肿瘤内浸润CD4+和FOXP 3+T细胞作为可切除结直肠癌预后的强阳性预测指标

背景技术

报告了CD3+和CD8+T细胞浸润作为大肠癌(CRC)患者生存的阳性预测指标。在此，我们证明CD4+和FOXP 3+T细胞密度在CRC中的预后意义。

方法

应用免疫组织化学和数字病理学方法对342例大肠癌根治性切除患者的CD3+、CD8+、CD4+和FOXP 3+T细胞的瘤内密度进行了定量研究。在322份标本中还评估了微卫星不稳定性。分析患者的人口学特征、临床病理特征和生存率。

结果

高CD3+、CD4+和FOXP 3+T细胞密度与无复发生存率(RFS)有关，CD8+、CD4+和FOXP 3+T细胞密度高与疾病特异性存活(DSS)有关。CD4+低、FOXP 3+T细胞密度低的患者预后极差。T分期、血管/淋巴浸润和CD4+T细胞密度是DSS的独立预后指标。高微卫星不稳定组CD4+、FOXP 3+T细胞密度分布与CD3+、CD8+T细胞密度无显着性差异(P>0.05)。

结论

肿瘤内CD4+T细胞密度、CD4+和FOXP 3+T细胞密度较其他临床病理特征更能反映预后。这些结果可能有助于建立新的预后因素和治疗策略。

结直肠癌(CRC)是世界上第三大最常见的癌症，也是全球第四大癌症相关死亡原因，每年导致50多万人死亡。1,2尽管最近外科治疗和化疗的进展有所改善，20%-25%的患者仍有致命的疾病复发，治疗的效果仍然不能令人满意。3

国际癌症控制联盟(UICC)的肿瘤、淋巴结和转移(TNM)分类已被证明是有价值的估计病人的预后。4,5然而，这种方法本身并不足以作为预测预后的指标，因为在同一组织肿瘤分期的患者之间，临床结果可能有所不同。6自20世纪90年代初以来，辅助化疗已被广泛推荐为第三阶段CRC患者的标准治疗方案；7目前，高危II期患者也在接受辅助化疗.8有多种化疗方案，如氟嘧啶单独或联合奥沙利铂，其强度随病情的不同而不同。9因此，需要识别新的预测生物标记物来分类和识别那些可以从辅助化疗中获得最大利益的患者。9,10,11

基于突变状态和肿瘤基因表达的分类方法在预测复发风险方面具有中等的预测精度和有限的临床应用价值。12,13,14近年来，许多报道表明原位免疫细胞浸润对肿瘤的预后有很好的影响。15,16,17肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)，特别是CD3+和CD8+T细胞，17,18可作为宿主对肿瘤免疫反应的指标，并可作为复发和整体生存的独立阳性预测因子。此外，一种称为免疫核心的评分系统，总结了肿瘤内CD3+和CD8+T细胞效应物的密度及其侵袭性边缘，对预测CRC患者的临床预后具有重要意义。19,20

相反，CD4+T细胞在CRC中作为预后指标的定义不太明确，很少有研究报告CD4+T细胞密度与生存率之间存在显著的关联。21,22此外，目前，叉头盒P3(FOXP 3)+细胞通常被认为在多种癌症中具有免疫抑制作用，23,24除CRC外，FOXP 3+细胞浸润的调查结果相互矛盾。25,26

在本研究中，我们不仅检测了CD3+和CD8+，还检测了CD4+和FOXP 3+T细胞，以探讨其预后价值。据我们所知，我们首次证明肿瘤内CD4+和FOXP 3+细胞浸润可能是最有意义的预测因素。

病人和组织样本

从1993年至2012年在日本山口大学医学院胃肠、乳腺和内分泌外科为CRC进行根治性切除的342名患者连续采集了癌组织标本。在腹膜反射以下的肿瘤患者被排除在这项研究之外，以排除低位直肠癌患者，其术前作为新辅助化疗(放射治疗)的治疗方法与结肠癌的腹膜反射不同，27切除后5年内因其他疾病死亡或停止随访的患者被排除在外，以确定5年的疾病特异性生存(DSS)和无复发生存(RFS)。病人的人口学特征和基线特征列于表中。1..辅助化疗主要用于Ⅲ期和高危Ⅱ期CRC患者.在第一、第二、第三阶段，接受辅助治疗的患者分别占11%、64%和87%(表)沙一)。山口大学医院伦理委员会(H17-83和H23-135)批准了道德、法律和社会影响。所有标本均经患者知情同意获取。

免疫组织化学与TIL分析

免疫组织化学(IHC)如先前所述。17,28简单地说，在对手术标本中的苏木精和伊红染色片进行病理检查后，从福尔马林固定的石蜡包埋标本中进行4-μm切片.采用文塔纳发现XT染色系统(Ventana，Tucson，AZ，USA)自动进行IHC染色。用抗CD3(兔单克隆抗体，518110079(CD3)；抗CD8抗体(小鼠单克隆抗体，1：50，IR 623；DAKO，福斯特市，CA，美国)，抗CD4抗体(小鼠单克隆抗体，518108816(CD4)；文塔纳抗体)和抗FOXP 3抗体(小鼠单克隆抗体，1：100，b 20034；ABCAM，剑桥，MA，美国)鉴定TIL的类型。以抗鼠IgG 1抗体(1：100，ab91353；ABCAM)作为同型对照。

使用高分辨率数字幻灯片扫描仪(NanoZoome-XRC 12000；Hamamatsu，日本)对幻灯片进行扫描，并通过计算机图像分析系统自动对所有肿瘤病灶进行评分(组织工作室；Definiens，德国慕尼黑)。测量记录为每个肿瘤组织单位的平均阳性细胞数，单位为平方毫米(图1)。1A)以及每个1毫米的阳性细胞数。2组织单位。结直肠癌组织可包括淋巴器官、坏死组织或厚纤维组织。本研究仅选择不包括瘤周淋巴细胞浸润及癌外淋巴样结构的主要肿瘤病灶进行分析(图一)。1B)。几乎所有病例检查的平均切片数为一个，最多检查4个病灶。

大肠癌CD3+肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)免疫组织化学(IHC)研究.a结肠组织分为1mm。2瓷砖，肿瘤组织突出红色。b选择肿瘤区作为曲线下的区域(用箭头表示)，不包括瘤周淋巴细胞浸润(开三角)和瘤外淋巴样结构(闭合三角形)。c典型的IHC表现为高CD3+细胞密度。d典型IHC表现为低CD3+细胞密度

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微卫星不稳定性分析

根据制造商的指示，使用QIAamp DNA FFPE组织试剂盒(齐根，德国希尔登)从切除标本中提取DNA。利用由BAT 25、BAT 26、NR-21、NR-24和Mono-27五个单核苷酸标记组成的Promega面板分析微卫星不稳定性(MSI)。利用msi分析系统进行PCR及后续分析。(普罗米加，麦迪逊，WI，美国)根据制造商的指示。CRC标本分为两组：MSI-高(MSI-H)，当5个标记中有两个或多个不稳定；微卫星稳定(MSS)，当零或一个标记显示不稳定。

统计分析

分类数据采用卡方检验或费舍尔精确检验进行评估。将DSS和RFS分别定义为从切除之日起至癌症死亡之日和肿瘤复发诊断日之间的间隔。生存率从CRC切除之日起至死亡，或至2017年5月1日止。用对数秩检验比较存活时间的分布。绘制了DSS和RFS的Kaplan-Meier曲线.采用Cox比例风险模型进行单因素和多因素分析。独立的预后因素由一个逐步选择的过程决定，在这个过程中，非显着性因素持续被拒绝。统计分析采用JMP 14(SAS研究所公司，CARY，NC，美国)。价值P < 0.05 was considered statistically significant.

TILs的IHC染色与分析

抗CD3抗体对TIL的IHC染色结果如图所示。1C，d根据中位数，他们被分为两组-高密度或低密度，有代表性的图像显示高密度(图1)。1C)和低密度(图1.1D)每个TIL的组。每毫米每支TIL的平均数目2IHC染色的细胞如图所示。2.

结直肠癌组织中肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的平均密度。每毫米TIL数2采用免疫组织化学方法对342例患者进行CD3、CD8、CD4和FOXP 3抗体检测。中位数(单元格/毫米)2)和范围也显示了

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为了阐明老年标本免疫染色的稳定性，对研究期前半期和后半期所有标记的平均阳性细胞数进行了比较。2 0 0 1年前后CD3+、CD8+、CD4+细胞数差异无显着性(P>0.0 5)。虽然2001年前与2002年后相比，FOXP 3+细胞有减少的趋势，但我们确定这些差异不会影响本研究的结果(图)沙一).

1 mm间CD3+细胞数2对15例组织单位进行评估，分析肿瘤内异质性。本研究从低、中、高CD3+细胞浸润病例中分别选取5例大肠癌进行分析。1mm间CD3+细胞数的变化2组织单位为0至205、0至1479和0至5070(细胞/毫米)2)分别适用于低、中、高渗透情况(图)S2).

根据TIL的密度判断预后

接下来我们研究了每个TIL的密度与患者预后的关系。总共有37例儿童权利委员会特有的死亡和75例复发。Kaplan-Meier生存曲线如图所示.3A-h根据每个TIL的密度。对数秩分析表明CD8+细胞密度较高(P=0.0234)，CD4+细胞密度(P < 0.0001) and FOXP3 + cell density (P(=0.0003)与改进的决策支持系统有关。同样，高CD3+细胞密度(P=0.0215)，CD4+细胞密度(P=0.0015)和FOXP 3+细胞密度(P0.0003)与RFS改善相关(图1)。3).

术后根据肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的高、低密度亚群生存。a根据CD3+细胞密度计算无复发生存(RFS)。b疾病特异性生存(DSS)根据CD3+细胞密度。cRFS按CD8+细胞密度计算。dDSS按CD8+细胞密度。eRFS根据CD4+细胞密度。fDSS根据CD4+细胞密度。gRFS按叉头盒P3(FOXP 3)+细胞密度。hDSS按FOXP 3+细胞密度。iRFS根据CD4+和FOXP 3+细胞密度。jDSS根据CD4+和FOXP 3+细胞密度。区分高密度和低密度细胞密度的截止值分别为339.1、72.2、64.6和75.3(细胞/毫米)。2)分别为CD3、CD8、CD4和FOXP 3。

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令人惊讶的是，CD4+和FOXP 3+细胞密度的组合最准确地预测了预后(图1)。3i，j)。CD4+TIL低密度和FOXP 3+TIL低密度的患者与极差的RFS有关(P < 0.0001) and DSS (P < 0.0001) when compared with those with high CD4 + TIL density and low FOXP3 + TIL density, low CD4 + TIL density and high FOXP3 + TIL density, or high CD4 + TIL density and high FOXP3 + TIL density.

决策支持系统的单变量和多变量分析

对DSS进行单因素和多因素分析，分析预后因素，如已知的临床因素和MSI状况，以及TILs的密度(表)。2)。单因素分析显示T分期、组织学分级、血管和淋巴浸润、辅助治疗以及CD8+、CD4+和FOXP 3+TIL的密度与DSS有关。MSI状态未显示为预后因素。在多因素分析中，影响预后的独立因素是T分期、血管和淋巴管浸润以及CD4+TIL密度(表)。3)。此外，CD4+细胞浸润率高是预后良好的最主要因素。P=0.0004)。

MSI状态与T细胞浸润

322例患者可测量MSI状态。比较了MSI-H组和MSS组TIL的密度，并将其列于表中。3..MSI-H组CD3+和CD8+细胞密度较高。P=0.0212和P与MSS组比较，分别为0.0153)。有趣的是，CD4+和FOXP 3+细胞在MSI-H组和MSS组之间的分布没有差异(P=0.8287和P分别=0.8287)。

在CRC患者中，有报道认为CD3+和CD8+标记物的存在与细胞毒性免疫反应有关，预后良好。15,16,17,18,19,20,26与以往报道一致，本研究证实CD3+和CD8+T细胞密度作为预后因素的有用性(图一)。3A-d).

本研究的主要新发现如下：CD4+细胞密度是本研究中独立的预后因素；FOXP 3+细胞浸润被证实是可切除性CRC的阳性预测指标；低CD4+细胞浸润和低FOXP 3+细胞浸润是判断CRC患者低生存率的准确预后因素；肿瘤MSI状态与高CD3+细胞密度和CD8+细胞密度显著相关，而与CD4+细胞密度或FOXP 3+细胞密度无关。

首先，我们发现高CD4+T细胞密度与预后呈正相关，在多因素模型中是一个独立的预后因素；它比肿瘤浸润深度或淋巴结转移阳性具有更大的预后价值。2)。据我们所知，这是第一份明确显示肿瘤内CD4+T细胞浸润作为可切除CRC的积极预后因素的有用性的报告。在我们的研究中，我们能够使用数字化的高分辨率图像和专门的软件来客观和定量地评估免疫细胞的肿瘤浸润，正如我们最近报道的那样；20,28这与其他研究不同，在其他研究中，分析仅限于研究人员选择的肿瘤的一部分。这种对所有肿瘤病变的分析可能有助于避免观察者的偏见，简化测量技术。此外，我们选择了明显没有瘤周淋巴细胞浸润或瘤外淋巴样结构的肿瘤区域(如图所示)。1B)。因此，我们能够准确地分析淋巴细胞的肿瘤内浸润。

CD4+T细胞密度是其他类型癌症(如肺癌、肾癌、前列腺癌和乳腺癌)的一个负面预后因素。28,29,30,31这种差异的原因尚不清楚，但可能是因为肿瘤微环境中CD4+T细胞的功能-即免疫反应激活或免疫抑制-可能因肿瘤类型不同而有所不同。与我们的结果一致，先前的研究报告说，在CD4+细胞缺乏调节的情况下，特定的CD8+T细胞会变得昏睡，不能转化为长寿命的功能效应细胞，32,33这意味着CD4+T细胞在管理和调节免疫系统对抗肿瘤细胞方面起着核心作用。作为对肿瘤的反应，幼稚CD4+T细胞可以根据细胞因子的产生和调节转录因子分化为四大类细胞-Th1、Th2、Th17和T调节细胞(Treg)。34,35一些研究表明Th1促进CD8+T细胞介导的适应性免疫，36Th1和细胞毒性基因水平与良好的预后有关，17而Th17高表达的CRC患者预后较差。我们认为这些复杂的机制增强了肿瘤微环境中的免疫反应，并对CRC的预后作出了贡献。

其次，我们证实了FOXP 3+细胞浸润的阳性预测值(图)。3G，h)。表达FOXP 3转录因子的CD4+T细胞具有Treg细胞的功能，抑制肿瘤细胞的有效免疫应答。37,38各种类型癌症的不良临床结果与大量FOXP 3+细胞侵入肿瘤组织有关。24然而，有关FOXP 3+细胞的结果在CRC中有报道，而FOXP 3+T细胞浸润率高的病例在某些研究中预后较好。25,26,39此外，有大量证据表明FOXP 3+/CD4+T细胞在功能和表型上存在异质性，表明FOXP 3+/CD4+T细胞可以根据FOXP 3和CD45RA在FOXP 3中的表达水平进行分级。低层/CD45RA+朴素Treg细胞，FOXP 3高CD45RA−效应细胞与FOXP 3低层CD45RA−非抑制性T细胞不具有抑制活性，可分泌促炎细胞因子。38,40,41在含有丰富肠道细菌的CRC异常肿瘤微环境中，非抑制性FOXP 3+细胞与某些肠道细菌的丰富程度有关；核梭杆菌与肿瘤侵袭有特别高的相关性。42因此，CRC肿瘤具有丰富的FOXP 3。低层T细胞浸润组预后明显优于高度浸润组(P<0.05)。高T细胞42在我们的结果中，明显高的FOXP 3+细胞密度与改善预后有关。然而，本研究的局限性之一是FOXP 3+细胞的数量仅通过免疫染色来量化，而非抑制性T细胞的百分比尚不清楚。本研究的另一个局限性是，2001年前FOXP 3+细胞数较2002年后有下降趋势，而研究期后半期FOXP 3+T细胞数中位数与前25%相当(图)。沙一)。因此，低密度组患者的生存状况越差，部分原因可能是老年患者预后不良。

我们还发现CD4+和FOXP 3+细胞密度对预后的预测价值最高(图1)。3i，j)。结果表明，仅浸润一种免疫细胞，即CD4+或FOXP 3+细胞，可能就足以为预防肿瘤复发提供有利的微环境。虽然需要进一步的研究来澄清这些结果背后的科学机制，但我们的发现可能有助于激发有关CRC肿瘤免疫的新想法和见解。

最后，我们发现MSI-H肿瘤CD3+和CD8+细胞密度高于MSS肿瘤，而CD4+和FOXP 3+细胞密度不受肿瘤MSI状态的影响(表)3)。MSI-H肿瘤是由错配修复基因缺失或改变引起的，约有6%~16%的CRC患者存在，且预后良好，转移潜能较低。43,44CD3+和CD8+细胞的检测结果与以往报道一致，而CD4+和FOXP 3+细胞的结果则不一致。MSI-H肿瘤与大量肿瘤组织浸润有关，CD3+和CD8+T细胞可识别肿瘤抗原。45,46CD4+细胞与MSI的关系尚未见报道，关于FOXP 3+细胞与MSI关系的报道也存在矛盾。在这项研究中，萨拉马等人。FOXP 3+细胞与MSI无明显关系，25以及LeGouvello等人。发现较低的mRNA表达水平Foxp 3在MSI-H肿瘤组织中。47在结直肠癌中，CD4+和FOXP 3+细胞的局部浸润可能受结肠微生物群的影响，而不受新抗原的影响。因此，未来的研究应该详细研究CD4+T细胞与含有结肠微生物的肿瘤微环境之间的关系。

总之，我们认为这项研究是首次报告CD4+和FOXP 3+T细胞密度联合检测在CRC患者中的预后意义。建议对第二和第三期CRC进行辅助化疗，推荐选择氟嘧啶单独或联合奥沙利铂方案。因此，这些新的预后指标的发现对于正确处理CRC患者的根治性切除具有重要意义。评估CD4+T细胞和FOXP 3+T细胞的密度有助于建立新的预后因素和治疗策略。