CryoEM结构拟南芥DDR复合物参与RNA-directed DNA甲基化 - ELISA试剂盒,酶免试剂盒,酶联免疫吸附试验, ELISA实验,ELISA,双抗体夹心法,科研蛋白,抗体,细胞系,武汉新启迪生物科技有限公司

摘要

转录的RNA聚合酶V (Pol V)在植物需要RNA-directed DNA甲基化,导致转录基因沉默。全球染色质波尔V协会需要组件的DDR复杂DRD1 DMS3 RDM1,但是这个复杂的装配过程和底层波尔V招聘机制仍然未知。在这里,我们表明,所有DDR复杂的组件硝唑与波尔V,我们报告两个复合物的cryoEM结构与波尔V recruitment-DR (DMS3-RDM1)和DDR′(DMS3-RDM1-DRD1肽),分别为3.6和3.5一项决议,。 RDM1二聚中心框架组装的整个复杂而协调DMS3和DRD1之间的相互作用的化学计量学1 DRD1:4 DMS3:2 RDM1。博士DRD1绑定到复杂引起的剧烈运动DMS3卷曲螺旋螺旋包。我们假设两种复合物功能性中间体调解波尔V招聘。

介绍

表观遗传调控通过DNA甲基化可以防止在许多真核生物基因转录和转座子运动。在植物中,新创DNA甲基化是由小分子rna瞄准特定基因组区域这一过程被称为RNA-directed DNA甲基化(RdDM)1。 RdDM需要两个植物RNA聚合酶被称为RNA聚合酶IV (Pol IV)和RNA聚合酶V (Pol V),和一些辅助蛋白与不同的功能2,3.。

规范化RdDM通路包括几个步骤可以分为两个主要的武器。简单地说,在第一臂的通路波尔IV成绩单复制成双链RNA(极)依赖RNA的RNA聚合酶2 (RDR2)和丁不同DICER-LIKE蛋白质成小干扰RNA (siRNAs),然后加载到ARGONAUTE 4 (AGO4)的蛋白质4。第二臂的通路,抄录波尔V新兵siRNA-loaded AGO4,进而引发DNA甲基转移酶的招聘领域重新甲基转移酶2 (DRM2)调解从头甲基化的胞核嘧啶序列上下文(CHG, CG和CHH H代表一个C或T)。由于波尔V入住率决定RdDM位点5,这是至关重要的,以确定波尔V是针对染色质。两个methyl-DNA绑定SU (VAR) 3 - 9 homologs-SUVH2和SUVH9-as以及组件的DDR complex-DEFECTIVE RNA-DIRECTED DNA甲基化1 (DRD1),一个假定的SNF2-containing染色质重塑蛋白;6有缺陷的分生组织沉默3 (DMS3),染色体结构的维护(SMC)铰链domain-containing蛋白质7; 和RNA-DIRECTED DNA甲基化1 (RDM1),植物蛋白质与守恒DUF1950域4,8——被证明是需要全球染色质协会波尔V,因此表现出强烈RdDM突变表型5,9。先前的研究显示物理DDR蛋白质之间的交互10,11之间,SUVH2 / SUVH9和DMS312,DRD1和波尔V之间11。人工SUVH9拘束,DMS3,或RDM1澳洲公平工作委员会轨迹在不同RdDM突变背景表明基因下游SUVH2 / SUVH9 DDR复杂行为13。一起,这些观察定位DDR复杂作为甲基化的关键组件,徒下游读者SUVH2 / SUVH9招募波尔V RdDM位点。然而,DDR复杂的装配特征和波尔V招聘的基本机制是未知的。

在这里,我们报告的cryoEM结构(DMS3-RDM1)博士和DDR′(DRD1 peptide-DMS3-RDM1)复合物。我们的结构表明,DRD1绑定到一个复杂的集中由一个RDM1二聚体的核心有两个二聚体DMS3两侧。惊人的构象变化发生在一个灵活的卷曲螺旋(CC)域的DMS3博士复杂绑定DRD1变成稳定的DDR′复杂。我们建议绑定的DRD1博士可能代表一个组装步骤复杂的DDR复杂RNA聚合酶的形成,可能导致招聘V。

结果

DMS3和RDM1形成一个稳定的复杂的体内和体外

DDR复杂被法律等人首次提出三种共沉淀蛋白质的复杂的免疫沉淀反应中紧随其后的是质谱(IP-MS)实验设计确定扶少团团员DMS3 DRD111。我们进行了互惠IP-MS实验用线条表达RDM1-3xFLAG(无花果。1和补充图。1)。正如预期的那样,我们发现这三个组件的DDR复杂这些样品中含量最丰富的蛋白质。重要的是,其余的蛋白质实验中确定代表常见的污染物得到其他独立IP-MS实验在我们实验室。有趣的是,我们观察到RDM1更有效地co-precipitating DMS3 DRD1相比。符合这一观察,DMS3-3xFLAG IP-MS结果显示大量的RDM1 DRD1相比更高11。我们执行ChIP-seq实验分析基因组定位不同的DDR组件。结果显示强大的本地化之间重叠的DDR蛋白质在波尔V网站,建议他们一起函数体内(无花果。1 b, c和补充图。1 b).

获得更多的了解DDR组件相互作用,我们进行了酵母混动实验(Y2H)。我们的数据证实了先前的观察,DMS3和RDM1 homo和二聚化10。然而,我们没有检测DRD1和DMS3或RDM1之间的相互作用,或与自身DRD1(补充图。1 c)。为了检测这些相互作用在不同的系统中,我们中的DDR蛋白质大肠杆菌,发现DMS3和RDM1表示,并组成了一个大型复杂的近似200 - 300 kDa本身(无花果。1 d上),即使没有DRD1,可怜的溶解度(补充图。1 d)。这些结果与获得的结果在IP-MS实验中,支持的想法,除了他们的交互与DRD1, DMS3和RDM1成立一个独立的稳定的复杂,我们命名为博士复杂。

博士的整体结构复杂

使用单粒子cryoEM,我们确定的结构复杂的博士(补充图3.6全面解决。2- - - - - -5和表1)。 DMS3 cryoEM结构表明,化学计量学:RDM1 2节(无花果。2)。复杂博士的两个RDM1分子形成二聚体的中心复杂(图。2)。 RDM1二聚作用主要是由疏水相互作用,这是符合RDM1的晶体结构8。围绕这个核心四DMS3 RDM1二聚体分子形式两个二聚体,每个绑定的暴露面RDM1单体的二聚体核心,互相对立。此外,对面的两个DMS3二聚体桥RDM1二聚体核心使用两个CC武器(图。2)。有趣的是,尽管两DMS3二聚体是相似的,这两种单体在每个DMS3二聚体有不同的结构:一个显示两个可见的铰链和CC域,而另一单体有可见的铰链但未解决的CC域结构(图。2 b)。为了清晰起见,他们被称为DMS3用盐酸和DMS3h,分别。

表1 CryoEM数据收集、细化和验证数据

全尺寸表

DMS3 RDM1及其广泛的交互

善意的SMC蛋白质相比,DMS3缺乏ABC-type腺苷三磷酸酶头但包含了SMC铰链域和更短的侧翼CC域(补充图。6a)。正如预测的那样,DMS3包含中央SMC铰链域两侧是两个~ 50残留长螺旋(无花果。2 b)。氨基端地区aa。 1-42和c端地区aa。 410 - 420年在所有不可见DMS3单体的结构,可能由于灵活性。 DMS3二聚在握手的配置中,使用两个铰链领域形成一个甜甜圈形状(图。2 b)。二聚作用主要是由两个相互接触两个β链(残留225 - 229和残留物,334 - 338年)从每个单体,折叠成一个连续β-sheet系统,横跨两个单体(补充图。8)。每个DMS3折180°左右铰链域,使N -α螺旋和c终端形成一个反平行的CC手臂(无花果。2 b)。这种类型的二聚和折叠与SMC家庭成员是一致的14,15,16,17。有趣的是,一个乙基显示(EMS)诱变筛选拟南芥中发现的DMS3 G339E突变导致新创DNA甲基化的损失7。 cryoEM结构表明,该G339残渣位于二聚作用之间的接口两个铰链域(无花果。2 b和补充图。8)。从一个没有侧链甘氨酸突变笨重的谷氨酸会创造空间的两个单体之间的冲突可能会扰乱这二聚接口(补充图。8)。符合这样的预测,我们发现重组的大小分布DMS3 WT和G339E突变体互相截然不同的凝胶过滤概要与G339E突变体显示洗脱较小的分子量(图。2摄氏度(左)。

当我们与SMC1-4 DMS3铰链的结构相比,我们发现,尽管大多数地区的铰链域是高度相似,DMS3拥有四个不同loops-i.e。循环1 - 4(无花果。二维)。此外,序列比对的DMS3直接同源不同植物物种中表示,四个循环是守恒的DMS3直接同源(无花果。2 d,对吧和补充图。6 b)。循环1位于最远端核心,导致DMS3二聚作用; 循环2和3面向中心的复杂,博士参与DMS3-RDM1交互; 循环4是在侧面,联系RDM1或CC领域从其他DMS3二聚体(无花果。2 e)。值得注意的是,DMS3二聚体与RDM1以非对称的方式,导致相同的循环的两种单体参与不同的相互作用。这些循环不与其他残留的复杂互动及其功能因此未知。

我们cryoEM结构复杂的博士也揭示了许多DMS3二聚体之间的相互作用和RDM1,估计埋的界面面积~ RDM1二聚体的表面积的31%。铰链二聚体和CC的DMS3与RDM1(无花果。2 f)。铰链dimer-RDM1交互主要是由疏水残基,而很少有残留参与氢键网络(无花果。2 f,插图1和2)。重要的是,G339E突变,这扰乱了DMS3二聚体,导致严重亏损DMS3-RDM1互动下拉实验(图。2摄氏度,对吧)。这表明DMS3二聚作用是稳定的相互作用的关键DMS3博士和RDM1复杂。此外,RDM1包含疏水口袋(惠普)由螺旋α1α6,最后c端段RDM1(无花果。2 f)。这个口袋里皮套裤结合的晶体结构8和一个突变(Y51A + Y54A)旨在破坏这口袋没能补一个rdm1突变体10。值得注意的是,两个口袋都被CC手臂的DMS3 cryoEM结构(无花果。2 e、f、插图3)。在一起,我们的观察表明,RDM1二聚作用的复杂的中心汇集了两个DMS3二聚体形成4 DMS3:2 RDM1化学计量学(无花果。2); 这二聚作用似乎发挥重要作用在维护的完整架构复杂的(也参见讨论部分)。

DRD1绑定在DDR′复杂引发剧烈CC运动

DRD1是100 kda SNF2蛋白质家族成员具有helicase-like SWI2 / SNF2域在其糖基。除了一个小守恒的地区(aa。 238 - 302年)前SWI2 / SNF2领域,大多数的n端结构域(元)不属守恒的拟南芥SWI2 / SNF2-containing蛋白质(补充图。9)。这个无特征域可能因此调解的具体交互DRD1博士与复杂。尽管DRD1 DDR复杂的一部分,我们Y2H实验未能表现出任何二进制与DMS3交互或RDM1(补充图。1 c)。然而,我们发现,当这三个蛋白表达在一起在酵母3-hydrid系统(Y3H) DRD1交互检测(图。1 e)。这些数据表明,DMS3-RDM1交互是一个稳定的DRD1交互的先决条件。由于贫穷的长篇DRD1溶解度大肠杆菌(补充图。1 d),我们利用Y3H系统寻找可溶性DRD1最小的地区与其他蛋白质(图交互的能力。1 e)。我们发现了一个DRD1实行我们称为肽7是足够的和交互所需的DRD1 DMS3和RDM1(无花果。1 edom1.7)。序列比对表明,肽7是守恒的DRD1蛋白质中不同植物物种的但不是其他SWI2 / SNF2蛋白质(图中找到。3和补充图。9)。当发生在大肠杆菌、DMS3 RDM1, DRD1肽7形成一个稳定和可隔离的复杂,我们称为DDR′复杂(无花果。1 d)。使用单粒子cryoEM,我们确定的结构DDR′3.5的复杂整体解决方案。虽然DDR′复杂的整体结构框架类似于复杂,博士的DDR′展览两个重要结构差异(图3罪犯).

首先,DRD1肽7形成三螺旋(α1、α2α3)和绑定到DMS3-RDM1 DDR′复杂(图。3 b, c)。螺旋α1螺纹成对称的,疏水裂RDM1二聚体形成的界面包括残留Lys121和Leu128(无花果。3 e,插图1)。另一方面,α2从事疏水相互作用两个CC武器和一个铰链从三个DMS3分子,而α3与CC的胳膊,从两个DMS3分子(图一个铰链。3 e,插图2)。值得注意的是,DMS3h循环2,也就是免费的复杂的现在与α3博士DRD1(无花果。2e和3 f,蓝色DMS3h(D))。此外,DMS3h循环4,联系人的CC手臂博士现在复杂与α2 DRD1肽7(无花果。2e和3 f,蓝色DMS3h(D))。我们试图模型的另一个DRD1肽7相同的相互作用复杂,然而,这导致了空间之间的冲突两个α1螺旋(无花果。4)。因此,DDR′复杂最有可能只包含一个分子的肽。

第二个博士和DDR′复合物之间的主要区别是,无序CC手臂DMS3之一h在复杂的命令,可见博士DDR′复杂的(即。在DMS3 CChc2)。这CC的手臂是从事与DRD1肽7(见上图)。这表明这个CC的构象变化大臂是由DRD1肽7绑定。有趣的是,下令CC的手臂有一个独特的构象,并不是博士观察到的复杂(图。3 d)。这DMS3用新命令CC的手臂被任命为DMS3单体hc2(无花果。3 b)。结合两个DMS3国家博士已经见过的复杂,我们有三种不同的DMS3州(DMS3h,DMS3用盐酸和DMS3hc2DDR′复杂(图)。3 d)。值得注意的是CC从两个DMS3武器用盐酸被认为在博士和DDR′复合物(无花果。2e和3 f)。这两个CC武器不与DRD1肽7。相反,他们主要是相互作用的疏水口袋RDM1(见上图)(图2 f).

确认组织内的DDR′复杂,我们应用不同的蛋白质交联reagents-disuccinimidyl辛二酸盐(DSS)和己二肼(ADH)结合4 - (4 6-dimethoxy-1 5-triazin-2-yl) 4-methyl-morpholinium氯(DMTMM)——DDR′复杂,使用质谱(MS)分析蛋白质-蛋白质之间的关系。我们发现的N -和C-coils DMS3展品丰富的内部交叉连接时折叠形成CC的手臂,RDM1交叉连接主要是铰链DMS3域,最后DRD1肽7交叉连接的CC DMS3(补充图。7和补充数据1)。这些cross-linking-MS (XL-MS)数据是在良好的协议与我们的结果cryoEM分析。

讨论

我们报告的结构拟南芥波尔V招聘复合物(DMS3-RDM1)博士和DDR′(DRD1肽7-DMS3-RDM1)。两个配合物的结构是相似的在他们core-two DMS3二聚体桥接RDM1二聚体。我们假设复杂可能代表早期中介复杂博士之前的形成完整的DDR复杂。这是两条线的证据支持。首先,虽然表达我们博士观察到复杂的蛋白质是稳定没有DRD1本身。第二,高浓缩的DMS3 RDM1观察在不同的温和IP实验(在150毫米氯化钠)从植物组织,地方DMS3与大量RDM1高于DRD1共沉淀11和RDM1共沉淀与大量DMS3高于DRD1(无花果。1)。博士结合的结构和生化分析和DDR′复杂与先前的基因研究描绘了一幅可能的DDR复杂可能组装(无花果。4).

从结构、RDM1二聚作用汇集了两个核心DMS3二聚体形成的化学计量学博士复杂4 DMS3:2 RDM1(无花果。4)。这是由佐佐木et al .,他报告说,一个包含L128R RDM1突变和I132R阻止homodimerization未能拯救一个基因rdm1突变体。然而,这种突变维护其正常与DMS3交互的能力10。博士的复杂,两个DMS3 CC武器是与疏水口袋(HP)交互RDM1二聚体,而其余CC武器是免费的,而且无序(图。4)。通过比较结构的DDR′复合物,博士看来,DDR复杂的组装,DRD1肽7的绑定的复杂导致博士一个引人注目的运动灵活CC手臂DMS3之一hDMS3变得有序和假设hc2构象的DDR′复杂(图。3 b, c,DMS3hc2(F))。也有可能更大的片段DRD1元可能稳定DMS3最后失踪CC的手臂h(D)的DDR′复杂。新命令CC臂定位接近DMS3的CC的手臂用盐酸从同一DMS3二聚体(DMS3用盐酸(E) -DMS3hc2(F)) DDR′复杂的状态,我们称作为“封闭”状态(无花果。4 b),因此相应的DMS3二聚体有一个灵活的CC手臂博士在复杂的被称为是一个“开放”的国家。类似的大型构象变化的CC武器也被观察到在其他SMC复合物(补充图。10,下半部分)和DNA被认为控制自己的协会18,19,20.。然而,SMC复合物相比,DMS3展品显著差异的方向CC武器(补充图。10)。构象变化观察到DMS3也可能实现不同的目的,因为DMS3铰链的内表面是被RDM1和不包含重要的带正电的补丁推测结合DNA,观察到在SMC蛋白质14,19。此外,这个DMS3构象变化是由绑定DRD1肽7,而不是ATP水解在SMC复合物。鉴于肽7广泛与自由CC的手臂,我们设想自由CC手臂在复杂的用于DRD1博士招聘组装完整的DDR复杂(图。4)。进一步的工作需要确定是否这个CC手臂本身就足够了DDR这个任务的复杂。

博士和DDR′复合物,RDM1二聚体作为支柱的组合提供了交互DMS3二聚体的表面。然而,很明显的DDR′复杂RDM1二聚体也参与DRD1绑定。当螺旋线α2和α3 DRD1肽7与CC交互主要武器和DMS3铰链,分别螺旋α1结合残留物形成的疏水裂Lys121和Leu128 RDM1二聚体界面(图。3 e)。因此,RDM1二聚体贡献超过仅仅保留完整性DRD1复合体都创建一个表面的相互作用。多少这个表面有助于DRD1招聘仍有待确定。然而,我们建议RDM1 Y2H数据本身不可能与DRD1(补充图。1 c)。可能的是,多个交互,7肽参与是必要的。这也是符合我们Y3H数据显示,DRD1只能当DMS3和交互RDM1存在(图。1 e)。总的来说,我们的数据支持复杂博士是可敬的前提条件的形成稳定的DRD1绑定(无花果。4).

我们假设波尔V的招聘可能会直接被DRD1架桥,鉴于其报道接近物理协会。法律等人观察到两个种群DRD1蛋白质在凝胶过滤实验与植物核提取一个co-migrating DDR复杂和另一个co-migrating大型波尔V复杂11。支持这个想法,DRD1波尔V时不稳定的催化亚基NRPE1在植物中被淘汰21。此时还不清楚如果波尔V直接招募到完全组装DDR复杂或如果预制DRD1-Pol V复杂博士招募到复杂(图。4摄氏度)。值得注意的是,交互的肽7在DDR′复杂DRD1的一小部分; > 90%的蛋白质丢失,包括大部分的n端结构域和c端一半包含SWI2 / SNF2 atp酶域。因此,体内,DRD1可能功能超出桥接波尔V .例如,atp酶域可能施加一个染色质重构函数来确保适当的Pol V招聘或在转录持续援助4,22,23,24,或者它可能调节RNA转录的处理25。与此一致的是,突变DRD1 atp酶域RdDM废除6,7。

高的疏水口袋等人提出,RDM1甲基化在CHH单链DNA结合上下文,因此建议RDM1新兵RdDM机械染色质甲基化26。我们cryoEM结构,相比之下,显然表明RDM1二聚体的疏水口袋都忙于CC DMS3域用盐酸在博士和DDR′复合物(无花果。2 e, f,3 f,对吧)。一种解释的差异我们的观察和高等人研究人工蛋白质绑定由于高蛋白浓度条件中使用他们的(即EMSA实验。 ~ 10μM)26。另一个可能性是DDR复杂与其他蛋白的相互作用能促进监管卷曲螺旋域允许的位移在染色质DNA结合本地化。

我们最近的功能、锌finger-tethering加上丧失RdDM突变体的实验表明,DMS3和RDM1能够触发RdDM在suvh2 suvh9双突变体,但SUVH9无法触发RdDMdms3或rdm1(或drd1)突变体13。这些实验清楚地地方SUVH2/9上游DDR的功能组件。此外,DMS3和RDM1无法触发RdDM要么drd1波尔V变异或突变体的催化亚基(nrpe1),将行动DMS3和RDM1上游或相同的步骤从Y2H DRD1和波尔诉前工作建议DMS3可能是DDR组件,身体与SUVH2/9交互4,9,12。这些结果,结合当前研究的结果,提出一个假设的模型RdDM波尔V的招聘活动(无花果。4摄氏度)。博士的模型显示复杂的形成是一个先决条件的招聘DRD1形成了DDR复杂。甲基化DNA读者蛋白质SUVH2/9可以作为招聘人员和/或博士DDR复合物的网站以前由RdDM甲基化。然后DRD1蛋白质可以作为DDR和波尔V复合物之间的桥梁,最终招募波尔V,这是需要延续额外RdDM。

总之,在这个工作我们决定博士和DDR′复合物的结构。转换从博士到DDR′复合物可以代表一个过渡DDR复杂的装配步骤导致波尔V招聘(图。4摄氏度)。 DMS3结构揭示了构象的转变的CC域从一个“开放”的“关闭”状态时绑定DRD1形成了DDR复杂。进一步确定的招聘机制波尔V的DDR复杂和DDR染色质等待的结构理解双方的交互由DRD1博士复杂和波尔V,以及那些由DMS3 DDR复杂和SUVH2/9。

方法

代的转基因RDM1-3xFLAG线

包含3盒xflag被克隆到pENTR-RDM1包含RDM1基因组片段的质粒13生成pENTR-RDM1-3xFLAG。 RDM1-3xFLAG片段被转移到JP726目标质粒27创建pEG-RDM1-3xFLAG使用LR clonase(表达载体)。这个质粒被引入土壤杆菌属AGL0,用于变换rdm1-3(FLAG_298G06)花卉植物的方法。

亚硫酸氢全基因组测序

基因组DNA Wassilewskija (WS),rdm13和两个独立的线条表达RDM1-3xFLAG提取使用DNAeasy植物迷你包(试剂盒)。 DNA被剪切Covaris S2 (Covaris)的300个基点。库,包括亚硫酸氢转换,是用NuGEN超低Methyl-seq工具包(NuGEN)和亚硫酸氢EpiTect工具包(试剂盒)制造商的指示。 WGBS分析类似13。一般来说,原始读取使用BSMAP TAIR10基因组排列282 - v(允许最大两个不匹配)和- n 1(调整到两股)。连续读取被丢弃的如果有超过三甲基化CHH网站内读取(50个基点久读)29。在每个胞嘧啶甲基化水平被计算成# C / C + (# # T)。 dmr WS -rdm1使用R包DMRcaller定义吗30.。定义CHH dmr,参数被应用31。基本上,100个基点箱子超过四胞核嘧啶和每个胞核嘧啶超过4阅读报道以及超过0.1的区别rdm1和WS用作截止。 dmr在200个基点是合并进行进一步分析。胞嘧啶甲基化在rdm1海波CHH DMR提取和绘制r . WGBS跟踪显示在无花果。1 c对应于野生型Col-0样本中描述粗呢衣服等。31。

免疫沉淀反应和质谱(IP-MS)

IP-MS执行与前面描述的一些细微的修改11。两个独立的RDM1-3xFLAG线以及untransformed WS控制植物生长在土壤工作时间长条件。收集10克的花序,磨在液氮和resuspended 40毫升IP缓冲区(50毫米三pH值7.6,150毫米氯化钠,MgCl 5毫米2德勤NP40 10%甘油、0.1%,0.5毫米,1毫米PMSF,μgμL−1胃酶抑素,1×完整EDTA-Free(σ))。组织是由douncing均质,离心机在10000×10分钟g在4°C和过滤100μm细胞教练。二百五十毫升水中Anti-FLAG M2磁珠(σ; M8823)每个样本使用。增加样本之前,珠子在IP缓冲洗两次,然后阻止15分钟在IP RT缓冲5% BSA w / v,并与IP缓冲洗两次。在4°C 3 h和孵化后旋转,样本洗五次与IP缓冲后跟两个洗IP没有NP40缓冲区。蛋白质与150年被筛选了三次μL IP缓冲区没有NP40但补充μg 250毫升−13 xflag肽(σ; F4799)。筛选了蛋白质沉淀与柠檬酸30分钟在冰和冷丙酮清洗和风干。

柠檬酸沉淀样本resuspended在100毫米三pH值8.5,8 M尿素和消化的顺序添加endoproteinase Lys-C和胰蛋白酶如前所述32。消化样本然后使用反相色谱分离在线和筛选了导演Q-Exactive质谱仪(ThermoFisher科学)串联质谱收集使用视收购计划33。数据随后被分析使用IP2套件的算法利用ProLuCID数据库搜索和DTASelect过滤使用decoy-database估计错误发现率34,35。比较样本之间的肽和蛋白质识别使用内部执行脚本。

染色质免疫沉淀反应(芯片)

芯片进行如前所述,一些细微的修改13。简而言之,3 g的花序RDM1-3xFLAG植物中描述这项工作,以及DMS3-3xFLAG DRD1-3xFLAG植物中描述法等。11生长在土壤在漫长的一天的条件下,在液氮磨和固定在核隔离缓冲区包含1% v / v甲醛。与添加甘氨酸固定反应停止,细胞核提取,染色质用使用Bioruptor + (Diagenode)。染色质免疫沉淀反应,5μg anti-FLAG M2抗体(σ; F1804)一夜之间在4°C与旋转和捕获一个1:1的混合蛋白质G和Dynabeads(表达载体; 10002 d和10002 d) 3 h与旋转在4°C。复合物与低盐缓冲洗一次,一旦与高盐缓冲,一次与氯化锂的缓冲和两次与EB缓冲区,然后筛选了洗脱缓冲两次20分钟的65°C。交联逆转了一夜之间在65°C,紧随其后的是蛋白酶K治疗4 h在45°C。 DNA纯化使用苯酚:氯仿和沉淀一夜之间在NaOAc−20°C,乙醇和Glycoblue(表达载体)。测序图书馆准备使用鼓掌V2超低系统1 - 16工具包(NuGEN),遵循制造商的指示。

数据分析、原始读取对齐到拟南芥参考基因组(TAIR10)领结(v1.0.0)36,允许最多只有唯一地映射读取两个不匹配,并删除重复读取与Samtools 0.1.1937。波尔V峰值被称为比较波尔对没有抗体抗体芯片控制芯片中描述刘et al。38,用MACS2问价值0.05 v (2.1.1)39。为ChIP-seq metaplot热图,山峰的峰会上使用两个以上的浓缩和土地使用NGSplot生成(v 2.41.4)40。 BamCompare (deepTools 2.0)41是用于生成ChIP-seq跟踪显示日志吗2比国旗ChIP-seq信号DRD1、DMS3和RDM1转基因线在国旗ChIP-seq信号untransformed Col0控制,或log2 anti-Pol V ChIP-seq信号比没有抗体控制。进口(2.4.16)被用来可视化生成的文件。

酵母两,三辆混合动力

酵母的实验,CDS RDM1序列,DMS3,和DRD1 DRD1删除报道在pENTR / D克隆质粒表达载体和sub-cloned pDEST22和pDEST32目标质粒(英杰公司)使用LR clonase(表达载体)。 Y3H实验、RDM1 cd克隆在修改pYES-DEST52(表达载体),其中GAL1子从pDEST22/32本构ADH1发起人所取代。

酵母转化完成后ProQuest 2台混合动力系统(英杰公司)根据制造商的指示和使用MaV203酵母菌株。四个独立的每个条件都生长在殖民地中不同浓度的3-amino-1 2, 4-triazole(3σ)。

蛋白表达和纯化

拟南芥RDM1和DMS3克隆到pCDFDuet-1 (EMD微孔),与6 xhis RDM1的n端上的标签。拟南芥DRD1 7肽克隆成pET21b (EMD微孔),用链锁状球菌II DRD1糖基的标签。质粒变成了Rosetta2 (DE3)大肠杆菌博士(EMD微孔)的蛋白质expression-pCDFDuet-1复杂; pCDFDuet-1和pET21b DDR′复杂。单个菌落接种在500 - 1000毫升磅文化动摇37°C。介绍过o。d。邓肯一次600达到0.4 - -0.6,文化是冷却到16°C和IPTG浓度添加到最终的0.1毫米。文化持续增长在一夜之间16°C瓶(16 - 20 h)。细胞在5000 rpm收获15分钟在4°C和PBS洗一次。细胞颗粒对蛋白质纯化直接使用或储存在以后使用−80°C。

颗粒在30 - 40毫升resuspended缓冲区包含20毫米HEPES-KOH pH值7.5,150毫米氯化钠,德勤v / v甘油10%,3毫米。标记亲和下拉,50 mM咪唑也添加到缓冲树脂,以减少非特异性结合。暂停与1×完整的蛋白酶抑制剂补充鸡尾酒(罗氏制药),1毫米PMSF, 1毫米苯甲脒和1.5毫克毫升−1蛋清溶菌酶,在冰上孵化了30分钟。之后,暂停打破细胞用在4°C。暂停是在11000×g1 h在4°C移除碎片。浮在表面的恢复,透过0.22μm PES膜(EMD微孔)。复杂博士是纯化使用5毫升陷阱惠普(GE),在DDR′复杂纯化使用5毫升喉炎陷阱惠普(GE),遵循制造商的建议。平衡,清洗缓冲陷阱惠普包含20毫米HEPES-KOH pH值7.5,150毫米氯化钠,v / v甘油10%,2毫米德勤,和50 mM咪唑; 咪唑洗脱缓冲补充了500毫米。平衡和洗缓冲区链锁状球菌陷阱惠普包含20毫米HEPES-KOH pH值7.5,150毫米氯化钠,10% v / v甘油,和德勤约3毫米; 洗脱缓冲包含50 mM Tris-HCl pH值7.5,150毫米氯化钠,EDTA 1毫米和2.5毫米desthiobiotin。筛选了配合物主要集中在4°C使用Amicon Ultra-15 100 kDa截止(EMD微孔)。 HiLoad 16/600 Superdex 200 pg列(GE)是平衡与缓冲区包含20毫米HEPES-KOH pH值7.5,150毫米氯化钠NGC追求10 + FPLC系统(Bio-Rad)。集中样本加载和运行在0.8 - -1.0毫升的列在流量最小−1。分数被收集和分析在sds - page沾帝国蛋白质染色(ThermoFisher科学)。最高分数相结合,集中使用Amicon Ultra-15 100 kDa截止。集中复杂要么是直接使用EM或储存在−80°C为以后使用(20% v / v甘油添加存储之前)。

CryoEM样品制备和成像

cryoEM样本优化,2.5的整除μL样品的浓度0.45 - -0.5毫克毫升−1应用到仪多洞的碳涂层铜网格(300目,QUANTIFOIL®R 1.2/1.3)。网格与595级涂抹滤纸(Ted斗篷)和瞬间冷冻与范一个马克IV Vitrobot液态乙烷。一个范TF20 cryoEM仪器被用来屏幕网格。 CryoEM电网最优粒子分布和冰层厚度是通过不同气体(空气源使用PELCO easiGlowTM、目标真空0.37 mbar目标当前马15; 或H2/ O2使用Gatan模型950先进的等离子体系统,目标70毫托的真空,目标50 W)的力量和辉光放电的时间,申请样品的体积,室内温度和湿度,吸水时间和力量,以及吸水后排水时间。我们最好的网格与20年代复杂的获得博士辉光放电使用H2/ O2和Vitrobot样品室温度设定在10°C,湿度100%,10 s吸水时间,−8吸水力,2 s排水时间。最好的DDR′复杂网格得到20年代辉光放电使用H2/ O2和Vitrobot样品室温度设定在10°C,湿度100%,11 s吸水时间,−5吸水力,1 s排水时间。

优化cryoEM网格范被加载到一个泰坦克里奥尔语与Gatan电子显微镜成像过滤器(GIF)量子LS设备和post-GIF K2峰会直接电子探测器。显微镜是在300千伏的GIF energy-filtering狭缝宽度设定在20 eV。电影与Leginon收购42超分辨率的电子计数模式/ 0.535像素的像素大小(复杂)的博士或计数模式/ 1.07像素的像素大小(DDR′复杂)。总数的40帧为每个电影在8秒,总剂量~ 50 e−/一个2/电影。

漂移校正电影帧

在每部电影帧对齐的漂移修正MotionCor2 GPU-accelerated程序43。第一帧时跳过漂移校正由于担忧更严重漂移/充电的框架。两个平均显微图,一个剂量权重和其他没有剂量权重,在漂移修正后为每部电影生成。平均显微图有一个校准1.07像素大小的样本规模。加权平均显微图没有剂量仅用于散焦的决心,与剂量加权平均显微图是用于所有其他的图像处理步骤。

结构复杂博士的决心

博士的复杂,的散焦值平均显微图被CTFFIND4决定44从−1.5−2.5μm。最初,总共有1543489个粒子自动选择从2513年平均显微图没有参考使用Gautomatch (http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang)。粒子是盒装在256×256平方像素尺寸和封存128×128平方像素(2.14像素大小)在做进一步处理之前由cryoSPARC v145。几个迭代reference-free 2 d分类随后执行删除粒子(即“坏”。与模糊或un-interpretable特性、类),1148692年收益率好的粒子。由此产生的粒子受到从头开始重建和三维多相分类与三个类cryoSPARC v1。一直只有一个类表现出良好的模型特性,含有31.9%的粒子(补充图。3)。粒子与类概率低于0.9被从这个好类。我们重新居中其余粒子这么好的类和删除重复基于每个粒子的唯一索引。由此产生的粒子被un-binned 256×256平方像素(1.07像素大小)最后的细化。

314414 un-binned,独特的粒子(20.4%的粒子)的异构分类受到最后一步的3 d auto-refinement RELION2.1(补充图。3)。两个一半地图从这auto-refinement一步受到RELION标准后处理程序。最后的地图复杂博士平均3.6解决基于RELION金本位FSC(见下文)。

DDR′复杂结构的决心

DDR′复杂,的散焦值平均显微图被由CTFFIND4−1.5−2.5μm不等。最初,总共有2482628个粒子自动选择从4383年平均显微图没有使用Gautomatch参考。尺寸的粒子是盒装240×240平方像素(1.07像素大小)进行处理的cryoSPARC v1。几个迭代reference-free 2 d分类随后执行删除粒子(即“坏”。与模糊或un-interpretable特性、类),1767986年收益率好的粒子。由此产生的粒子受到从头开始重建和三维多相分类有五类cryoSPARC v1。一直只有一个类表现出良好的模型特性,含有25.5%的粒子(补充图。3)。我们重新居中这个好类的粒子和删除重复唯一索引的基础上最终细化每个粒子(补充图。4).

620248 un-binned,独特的粒子(25.0%的粒子)的异构分类受到最后一步的3 d auto-refinement RELION2.1(补充图。4)。两个一半地图从这auto-refinement一步受到RELION标准后处理程序。最后的DDR′地图复杂平均3.5解决基于RELION金本位FSC(见下文)。

解决评估

以上决议报告是基于“金本位”FSC 0.143标准46。 FSC曲线计算使用软球面罩和高分辨率噪声替换被用来纠正卷积面具对FSC的影响曲线47。可视化之前,所有地图都是通过应用负磨B因素估计使用自动程序48。当地使用ResMap分辨率估计49。地图的整体质量博士和DDR′复合物提出了补充图。3罪犯和补充图。4罪犯,分别。数据收集和重建数据总结在表1。

模型建立和细化

援助单元赋值和模型建立,我们利用报道RDM1结构(PDB代码:3 gan),上到博士的中部地区复杂密度地图UCSF嵌合体50。我们手动调整它的侧链构象,必要时,主链转移到比赛密度地图使用傻瓜51。接下来,我们建造DMS3新创的原子模型。序列的任务主要是指导下可见密度与笨重的侧链氨基酸残基,如Trp,酪氨酸,法和参数。其他残留物包括通用电气和Pro还帮助分配过程。独特的序列模式片段包含这样的残留残留的用于验证任务。

博士的DDR′复杂,复杂模型严格安装密度地图的使用傻瓜DDR′和手动调整。这使我们能够识别额外的密度DRD1肽7和一个卷曲螺旋臂DMS3缺席的复杂,博士的原子模型构建新创类似方法如上所述。

原子模型提炼使用凤凰在现实空间52二级结构和几何约束。细化统计和DDR′博士总结表1。这两个模型也是基于Molprobity成绩评估53拉马钱德兰情节(表1)。模型/地图FSC验证补充无花果所示。3 e和4 e。代表密度的蛋白质和RNA补充图所示。5。所有组织图像本文使用UCSF嵌合体生成和ChimeraX54。

他的标签关联下拉

Rosetta2 (DE3)大肠杆菌表达pCDFDuet-1-His-RDM1 / DMS3或pCDFDuet-1-His-RDM1 / DMS3 G339E被诱导蛋白表达和细胞溶解产物制备。 50毫升水中磁性Ni-NTA琼脂糖悬挂与洗缓冲区(试剂盒)平衡(20毫米消息灵通的pH值7.5,200毫米氯化钠,v / v甘油10%,50 mM咪唑,v / v Tween20 0.05%, 2毫米德勤,PMSF和1毫米。七百毫升的细胞溶解产物与珠子孵化与旋转4°C。上层清液被删除了,珠子是洗四次1000μL洗缓冲与旋转4°C。结合蛋白与20μL洗脱筛选了两次缓冲区(20毫米消息灵通的pH值7.5,150毫米氯化钠,v / v甘油10%,500毫米咪唑,2毫米德勤)在4°C 5分钟。洗出液是结合在一起的。样本在sds - page分析,沾染了帝国蛋白质染色、扫描和量化奥德赛CLx成像仪(LI-COR生物科学)使用700和800 nm通道。洗出液中蛋白质乐队被标准化的输入,然后DMS3 / RDM1计算的值。从两个实验平均图所示。2摄氏度。

凝胶过滤分析DMS3 WT和G339E(无花果。2摄氏度),Rosetta2 (DE3)大肠杆菌表达pCDF-His-DMS3或pCDF-His-DMS3 G339E被诱导蛋白表达和细胞溶解产物制备。细胞溶解产物对应100 - ml文化经过300μL包装Ni-NTA琼脂糖在4°C(试剂盒)。珠子广泛洗了洗缓冲区(20毫米HEPES-KOH pH值7.5,150毫米氯化钠,v / v甘油10%,德勤2毫米和50毫米咪唑)和筛选了两次100μL洗脱缓冲(清洗缓冲补充了500毫米咪唑)在4°C 10分钟。洗出液组合和分析在分析Superdex 200 10/300 GL (GE) 0.5毫升最小的流量−1与凝胶过滤,平衡缓冲(20毫米HEPES-KOH pH值7.5,150毫米氯化钠)。

蛋白质交联

同位素DSS (DSS-H12 / D12)和抗利尿激素(ADH-H8 / D8)被用来交联DDR′复杂。 DSS交叉连接之间的一级胺赖氨酸残留物和蛋白质的N末端,ADH酸性氨基酸残基之间的交叉连接(Asp和Glu),但依赖于耦合试剂DMTMM激活羧基组在交联反应。 DMTMM还可以直接交联赖氨酸本身的酸性渣。因此,在一个抗利尿激素/ DMTMM反应,两种类型的化学将generated-ADH-mediated DMTMM-mediated交联(后者称为零联系; 女士可以区分ZL)——分析。典型的摩尔比率ADH DMTMM是1:1的交联反应55。 cross-linkers的最佳浓度和交联条件(时间和温度)经验决定利用sds - page和蛋白质染色。在交联实验中,50μg DDR′复杂的交联与抗利尿激素的15毫米(创意分子Inc .)和DMTMM(σ)或0.5毫米的DSS(创意分子Inc .)在室温下10和30分钟,分别。 100毫米醋酸钠的反应被淬火/三、pH值7.0或50 mM碳酸氢铵,分别为30分钟37°C。样本储存在−80°C到MS分析。

MS分析样品处理

交联并淬火措施后,样本处理如前所述56。二硫键是减少了添加三羟甲基氨基甲烷(2-carboxyethyl)磷化氢,液自由硫醇组与碘乙酰胺烷基化和蛋白质被消化endoproteinase Lys-C (Wako 1:10 0 3 h 37°C)和胰蛋白酶(Promega 1:50,一夜之间在37°C)。摘要被固相萃取净化(水域Sep-Pak tC18)和分馏的凝胶排阻色谱(SEC)使用Superdex肽PC 3.2/300列(通用电气医疗集团)56。

液体chromatography-tandem质谱(质/女士)

重复注射三秒的分数进行分析Easy-nLC 1200系统耦合到一个Orbitrap融合lumo质谱仪(ThermoFisher科学)。色谱分离是通过使用一个好评PepMap RSLC C18柱(25厘米×75μm 2μm粒度)(ThermoFisher科学)和梯度的11 - 40%在60分钟,移动阶段=水/乙腈/甲酸,95:5:0.15,v / v / v和B =乙腈/水/甲酸,80:20:0.15,v / v / v。流量被设定300 nL分钟−1。质谱仪是在最高速度模式3 s的周期时间,组成的一个女士Orbitrap分析仪120000分辨率扫描,其次是MS / MS扫描线性离子阱中快速扫描模式。碎片进行了使用线性离子阱中碰撞诱导解离的隔离宽1.2米/z和规范化的碰撞能量的35%。只有前兆之间的电荷状态3 + 7 +被选为碎片,和单一同位素峰选择设置为“肽”模式。动态排斥(±10 ppm, 30年代,1重复计数)被启用。

交联与xQuest肽的识别

xQuest56,57被用来确定交联肽从MS / MS数据,使用一个数据库,其中包含三个目标蛋白质的序列加7污染物蛋白质识别从普通蛋白质识别搜索使用吉祥物(MatrixScience):人类角蛋白和三四个大肠杆菌蛋白质。的主要搜索设置xQuest酶=胰蛋白酶,最大错过分裂数= 2,质量公差= 15 ppm数据,女士和0.2/0.3 MS / MS数据哒。进一步过滤搜索结果根据以下设置:质量错误=−6 + 1 ppm, %抽搐sub-score≥0.1 DSS和抗利尿激素数据,为ZL数据和≥0.15,δ得分≥0.9。此外,以下xQuest得分的否决是应用:≥18 DSS和抗利尿激素数据和≥23 ZL数据。候选人交叉连接满足这些标准只手动评估和识别至少有四个键整体分裂或连续三键分裂/肽保留最后的单子。没有进一步的尝试网站本地化。列出了所有交联肽在补充数据1。

报告总结

进一步研究信息设计是可用的自然研究报告摘要与这篇文章有关。

数据可用性

亚硫酸氢全基因组测序和芯片测序数据,支持本研究的结果可在基因表达综合(GEO)加入GSE130319数量和GSE130290,分别。原子模型和cryoEM密度地图在这项研究可从PDB和EMDB加入6号ois(博士),6 oit (DDR′)和EMDB - 20080(博士),分别EMDB - 20081 (DDR′)。的蛋白质组学数据IP-MS实验(图。1)可从巨大的数据存储库(https://massive.ucsd.eduMSV000084088)数据集标识符。 cross-linking-MS数据支持本研究的发现可以从ProteomeXchange财团通过骄傲合作伙伴库(proteomecentral.proteomexchange.org)58PXD013470与数据集标识符。所有其他相关数据支持这项研究的重要发现都包含在这篇文章,其补充文件或信息从相应的作者在合理的请求。报告摘要本文可以作为补充信息文件。