配的对照组的降低（ICV瘦素与媒介物：在食物条件下，附睾脂肪质量减少78％） ; 通过双尾学生测试，p = 0.0002对比车辆，在HFD条件下减少44％; 通过双尾学生测试，p = 0.07对比车辆;补充表 1和5）如也被别人观察到57，58。这些影响可能是由于中央瘦素的激活脂肪分解和白色脂肪组织中抑制脂肪酸从头合成能力45，57。值得注意的是，在长期ICV瘦素治疗的大鼠中观察到全身性低瘦素血症也增加了针对瘦蛋白的外周激素作用的证据。
瘦素抗性与肝TG累积相关10，59和高循环瘦蛋白水平，这有可能增加瘦素抗性的反射，并与相关NAFLD 60。跨越BBB的瘦蛋白转运是可饱和的61。因此，尽管在肥胖，瘦素抵抗，状态中全身瘦素水平增加，但CNS中的相对低瘦蛋白血症发展。我们在HFD喂养的动物发现了ICV瘦素保留了对脑STAT3信号，肝脂含量和效果脂肪酸从头合成提供了用于瘦素抗性可以通过直接CNS施用部分地克服概念证据33，34。由于神经肽如瘦蛋白可以通过鼻内给药途径递送到CNS中，因此鼻内瘦素治疗可能是NAFLD中可能的未来治疗策略。已经进行了啮齿类动物概念实验的证明并且提供了有希望的结果，例如，瘦素的厌食效应在饮食诱导的肥胖大鼠鼻内接受瘦素62中得以保留。此外，用放射性标记的瘦蛋白证明全身性高瘦素血症不会妨碍鼻内给予瘦素进入大脑63。进一步支持这一概念，我们在这里显示，瘦素的鼻内给药可以在DVC中急性磷酸化STAT3，表明瘦素被快速摄入大脑（补充图 1e））。我们的研究支持这样的观点，即在CNS中直接靶向瘦蛋白信号传导途径可以规避潜在的瘦蛋白转运蛋白缺陷，因此可能具有治疗NAFLD的治疗潜力。基于这些发现，似乎有希望测试鼻内瘦素是否克服了肥胖和2型糖尿病患者的瘦素抵抗。然而，虽然鼻内瘦素给药在啮齿动物研究中显示出有希望的结果，但在人体中的临床应用具有某些局限性：当鼻内施用肽激素时必须施用相对高的剂量。由于重组瘦蛋白是昂贵的，因此鼻内瘦素的人体试验目前不可行。此外，通过鼻粘膜的可变吸收可能是一个问题。然而，64，65或共同注入与还原在肥胖状态下瘦蛋白敏感性肽或药物瘦素 66。
总之，我们显示大脑中的瘦素信号通过刺激TG分泌和减少脂质生成而不诱导高甘油三酯血症来保护肝脏中的异位脂质积聚。值得注意的是，当将瘦蛋白直接施用于第三脑室时，这些效应大部分保存在肥胖动物中。因此，脑瘦素信号传导的刺激可能是一种改善肝脏脂肪变性的策略，不仅可以改善脂肪营养不良，还可以改善肥胖和糖尿病等疾病。
方法
动物和道德批准
所有实验均在大约10周龄的雄性Sprague Dawley（SD）大鼠中进行，所述大鼠喂食标准饲料（嗅R / MH Alleinfutter，sniff Spezialdiaeten GmbH，Soest，德国）或高脂肪饮食（HFD; 60％）。来自脂肪的卡路里; D12492，Research Diets，Brogaarden，Denmark）。大鼠购自奥地利维也纳医科大学实验动物研究和遗传学系或法国Janvier实验室。所有动物随意接受自来水并在12小时光照/ 12小时黑暗循环中在单独的笼子中保持在室温下。对于所有外科手术，大鼠最初用氯胺酮和甲苯噻嗪的混合物麻醉，然后在用改进的14号静脉内（IV）套管（Venflon，BD，Switzerland）插管后保持在异氟烷吸入麻醉下。我们遵守了动物测试和研究的所有相关道德规范，并且实验程序得到了奥地利联邦科学，研究和经济部的批准（BMWFW-66.009 / 0246-WF / V / 3b / 2015）。小鼠实验由纽约州纽约西奈山医学院国际动物护理和使用委员会批准（IACUC LA09-00174）。
急性泰洛沙普输液研究
Tyloxapol研究（图1a和4d中概述的方案 ）如其他地方所述进行19。简言之，给大鼠植入针对第三脑室的22号单导管（PlasticsOne，Roanoke，VA）（ICV;坐标：矢状缝上前囟后2.5mm，皮质表面下9mm）或26 -gauge双套管针对背侧迷走神经复合体（DVC;坐标：前囟后部13.3 mm，中线0.6 mm，皮质表面下6.9 mm）或下颌中下丘脑（MBH;坐标：距前囟后3.3 mm，0.4中线mm;皮质表面下9.6 mm）。此外，所有大鼠都接受了留置的颈内静脉导管，用于采血和注射。在输液实验之前，我们允许大鼠从个体笼中的手术中恢复5-7天。
在PBS，pH7.4中以80mg / ml的浓度制备泰洛沙泊溶液（Triton WR-1339，T0307，Sigma Aldrich，Germany）。在泰洛沙泊输注实验之前将动物禁食5-6小时，以排除由胃肠道乳糜微粒分泌引起的甘油三酯（TG）在血浆中出现引起的肝VLDL通量的过高估计。通过插入预植入引导插管的1mm投影（PlasticsOne，Roanoke，VA）的输注插管，禁食大鼠在4小时内接受连续ICV，DVC或MBH输注（时间点-60分钟至180分钟; ICV输注率0.083μl/ min，DVC和MBH输注率0.0055μl/ min /侧）与leptin（ICV1μg/ h; DVC和MBH0.05μg/ h; Protein Laboratories Rehovot Ltd.，Israel）或人工脑脊液作为车辆（ACSF，Tocris，UK）。在0分钟的时间点，通过预植入的静脉导管给大鼠施用IV tyloxaypol丸剂（600mg / kg）。在整个实验期间，大鼠有意识并允许其在笼子中自由移动。在-60,0,30,60,90,120,150和180分钟的时间点通过静脉导管采集血样用于测量血浆TG。在输注期结束时，通过致死性IV注射氯胺酮然后断头处死大鼠。VLDL分泌率由血浆中累积的TG随时间的斜率通过线性回归分析计算，假设TG的平均分子量为884克/摩尔，VLDL的平均分布容积为0.042 ml / g体重。在整个实验期间，大鼠有意识并允许其在笼子中自由移动。在-60,0,30,60,90,120,150和180分钟的时间点通过静脉导管采集血样用于测量血浆TG。在输注期结束时，通过致死性IV注射氯胺酮然后断头处死大鼠。VLDL分泌率由血浆中累积的TG随时间的斜率通过线性回归分析计算，假设TG的平均分子量为884克/摩尔，VLDL的平均分布容积为0.042 ml / g体重。在整个实验期间，大鼠有意识并允许其在笼子中自由移动。在-60,0,30,60,90,120,150和180分钟的时间点通过静脉导管采集血样用于测量血浆TG。在输注期结束时，通过致死性IV注射氯胺酮然后断头处死大鼠。VLDL分泌率由血浆中累积的TG随时间的斜率通过线性回归分析计算，假设TG的平均分子量为884克/摩尔，VLDL的平均分布容积为0.042 ml / g体重。在输注期结束时，通过致死性IV注射氯胺酮然后断头处死大鼠。VLDL分泌率由血浆中累积的TG随时间的斜率通过线性回归分析计算，假设TG的平均分子量为884克/摩尔，VLDL的平均分布容积为0.042 ml / g体重。在输注期结束时，通过致死性IV注射氯胺酮然后断头处死大鼠。VLDL分泌率由血浆中累积的TG随时间的斜率通过线性回归分析计算，假设TG的平均分子量为884克/摩尔，VLDL的平均分布容积为0.042 ml / g体重。
慢性脑输液
如图1和图2所示，在SD大鼠中进行慢性脑瘦素输注研究。 1f，l和5a。用靶向第三脑室的脑立体定位输注套管手术植入大鼠（ICV;坐标：距矢状缝上的前囟后2.5mm，皮质表面下10mm; PlasticsOne，Roanoke，VA）。将套管连接到位于颈部皮下的渗透性微型泵（ALZET Model 2004，Cupertino，CA），允许连续ICV输注连续28天，使用瘦素（0.3微克/天用于食物喂养的动物，0.9微克/天用于HFD喂养的动物），瘦蛋白受体拮抗剂（LpR拮抗剂;6μg/天; Protein Laboratories Rehovot Ltd.，Israel），或载体（ACSF，Tocris，UK）。手术后，将动物单独饲养。每天监测食物摄取和体重，并且ICV瘦素输注实验中的对照大鼠被食物限制以与相应的瘦蛋白输注组保持相似的体重。食物限制的动物在下午每天接受一份食物。我们经常检查喂养模式，发现他们在一天中的几餐中消耗了他们的食物部分，而不是显示任何暴饮暴食行为。为了进一步确保在HFD食物限制动物中没有暴食，这些组在一天中均匀分布三份食物。肝脏脂质含量通过非侵入性评估 我们经常检查喂养模式，发现他们在一天中的几餐中消耗了他们的食物部分，而不是显示任何暴饮暴食行为。为了进一步确保在HFD食物限制动物中没有暴食，这些组在一天中均匀分布三份食物。肝脏脂质含量通过非侵入性评估 我们经常检查喂养模式，发现他们在一天中的几餐中消耗了他们的食物部分，而不是显示任何暴饮暴食行为。为了进一步确保在HFD食物限制动物中没有暴食，这些组在一天中均匀分布三份食物。肝脏脂质含量通过非侵入性评估1例 H-MRS在套管植入前两天和术后28天在短暂异氟醚麻醉的大鼠中或通过在死后的肝组织中的改良的Folch提取。注意，使用MR兼容的ICV输注试剂盒和渗透微型泵进行1 H-MRS。手术后28天处死动物，收获肝组织和EDTA处理的血浆用于进一步分析。
肝脏1 H-MRS
磁共振波谱在Biospec 9.4 T / 30 cm MR系统（Bruker Biospin，Ettlingen，GER）上使用86 mm 1进行用于发射的H调谐谐振器和用于信号接收的四通道射频线圈阵列。在系统制造商提供的动物支架上的俯卧位用异氟烷/氧气混合物麻醉动物。通过MR兼容的小动物监测和门控系统（SA Instruments Inc.，Stony Brook，NY，USA）监测生命功能（ECG，呼吸频率，温度），并用水加热垫将体温保持在37℃。 。通过短回波时间单体素MRS序列（刺激回波采集模式，TE = 3ms，TR = 5000ms，NS = 32）进行肝内脂质的测量而没有水信号抑制。感兴趣的体积为6×6×6 mm 3放置在肝实质内，数据采集与动物的呼吸运动同步。离线处理MRS数据，并且使用水（W）和脂质的亚甲基（L; CH2-1.25ppm和CH-3 0.9ppm）的信号强度来定量肝脏中的脂质含量，因为肝内脂质含量= [L /（L + W）]并以百分比给出。
慢性腹腔内瘦素输注研究
用预填有瘦蛋白或载体（ACSF，Tocris，UK;图2a中的方案）的渗透微泵（ALZET Model 2004，Cupertino，CA）腹膜内植入动物 。我们输注与慢性ICV输注实验IP（0.3μg/ d）相同的剂量，以排除ICV输注瘦素进入外周导致对肝脏的直接影响。
诱导外周LpR KO小鼠（LpRΔPER小鼠）
他莫昔芬诱导型LpRΔPER（LpR flox / flox Rosa26 Cre-ERT2 / +）和对照小鼠（LpR flox / flox）是来自Yiying Zhang和Streamson Chua Jr.（哥伦比亚大学，纽约州）的礼物。该研究（图2c中概述的方案 ）在他莫昔芬诱导（IP三苯氧胺注射，剂量为1mg /天，每只小鼠，连续5天）20至32周龄之后5至10周进行。通过SYBR Green qPCR评估，我们实现了肝脏中LpR的70％敲低（补充图 3f））。野生型LpR的引物序列是（正向）5'-GGACTGAATTTCCAAAAGCCTG-3'和（反向）5'-CATAGCTGCTGGGACCATC-3'和（正向）5'-GCATACAGGTCCTGGCATCT-3'和（反向）5'-CCATCCAGCCATTCAGTCTT- CYP A为3'。使用Δ-Δ-C t方法（2- ΔΔCt）分析数据）。在快速5-6小时后，在0分钟的时间点通过尾静脉采样收集基线血液样品。然后通过尾静脉注射Tyloxapol（500mg / kg体重）。在注射泰洛沙泊期间将小鼠约束2-3分钟，但之后能够在各个笼子中自由移动，除了在注射泰洛沙泊后1小时和2小时快速收集额外的血液样品之外。在最后一次取样（时间点2小时）后，用异氟烷麻醉小鼠并通过颈脱位法杀死小鼠。
从头脂肪生成体内分析
大鼠配有靶向第三脑室的立体定位脑输注套管，所述第三脑室与位于颈部皮下的渗透性微型泵相连。在2周的过程中，大鼠接受载体或瘦素ICV。详细协议如图3i所示 。外科手术与上述慢性输注方案相同。手术后，所有大鼠接受35ml / kg体重D 2 O，用0.9％NaCl ip推注。然后大鼠继续接受6％的D 2O在他们的饮用水中。用改良的Folch法提取肝组织中的TAG和DAG种类。简言之，用组织溶解器将约25mg肝组织匀浆（2个循环，在25Hz下1分钟），并用600μl氯仿：甲醇（3：1）和100μl水提取DAG和TAG种类。 ，增加内部标准。用配备有ZORBAX Eclipse Plus C18 2.1×100mm1.8μm柱的UHPLC（1290 Infinitiy，Agilent，Santa Clara，CA）分离脂质类别，并用质谱法测量相应TAG物质中的氘富集（6540 QTOF，Agilent，Santa克拉拉，加利福尼亚州）。使用内标标准定量TAG和DAG：TAG（15：0/15：0/15：0）和DAG（17：0/17：0）（Larodan，Solna，SE）。m + 1 / m + 0面积比校正背景; 通过将TAG物种中的氘富集除以交换的氢的数量来量化从头脂肪生成，通过前体水富集（6％）标准化67。为了更广泛地了解肝脏从头脂肪生成，我们分析了每个不同TAG类中氘的掺入（％富集）。对于血浆TAG分析，用200μl冷甲醇将20μl血浆脱蛋白，并将上清液注入仪器中。对于补充图6a中的血浆/肝脏TAG相关性分析， 仅包括对总TAG峰面积贡献> 0.1％的血浆TAG类别。
迷走神经肝支迷走神经切断术
如其他人所述，进行腹侧膈下迷走神经干或假手术的肝分支的迷走神经切断术68。简而言之，在腹侧中线上做了一个小切口。切断胃肝韧带以去除肝脏和食道之间的结缔组织，以暴露下行腹侧食管和腹侧膈下迷走神经干。使用溶解在盐水中的0.1％甲苯胺蓝显现肝分支并横切。为了使神经恢复的可能性最小化，用70％乙醇中的10％苯酚溶液轻拍断开的神经末梢。用缝合线封闭腹壁和皮肤。对于假手术，除了横切迷走神经分支和苯酚处理外，采用相同的程序。在10天的恢复期后，在泰洛沙泊研究中进行急性ICV瘦素/媒介物输注。
肝脏特异性交感神经切除术
通过向门静脉推注6-羟基多巴胺（25mg / kg; 6-OHDA），一种特异性靶向交感神经纤维的神经毒素或载体（盐水中0.1％抗坏血酸;以及对照组）进行肝脏特异性交感神经切除术。假控制）。注意，在单独的剂量发现研究中确定了适当剂量的6-OHDA，其中注射剂量范围为10至50mg / kg体重。对于门静脉内6-OHDA注射，沿着白线进行中线切口。将结肠轻轻地布置在浸泡在盐水中的无菌棉纱布上，直到肠系膜血管清晰可见。肠系膜静脉用端口细管（ID 0.58×OD 0.96 mm）插管，并将管尖推进肝门进入门静脉。然后在2分钟内缓慢注射6-OHDA，并移除管道，用组织胶密封穿刺部位。将结肠返回腹腔，用缝线封闭肌肉和皮肤切口。在交感神经切除术后立即给大鼠植入脑输注试剂盒和渗透微泵，以启动如上所述的ICV慢性输注研究。由于具有显着的首过效应，肝脏是药物交感神经切除术的主要靶器官，而其他组织未受到显着影响（补充数字）在交感神经切除术后立即给大鼠植入脑输注试剂盒和渗透微泵，以启动如上所述的ICV慢性输注研究。由于具有显着的首过效应，肝脏是药物交感神经切除术的主要靶器官，而其他组织未受到显着影响（补充数字）在交感神经切除术后立即给大鼠植入脑输注试剂盒和渗透微泵，以启动如上所述的ICV慢性输注研究。由于具有显着的首过效应，肝脏是药物交感神经切除术的主要靶器官，而其他组织未受到显着影响（补充数字） 图4a和b）通过ELISA（LDN，Nordhorn，Germany）测量组织去甲肾上腺素水平来验证。
瘦素信号传导研究
脑信号传导研究在补充图 1a和b中描述在已经禁食5小时的自由移动的SD大鼠中进行预处理，并如上所述预先植入ICV套管。在将具有1mm突出物的输注插管插入引导插管后，向有意识的大鼠推注瘦蛋白（10μl，10μl，Protein Laboratories Rehovot Ltd.，Israel）或载体（ACSF，Tocris，UK）并且处死30只。使用异氟醚麻醉和斩首后推注最小值。在液氮中冷冻相应的矢状脑切片后，使用穿孔活组织检查试剂盒收集来自弓状核，室旁核和背侧迷走神经复合体的组织样品。在IP注射瘦蛋白（1mg / kg体重）后60分钟收获DVC的脑活组织检查和HFD喂养的大鼠的MBH（D12492，Research Diets，Brogaarden，Denmark，超过8周）。
鼻内瘦素信号传导研究
补充图1e中的鼻内瘦蛋白输注研究在 氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉下在大鼠中进行。将溶解在盐水或对照溶液（盐水）中的1mg / kg瘦蛋白（Protein Laboratories Rehovot Ltd.，Israel）均等地滴注到禁食5小时的动物的两个鼻孔中。30分钟后，处死大鼠并从DVC收集穿孔活组织检查。使用磷酸特异性抗体的Western印迹评估STAT3的磷酸化状态。
分析程序
收获后，立即将所有组织样品快速冷冻在液氮中。将血液样品收集在EDTA管中。用市售的血糖仪（OneTouch®Ultra，Milpitas，CA）测量血糖。用德国Sigma Aldrich的比色试剂盒测量血浆甘油三酯和游离甘油。通过ELISA（瘦蛋白：Phoenix Pharmaceuticals，Burlingame，CA;胰岛素：Mercodia，Uppsala，Sweden）测量血浆瘦蛋白和胰岛素。用比色测定法测量血浆葡萄糖水平（Human-Glucose liquiUV，Wiesbaden，Germany），酮体和血浆游离脂肪酸水平（均为Wako Chemicals，Neuss，Germany）。用改良的氯仿 - 甲醇Folch提取物19提取肝脏TG。用Precellys装置（Precellys24，Bertin Technologies SAS; Montigny-le-Bretonneux，France）将肝脏（100mg）在3：1氯仿 - 甲醇混合物中均化，然后在玻璃管中在室温下孵育4小时。加入0.9％盐水后，将样品涡旋并以2000rpm离心10分钟。将下层有机相转移到另一个玻璃管中并在氮气下蒸发。将样品在含有65％乙醇的3M氢氧化钾溶液中在70℃下在水浴中皂化60分钟。用上述Sigma Aldrich试剂盒测量TG。用ELISA试剂盒（LDN，Nordhorn，Germany）测量组织去甲肾上腺素水平。
血浆脂肪酸谱
如前所述19使用气相色谱分析肝脏脂肪酸谱。简言之，将10mg肝组织在氯仿 - 甲醇（3：1）中匀浆，并在加入10μg内标（十七烷酸）脂质后，通过离心（3000× g ;在4℃下10分钟）分离并分离。下层相在氮气下蒸发。通过加入（5：1）甲醇 - 甲苯混合物和乙酰氯并加热至100℃（1小时）来制备脂肪酸甲酯。冷却至室温后，加入6％碳酸钠并离心（3000× g， 5分钟。使用配备有PTV注射器和DB-23柱的6890 N / 5973 N GC-MSD系统（Agilent，Santa Clara，CA），通过气相色谱分析上层（300μl）（30μl）。 m，0.25 mm内径，膜厚0.15 mm，Agilent J＆W），使用氦气作为载气。通过比较积分峰面积与标准色谱图进行峰识别和定量。所有计算均基于脂肪酸甲酯值。
血浆长链酰基肉碱
在Acquity TQD检测器（Waters，Milford，MA）上通过正丁基化衍生化后，通过流动注射分析从血浆中测定脂质衍生的长链酰基 - 肉碱。用于半定量分析的氘代内标以及所有其他试剂获自Recipe Chemicals（Munich，Germany）。根据制造商（配方）说明使用程序，转换和计算。
FAS活性测定
如参考文献1中所述，通过分光光度法测量肝组织样品中的脂肪酸合酶（FAS）活性。69。简言之，将肝组织（150mg）在含有0.25M蔗糖，1mM DTT，1mM EDTA和蛋白酶抑制剂混合物（Roche，Nutley，NJ）的冰冷缓冲液（pH7.0）中匀浆。将匀浆以20,000× g离心10分钟 在4°C下收集无脂肪的infranatant。将浸渍剂在4℃下以100,000g超速离心1小时。将剩余的下层剂与含有0.5mM DTT的500mM磷酸钾缓冲液（pH7.4）1：2混合，并在37℃下孵育至少20分钟以获得样品的最大活性。此外，将含有0.1 mM EDTA，1mMβ-巯基乙醇和5μl新鲜制备的NADPH溶液（100 mM磷酸钾缓冲液pH 7.0中的10 mM NADPH）的200μl500mM磷酸钾缓冲液（pH 7.0）加入96 - 孔板并在37℃下孵育至少10分钟。向每个孔中加入浓度为100μl的活化样品，并通过加入10μl底物溶液（5mM乙酰辅酶A和5mM丙二酰辅酶A，溶解于100mM钾中的3：4的比例）开始反应。磷酸盐缓冲液pH 7。溶解于100mM磷酸钾缓冲液（pH7.0）中的2和5mM丙二酰-CoA以3：4的比例溶解。在340nm下每分钟测量吸光度20分钟并计算斜率。FAS酶活性（mU / mg蛋白质）定义为每分钟消耗1nmole NADPH / mg。为了计算最终活性，使用每M / cm 6220的消光系数。
蛋白质印迹分析
用40mMβ-甘油磷酸盐，2mM原钒酸钠，20mM MOPS，30mM氟化钠，10mM焦磷酸钠，2mM EGTA，5mM EDTA，pH7.4和完全™蛋白酶抑制剂混合物（肝脏和脑组织样品）均质化（ Roche; Nutley，NJ）在Precellys管中含有陶瓷珠（Precellys24，Bertin Technologies SAS; Montigny-le-Bretonneux，France）并立即放在冰上。然后将裂解物转移至高压灭菌的Eppendorf管中，并在4℃以13,000rpm离心20分钟。用Pierce BCA Protein Assay Kit（＃23225，ThermoFisher Scientific Inc.，Waltham，MA）测量蛋白质浓度。蛋白质提取物在4-12％NuPAGE凝胶上分离（Invitrogen，Carlsbad，CA）并印迹到PVDF-P膜上用于化学发光检测或PVDF-FL膜用于红外检测（Immobilon; Merck-Millipore; Burlington，MA）。将膜在室温下封闭1小时，在Odyssey LI-COR封闭缓冲液（LI-COR Biosciences，Lincoln，NE）中以1：2稀释在TBS或5％脱脂奶粉（w / v）中（＃9999; Cell信号传导; Danvers，MA）在1×TBS-T中，并在4℃下在一抗中孵育过夜。针对ACC的一抗（Cat.3676，Lot＃6）磷酸-ATPCL Ser455（Cat.431a，Lot＃2），PDI（Cat.3501，Lot＃3），GAPDH（Cat.5174，Lot＃4），STAT3总计（Cat.4904，Lot＃7）和phospho-Stat3 Tyr705（Cat.9145，Lot＃26）（所有Cell Signaling Technology）; FAS（Cat.610962，Lot＃3266988），MTP（Cat.612022，Lot＃3266983）（均为BD Bioscience）; PPARα（Cat.sc-398394，Lot＃G0571），STAT5总量（Cat。sc-74442，Lot＃C1618）和HSC70（Cat.sc-7298，Lot＃E1914）（所有Santa Cruz Biotechnology）; phospho-STAT5αTyr694（Cat.71-6900，Lot＃TF268386）（Thermo Fisher Scientific）; 转铁蛋白（Cat.ab82411; Abcam）和ApoB抗血清（来自Larry Swift博士的礼物; Vanderbilt大学医学中心）均以1：1000的稀释度和次级HRP连锁抗体对抗小鼠（Cat.7076，Lot＃ 32）和兔（Cat.7074，Lot＃26）（均为Cell Signaling Technology）均以1：3000的稀释度或适当的IRDye®二抗（LI-COR，Lincoln，NE）稀释度为1：15,000，用过的。用Fusion X（Vilber，France）或LI-COR Odyssey（LI-COR，Lincoln，NE）扫描印迹，并用Image J（版本1.48 v）或LI-COR ImageStudioLite（版本5.2.5）进行定量。 ， 分别。批次＃E1914）（所有圣克鲁斯生物技术公司）; phospho-STAT5αTyr694（Cat.71-6900，Lot＃TF268386）（Thermo Fisher Scientific）; 转铁蛋白（Cat.ab82411; Abcam）和ApoB抗血清（来自Larry Swift博士的礼物; Vanderbilt大学医学中心）均以1：1000的稀释度和次级HRP连锁抗体对抗小鼠（Cat.7076，Lot＃ 32）和兔（Cat.7074，Lot＃26）（均为Cell Signaling Technology）均以1：3000的稀释度或适当的IRDye®二抗（LI-COR，Lincoln，NE）稀释度为1：15,000，用过的。用Fusion X（Vilber，France）或LI-COR Odyssey（LI-COR，Lincoln，NE）扫描印迹，并用Image J（版本1.48 v）或LI-COR ImageStudioLite（版本5.2.5）进行定量。 ， 分别。批次＃E1914）（所有圣克鲁斯生物技术公司）; phospho-STAT5αTyr694（Cat.71-6900，Lot＃TF268386）（Thermo Fisher Scientific）; 转铁蛋白（Cat.ab82411; Abcam）和ApoB抗血清（来自Larry Swift博士的礼物; Vanderbilt大学医学中心）均以1：1000的稀释度和次级HRP连锁抗体对抗小鼠（Cat.7076，Lot＃ 32）和兔（Cat.7074，Lot＃26）（均为Cell Signaling Technology）均以1：3000的稀释度或适当的IRDye®二抗（LI-COR，Lincoln，NE）稀释度为1：15,000，用过的。用Fusion X（Vilber，France）或LI-COR Odyssey（LI-COR，Lincoln，NE）扫描印迹，并用Image J（版本1.48 v）或LI-COR ImageStudioLite（版本5.2.5）进行定量。 ， 分别。批次＃TF268386）（赛默飞世尔科技）; 转铁蛋白（Cat.ab82411; Abcam）和ApoB抗血清（来自Larry Swift博士的礼物; Vanderbilt大学医学中心）均以1：1000的稀释度和次级HRP连锁抗体对抗小鼠（Cat.7076，Lot＃ 32）和兔（Cat.7074，Lot＃26）（均为Cell Signaling Technology）均以1：3000的稀释度或适当的IRDye®二抗（LI-COR，Lincoln，NE）稀释度为1：15,000，用过的。用Fusion X（Vilber，France）或LI-COR Odyssey（LI-COR，Lincoln，NE）扫描印迹，并用Image J（版本1.48 v）或LI-COR ImageStudioLite（版本5.2.5）进行定量。 ， 分别。批次＃TF268386）（赛默飞世尔科技）; 转铁蛋白（Cat.ab82411; Abcam）和ApoB抗血清（来自Larry Swift博士的礼物; Vanderbilt大学医学中心）均以1：1000的稀释度和次级HRP连锁抗体对抗小鼠（Cat.7076，Lot＃ 32）和兔（Cat.7074，Lot＃26）（均为Cell Signaling Technology）均以1：3000的稀释度或适当的IRDye®二抗（LI-COR，Lincoln，NE）稀释度为1：15,000，用过的。用Fusion X（Vilber，France）或LI-COR Odyssey（LI-COR，Lincoln，NE）扫描印迹，并用Image J（版本1.48 v）或LI-COR ImageStudioLite（版本5.2.5）进行定量。 ， 分别。1000和次级HRP连接的抗小鼠（Cat。7076，Lot＃32）和兔（Cat.7074，Lot＃26）（均为Cell Signaling Technology）均以1：3000稀释度或适当的IRDye®二抗（使用稀释度为1：15,000的LI-COR，Lincoln，NE）。用Fusion X（Vilber，France）或LI-COR Odyssey（LI-COR，Lincoln，NE）扫描印迹，并用Image J（版本1.48 v）或LI-COR ImageStudioLite（版本5.2.5）进行定量。 ， 分别。1000和次级HRP连接的抗小鼠（Cat。7076，Lot＃32）和兔（Cat.7074，Lot＃26）（均为Cell Signaling Technology）均以1：3000稀释度或适当的IRDye®二抗（使用稀释度为1：15,000的LI-COR，Lincoln，NE）。用Fusion X（Vilber，France）或LI-COR Odyssey（LI-COR，Lincoln，NE）扫描印迹，并用Image J（版本1.48 v）或LI-COR ImageStudioLite（版本5.2.5）进行定量。 ， 分别。
统计
数据显示为平均值±SEM。组间比较采用ANOVA，然后重复不成对的双尾学生t检验。甲p的<0.05值被认为是统计学显著。在补充图 2c，补充图 2m中，用GraphPad Prism（版本7）计算Pearson相关系数。
报告摘要
本文的报告摘要以补充信息文件的形式提供。有关研究设计的更多信息，请参阅与本文相关的自然研究报告摘要。
数据可用性
补充图7中提供了正文中提供的所有印迹的未剪切扫描。支持本研究结果的所有数据均可从相应的作者索取。