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套细胞淋巴瘤(制程)是一种激进的非霍奇金B细胞淋巴瘤来自天真pre-germinal中心细胞地幔区1。 尽管在靶向治疗的发展进步,制程不良的预后,平均5 - 7年的生存2。 制程的发病机制很复杂,由于分子改变几个监管中心。 监管控制基因转录的研究大部分的癌症,包括制程; 然而,蛋白质翻译的监管机制在癌症包括制程不太理解。 翻译机器,也称为翻译起始复合物(eIF4F),调节mrna的翻译主要通过翻译起始factor-4E (eIF4E)。 我们之前和其他人在制程中表明eIF4E是过表达的组织,并与不良预后相关3.,4。
长非编码RNA (lncRNAs)定义模糊> 200个核苷酸长度范围内的几个碱基的RNA,和他们缺乏编码潜力。 由于其重要的角色在基因表达的表观遗传过程lncRNAs最近得到广泛的重视。 而转录lncRNAs在癌症中的作用研究5,翻译lncRNAs监管的作用被发现只有在最近几年。 我们最近报道,lncRNA ROR-AS1高度调节在制程组织并通过表观遗传调节基因转录镇压复杂6。 最近的核糖体分析以及多核糖体分析方法提出了证据表明一些lncRNAs可以找到与核糖体和poly-ribosomal分数7。 这就提出了一个可能性,ribosome-bound lncRNAs可以参与微调速度或特异性的翻译机器。
确定翻译machinery-associated lncRNAs在制程中,我们使用的恢复期患者肿瘤细胞正常淋巴结和相应的控制和执行RNA-immunoprecipitation (RIP)测序。 RNA提取的恢复期患者(n= 4),恢复期细胞系(Jeko)和正常对照组(n= 3)推倒了anti-eIF4E抗体,其次是RNA序列和二次分析检测lncRNAs。 特定绑定的lncRNAs eIF4E被浓缩评估分析,阅读数映射到基因的RNA样品免疫沉淀反应与eIF4E (IP)比较与总RNA样本。 数据分析证明了数以百计的lncRNAs与eIF4E有关。 基于两方面的变化,我们选择了前八名eIF4E-enriched lncRNAs恢复期患者样本,包括小说(NBPF8和rp4 - 550 h1.6)和known-lncRNAs (ZNFX1-AS1、SNHG5 FTX, GAS5, CECR7,和SNHG12)与正常对照组相比(图1和S1)。 我们确认下这些八个lncRNAs eIF4E RIP-sequencing数据Jeko恢复期细胞系通过微分约束分析。 结果证实,这些lncRNAs确实与eIF4E Jeko细胞,尽管恢复期病人和制程之间表达水平不同细胞系(无花果。1)。 进一步富集分析Jeko表明FTX和SNHG12高出15倍浓缩了ant-eIF4E抗体,表明与eIF4E lncRNAs的特定绑定(无花果。1 b)。 进一步确认直接协会SNHG12 lncRNA eIF4E,我们表现RNA-IP三程线(Jeko、米诺和格兰塔)和正常对照组(n= 3)与免疫球蛋白和eIF4E抗体,紧随其后的是有针对性的逆转录酶聚合酶链反应(RT)。 rt - pcr数据显示SNHG12是高纯度与anti-eIF4E RNA-IP后抗体与免疫球蛋白控制在所有三个制程细胞系测试,而正常B细胞没有明显的SNHG12浓缩anti-eIF4E IP(图。1 c)。 总体而言这些数据表明,一些lncRNAs事实上与翻译有关机械制程,可能在翻译中发挥作用的监管。
一个褶皱的变化前八名lncRNAs RNA-IP使用anti-eIF4E抗体在制程中发现肿瘤细胞(n= 4)和Jeko细胞系相比正常控制(n= 3)所示。blncRNAs富集分析通过比较映射的阅读数量在RNA样本推倒ant-eIF4E抗体总RNA样本Jeko细胞系。cSNHG12 RNA-IP后被rt - pcr检测化验在制程中使用eIF4E抗体细胞株(n= 3)Jeko、米诺和格兰塔和正常控制(n= 3)。 GAPDH是用作控制
此外,siRNA-mediated抑制SNHG12或FTX(但不是SNHG5或ZNFX1-AS1)减少了20 - 25%增殖MTT试验评估(图。2;S2A-D)。 FTX和SNHG12 lncRNAs之前其他癌症中扮演很重要的角色8,9,但他们的角色在蛋白质翻译或制程增长是未知的。 它已经知道eIF4E使用cap-binding主题mrna结合翻译10,虽然我们以前表明eIF4E使用rna结合主题与lncRNA GAS5 (ref。7)。 检查rna结合的相对重要性和帽绑定的eIF4E图案之间的交互eIF4E lncRNAs,各种质粒的结构:(i) eIF4E (HA-eIF4EWT),(2)eIF4E与rna结合主题(HA-eIF4E删除Del1&2),(iii)帽突变(HA-eIF4E帽突变),被转染进hek - 293 t细胞和执行RNA-IP lncRNAs FTX SNHG12。 有一个净3-5-fold增加绑定SNHG12或FTX lncRNAs细胞overexpressing HA-eIF4EWT相比那些转染空载体。 然而,过度HA-eIF4EDel1&2但不是HA-eIF4E帽突变减少之间的绑定eIF4E SNHG12或FTX lncRNAs(无花果。2 b)。 然后我们测试是否这些lncRNAs (SNHG5, SNGH12、FTX ZNFX1-AS1)能够调节eIF4E下游靶基因的翻译原癌基因,BCL2,Bcl-xl。 如无花果所示。2摄氏度,MYC但不是BCL2或BCL-XL蛋白质含量明显增加SNHG5 siRNA-mediated击倒后或SNHG12; 同时,全球蛋白质翻译没有影响(图。2摄氏度;S3A)。 此外,MYC mRNA水平仍影响至少击倒的SNHG12 lncRNA,虽然适度减少MYC mRNA观察SNHG5击倒,这表明SNHG12 lncRNA可以调节MYC基因表达在翻译水平上(S3B).
一个酒吧图表显示的效果lncRNAs SNHG5, SNHG12, FTX, ZNFX1细胞的增长。 指定lncRNAs被撞倒了转染核,48 h后镀转染细胞的增长在96 -孔板通过MTT试验评估。 禁止代表平均±标准差八复制; * *p< 0.001。b琼脂糖凝胶的图像显示总水平(左面板)和eIF4E-bound(右面板)lncRNAs SNHG12和293年FTX t细胞转染空向量(V), HA-eIF4EWT,HA-eIF4EDel1&2,或者HA-eIF4EM-caplncRNA水平被rt - pcr检测使用总RNA(左)或RNA-IP anti-HA抗体。 β-Actin被用作加载控制。c西方的屁股的图片显示出原癌基因的蛋白质含量,bcl - 2,和在细胞转染BCL-XL控制单独或lncRNA针对性siRNA每个lncRNA击倒
总之,我们所知,我们首次报告,几个lncRNAs包括SNHG12, FTX, SNHG5, ZNFX1-AS1发现与翻译有关机械通过eIF4E恢复期肿瘤细胞。 我们还表明,rna结合主题(但不是cap-binding域)eIF4E负责绑定与eIF4E lncRNAs。 lncRNAs中绑定到eIF4E,至少SNHG5 SNHG12可以调节在制程细胞原癌基因的翻译。 未来的工作将需要澄清是否eIF4E-bound ribosome-bound lncRNAs能够引起额外的监管角色,翻译机器。 我们的结果扩大翻译监管和已知的曲目lncRNA生物学癌症治疗的潜在影响。 在未来的研究可能澄清如果eIF4E——或者ribosome-bound lncRNAs翻译机械让额外的监管角色。