YAP1群幕上室管膜瘤需要而对肿瘤发生和核转录因子I-mediated转录项目 - ELISA试剂盒,酶免试剂盒,酶联免疫吸附试验, ELISA实验,ELISA,双抗体夹心法,科研蛋白,抗体,细胞系,武汉新启迪生物科技有限公司

YAP1群幕上室管膜瘤需要而对肿瘤发生和核转录因子I-mediated转录项目

摘要

YAP1 fusion-positive幕上的瘤主要发生在婴儿,但肿瘤形成的分子机制是未知的。这里我们展示YAP1-MAMLD1融合足以推动恶性转换在老鼠身上,和由此产生的肿瘤histo-molecular人类瘤的特征。核本地化YAP1-MAMLD1蛋白质是由MAMLD1 YAP1-Ser127磷酸化和独立。染色质immunoprecipitation-sequencing分析人类YAP1-MAMLD1-positive室管膜瘤揭示NFI浓缩,而转录因子结合位点在YAP1-bound监管元素图案,表明这些转录因子在YAP1-MAMLD1-driven肿瘤发生的作用。而结合位点的突变YAP1融合或镇压NFI目标防止肿瘤诱导小鼠。在一起,这些结果说明YAP1-MAMLD1融合功能的致癌司机室管膜瘤通过招聘而NFI,临床前研究表明理由阻止YAP1之间的交互融合和NFI,而转录因子。

介绍

瘤(杀虫剂)神经上皮肿瘤发生在所有年龄组,不同主要沿神经轴位置。在儿童,杀虫剂占中枢神经系统恶性肿瘤的10%,其中30%发生在3岁以下儿童1,2,3.。杀虫剂chemotherapy-resistant肿瘤,大多缺乏可操作的分子靶点,因此神经外科干预局部肿瘤控制过程中起着重要作用4,5。除了切除,术后相关区域大剂量放射治疗被认为是标准治疗对于12个月以上的孩子和non-disseminated疾病6,7。虽然这些方法可以有效地减少杀虫剂复发的风险,长期后遗症与疗法强化稳步增长,尤其是在婴儿。因此,对于非常小的杀虫剂的病人,可靠的危险分层和迫切需要新的治疗方案。

通过最近的协作努力在脑部肿瘤的分子特征,我们已经识别出分子中出现的不同种类的杀虫剂的三个解剖隔间中枢神经系统8。这个分子分类优于当前关于临床组织病理学分类关联8。在幕上的(ST)室,两个分子团体,ST-EPN-RELA和ST-EPN-YAP1相关的儿童。值得注意的是,这两个ST-EPN分子组织的特点是频繁的复发性基因改变,不存在于任何其他团体。 ST-EPN-RELA肿瘤主要港口NF-κB效应之间的融合RELA和邻近的基因特征,C11orf95,由于11号染色体上q chromothriptic事件9。在小鼠中,RELA融合蛋白驱动肿瘤形成forebrain-derived神经干细胞(nsc)在同种异体移植物或rca /电视系统模型10。肿瘤的形成是伴随着NF-κB目标基因的激活,表明抑制信号通路可能代表一个潜在的靶向治疗方法在这个分子集团9。

ST-EPN-YAP1肿瘤的特点是周期性的河马的融合途径调节器YAP1 mastermind-like蛋白MAMLD1或一种无特征蛋白质FAM118B8。 ST-EPN-RELA肿瘤相比,没有额外的改变,包括纯合子CDKN2A删除或TP53突变,在ST-EPN-YAP1曾被观察到8,11。尽管YAP1-MAMLD1和YAP1-FAM118B融合已报告在其他类型的癌症,它被认为是可能的致癌因素,这些构成婴儿ST-EPNs基于高频YAP1融合在这种类型的癌症。核心河马通路是由上游信号转导蛋白,通常限制保留器官生长和肿瘤发生的转录辅因子YAP1胞质12,13。核易位YAP1可以促进扩张和未分化的干细胞增殖导致上皮或软组织肿瘤的形成14,15,16,17。然而,YAP1的确切致癌作用和YAP1融合蛋白在杀虫剂还有待调查。

在这项研究中,我们分子描述YAP1融合蛋白的作用在人类主要杀虫剂。此外,我们开发一个electroporation-based YAP1-MAMLD1-driven ST-EPN-YAP1小鼠模型。使用这个鼠标模型,我们发现机械的见解的转换能力YAP1-MAMLD1心室神经前体细胞,我们识别出潜在的渠道有针对性的治疗干预。

结果

在人类ST-EPN-YAP1s核本地化YAP1融合

我们首先分析了全基因组DNA甲基化分析数据的主幕上的45级II或III瘤(ST-EPNs),所有的预测是根据最近发表的脑瘤ST-EPN-YAP1分类器18,连同参考群ST-EPN-RELA出版8。无监督聚类的t分布式随机邻居嵌入(t新力)持续发现两个稳定的分子组,以前叫ST-EPN-RELA (n= 92)和ST-EPN-YAP1 (n分别为= 45)(图。1b),分子组与特定年龄组(补充图密切相关。1)。虽然ST-EPN-RELA和ST-EPN-YAP1主要被发现在儿科患者,ST-EPN-YAP1肿瘤大多局限于婴儿期(1年的平均年龄比8年ST-EPN-RELA)。给定的已知作用YAP1作为细胞核转录co-activator作为癌基因13,19,20.,我们首先检查YAP1的表达在人类主要ST-EPN-YAP1样品(图。1 c)。免疫染色的anti-YAP1抗体显示主要的核表达YAP1蛋白在肿瘤细胞(无花果。1 d, e)。 YAP1直接磷酸化的丝氨酸残基127 (S127) LATS1/2通常保留蛋白质在14-3-3蛋白的胞质由于封存13。免疫组织化学(包含IHC) p-YAP1 (S127)导演的抗体,但是,显然表明核本地化信号(NLS) p-YAP1 (S127)在一个大的一部分细胞ST-EPN-YAP1(无花果。1 f)。这些发现表明,phosphorylation-dependent亚细胞定位机械ST-EPN-YAP1中特异表达。

RNA-seq-based转录组分析从七个独立ST-EPN-YAP1人类肿瘤32±15%的预测YAP1成绩单起源于YAP1-fusion基因(s)(均值±南达科他州。n= 7,补充图。1 b)。整体YAP1表达水平在人类ST-EPN-YAP1肿瘤并不高于其他颅内室管膜瘤分子团体(补充图。1 c),但高于平均水平相比,其他基因在个体肿瘤(补充图。1 d)。符合这些观察,免疫印迹(WB)分析揭示内生YAP1水平相当的野生型蛋白在人类主要ST-EPNs(无花果。1 g h)。我们发现融合类型,YAP1-MAMLD1 (140 kDa)和YAP1-FAM11B (120 kDa) ST-EPN-YAP1样本而不是ST-EPN-RELA样品(图。1胃肠道)。蛋白质水平的YAP1-MAMLD1(无花果。1克)和YAP1-FAM118B(无花果。1 h)相比,核分数高出几倍的细胞质分数(无花果。1我)。此外,IHC-based检测核本地化p-YAP1(无花果。1 f)也验证了世行(无花果。1 j)。这些结果强烈暗示YAP1融合蛋白在细胞核的功能作用。

YAP1融合需要MAMLD1域核易位

它已经表明,YAP1核易位是需要发挥其致癌作用21。因此,我们下一步调查机制S127 phosphorylation-independent核易位YAP1融合蛋白的小鼠大脑发展。为了研究亚细胞定位体内,我们使用了一个在子宫内electroporation-based基因转移的方法22,23(无花果。2)。我们设计实验构造编码最常见的融合类型,YAP1-MAMLD1以及控制结构包括野生型基因融合的合作伙伴和截断和突变YAP1。每个构造是融合血凝素(哈)标记下CAG上游启动子和IRES-EGFP在pT2K-based表达载体22(无花果。2)。自从ST-EPN-YAP1肿瘤出现圣地区的大脑和被认为起源于径向神经胶质nsc或室管膜前体细胞24在胚胎发生,我们有针对性的大脑心室区。 HA-tagged重组蛋白质的亚细胞定位分析了电穿孔后两天的侧脑室E13.5老鼠(图。2 b, c)。而外源野生型YAP1蛋白质(YAP1-HA)主要定位在细胞质中,外源野生型MAMLD1蛋白质(MAMLD1-HA)积累在细胞核,与先前的报告一致25。外生长篇YAP1-MAMLD1融合局部细胞核内,类似于人类ST-EPN-YAP1肿瘤细胞。截断YAP1蛋白质(YAP1ΔC-HA),完成YAP1-encoded对应部分的融合蛋白中没有检测到细胞核。这个结果表明,失去YAP1糖基的形成造成融合不负责的核易位YAP1-MAMLD1融合蛋白。

探索的贡献MAMLD1域的核本地化YAP1-MAMLD1融合蛋白,我们确定了11个氨基酸(YPNKIKRPCLE aa79 - 89)的假定的NLS MAMLD1使用NLS映射器工具26。事实上,YAP1ΔC融合这个NLS (YAP1ΔC-MAMLD1 (NLS))恢复核蛋白质的积累3 t3(补充图小鼠成纤维细胞系。2)。同时,YAP1-MAMLD1ΔNLS缺乏MAMLD1 NLS(无花果。2),主要分布在细胞质体内(无花果。2 b, c),表明YAP1融合伙伴MAMLD1驱动核易位的融合蛋白通过其11个氨基酸NLS。

我们下一个调查如果MAMLD1域代表一个更强有力的核穿梭机制YAP1 S127磷酸化的预防。为了这个目的,我们介绍了S127A YAP1点突变的蛋白质(YAP1 (S127A) ha)及其亚细胞定位研究。积累的突变蛋白在细胞核中,但在一个小得多的程度上与YAP1-MAMLD1融合蛋白(无花果。2 b, c)。值得注意的是,核本地化YAP1-MAMLD1并不影响体外即使S127 over-phosphorylation被超表达的诱导Lats2和Sav1(无花果。2 d, e),可能因为聚变无法与细胞质YAP1调节器14-3-3(图。2 f)。这些数据强烈建议YAP1-MAMLD1 phosphorylation-independent和MAMLD1-mediated核本地化。

调查的影响YAP1融合蛋白在electroporated大脑神经干细胞分化,我们利用transposon-based基因组集成系统。鉴于pT2K质粒携带Tol2独联体元素27,co-transfection pT2K质粒一起Tol2转座酶(T2TP)使Tol2的集成独联体在元素,即。YAP1-MAMLD1和控制结构(cf无花果。2),在转染细胞的基因组和结果CAGpromoter-driven组成型表达27。这电穿孔的策略,我们有针对性的nsc引起锥体神经元的皮质板和室管膜细胞前体28,29。后electroporation-based和控制EGFP融合质粒转染,转化细胞的命运进行了分析在产后一天(P) 7(图。3.)。控制动物,细胞转染IRES-EGFP和T2TP均匀分布在皮质层和心室区,室管膜细胞通常坐落在开发过程中(图。3 a, b)。相比之下,组成型表达YAP1-MAMLD1-IRES-EGFP与T2TP导致积累EGFP-positive细胞接近大脑心室区。这些细胞缺乏神经突产物,未能形成皮质层结构(补充图。3),建议未能正确区分和迁移(图。3 c).YAP1-MAMLD1表达细胞具有很强的扩散活动,评估Ki67染色,相比附近non-transfected细胞(图。3 d)。这个结果指向一个潜在的细胞自动前驱细胞过度增生带着融合基因。成为人类主要ST-EPN-YAP1肿瘤(图中观察到。1 f, g),蛋白质磷酸化YAP1 (p-YAP1),以及pan-YAP1蛋白质(YAP1)是在细胞核中发现的YAP1-MAMLD1electroporated细胞(图。3情况),从而显示其核本地化是独立于S127 YAP1磷酸化状态的氨基端融合伙伴。

YAP1-MAMLD1聚变驱动器体内肿瘤形成

监控转染细胞在体内的长期命运,我们进行了在子宫内电穿孔的重组YAP1融合的上游IRES-Luciferase(卢克)或构造的控制T2TP转座酶,使体内生物发光成像electroporated细胞(cf无花果。2)。因为的转换能力C11orf95-RELA特征融合的ST-EPN-RELA肿瘤,据报道Cdkn2a零胚胎nsc9,我们测试了我们的电穿孔系统是否适合ST-EPN肿瘤建模使用类似的条件。按照先前的研究9,co-transfection质粒编码C11orf95-RELA-忿怒-卢克和一个sgRNA瞄准Cdkn2a轨迹(补充图。3 b, c),Cas9和T2TP导致肿瘤的形成。 electroporated老鼠表现出神经症状~ 50天出生后外显率为100%(图3 i (k)。这个结果证实electroporation-based基因转移的效用ST-EPN建模。类似于C11orf95-RELA借动物,荧光素酶在小鼠electroporated信号强度YAP1-MAMLD1随着时间的推移稳步上升(图3 i, j),所有的动物(外显率100%)安乐死是由于发生神经系统体征平均4 - 5周后出生(图。3 k)。过度的YAP1野生型(YAP1-HA)磷酸化YAP1 (YAP1 (S127A) ha)或截断YAP1 (YAP1ΔC-HA和YAP1-MAMLD1ΔNLS)并没有导致肿瘤的形成。尽管我们发现类似的荧光素酶信号强度相比,出生后早期YAP1-MAMLD1,荧光素酶信号不断腐烂,消失在3 - 4周内没有神经系统的发生(图迹象。3 i, j)。早期增加信号强度也可能与初始YAP1-dependent加速大脑细胞增殖的心室区30.; 荧光素酶信号MAMLD1野生型(MAMLD1-HA转染动物失去更快(无花果。3 j)。控制动物长期监测期间没有出现肿瘤超过几个月(无花果。3 k)。电穿孔的YAP1-MAMLD1在pT2K IRES-EGFP矢量显示肿瘤广泛传遍所有脑区(无花果。3 l,m)。虽然大多数EGFP-positive细胞增殖活跃P7评估时(无花果。2 e, f),只有五分之一(16.8±2.63%)EGFP-positive肿瘤细胞(表达外源YAP1-MAMLD1)也被增殖(Ki67-positive)(均值±南达科他州。n= 6,无花果。3 n-v中),可能表明肿瘤内异质性YAP1-MAMLD1借肿瘤。

人类ST-EPN-YAP1 YAP1-MAMLD1-driven老鼠肿瘤模仿

接下来,我们调查了来自小鼠肿瘤的分子特征YAP1-MAMLD1-electroporated动物在几个发育时间点,相比人类同行。自发展中大脑的nsc心室区顺序表达不同转录因子(TFs)区分31(无花果。4),我们的分析表达这些人类杀虫剂TFs转录组数据。在人类的杀虫剂子组,ST-EPN-YAP1显示的最高表现PAX6,一个放射状胶质神经干细胞标记的大脑皮层32,但没有表达加工神经源性祖细胞的标志31也不OLIG2和CSPG4/喜欢的《忍者外传2》,为胶质祖细胞(图标记。4 b, c和补充图。4 a、b),这表明ST-EPN-YAP1可以从PAX6阳性细胞。类似于人类肿瘤,electroporated YAP1-MAMLD1细胞表达Pax6但不加工,Olig2,喜欢的《忍者外传2》在肿瘤发生(例如E15.5, P0,和P7)(图4 d - s和补充图。4摄氏度)。因此,引起的小鼠肿瘤YAP1-MAMLD1过度可能源自Pax6-positive神经干细胞。这些老鼠肿瘤组织学检查显示部分多形性地区和一些血管坏死没有明显变化,而经济增长模式正在取代而非渗透性的,周围组织的描述。没有观察到血管周围pseudo-rosettes(补充图。4 d).

测试这个新的ST-EPN-YAP1老鼠模型的保真度,我们选择了513个基因的1000最重要的差异表达基因排列Affymetrix人类ST-EPN-YAP1和ST-EPN-RELA样本之间的基因芯片,是人类和小鼠之间的同源。随后,我们对基因的表达水平在这组同源YAP1-MAMLD1-driven老鼠肿瘤(n= 5),人类ST-EPN-RELA (n= 49)和ST-EPN-YAP1 (n= 11)肿瘤; 我们应用结合无监督聚类和主成分分析的样品(图。4 t, u)。小鼠肿瘤的分子签名与人类ST-EPN-YAP1明显相关,而不是人类ST-EPN-RELA肿瘤,证明分子相似的小鼠模型各自的人类肿瘤样本。我们进一步包括RELA小鼠模型的一个子集(n= 5)和儿科多形性成胶质细胞瘤(pGBM)肿瘤(n= 9)作为外部控制和发现各自的人类和小鼠之间的分子签名杀虫剂子组仍然表现出最相似(补充图。4 e).

TF图案丰富在ST-EPN-YAP1s YAP1-binding位点

内源性YAP1野生型mRNA和蛋白表达水平之间具有可比性分子人类ST-EPNs (cf组。补充图。1和无花果。1克,h)。此外,超表达野生型YAP1并没有导致肿瘤内部的开发大脑皮层(cf,无花果。3 k)。这数据促使我们假设激活特定YAP1 fusion-mediated基因网络原因ST-EPN-YAP1肿瘤形成。获得进一步了解造成的转录调控YAP1融合,我们评估全基因组YAP1入住率用来进行标本的主要人类ST-EPN-YAP1 (YAP1 fusion-positive, n = 3; 补充数据1)和ST-EPN-RELA (YAP1 fusion-negative,n= 3; 补充数据1)肿瘤使用染色质免疫沉淀反应和随后的DNA测序(ChIP-seq)。 YAP1 ChIP-seq执行使用一个抗体YAP1蛋白质的n端保证融合蛋白的识别。数据分析揭示了一些位点共同YAP1的入住率在ST-EPN-YAP1 ST-EPN-RELA样本,而且两组之间的显著差异(补充图。5 a、b)。最小化YAP1野生型蛋白的潜在影响,只有ST-EPN-YAP1-specific高信任度YAP1-binding网站,有关所有YAP1-binding站点在这个组的9% (n= 1246/13,582)被选为进一步分析(补充图。5罪犯)。 YAP1作为转录co-activator,招募了DNA通过第二个DNA结合转录因子(TF)33。因此,我们下一个评估TF-binding图案在注释杀虫剂subgroup-specific YAP1目标位点,以及在共同YAP1山峰ST-EPN-RELA和ST-EPN-YAP1子组。主题浓缩分析显示,核因子的dna图案我(NFI)和四茶域内家庭成员(TEAD1-4)高纯度ST-EPN-YAP1-specific YAP1目标网站。这些图案没有跻身前丰富基因共同YAP1峰值与ST-EPN-RELAs共享或ST-EPN-RELA-specific YAP1-binding位点(补充图。5 e补充数据2)。 NFI家族的表达水平和TEAD1-4 ST-EPN-YAP1之间类似ST-EPN-RELA肿瘤(补充图。5 f).

YAP1转录功能与激活有关独联体监管DNA元素,增强剂和super-enhancers等20.,34,35。因此,我们问高信任度YAP1-binding网站包括与增强剂或super-enhancer元素。我们定义这些元素的存在都H3K27乙酰化作用(H3K27ac)和YAP1山峰(图。5 a、b)。大约87% (n= 1084/1246)和45% (n= 1100/2464)ST-EPN-YAP1和ST-EPN-RELA山峰重叠EPN-specific增强剂(n= 45495)(补充图。5度)。相关分析的类属特异性的增强剂活性和基因表达,我们最近发现enhancer-associated ST-EPN-YAP1肿瘤基因特别活跃5。通过这些数据,13.4%的整个基因组ST-EPN-YAP1-specific监管所有元素都受YAP1 (n= 285/1246),这意味着YAP1 fusion-associated转录依赖性在ST-EPN-YAP1仅限于特定位点相对较少。 YAP1-bound大幅增强器和super-enhancer域是与更大的转录负载在ST-EPN-YAP1标本,如M-phase-associated基因NDEL1位点(图5 b, c补充数据3.).

探索生物过程的基因受YAP1只在人类ST-EPN-YAP1肿瘤,我们应用基因本体论(去)分析129个基因与257年YAP1-specific监管元素(补充数据4)。去分析识别已知YAP1-associated过程,如细胞骨架组织、细胞迁移、细胞粘附和细胞群的积极监管前十名ST-EPN-YAP1肿瘤(图的重要生物学过程。5 d),与以前的研究一致20.。值得注意的是,NFI和TEAD-binding网站保持顶部丰富图案,当我们限制浓缩分析YAP1-bound监管元素(无花果。5比和补充数据5),这表明这些dna结合蛋白TFs中央ST-EPN-YAP1相关性肿瘤细胞。

而需要YAP1-MAMLD1-driven肿瘤发生

根据ChIP-seq数据从主人类ST-EPN-YAP1标本(cf无花果。5)和核YAP1-MAMLD1蛋白质积累在人类原发性肿瘤(无花果。1比的转录项目),我们假设YAP1 fusion-driven室管膜瘤依赖之间的直接交互融合,而TFs。事实上,我们确认的表达TEAD-mediated YAP1目标,CTGF和CYR6136相比,被YAP1-MAMLD1强烈增强YAP1 WT体外(无花果。6a)。这种交互数据符合ST-EPN-YAP1和ST-EPN-RELA子组之间比较转录组概要分析,表明这些基因在小鼠模型和YAP1-specific人类肿瘤样本(补充数据6)。调查是否需要YAP1-TEAD交互体内肿瘤形成,我们生成一个pT2K质粒向量编码YAP1-MAMLD1融合基因突变而互动网站(YAP1 (S94A) -MAMLD1)。我们证实S94A突变有效预防绑定而蛋白的融合蛋白在体外(无花果。6 b)。这些观察结果一致,YAP1 (S94A) -MAMLD1-mutated蛋白质未能上调YAP1-TEAD目标蛋白质(无花果。6摄氏度).

我们介绍了YAP1 -MAMLD1 (S94A)基因一起T2TP在E13.5转座酶通过在子宫内电穿孔的老鼠。出生后早期积极的荧光素酶信号表示成功的电穿孔,但失去了所有的动物的信号(n=在3周(图8)。6 d)。长期监测期间,没有发现肿瘤,和所有的动物表现出神经症状(无花果。6 e),这表明YAP1和而蛋白质之间的相互作用对肿瘤发生是必需的。这些结果强烈支持我们的见解推断从YAP1 ChIP-seq人类ST-EPN-YAP1肿瘤样本的数据。之间的交互而TFs和YAP1融合蛋白可以作为一个中央转录控制和随后的肿瘤发生和放松管制的机制可以定义一个特定的分子群ST-EPNs。

nfi至关重要的fusion-driven增生

虽然YAP1-TEAD互动是必不可少的YAP1-MAMLD1借肿瘤发生(无花果。6),electroporated动物携带的NLS-conjugated YAP1域(YAP1ΔC-MYC (NLS))以及YAP1-FAM118B没有出现肿瘤,尽管他们的核本地化(图。3 k; 补充无花果。3 d, e和6),这意味着MAMLD1域可能有其他角色转变主要细胞,除了核穿梭。由于事实NFI TF-binding主题被确认为最丰富的主题在人类ST-EPN-YAP1s YAP1-binding网站(无花果。5),我们假设NFI TFs可能作为YAP1-MAMLD1代数余子式招聘所需的基因位点,其致癌活性。事实上,co-immunoprecipitation荷兰外商投资局对实验显示两者的物理相互作用和全美独立工商业者联合会与YAP1-MAMLD1但不是YAP1 HEK293T细胞和人类初级ST-EPN-YAP1细胞(无花果。7 a、b和补充图。7一个)。 ChIP-seq人类ST-EPN-YAP1s与荷兰外商投资局对一个anti-NFIA抗体发现山峰重叠YAP1-interacting位点的96%(1201年1246的峰值),虽然这ST-EPN-RELAs重叠是13%(337个席位中赢得了2464年的峰值)(无花果。7 c)。报道在之前与小鼠神经干细胞研究37荷兰外商投资局对,结合位点的检测TEAD-mediated YAP1目标基因CTGF和CYR61在ST-EPN-YAP1s(补充图。7 b, c)。因此,似乎YAP1-MAMLD1和NFI蛋白质相互作用通过MAMLD1 ST-EPN-YAP1s域。

自从YAP1-bound基因NFI-binding图案被激活组蛋白标记修改H3K27Ac(无花果。5),我们检查是否Nfi蛋白质目标基因的转录镇压由YAP1-MAMLD1共享导致靶细胞的增殖活动。荷兰外商投资局对老鼠,和全美独立工商业者联合会表示心室区发展中大脑皮层38,39。符合这一发现,转染细胞YAP1-MAMLD1-IRES-EGFP荷兰外商投资局对表达都和全美独立工商业者联合会在细胞核2天电穿孔(补充图。7 d)。镇压Nfi目标基因,我们利用Nfia-En荷兰外商投资局对编码的dna结合域融合转录阻遏十字的领域,作为Nfi重组转录抑制因子40。事实上,我们确认激活Nfia-En阻塞CTGF和CYR61通过体外YAP1-MAMLD1(补充图。7小时)。六天后在子宫内电穿孔YAP1-MAMLD1-IRES-Luc用EGFP单独或与Nfia-En-IRES-EGFP(对应于P0), 82.9±3.0%和83.8±4.5%的EGFP-positive细胞表达外源YAP1增生性病变EGFP只有和Nfia-En-IRES-EGFP分别表达大脑(均值±s.d ,无花果。7 d, l和补充图。7我)。在这个阶段,显著减少Nfia-En-expressing细胞增殖(Ki67-positive)比控制细胞(65.4±2.6%为控制与Nfia-En 26.5±7.8%,均值±道。 ,无花果。7 h-k l)。与此同时,我们没有观察到显著的凋亡细胞死亡在P0 Nfia-En-overexpressing细胞(图7米和补充图。7 mp)。 electroporated动物的长期观察,这两种情况下产生肿瘤在大脑皮层在相似的时期(EGFP独自生存中位数:33天,nNfia-En-EGFP = 8和32.5天,n= 8),可能是因为并不是所有YAP1-expressing细胞Nfia-En-electroporated EGFP-tagged抑制转基因的老鼠表达(无花果。7 n)。我们发现Nfia-En-overexpressing产生肿瘤细胞的损失,然而(n= 7/7,无花果。7 o-q)。总之,这些数据表明,NFI所需蛋白质YAP1-MAMLD1-driven皮质神经祖细胞的增生。

讨论

临床方面,更有利的结果相比ST-EPN-YAP1 ST-EPN-RELA迄今为止只从回顾性数据推导出但仍然需要确认在前瞻性试验8,41,42。虽然clinico-pathologic特征包括室性或室周的地区大量肿瘤和典型的外观multinodularity和异构在MRI图像对比度增强幼儿可能暗示ST-EPN-YAP1肿瘤,一个合适的分子检查是必不可少的42。精确的分子分类代表任何潜在的未来的一个重要前提条件可能包括谨慎治疗降级的分层ST-EPN-YAP1病人和还将有助于利用subgroup-specific治疗目标。

失调的河马/ YAP1-signaling途径越来越多的观察作为致癌转换的一个重要因素。而放大的野生型YAP1参与肿瘤的形成在不同哺乳动物组织43,44,最近我们发现独特YAP1融合变异的特征标志人类ST-EPN集团ST-EPN-YAP14,8。结果YAP1结构变异的公认的致癌功能在一个尚未探索生物的水平。在这里,我们表明,被迫表达最常见的室管膜瘤YAP1融合变体,YAP1-MAMLD1,足以形成肿瘤发展中老鼠的大脑。YAP1-MAMLD1 -overexpressing皮质祖细胞有丝分裂退出失败,作为YAP1-dysregulated卫星细胞在横纹肌肉瘤的报道16。相反,过度的YAP1全长cDNA没有诱导肿瘤在我们的模型系统中,暗示dose-independent机制YAP1 fusion-driven ST-EPN-YAP1肿瘤发生。

的nuclear-localized YAP1蛋白质功能与其他TFs co-transcriptional调节器,如TP73 RUNX,而成员33,45,46。破坏核易位机械通常与癌症有关21,47,48。这样的机制之一是127年YAP1在丝氨酸磷酸化,p-YAP1 (S127) LATS1/2激酶,提高胞质保留YAP1通过14-3-3-mediated锚定13。因此,有害的体细胞突变或hyper-methylationLATS1/2和他们的上游激酶MST1/2导致核易位YAP1,导致肿瘤不同癌症类型的机制49。值得注意的是,我们发现p-YAP1 (S127)在人类主要的核ST-EPN-YAP1肿瘤。符合这一观察,我们发现核本地化YAP1-MAMLD1融合S127 phosphorylation-independent小鼠(无花果。3 g)。重要的是,S127A YAP1易位引起的突变成核的皮质神经祖细胞体内更少的程度比YAP1-MAMLD1(无花果。2 b, c)。因此,phosphorylation-dependent YAP1核本地化不同细胞类型之间可能是不同的。同意这个想法,没有放大YAP1或突变S127 ST-EPN-YAP1s YAP1已经报道的。

尽管MAMLD1 YAP1域的域介导核易位,MAMLD1可能仍然是积极与YAP1导致肿瘤发生在其他方面ST-EPNs的上下文中。这个概念是由我们的发现,迫使表达YAP1 (S127A) YAP1ΔC-MYC (NLS)没有造成肿瘤在大脑皮层(无花果。3.和补充图。6)。这个数据与YAP1的致癌效应(S127A)在其他组织,包括肝脏、皮肤、骨骼肌14,15,16,17。虽然MAMLD1 transactivating co-activator规范的等级信号的功能Hes3启动子25,我们看到无论是upregulationHes3也不特定绑定的YAP1Hes3在ST-EPN-YAP1肿瘤位点,而ST-EPN-RELAs。 L103P点突变在MAMLD1域融合蛋白引起的损失transactivation函数Hes325。电穿孔的YAP1-MAMLD1 (L103P)没有减弱YAP1-MAMLD1-mediated肿瘤形成(n= 5/5,生存中位数:31.5天),这表明MAMLD1 transactivation函数Notch信号可能不是相关YAP1-MAMLD1致癌能力。相反,我们发现MAMLD1域与NFI TFs,融合蛋白是招募增强地区丰富而和人类ST-EPN-YAP1s NFI-binding图案。

缺乏主要tumor-derived ST-EPN-YAP1肿瘤细胞系和PDX模型已经阻碍了潜在的药物适合这种疾病的识别。另外一个策略进行有意义的临床前研究包括生成肿瘤模型,引入disease-relevant体内致癌变化。我们建立了第一ST-EPN-YAP1小鼠模型肿瘤生长mid-embryonic阶段外显率为100%,可用于未来的体内研究。体外研究其他类型的癌症YAP-driven提出减少YAP1剂量效应诱导肿瘤回归50,51,52。然而,镇压YAP1表达在人类患者目前并不可行,由于缺乏有效的靶向基因传递方法成恶性细胞。小分子调节器河马的途径,如肾上腺素和多巴酚丁胺,损害YAP1函数53,54。行动的机制需要磷酸化S127 YAP1,导致增加细胞质保留YAP1和衰减YAP1核函数。然而,phosphorylation-independent核本地化YAP1融合蛋白的研究表明,这些分子可能对ST-EPN-YAP1是无效的。也许药物中断YAP1-TEAD交互代表一个潜在的未来战略的婴儿有效地治疗这种疾病。无论如何,YAP1-TEAD抑制剂55,56,57有效地穿透血脑屏障仍有待确定。最近的一项研究还发现了BRD4 YAP1 /小胡子复杂的代数余子式和显示效率回归的乳腺和肺肿瘤体内打赌抑制剂58,这表明押注抑制剂可能对ST-EPN-YAP肿瘤也有相似的效果。

本研究证明致癌功能ST-EPNs YAP1-MAMLD1融合的发展,和数据支持的想法YAP1融合抑制可能诱导分化和细胞循环退出管制脑祖细胞。我们的综合方法,包括electroporation-based肿瘤模型,提供了一个框架,用于目标识别在其他癌症与公认的致癌难以治疗的改变。

方法

人体材料

肿瘤样本收集病人提供书面知情同意后,根据协议的机构审查委员会批准的海德堡大学医院和NNBurdenko神经外科研究所。只有圣杀虫剂(二级)和圣未分化杀虫剂(三级),自信地预测ST-EPN-YAP1或ST-EPN-RELA肿瘤包括在这项研究中。这种分类是根据DNA methylation-based中枢神经系统肿瘤分类的方法18。没有病人接受化疗或放疗前手术切除原发肿瘤。

畜牧业

cd -老鼠从查尔斯河,住在一个动物园12 h光/暗周期。插头和生日的日子定为胚胎天0.5 (E),产后(P) 0,分别。所有动物实验进行了本研究根据宾州州立大学制度动物保健和使用委员会和动物福利法规批准的动物保健和使用委员会神经科学研究所NCNP、日本和德国的负责任的政府(Regierungsprasidium卡尔斯鲁厄,批准文号:G204/16)。

细胞系

hek - 293 t (crl - 3216), LN229 (crl - 2611),和NIH / 3 t3 (crl - 1658)细胞从写明ATCC购买。 HEK293T细胞培养与杜尔贝科修改鹰媒体(DMEM Gibco)补充10%胎牛血清(的边后卫,Gibco), 100 U /毫升青霉素和链霉素100µg /毫升。文化被保持湿润有限公司5%2气氛在37°C和亚文化当80%的融合。支原体污染被GATC /欧陆坊定期评估。

LN229细胞在DMEM培养(康宁,10 - 013 - cv)补充10%的边后卫(Gibco, 10437028)和1% antibiotic-antimycotic解决方案(康宁,30 - 004 - ci) 37°C公司为5%2。 NIH / 3 t3细胞培养在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)(康宁,10 - 013 - cv)补充10%牛血清(antibiotic-antimycotic Gibco, 16170078)和1%解决方案(康宁,30 - 004 - ci) 37°C公司为5%2。数据库中列出这些细胞系是僵死的细胞系由ICLAC和NCBI Biosample维护。这些细胞株并不在本研究验证。之前所有的细胞系进行支原体阴性实验。除非另有指示,confluency与细胞生长实验进行到50%。

质粒

人类的全部或部分编码区域YAP1(NM_001130145.2)和MAMLD1(NM_005491.4)的互补与c端公顷标记放大了PCR克隆到pT2K IRES-EGFP和pT2K IRES-Luc质粒向量22。的HA-taggedYAP1-MAMLD1融合基因的融合基因表达ST-EPN-YAPs合成生命技术(达姆施塔特,德国)和插入pT2K表达质粒。YAP1 (S127A)和YAP1 -MAMLD1 (S94A)从生成YAP1和YAP1-MAMLD1通过定点诱变。 Tol2-based稳定的基因表达,pT2K质粒是co-transfectedTol2转座酶pCAGGS质粒编码27。的Myc-tagged Tead4表达载体是来自Addgene (# 24638)。 px330-based sgRNAs被用于诱导突变损失函数Cdkn2a。测量试验,500个基点的DNA片段生成的目标地区Cdkn2a由PCR扩增。用于PCR引物:5′-CGGCGATGTTCTACAGGAG-3′, 5′-GAAGCTATGCCCGTCGGTC-3′。小猪bac (PB)的表达向量生成通过克隆CAG-IRES-EGFP磁带从pCAG IRES-EGFP59到十亿分之EGFP60NotI。 Nfia-En cDNA40是插入到XhoI网站的多个克隆网站,pPB Nfia-En-IRES-EGFP屈服。代YAP1-MAMLD1ΔNLS cDNA,假定的NLS序列预测通过检查的顺序使用NLS MAMLD1映射工具26。使用Quikchange YAP1-MAMLD1 cDNA受到定点诱变突变工具包(安捷伦)。

抗体

以下抗体被用于这项研究:YAP1(包含IHC GTX129151 GeneTex, 1:50 0), YAP1(# 14074年,春秋国旅,1:1000 WB和1:200包含IHC), YAP1 (sc - 15407×SCBT, 1:1000 WB和芯片),p-YAP (S127) (ab76252、abcam 1:200包含IHC), p-YAP (S127)(# 13008、细胞信号、1:1000 WB和包含IHC补充图验证。8),Ki67(包含IHC ab15580 Abcam, 1:50 0), HA(# 3724年,春秋国旅,1:50 0 ICC和包含IHC), HA (# mms - 101 p BioLegend 1:20 00 WB), Myc (1:50 0 # 9 e10,杂种细胞发育研究银行WB), Lats1(# 3447年,春秋国旅,1:1000 WB),肌动蛋白(A5316、Sigma-Aldrich 1:5000 ab49900, Abcam, 1:25000 WB), CTGF (sc - 14939、SCBT 1:1000 WB), Cyr61 (sc - 13100、SCBT 1:1000 WB), 14-3-3 (sc - 629、SCBT 1:1000 WB),国旗(M2,σ,1:10 0的IP, 1:1000 WB), Pan-Tead(# 13295年,春秋国旅,1:1000 WB), TBR2 /加工(包含IHC ab23345 Abcam, 1:50 0),喜欢的《忍者外传2》(ab129051、Abcam 1:400包含IHC), PAX6 (pprb - 278 p Covance包含IHC 1:50 0; 猫# sc - 81649、SCBT 1:200包含IHC) Olig-2(包含IHC AB9610、微孔、1:50 0),Nfia (HPA008884,σ,摘要包含IHC和1:50 0 WB),全美独立工商业者联合会(HPA003956,σ,摘要包含IHC和1:50 0 WB),裂解半胱天冬酶3(包含IHC # 9664, CST, 1:10 0)和GFP (# ab13970、Abcam 1:1000包含IHC)。

疣状

E15.5、P0和P7 electroporated老鼠的大脑解剖和固定4% PFA / PBS一夜之间在4°C。 cryoprotection后30% (w / v)蔗糖在PBS,大脑是嵌入在10月复合冻块。 12µm-thick cryosections被燥热引起抗原决定基检索处理柠檬酸缓冲(pH值6.0)包含IHC之前。 4µm-thick石蜡包埋人类和小鼠肿瘤部分显示应用程序发布协议61。 deparafinization后,部分被孵化与主抗体室温(RT)一夜之间,其次是政府与生物素化的二次抗体(向量)在RT 1 h。信号放大了辣根过氧化物酶系统(ABC工具包,向量)DAB染色(Sigma-Aldrich)紧随其后。

免疫荧光,部分被封锁10%正常驴血清(NDS)在PBS 0.1% Triton-X (PBST) 30分钟在RT和初级抗体孵育过夜在4°C。与PBST几个洗后,与二次孵化的部分抗体稀释10%是因为在TBST 1 h rt,幻灯片是安装在延长黄金Mountant(英杰公司# P10144)。核与DAPI染色(300海里)。图像获得了共焦显微镜(800年蔡司LSM和徕卡SP8闪电)。

量化的HA核本地化E15.5 electroporated样本,0.1毫米2选择框被选为计算区域。在分析选择框是保持不变。 EGFP的细胞double-positive和公顷数分为四类基于HA信号的位置:(1)核:在HA信号只在细胞核,细胞核(2)>细胞质:细胞核内的荧光强度高于细胞质,细胞质(3)>核:在细胞质中,荧光强度高于细胞核、细胞质和(4):HA信号只发现在细胞质中。大约100 - 300细胞数为每个样本。细胞的百分比数据表示为每个类别(HA本地化类别/总细胞细胞核×100)。

在产生肿瘤扩散量化,6毫米2在肿瘤中心区域被选中。两个部分每个肿瘤在三个独立的肿瘤样本量化。部分是沾EGFP Ki67和EGFP (+) Ki67 (−), EGFP (+) Ki67(+)和EGFP (−) Ki67使用ImageJ手动(+)细胞数(美国马里兰州)。只有清楚地标记细胞至少包括五个焦点。在300 - 400年为每个肿瘤细胞被计入总数。数据显示为阳性细胞比例=(积极核细胞/总细胞细胞核×100)。

Nfia-related扩散量化的结构,两个部分/ P0电穿孔样本是从三个独立使用电穿孔样本。部分被染色和EGFP Ki67和分析。 0.12毫米2选择区域是用来定义的计算区域组织。 EGFP (+) Ki67(+)和EGFP使用ImageJ手动(+)细胞数。总共超过100细胞数为每个肿瘤部分。扩散指数计算双阳性细胞/总EGFP-positive细胞×100。对裂解Caspase-3量化,每一个部分P0 electroporated样本计算三个独立electroporated样本。部分是沾anti-EGFP和anti-CC3之前的分析。 0.1毫米的一个领域2在每个部分分隔和总CC3吗+EGFP+和EGFP+细胞位于该地区被数手动使用图像j .大约每节300细胞数。凋亡指数计算使用以下公式:CC3 (+) EGFP (+) / EGFP (+)×100。

量化的EGFP-positive细胞内部YAP1-MAMLD1简况肿瘤,每个成年老鼠一段electroporated E13.5,发达的神经系统体征计入6任意选定字段从两个独立的老鼠。 anti-EGFP和DAPI染色部分提交以共焦显微镜成像采集和瓷砖图像。 0.05毫米的一个领域2被选中的中心EGFP的肿瘤和总吗+细胞数。所有细胞复染色与DAPI在选定的区域内使用ImageJ手工计算。量化数据表示为EGFP的百分比(+)细胞。

对体外培养的细胞染色,LN229和NIH / 3 t3细胞在盖玻片固定4% PFA / PBS 20分钟和孵化透化作用缓冲(PDT: 0.3%钠脱氧胆酸盐,0.3% Triton x - 100在PBS) 30分钟在冰上。固定细胞被封锁在4°C与5% BSA / PBS 1 h,其次是孵化一夜之间在4°C主要抗体稀释2.5% BSA / 0.05% Triton x - 100 / PBS。洗后用0.1% Triton x - 100 / PBS,细胞被孵化与二次抗体稀释2.5% BSA / 0.05% Triton x - 100 / PBS 2 h在4°C。细胞被洗Triton x - 100 / PBS为0.1%,与PBS冲洗,安装在延长黄金Mountant(英杰公司# P10144)。核与DAPI染色(300海里)表示。

西方墨点法

人类主要ST-EPNs被用在低渗的解决方案。核和细胞质分数被micro-centrifugation分离和细胞溶解使用NE-PER核和胞质提取试剂(# 78833,热科学)和完整的蛋白酶抑制剂鸡尾酒(猫# 11697498001,罗氏公司)。 p-YAP1检测,NE-PER核和胞质提取试剂与完整的蛋白酶抑制剂补充鸡尾酒(猫# 11697498001,罗氏公司)和PhosSTOP™(猫# 4906845001,默克公司)。验证表达式向量在这项研究中,HEK293T细胞转染质粒和收获post-transfection 2天。细胞颗粒细胞溶解里帕缓冲区和10μg蛋白质的溶解产物被用于蛋白质检测61。短暂、蛋白质变性5分钟在95°C,装上NuPAGE Bis-Tris (# NP0301BOX,英杰公司)或NuPAGE Tris-Acetate凝胶(# EA0375BOX,英杰公司),通过sds - page分离(100 - 120 V)。蛋白质被转移到methanol-activated PVDF膜的坦克electrotransfer Towbin缓冲区1 h30分钟在100 V。膜被5%的脱脂0.5% TritonX / TBS (TBST) 1 h RT前一夜孵化主要抗体。与TBST洗涤后,膜与二次孵化抗体1 h rt发展中,孕育了膜与发射极耦合逻辑(RPN2106,通用电气Lifesciences)或ECL ' (RPN2232,通用电气Lifesciences)推荐的制造商其次是暴露在放射自显影法电影在黑暗的房间里。体外研究基因功能,质粒是暂时性的转染到LN229和NIH / 3 t3细胞。这些细胞被收获1天post-transfect和细胞溶解SDS-lysis缓冲区(10毫米Tris-HCl, pH值7.5,1% SDS, 50 mM氟化钠,1毫米衣饰归宿4),其次是sds - page62。 Uncropped免疫印迹结果补充图所示。9。

Immuno-precipitation (IP)

根据出版协议IP进行61。 HEK293T LN229细胞转染和表达向量和收获2天post-transfection蛋白质的兴趣。细胞颗粒细胞溶解了IP缓冲区(20毫米Tris-HCl, pH值8.0,200毫米氯化钠,EDTA 1毫米,1毫米EGTA, 1% Triton x - 100)或IP裂解缓冲(猫# 87788,热科学)和完整的蛋白酶抑制剂鸡尾酒(猫# 11697498001,罗氏公司)。河马路径组件IP,细胞细胞溶解与缓冲区里帕补充完整的蛋白酶抑制剂的鸡尾酒。蛋白质提取与anti-FLAG孵化M2亲和力凝胶(σ# A2220)在4°C 2 h。免疫沉淀反应是洗四次里帕缓冲区和提取NuPaGE摩门教的样品缓冲和白平衡进行了分析。 NFI IP,细胞细胞溶解与IP缓冲补充完整的蛋白酶抑制剂鸡尾酒2天post-transfection和蛋白质提取与Anti-FLAG孵化™M2磁珠(猫# M8823, 30μL /样本,Sigma-Aldrich)为4 h rt,蛋白复合物与磁架拆除。与IP缓冲连续洗涤后,蛋白质被珠子与NuPaGE摩门教的样品提取缓冲,WB进行了分析。

在子宫内电穿孔

在子宫内电穿孔进行了报道23,63。具体地说,DNA质粒混合物为每一个质粒(1毫克/毫升)注入侧脑室E13.5胚胎和广场电气脉冲(32 V, 50毫秒,450 ms-off, 5个脉冲)交付使用forceps-like电极。 E15.5胚胎操作牺牲,P0, P7或者当动物表现出神经脑部肿瘤的迹象。 EGFP-expressing大脑样本选择进一步进行组织学分析。

对于体内肿瘤的形成分析,luciferase-expressing electroporated动物腹腔内注射在新生儿阶段的选择D荧光素和随后的生物荧光成像。转染细胞增长每周监测的测量发光强度与新腔LT系列III卡尺(珀金埃尔默)。动物牺牲,一旦表现出神经症状,如头部倾斜、步态异常、弯腰驼背的姿势,或者在6个月大的时候如果没有症状。提取总rna从发达肿瘤与试剂盒RNeasy +工具包和分析Affymetrix Genechip 430 v2。从肿瘤基因组DNA分离诱导体细胞突变的验证Cdkn2a位点。扩增DNA片段覆盖目标菌进行地区subcloned pGEM-T容易质粒(Promega),其次是Sanger测序。套PCR引物5′-CGGCGATGTTCTACAGGAG-3′, 5′-GAAGCTATGCCCGTCGGTC-3′。

肿瘤模型的跨物种验证

老鼠的肿瘤样本的比较病人的肿瘤样本是由应用semi-supervised Affymetrix微阵列基因表达数据聚类从室管膜瘤肿瘤(YAP1: 11个样品,RELA: 49样本)。跨物种的比较图。4 t组之间的差异表达基因和u,发现与Limma包64根据他们的调整和排序p值(< 0.05)。排名前1000的差异表达Affy探针选择和组合的基础上,选择每个基因表达最高的调查导致了671个基因。接下来,使用编码数据库513 human-mouse直系同源基因选择的671个基因。为选定的同源基因,最终验证了非监督层次聚类和主成分分析ST-EPN-RELA / ST-EPN-YAP1人类肿瘤样本数据结合五YAP1肿瘤模型。

补充图。4 e,差异表达Affy基因探针之间的YAP1-MAMLD1简况和C11orf95-RELA借小鼠模型选择与高信心(n= 4581,p< 0.05)。 orthologues在选定的基因差异表达相比Affy基因探针之间YAP1 RELA人类肿瘤(5000强最自信探针),导致539探针常见的308个同源基因(补充数据6)。额外的验证YAP1小鼠模型是由包含Affymetrix数据从人类pGBM肿瘤(n= 9)和RELA小鼠模型(n= 5)主成分分析与选择的308个基因在物种。

荷兰外商投资局对YAP1和TF芯片测序

浓缩YAP1-bound和NFIA-bound DNA片段的芯片和随后的图书馆准备ChIP-derived DNA的活动主题(CA)卡尔斯巴德5。室管膜瘤脑瘤组织浸没在PBS + 1%甲醛、切成小块,在RT孵化15分钟。停止了固定的0.125米甘氨酸(最终浓度)。组织块然后治疗TissueTearer最后旋转下来洗2×PBS。染色质被孤立的裂解缓冲,紧随其后的是中断Dounce均质机。溶菌产物都用使用EpiShear™探头超声发生器(活动主题,猫# 53051)与一个EpiShear™冷却声波降解法平台(活动主题,猫# 53080)和DNA剪切平均长度为300 - 500个基点。基因组DNA(输入)是由治疗整除的染色质与核糖核酸酶、蛋白酶K,和热de-crosslinking一夜之间在65°C,紧随其后的是乙醇沉淀。丸resuspended和由此产生的DNA是量化NanoDrop分光光度计。外推到原始染色质体积允许定量总染色质的产量。染色质的整除(15μg)事先批准与琼脂糖珠蛋白(表达载体)。基因组DNA感兴趣的区域隔离使用4μg荷兰外商投资局对抗体(Atlas抗体、目录号HPA008884)或8μg YAP1抗体(圣克鲁斯、目录号sc - 15407×)。从珠子复合物被洗,筛选了SDS缓冲区,并受核糖核酸酶和蛋白酶K治疗。交联被孵化了一夜之间在65°C,和芯片DNA被phenol-chloroform纯化提取和乙醇沉淀。定量PCR (QPCR)的反应进行了一式三份特定基因组区域使用SYBR绿色Supermix (Bio-Rad)。由此产生的信号被实施规范化底漆效率QPCR每一对引物使用输入DNA。

ChIP-sequencing读取对齐使用BWA v0.5.10工具65GRCh37参考基因组1000克。数据质量控制进行了采用Qualimap v2.266(补充数据1)。荷兰外商投资局对DNA YAP1交互网站,通过应用mac v1.4被确定67与一个p值1 e−9和低阈覆盖全基因组测序数据匹配样本的控制数据。无监督聚类的前5000名变量标准化YAP1峰值信号减去控制读计数被执行主成分分析应用。识别高信任度YAP1 DNA相互作用在所有三个网站常见测试YAP1或RELA杀虫剂,分别,我们结合YAP1互动网站每组使用合并函数可用Bedtools v2.2468每组通过请求所有三个样本支持YAP1 DNA互动网站的存在。 YAP1 DNA的两个结果集互动网站相互比较来区分交互网站常见的和特定YAP1或RELA杀虫剂,分别。样本中重叠峰集可视化使用UpSetR v1.3.369基于样本覆盖每个峰的数量。荷兰外商投资局对高信任度的山峰从子集获得ST-EPN-YAPs YAP1网站也合并和比较基因组区域的重叠。

TF的主题使用荷马v4.8.3富集分析70。在这里,我们已经添加了TEAD3主题(ID: MA0808.1)从JASPAR核心数据库71荷马的默认数据库388年主题(包括TEAD1、TEAD2和TEAD4图案)。集YAP1山峰常见的两组之间应用作为motif-enrichment额外的控制分析。类属特异性的强化剂和超级增强地区和他们的相关靶基因的表达从先前的研究获得5。

RNA-sequencing

测序读是一致使用明星tripwire GRCh37参考基因组1000克72通过报告只读取一个最好的对齐。独特的基因数一致执行读取使用包Subread v1.4.673基于Gencode第十九节注释。注入工具包v.0.6.3应用融合基因的发现74使用默认参数设置。 YAP1融合的重量相比WT计算的比例分割读取只覆盖断点之间基因的外显子形成融合分裂的总数相比读覆盖外显子边界包括那些支持WTYAP1外显子连接(见补充数据1)。比较基因表达的杀虫剂使用RNA-seq儿科胶质母细胞瘤进行相应的数据研究75。

H3K27ac ChIP-sequencing

最初的数据分析,峰打电话,enhancer-associated最近的基因检测进行了研究5。我们使用相同的对齐和峰值调用程序YAP1 ChIP-seq数据处理。相关的类属特异性的与基因表达增强器信号进行基于拓扑关联域内搜索的调整p值限制0.0176。

去分析

YAP1-bound基因的去分析与ST-EPN-YAP1 H3K27-marked增强剂和大卫ST-EPN-RELA肿瘤进行使用资源77专注于生物过程,分子功能,细胞组件,和KEGG通路类别(见补充数据4)。可视化是使用REViGO生成web服务78。

报告总结

进一步研究信息设计是可用的自然研究报告摘要与这篇文章有关。

数据可用性

研究中的所有测序数据中可用以下公共数据库:EGAS00001002696对于ST-EPNs RNAseq和芯片seq,GSE65362450年k-methylation ST-EPNs数组,GSE64415ST-EPNs Affymetrix表达数据集,GSE134404恶性胶质瘤,Affymetrix表达数据集,GSE110625Affymetrix表达数据集的小鼠YAP1-MAMLD1-driven和C11orf95-RELA-driven肿瘤。