摘要
神经母细胞瘤(NB)是最常见的颅外的小儿实体肿瘤中可见。 它显示一个极端的临床异质性,特别是在诊断和对治疗的反应,往往取决于癌细胞分化/具备干细胞。 频繁出现的血和尿儿茶酚胺水平升高的患者受到NB的解剖表明,肾上腺素能系统是更好地了解这种癌症的关键。 β3-adrenoreceptor(β3-AR)是最后确认的肾上腺素能受体,参与不同的肿瘤条件,如黑色素瘤。 多个研究表明,生物活性脂质鞘氨醇的失调1-phosphate (S1P)代谢和信号参与许多病理疾病包括癌症。 然而,NB S1P是否重要进展和攻击性仍在调查之中。 这里我们提供实验证据,β3-AR表达在NB,既有人类标本和细胞系,在极度的激活参与核扩散和具备干细胞/分化之间的监管,通过其功能相声鞘氨醇激酶2 (SK2) / S1P受体2 (S1P2)轴。 具体由SR59230Aβ3-AR拮抗作用抑制NB生长和肿瘤进展,把具备干细胞细胞分化在体内和体外都通过特定SK2 / S1P的封锁2信号。
介绍
神经母细胞瘤(NB)是最常见的颅外的实体瘤发生在童年。 NB起源于神经嵴的sympathoadrenal世系祖在开发过程中。 这是一个异构的恶性肿瘤预后从好的结果在高风险、低风险的疾病贫穷的生存取决于肿瘤生物学和临床表现诊断。 分子、遗传和生物特性定义不同的临床行为,不同于完全自发分化和回归转移性传播(1,2]。 这些特性的结合目前用于分层患者分为三组,低收入,中间和高风险,根据国际儿科肿瘤学会欧洲神经母细胞瘤组(SIOPEN)和儿童肿瘤组(齿轮)3.]。 越来越多的影响预后显著的遗传特性,除了知名MYCN放大,最近研究,有时包括发达的临床试验,特别是复发/难治性疾病(4]。 可用的治疗方法治疗NB的有很多,但不幸的是并不总是足够有效,特别是对高危NB。 治疗高危NB仍面临的挑战包括5年总生存期(OS)尚未达到50%相关高危复发(80%)的2年从诊断5]。 化疗、放疗、手术切除,骨髓疗法,基于管理和维护治疗口腔类维生素a,是单独使用或根据特定的本地化和分期的肿瘤。
该项受体(β-ARs) G protein-coupled受体,负责协调血管舒张,心脏功能,生热作用和其他许多在卫生组织反应。 然而,现在承认β-ARs维持不同癌症的发病机理,从良性肿瘤如小儿血管瘤6,7)几种恶性肿瘤类型包括血管肉瘤(8],乳腺癌[9],卵巢癌[10),和黑素瘤11,12]。
直到几年前,β2-AR亚型被确认为最参与肿瘤的途径(13]。 然而,β3-AR亚型的异常表达所示最近几个癌症,如白血病、血管肿瘤、结肠癌癌(14,15,16),和许多其他人类癌症(17]。 此外,最近的研究表明,使用选择性β3-AR拮抗剂在黑色素瘤是有效地降低肿瘤的生长通过直接anti-tumoral效应(18),通过影响肿瘤微环境反应性(19]。 这些结果表明,β3-AR比此前认为的更广泛的肿瘤,这表明它可能在癌症生物学中发挥重要作用。
有趣的是,在体内和体外NB模型,孔隙类型β1-ARβ2-AR拮抗剂可以影响肿瘤生长单独或结合化疗药物(20.,21]。 然而,是否β3-AR亚型表达在NB和是否可以扮演一个角色在NB肿瘤生物学到目前为止还没有被调查。
鞘氨醇1-phosphate (S1P)是一个功能强大的生物活性脂质,影响多种细胞功能如增殖、存活和分化。 许多生长因子、激素和细胞因子利用鞘氨醇激酶1 (SK1)和/或SK2 S1P的酶催化ATP-dependent生产,对他们施加的生物效应,在很大程度上依赖于五个特定的绑定到一个或多个G protein-coupled受体(S1P命名1 - 5)[22]。 有越来越多的文献数据显示S1P所发挥的重要作用及其在癌症新陈代谢(23]。 SK1的作用在癌症已经研究的很透彻,SK2的贡献只在最近几年出现了。 事实上,除了其他的体外研究,体内数据报道,针对SK2显著减少肿瘤生长在一系列人类异种移植模型小鼠(24,25,26]。 SK2 NB细胞和组织中表达升高; 此外,它已被证明,S1P S1P的具体约定2诱导VEGF表达,血管生成的主要中介,与NB有关肿瘤恶化[27]。
我们的研究结果清楚地表明,β3-AR NB肿瘤中表达,其调制强烈影响肿瘤的生长。 此外,我们提供SK2 / S1P的实验证据2轴是负责在NBβ3-AR-dependent效果并提供分子基础考虑β3-AR / SK2 / S1P2作为一个有前途的治疗目标注治疗。
结果
β3-AR NB肿瘤细胞中表达
尽管最近的研究表明,β3-AR广泛表达在一些癌症组织(17),这种受体的存在在NB尚未研究。 评估β3-AR的表达,无论是调制的缺氧环境,我们培养的三个不同的NB细胞系,一个小鼠(Neuro-2A)和两个人类(SK-N-BE (2), (2) C),在normoxia(21%啊2)和缺氧(1% O2为24小时)条件。 免疫印迹(WB)分析表明,β3-AR蛋白表达在所有调查NB细胞系,这只有在Neuro-2A细胞,β3-AR表达显著增加了缺氧(图。1)。 发现β3-AR表示还在许多细胞来源于人类NB的病人,通过免疫荧光分析如图所示的肿瘤部分(无花果。1 b)。 免疫荧光染色过程验证的积极控制人类支气管上皮细胞,表达β3-AR[之前报道28),和消极的控制人类表皮(补充图。1)。 几个β1的能力——β2-blockers NB细胞产生抗肿瘤活性已经证明(20.,21),然而,可能扮演的角色的β3-AR维护NB生存是完全未知的。 评估β3-AR选择性拮抗剂SR59230A对细胞存活率的影响,采用MTT试验使用不同浓度的SR59230A 24 h 3 NB细胞系。 结果表明,β3-AR拮抗剂能够减少剂量依赖性的方式(图的细胞生存能力。1 c),在浓度显著影响限制在1µM Neuro-2A细胞和5µM SK-N-BE(2)和(2)C)。 这些结果表明,NB癌细胞表达的β3-AR是既定的,它可能在维持细胞生存起到至关重要的作用。 为了估计SR59230A不相干的毒性,我们执行细胞生存MTT试验用β3-AR拮抗剂存在剂量依赖的相关性在人类HMEC-1微血管内皮细胞和成纤维细胞,imr - 90。 在上述肿瘤细胞类型SR59230A不是有毒剂量低于5μM,如补充图所示。2浓度,而从5μM剂量依赖性的细胞存活率降低,即使在较小程度上相比肿瘤细胞系(图中观察到。1 c).
β3-AR是既定的小鼠和人类神经母细胞瘤细胞的表达,参与细胞的生存。一个世行和相对光密度定量分析,显示表达β3-AR蛋白在小鼠(Neuro-2A)和人类((2)C, SK-N-BE (2) NB细胞系在常氧(H) (N)和缺氧条件。结果归一化的表达β-actin和报告为±SD,褶皱变化控制(常氧条件),设置为1。 墨迹是代表三个独立的实验。 意义被未配对计算t以及分析SD (*P< 0.05)。b免疫荧光染色的β3-AR肿瘤部分两个国家统计局(NB1 NB2)源自人类患者,显示许多β3-AR阳性细胞。 图片是类似的结果的代表n= 6。cMTT生存分析Neuro-2A, (2) C和SK-N-BE (2) NB细胞系,用不同浓度的SR59230A 24 h。 结果报告为三个独立实验的均值±SD表现一式三份。 意义是由单向方差分析计算分析其次是Bonferroni事后测试(ns =不显著,*P< 0.05,* *P< 0.01,* * * *P< 0.0001)
β3-AR封锁调节S1P代谢和信号在人类NB (2) C细胞
文献数据显示S1P信号强烈影响NB进展(27,29]。 值得注意的是,最近的一篇论文报道之间的相声β3-AR和心脏衰竭(S1P信号30.]。 针对这个实验数据,我们想知道这两个通路在NB潜在相关的肿瘤生物学。 为了解决我们的假设,我们进行了体外实验在人类细胞系(2)C。 这个细胞株,定义为i类型NB细胞,是最人类NB细胞致瘤的恶性神经嵴干细胞特性,如高自我更新和multi-potency属性(31,32]。 实际time-PCR (2) C细胞亚致死剂量处理SR59230A(1μM) 24 h,表明,在酶(SK1, SK2) (S1P受体1,S1P2,S1P3.)和S1P运输车老处女同族体2 (Spns2)中表达这些细胞,只有S1P2受体转录是引起β3-AR时表达下调(无花果。2)。 然而,世行分析表明,S1P的蛋白质含量2和SK2强烈减少(2)C细胞治疗SR59230A 24 h,而SK1表达式(图未受到影响。2 b)。 以证实选择性拮抗剂的药物使用SR59230Aβ3-AR在我们的模型中,我们利用一个RNA干扰抑制方法β2——β3-ARs使用特定siRNAs受体。 如无花果所示。2摄氏度,具体的沉默β3-AR S1P下降2和SK2,确认结果采用β3-AR拮抗剂。 减少S1P2SK2蛋白质含量并没有观察到当β2-AR表达下调,表明S1P的调制2和SK2施加SR59230A选择性β3-AR-antagonism。 此外,选择性β3-AR兴奋剂BRL37344显著增加SK2和S1P的表达2(补充图。3.)。 综上所述,这些结果表明β3-AR之间可能的相互作用的存在,在NB细胞S1P代谢和信号。
β3-AR封锁调节S1P信号在人类神经母细胞瘤(2)C细胞。一个人类NB的rt - pcr (2) C细胞系处理1μM SR59230A 24 h。 (S1P受体信使rna表达水平的变化1,S1P2,S1P3.SK2),代谢酶(SK1, SPL)和S1P运输车(Spns2)执行的三个独立的实验报告为平均数±标准差一式三份,使用2 ^(-ΔΔCt)方法部分中描述的方法。 数据规范化β-actin RNA表达和价值观对待样本报告为褶皱变化控制,设置为1。 意义被未配对计算t以及分析SD (* *P< 0.01)。b世行和相对光密度定量分析,显示出SK1的蛋白表达水平,SK2, S1P2在NB (2) C细胞株后24 h(1)μM SR59230A治疗。 结果规范化β-actin的表达和报道意味着±SD,褶皱变化控制,设置为1。 墨迹是代表三个独立的实验。 意义被未配对计算t以及分析SD (*P< 0.05,* * *P< 0.001)。c世行和相对光密度定量分析,显示出β2-AR的蛋白表达水平,β3-AR, SK2 S1P2在NB (2) C细胞系的分子沉默β2β3-AR。 结果规范化β-actin的表达和报道意味着±SD,褶皱变化控制,设置为1。 墨迹是代表三个独立的实验。 意义是由单向方差分析计算分析其次是Bonferroni事后测试(ns =不显著,*P< 0.05,* *P< 0.01,* * * *P< 0.0001)
β3-AR封锁增加细胞增殖,减少神经元分化的人类NB (2) C细胞S1P的参与2受体
等,目前治疗癌症治疗NB利用区分代理,如类维生素a (33,34]。 在黑素瘤细胞,β3-AR具备干细胞与维护有关潜在的(19但负责这种效应的分子机制仍然不明。 在这里,我们调查是否β3-AR调制可能影响具备干细胞/ NB恶性肿瘤中分化状态。 因为分化过程通常伴随着大量减少的细胞,首先我们评估是否β3-AR调制可能影响的扩散(2)C NB细胞。 (3.H]胸腺嘧啶核苷掺入扩散试验表明,β3-AR药理学封锁的增殖率下降(2)C NB细胞,相反,β3-AR通过使用选择性的激活受体激动剂BRL37344,引起增加扩散(无花果。3.)。 此外,1的anti-mitogenic行动µM SR59230A S1P面前被废除2受体激动剂,CYM5520; 相反,我们发现BRL37344施加的促有丝分裂的行动又在ABC294640 SK2抑制剂的存在。 同意S1P的参与2,与S1P孵化2拮抗剂,JTE013,显著降低BRL37344-dependent促有丝分裂的影响。 相反,细胞增殖并不是影响选择性β1-AR -(氨酰心安)和β1 /β2-AR(心得安)拮抗剂(无花果。3.),排除可能参与β1 /β2-AR SR59230A-dependent anti-proliferative行动。
β3-AR调节人类神经母细胞瘤的增殖率(2)C细胞通过SK2 / S1P的参与2信号。3.H-thymidine扩散试验(1μCi /) (2) C细胞线处理1μM SR59230A存在与否的10μM CYM5520, 1μM BRL37344存在与否的1μM ABC294640和1μM JTE013, 1μM阿替洛尔和1μM普萘洛尔24 h。 结果报告为平均数±标准差的三个独立的实验。 意义是由单向方差分析计算分析其次是Bonferroni事后测试(* *P< 0.01 SR和CTRL, * * * *P< 0.0001 BRL和CTRL;# # # #P< 0.0001 SR + CYM与老;§P< 0.05 BRL + JTE与强;§§§§P< 0.0001 BRL + ABC和BRL)
(2)C细胞治疗72 h 1μM SR59230A能够诱导神经突(图产物。4)。 此外,神经分化标记蛋白质Map2 24 h后调节蛋白水平SR59230A治疗(图。4 b)。 确认SR59230A药物诱导的神经元分化标记Map2 NB (2) C细胞是由于选择性β3-AR-blockade,我们执行β3-AR mRNA表达的沉默。 免疫印迹分析表明,β3-AR下调NB表型转向神经元分化通过增加神经元标记Map2,确凿的药理方法(图。4摄氏度)。 调查S1P的参与2β3-AR-blockade受体的神经元分化诱导,我们使用了S1P2受体激动剂CYM5520。 有趣的是,分化标记的upregulation Map2β3-AR-blockade完全废除了治疗后观察S1P2受体激动剂CYM5520(无花果。4 d).
β3-AR封锁增加神经元分化的人类神经母细胞瘤(2)C细胞通过SK2 / S1P的参与2信号。一个图像显示神经突(黑色箭头)和产物相对量化SR59230A 72 h后治疗和控制条件(2)C细胞。 量化神经突的产物,从六个随机选择的领域获得的图像在每个条件好一式三份,和neurite-bearing细胞数。 结果报告为平均数±标准差的三个独立的实验。 意义被未配对计算t以及分析与平等的SD (* * * *P< 0.0001)。b世行和相对光密度定量分析,显示Map2分化标记的蛋白质含量(2)C细胞系处理1μM SR59230A 48 h。 结果规范化β-actin的表达和报道意味着±SD,褶皱变化控制,设置为1。 污点是代表三个独立的实验。 意义被未配对计算t以及分析SD (* *P< 0.01)。c世行和相对光密度定量分析,表明蛋白质含量(2)C的Map2细胞系转染炒(Scr)和β3-AR-siRNA 48 h。 结果规范化β-actin的表达和报道意味着±SD,褶皱变化控制,设置为1。 污点是代表三个独立的实验。 意义被未配对计算t以及分析SD (* *P< 0.01)。dWB和相对光密度定量分析,显示Map2分化标记的蛋白质含量(2)C细胞系处理1μM SR59230A 48 h,在存在10μM CYM5520。 结果规范化β-actin的表达和报道意味着±SD,褶皱变化控制,设置为1。 污点是代表三个独立的实验。 意义是由双向方差分析计算分析Bonferroni事后测试(*紧随其后P< 0.05;#P< 0.05 CYM + SR和SR)。e上面板:(2)C细胞的免疫荧光图像处理1μM SR59230A 48 h,在存在与否的10μM CYM5520和彩色anti-Map2抗体,Alexa-fluor488二级抗体和propidium碘(π)。 图片是代表三个独立实验相似的结果。 25µm比例尺。 降低面板:量化的Map2-associated荧光强度归一化到π,上面的褶皱变化控制设置为1。 数据均值±SD六个领域的每个标本量化的三个独立的实验。 SR59230A显著地增加Map2单向方差分析(*P< 0.05); S1P的药理活性2由CYM5520废除SR59230A-induced显著地增加Map2双向方差分析Bonferroni紧随其后的事后测试#P< 0.05。f上面板:(2)C细胞的免疫荧光图像处理1μM SR59230A 72 h,在存在与否的10μM CYM5520和彩色anti-Neurofilament抗体,Alexa-fluor488二级抗体和π。 图片是代表三个独立实验相似的结果。 25µm比例尺。 降低面板:量化的Neurofilament-associated荧光强度归一化到π,上面的褶皱变化控制设置为1。 数据报告为平均数±标准差如上所述部分e。SR59230A显著地增加神经丝的单向方差分析(* * *P< 0.001); S1P的药理活性2CYM5520废除SR59230A-induced增加显著的神经丝的双向方差分析其次是Bonferroni事后测试(###P< 0.001)
Map2免疫荧光染色的(2)C细胞接受SR59230A, S1P的存在与否2证明S1P受体激动剂CYM55202参与β3-AR下游效应,因为S1P吗2订婚的受体激动剂恢复Map2表达式由β3-AR封锁(无花果。4 e)。 此外,后期的表达神经元分化标记神经丝与以前的研究结果是一致的,被SR59230A调节β3-AR阻塞时,而这是完全废除CYM5520(图的存在。4 f).
我们的数据表明,NB癌症,β3-AR封锁导致开关从一个神经元分化增殖状态,这种效果是S1P时完全废除2选择性受体激动剂受体触发。 这些结果证明存在功能性相声β3-AR和S1P信号之间调节NB细胞的增殖和分化的平衡。
β3-AR封锁减少具备干细胞在人类NB (2) C细胞通过调节SK2 / S1P2信号轴
自我更新的多功能的存在肿瘤细胞的恶性祖细胞被认为是一个水库负责NB增长和缺乏对化疗的敏感性(35,36]。 上述数据β3-AR NB细胞分化的作用,促使我们调查是否β3-AR调制可以改变人类干细胞特性(2)C细胞。 Neurosphere形成进行分析和数据表明,β3-AR和S1P信号调制强烈影响的能力NB细胞使neurospheres(无花果。5)。 特别是,当β3-AR被SR59230A neurospheres的数量(2)C细胞明显减少,和与该参数,neurospheres显示一个较小的直径,而控制条件。 此外,S1P的管理2受体激动剂CYM5520中和这两种β3-AR-antagonist所带来的影响。 另一方面,β3-AR兴奋剂BRL37344具备干细胞诱导显著增加的潜力,量化通过测量neurospheres的数量和规模,这效果是完全废除当SK2酶被选择性抑制剂ABC294640(无花果。5 a - c)。 尽管干细胞标志物CD133的表达neurospheres通过流式细胞仪分析显示无显著差异β3-AR以及S1P信号调制时,干细胞标记物的表达CD34的表达下调SR59230A,有趣的是,这种效应被CYM5520恢复。 此外,BRL37344 neurospheres CD34的表达增加,但当SK2活动是药物被ABC294640,干细胞标记的表达类似于控制条件(无花果。5 d),导致结论SK2具备干细胞参与的增强作用的下游β3-AR NB。
β3-AR封锁减少具备干细胞在人类神经母细胞瘤(2)C细胞通过调节SK2 / S1P2信号轴。 Neurospheres形成分析人类神经母细胞瘤细胞系(2)C。 细胞被镀在MW24 (1×104细胞/)Neurosphere基础培养基(见“方法”部分),24小时后用1μM SR59230A或1μM BRL37344,存在与否的10μM CYM5520或1μM ABC294640。 一旦形成,球被破坏,细胞re-plated第二通道(P2)。一个图片7天后neurosphere形成(P2)。 具备干细胞治疗的效果上的特点(2)C neurospheres,被使用不同的分析评估。bneurospheres形成每口井的数量计算相比,使用光学显微镜和控制条件。 结果报告为平均数±标准差和代表三个独立的实验。 意义被未配对计算t以及分析SD (* *P< 0.01,* * *P< 0.001)和双向方差分析分析其次是Bonferroni事后测试(§§§P< 0.001 ABC + BRL比BRL)。c平均直径的球体被使用ImageJ软件量化。 结果报告为平均数±标准差和代表三个独立的实验。 意义被未配对计算t以及分析SD (* *P< 0.01,* * *P< 0.001)和双向方差分析分析其次是Bonferroni事后测试(#P< 0.05 CYM +老与老;§§§P< 0.001 ABC + BRL比BRL)。d流式细胞术分析neurospheres使用MACSQuant分析仪是由10 (Miltenyi生物技术)。 球体的中断后,细胞被沾anti-CD34-PE-Vio770, anti-CD133-APC抗体和Viobility可固定的染料。 结果报告为±SD CD34阳性细胞,是代表三个独立的实验。 意义被未配对计算t以及分析SD (* *P< 0.01,* * *P< 0.001)和双向方差分析分析其次是Bonferroni事后测试(###P< 0.001 CYM +老与老;§§P< 0.01 ABC + BRL与BRL)
综合这些结果强调相声β3-AR之间的角色和SK2 / S1P2具备干细胞信号轴,在控制之间的平衡人类NB (2) C /分化细胞。
β3-AR封锁,SR59230A减少NB / J小鼠肿瘤的生长,通过参与SK2 S1P2
在不同NB细胞,减少一些大众化的β-AR拮抗剂显示肿瘤的增殖和生存能力在体外和体内肿瘤的生长20.,21]。 然而,在NBβ3-AR肿瘤生长所扮演的角色从来没有调查。 由体外结果,我们调查是否β3-AR拮抗剂SR59230A可能影响肿瘤生长在NB癌症的小鼠同源的模型。 为此,我们注入皮下Neuro-2A细胞/ J小鼠肿瘤质量是显而易见的,在6天,老鼠每天治疗8天,直到牺牲。 如无花果所示。6 a、b老鼠接受SR59230A 8天,有一个强大的减少NB比vehicle-treated小鼠肿瘤的生长。 符合之前的体外获得的数据,观察肿瘤生长障碍SR59230A-treated老鼠被使用S1P部分恢复2受体激动剂CYM5520。 有趣的是,观察肿瘤生长的部分减少CYM5520 alone-treated老鼠可以解释为S1P的抗血管生成作用2受体如补充图所示。4。 有趣的是,在老鼠ABC294640 SK2抑制剂治疗,肿瘤生长抑制类似于观察SR-treated老鼠。 此外,没有进一步减少小鼠的肿瘤大小与β3-AR co-treated拮抗剂一起SK2抑制剂,而独自β3-AR拮抗剂。 最后,肿瘤重量8天的治疗后,表现出强烈的减少,当老鼠在对待β3-AR-antagonist SR59230A。 再次,对于肿瘤的生长速度,这种效应S1P明显恢复2受体激动剂CYM5520,另一方面,没有显著性差异,当老鼠在对待SR59230A和ABC294640相比单独SR59230A(无花果。6摄氏度)。 肾上腺素和去甲肾上腺素的量化的等离子体/ J小鼠接受SR59230A ABC294640,在补充图。5 a、b在我们的模型中,清楚地表明SK2抑制和β3-AR对抗能降低血浆的去甲肾上腺素的浓度,而ABC294640显著降低肾上腺素量。 此外,正如图所示。6 dSR59230A和肿瘤ABC294640强烈S1P水平下降。
β3-AR封锁降低了/ J小鼠肿瘤生长在通过SK2 / S1P的参与2信号轴。 Neuro-2A细胞被注入皮下注射(1×106细胞)的侧面/ J雌性老鼠。 当一个明显的肿瘤质量成立(6天),老鼠接受车辆(i.p)、SR59230A 10毫克/公斤(i.p)单独或结合CYM5520 5毫克/公斤(i.p)和ABC294640 30毫克/公斤(订单)。一个8天的治疗后,小鼠牺牲质量和肿瘤切除; 肿瘤的图像分别代表所有肿瘤的最终大小为每个治疗(n= 6组)。b肿瘤生长速度通过测量肿瘤大小的质量计算的体积=[(长度×widht)2在车辆(/ 2)n= 6)SR59230A (n= 6)CYM5520 (n= 6)和SR59230A + CYM5520 (n= 6)(上)和车辆(n= 6)SR59230A (n= 6)ABC294640 (n= 6)和SR59230A + ABC294640 (n= 6)(底部)。 车辆和SR肿瘤大小结果报告(上)和(下)图是指相同的肿瘤。 意义是由双向方差分析计算分析Bonferroni事后测试(*紧随其后P< 0.05,* *P< 0.01,* * * *P< 0.0001;##P< 0.01 SR + CYM与老,# # # #P< 0.0001 SR + CYM与老;§§§P< 0.001,§§§§P车辆与ABC p < 0.0001)。c肿瘤重量在实验的终点(14天)(n每组)= 6。 结果报告为单个点与平均(中线)±标准差。 意义是由双向方差分析计算分析后跟Bonferroni事后考验(* * * *P< 0.0001;##P< 0.01 SR + CYMvs。 老;§§§§PABC和车辆p < 0.0001)。dS1P测量肿瘤的车辆(n= 3),SR59230A - (n= 3)和ABC294640-treated老鼠(n= 3)。 结果报告为平均数±标准差。 意义是由单向方差分析计算分析其次是Bonferroni事后测试(* *P< 0.01,* * *P< 0.001)
体内结果明确支持持续的β3-AR NB的参与肿瘤的进展。 此外,所发挥的具体作用β3-AR NB依赖,至少部分,通过SK2和S1P S1P信号通路2调制。
NB肿瘤生长减少施加SR59230A通过调制SK2 / S1P2信号轴,NB细胞的神经元分化的增加有关
与特定的目的来分析肿瘤的分化状态质量分离同源的老鼠接受β3 / SK2 / S1P2调节器,我们执行世行如果分析研究早期的表达,中间值和神经元标记。 如无花果所示。7一个,β3-AR-antagonist SR59230A和SK2-inhibitor ABC294640,都能减少神经元早期分化的蛋白表达水平标记NeuroD1在肿瘤切除从/ J小鼠同源的; 然而,在S1P的存在2受体激动剂CYM5520,这种效应被废除。 相反,表达水平的中间神经元分化标记Map2和后期分化标记神经丝,调节SR59230A -或ABC294640-treated老鼠。 引人注目的是,这些分化标记的表达小鼠接种与SR59230A S1P的存在2受体激动剂CYM5520,与车辆情况(无花果。7 b, c).
神经母细胞瘤肿瘤生长减少SR59230A通过施加SK2 / S1P2信号轴是伴随着增加神经元NB细胞的分化。一个世行和相对光密度定量分析,显示了蛋白质表达水平NeuroD1早期分化的标志。 从肿瘤溶解产物得到质量(14天)的车辆,SR59230A、CYM5520和SR59230A + CYM5520-treated老鼠(n为每个组)= 3(上)和车辆,SR59230A、ABC294640和SR59230A + ABC294640-treated老鼠(n为每个组)(底部)= 3。 意义是由双向方差分析计算分析Bonferroni事后测试(*紧随其后P< 0.05,* *P< 0.01;#P< 0.05 SR + CYMvs。 SR)。b上面板:免疫荧光的石蜡包埋神经元分化的肿瘤部分显示表达Map2标志。 车辆图像代表类似的结果(n= 5),SR59230A - (n= 5),CYM5520 - (n= 5),SR59230A + CYM5520 - (n= 5),ABC294640 - (n= 5)和SR59230A + ABC294640-treated老鼠(n= 5)。 较低的面板:Map2-associated荧光强度的量化。 数据均值±SD的八个领域的每个标本量化三个独立的实验。 意义是由单向方差分析计算分析后跟Bonferroni事后考验(* * * *P< 0.0001 SR和车辆,* * *P< 0.0001 ABC和车辆,* * * *P< 0.0001 SR + ABC和车辆;# # # #P< 0.0001 SR + CYM与SR。c上面板:免疫荧光的石蜡包埋肿瘤部分显示神经元分化标记神经丝的表情。 车辆图像代表类似的结果(n= 5),SR59230A - (n= 5),CYM5520 - (n= 5),SR59230A + CYM5520 - (n= 5),ABC294640 - (n= 5)和SR59230A + ABC294640-treated老鼠(n= 5)。 较低的面板:Neurofilament-associated荧光强度的量化。 数据均值±SD的八个领域的每个标本量化三个独立的实验。 意义是由单向方差分析计算分析后跟Bonferroni事后考验(* * * *P< 0.0001 SR和车辆,* * *P< 0.0001 ABC和车辆,* * * *P< 0.0001 SR + ABC和车辆;# # # #P< 0.0001 SR + CYM与SR
体内获得的数据证实了我们的初步结果,并强调所发挥的关键作用的β3-AR控制肿瘤的生长和肿瘤分化等级的NB。 此外,我们确认生物效应观察β3-AR-blockade条件依赖S1P信号通路的调节。
讨论
非选择性的影响β-blocker普萘洛尔结合抗癌药物已经报道在不同的肿瘤疾病,包括NB (21),而具体的参与β3-AR没有调查。 最近,β3-AR表达式在几个癌症组织进行了分析。 在不同的肿瘤标本,检测到了更高水平的β3-AR观察黑色素瘤和中等水平的表达在甲状腺乳头状癌等癌症组织和t细胞淋巴瘤(17]。 文献数据已经表明,β3-AR表达增加在缺氧条件下,封锁以来参与黑色素瘤生长,减少体内肿瘤生长(18]。 此外,β3-AR激活黑素瘤持续增长和攻击性驾驶基质微环境对angiogenetic和促炎细胞因子的分泌19),因此涉及β3-AR黑色素瘤的适应性反应。 然而,表达和可能的失调β3-AR尚未调查在NB。 我们首次展示β3-AR NB细胞中持续表达,而据报道,β3-AR缺氧下诱导黑色素瘤细胞(18]。 在这项研究中,三个不同的NB细胞系曾,小鼠Neuro-2A体内同源的模型和人类SK-N-BE(2)和(2)C在体外实验中,第一次显示β3-AR由表示在所有上述观察NB细胞。 值得注意,更高水平的儿茶酚胺代谢产物,NB肿瘤条件反映儿茶酚胺生产肿瘤微环境。 我们可以推测,儿茶酚胺可能目标癌症细胞通过β3-AR的激活,导致一个前馈回路NB癌症的生长和恶性肿瘤。 事实上,从NB小鼠血浆中儿茶酚胺水平的降低β3-AR封锁或SK2抑制后增强了我们的机械模型S1P /β3-AR相声在NB(补充图。5).
我们集中我们的注意力效应引起的次致死量β3-AR拮抗剂SR59230A(1µM)以来中等毒性浓度超过5µM可能部分归因于它的脱靶效应,正如我们在肿瘤细胞系如人类成纤维细胞和内皮细胞(补充图。2)。 1的影响µM SR59230A治疗作为药理工具阻止β3-AR拟表型获得通过RNA干扰方法,从而确认在我们的模型的特异性和选择性SR59230A为后续实验。
强大的细胞分化和肿瘤发生之间的关系在NB来自岛田histology-grading系统中,分化的年级有一个重要的预后意义,作为未分化肿瘤最恶性的(37]。 除了减少肿瘤细胞的生存能力,药理工具,击中了干细胞的潜力,促使细胞分化,从而抵消药物抗性的发生,可能代表一个有前途的治疗方法NB。 事实上,高危病例NB面临由于therapy-resistant复发的预后不良,依赖于肿瘤干细胞的存在,表现为低分化表型。 出于这个原因,目前治疗高危NB的区分代理视黄酸在完成细胞毒性治疗。 虽然这改善生存,在转移性NB患者空闲的存活率仍然很低(38]。 因此,我们集中我们的注意力在神经元分化和用亚致死剂量的SR59230A进行后续实验,解剖一个至关重要的角色β3-AR具备干细胞之间的平衡和NB细胞的分化。 有趣的是,神经分化的分析(2)C细胞形态学和分子方法证明β3-AR封锁能够提高神经突形成和神经元标记表达式。 早期的蛋白表达降低神经元分化标记NeuroD1 SR59230A-treated NB肿瘤切除的小鼠,加强我们的体外结果在NB生物学β3-AR的作用,高水平的这个标记参与促进NB进展。 有趣的是,NeuroD1一直也参与间变性淋巴瘤激酶(alaska airlines)的感应,已知的一个最重要的易感性基因NB (39肿瘤发生,因此,暗示NeuroD1下调SR59230A-treated肿瘤可能抵消alaska airlines维持NB肿瘤发生。
尽管CD133抗原被公认为最重要的一个在NB stemness-related标记(40,41),我们观察到neurospheres (2) C细胞表现出轻微的CD133抗原的表达,并没有显著改变这个标记β3-AR调制后的表情。 相反,CD34抗原的表达显著受到的约束力β3-AR和S1P信号的调制。 这些结果与文献数据协议,事实上,尽管CD34抗原是首先确定为造血标记,几项研究表明,它代表了一个特定的癌症干细胞的标志在NB。 此外,NB细胞和球体来源于骨髓转移的高危肿瘤,以及我们的球体从C(2)细胞株,不CD133的表达显著水平,而不是包含CD34丰富族群,确认为最致瘤的细胞和负责NB患者的复发42,43,44,45]。 我们的结果因此加强所发挥的关键作用β3-AR具备干细胞特性的控制肿瘤发生的亚种群的NB细胞癌症。 因此,可以认为,儿茶酚胺,除了发布促进NB增长,调节之间的平衡通过β3-AR NB细胞具备干细胞分化和激活。
证据β3-AR / S1P相声最近报道,这个分子相互作用似乎参与physiopathological效应在不同的细胞环境中(30.,46]。 功能之间的相互作用的发生β3-AR和SK / S1P轴已经证明药理和RNA干扰的方法,而这些结果进一步证实了就业的一个特定的β3-AR受体激动剂。 在我们的NB细胞模型中,β3-AR拮抗剂强有力地下调SK2 S1P2而它不影响SK1表达式。 相反,在治疗BRL37344反向影响SK2和S1P的表达2。 我们可以推测,一个明显的基底β3-AR的本构活动发生在NB细胞,即使绑定β3-AR受体激动剂进一步强化受体激活。
值得注意的,我们的研究结果与已发表的研究报告说,在协议SK2 NB中高度表达,被要求通过S1P生物活性脂质S1P的生产2发挥生物功能在NB (27]。 此外,鞘氨醇类似物和前药FTY720减少SK2活化和细胞增殖的NB体外和体内肿瘤的生长表现出协同效应与topotecan [29]。
这些结果强化了这一观念:SK / S1PR轴是一个信号通路,可以利用不同的外源线索来促进肿瘤的生长和侵略性。 特别是具体β3-AR相声是基本神经元分化的诱导NB的创新和有效的策略,可以治疗高危NB的病人。 观察小鼠CYM5520略有减少NB的增长可以归因于S1P的负面作用2在肿瘤血管生成(补充图。4),可能会影响体内肿瘤的生长,与文献数据协议(47]。 值得提及的是,S1P2广泛分布于组织和产生系统性影响难以分析。 不管怎样,这些影响只是显然与我们的机械模型相比,由于在CYM5520 SR59230A完全恢复的效果在体外和体内。 我们假设transactivation S1P2通过著名的S1Pβ3-AR发生由内向外信号,要求释放SK2激活和S1P的参与。 事实上,β3-AR封锁和SK2抑制显著减少肿瘤S1P水平质量。 虽然我们不能排除部分补偿效应SK1 SK2抑制后的系统性S1P,这是否出现不回复S1P下降ABC294640治疗肿瘤。
总之,我们的研究结果强调所发挥的关键作用调节肿瘤发生的β3-AR NB。 密集的研究旨在解决β3-AR的分子机制和SK / S1P轴将轻松识别创新目标治疗高危NB。 这些发现可能对治疗产生相关影响的目的,因为可用的治疗方法仍不够有效的转移性疾病。 此外,基于生物治疗,专门针对通路NB负责恶性转化和发展可能更有效和更少的比标准化疗药物毒性。
材料和方法
细胞培养
SK-N-BE (2), (2) C人类NB癌细胞,并从写明ATCC Neuro-2A小鼠NB癌细胞获得。 SK-N-BE(2)和(2)C细胞在DMEM: F12补充10%的的边后卫,Neuro-2A细胞在DMEM补充10%的的边后卫。 细胞系培养在37°C water-satured, 5%的公司2气氛,21% O2O normoxia, 1%2缺氧。
免疫印迹分析
收集细胞和细胞溶解里帕缓冲含有蛋白酶抑制剂的鸡尾酒。 量化后,20μg总蛋白质被用来进行sds - page和白平衡分析。 一夜之间,PVDF膜被孵化主要抗体(anti-Map2、细胞信号、# 4542; anti-SK1 anti-SK2, ECM生物科学,# SP1621和# SP4621,分别; anti-S1P2Proteintech, 21180 - 1 - ap; anti-NeuroD1、Abcam ab60704; anti-β2-AR sc - 9042, anti-β3-AR sc - 13108和anti-β-actin sc - 1615,圣克鲁斯生物技术)在4°C,然后与特定的二级抗体1 h在室温下。 绑定特定蛋白的抗体被发现通过使用清晰西方ECL衬底(Biorad)。
MTT试验
肿瘤细胞的生存能力评估使用MTT试验。 NB细胞治疗24小时与不同浓度的SR59230A然后保持在麻省理工1 h在37°C与同等体积的DMSO溶液溶解。 可溶性染料的吸光度是使用分光光度计在570纳米处。
实时聚合酶链反应
基因表达分析使用2 ^(-ΔΔCT)比较的量化方法48]。 短暂,总RNA(1µg),提取与TriReagent™(Sigma-Aldrich开发)是使用iScript反向转录™互补脱氧核糖核酸合成装备RT-qPCR (Bio-Rad实验室开发。)根据制造商的指示。 目标基因mRNA水平的量化进行了一式三份为每个标本采用TaqMan普遍掌握混合和自动化的ABI棱镜7500序列检测器系统(热费希尔科学公司)。 人类特定TaqMan基因表达分析用于基因表达研究从热费希尔科学有限公司购买目标序列的同步放大(SPHK1: Hs00184211_m1 SPHK2: Hs01016543_g1, SGPL1: Hs00393705_m1, SPNS2: Hs01390449_g1, S1PR1: Hs00173499_m1, S1PR2: Hs01003373_m1, S1PR3: Hs01019574_m1基因表达分析)一起看家基因,β-actin (ACTB: Hs99999903_m1基因表达分析)进行了本质上如前所述[49]。 结果分析了ABI棱镜序列检测系统软件,版本1.7(热费希尔科学公司)。
细胞转染
细胞成长为组织文化6-well盘子,当60%汇合的转染了核工器(SASI_Hs01_00015585和SASI_Hs01_00015586β3-AR; SASI_Hs01_00209061和SASI_Hs01_00209062β2-AR)使用Lipofectamine RNAiMAX(热费希尔科学公司),根据制造商的说明(如前所述)(50]。 简而言之,Lipofectamine RNAiMAX孵化了siRNA在没有血清和抗生素的DMEM 20分钟,然后脂质/核糖核酸复合物添加到细胞的最终浓度在含血清DMEM 20海里。 24小时后,细胞被转移到没有血清DMEM然后用于实验72 h内转染的开始。
扩散分析
细胞增殖是由测量(3.H]胸腺嘧啶核苷掺入。 (2)C细胞serum-starved 24 h,然后用不同的分子的挑战如图传说中描述。 (3.H]胸苷(0.5μCi /)增加了在过去4 H的孵化。 细胞被洗了在500年之前冰冷的PBSμl添加10%三氯乙酸(TCA) 5分钟在4°C。 柠檬酸被移开,250μl乙醇:醚(3:1 v / v)的解决方案是添加; 盘子被配置在化学罩直到完成解决方案的蒸发。 样本然后在0.25 N细胞溶解氢氧化钠为2 h 37°C。 公司的3.H]胸苷被闪烁计数测量。
免疫荧光的细胞和组织
人类和小鼠肿瘤的免疫荧光分析质量进行如下。 样本快速切除,在缓冲4%甲醛固定24小时,石蜡包埋。 5µm厚,组织学部分从样本,deparaffinised,煮10分钟的柠檬酸钠缓冲(10毫米,pH值6.0; Bio-Optica)抗原检索和应用一夜之间在4°C兔多克隆抗体anti-Neurofilament(1:10 0,反- 160 kd神经丝中,Abcam, ab64300)和兔多克隆抗体anti-MAP2 (1:50; anti-Map2、细胞信号、对小鼠肿瘤# 4542),兔多克隆抗体anti-β3受体(1:50,Abcam ab140713)人类NB。 免疫反应了孵化部分与驴anti-rabbit Alexa萤石594 -共轭免疫球蛋白(1:350; 杰克逊实验室)。 与4对比染色后,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI),代表图像获得了奥林巴斯BX63显微镜耦合CellSens维成像软件1.6版本(奥林巴斯)。
(2)C细胞的免疫荧光分析进行如下。 (2)C被播种在显微镜载玻片poly-lysine涂层(35000细胞/在Nunc Lab-Tek室幻灯片4)在60 - 70% serum-starved融合,然后用药物药理pre-incubated 30分钟之前挑战1μM SR59230A在37°C。 免疫荧光分析本质上是如前所述[50]。 短暂,在不同的时间间隔在传说暗示,细胞被固定在2%多聚甲醛在PBS 20分钟。 透化作用和淬火获得通过添加解决方案包含Triton x - 100 0.1%,乙醇胺(1:165)在室温下为30分钟。 细胞被封锁在1% BSA 1 h和孵化主要抗体(anti - 160 kd神经丝中,Abcam, ab64300; anti-Map2、细胞信号、# 4542)1 h,随后,在PBS反复洗涤后,幻灯片是孵化Alexa-fluor488二级抗体。 获得的图像使用徕卡SP8激光扫描共焦显微镜(徕卡Microsystems GmbH是一家位于德国)63 x的目标。
Neurosphere化验
neurosphere形成试验,24-well盘子被涂上一层1,2%的聚(甲基丙烯酸2-hydroxyethyl酯)在95%乙醇稀释。 然后,细胞被镀(5.000 /)Neurosphere基础培养基组成的DMEM: F12 B27补充2%,1% N2、20 ng / ml FGF和20 ng / ml EGF。 24小时后,细胞治疗1μM SR59230A和1μM BRL37344孤独,或结合1μM ABC294640和10μM CYM5520。 一旦形成,球被破坏,细胞re-plated第二通道(P2)。 7天之后,neurosphere数和直径大小测量使用ImageJ软件(美国国家卫生研究院)。 Neurosphere被中断和染色流式细胞术分析。
流式细胞术分析
评价抗原CD34的表达和CD133 neurospheres人类NB (2) C细胞(P2)机械分离,和单个细胞悬浮在染色缓冲区。 细胞比货代阻塞处理试剂,然后沾Viobility 488/520可固定的染料,anti-CD34 (PE-Vio770)和反- cd - 133 (APC)抗体(Miltenyi研究)。 染色后,细胞进行流式细胞仪使用Miltenyi研究MACSQuant分析仪10。 通过使用Flowlogic结果进行了分析TM软件
S1P量化
S1P浓度在肿瘤质量决定使用鞘氨醇1-phosphate分析工具包(雁行生物科学,k - 1900)根据制造商的指示。 450纳米的吸光度测定,样品S1P的浓度是由与标准曲线比较。
同基因的肿瘤模型
女性NCI / JCr老鼠4-weeks-old从查尔斯河实验室购买(弗雷德里克)。 Neuro-2A细胞皮下植入/ J受体小鼠注射1×106细胞在100年µl PBS的右翼。 当Neuro-2A细胞形成了一个明显的肿瘤(约6天),治疗开始。 治疗是SR59230A和车辆管理,一天两次,一天一次,ABC294640 CYM5520。 SR59230A (Tocris Bioscence)交货10毫克/公斤的生理溶液通过腹腔内(i.p。); ABC294640 (MedChem表达)是在30毫克/公斤0375%的吐温80 PBS通过口服(订单); CYM5520(西格玛奥德里奇)交货5毫克/公斤3.6% DMSO溶液通过i.p PBS。肿瘤的生长速度是评价质量与口径,通过测量肿瘤和肿瘤体积计算的体积质量=[(长×宽)2/ 2)。 老鼠牺牲后8天的治疗。
统计数据
光密度分析WB乐队是由ImageJ软件。 图形化表示通过GraphPad棱镜6.0 (GraphPad软件,圣地亚哥,CA),并使用未配对学生的统计分析t以及,单向和双向方差分析方差分析Bonferroni事后测试紧随其后。 对肝癌生存分析的意义是由单向方差分析计算分析Bonferroni事后测试紧随其后。 真正Time-PCR意义被未配对计算t以及分析SD相等。 对于[3.H]胸苷扩散试验意义被未配对计算t以及分析SD相等。 分析neurosphere意义被未配对计算t以及分析以同样的SD和双向方差分析分析Bonferroni事后测试紧随其后。 对于肿瘤的生长速率的意义是由双向方差分析计算分析Bonferroni事后测试紧随其后。 肿瘤重量分析的意义是由双向方差分析计算分析Bonferroni事后测试紧随其后。 星号显示统计学意义如图传说报道。