caspase-11信号转导增强移植物抗宿主病

急性移植物抗宿主病(GVHD)仍然是广泛应用异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)治疗造血恶性肿瘤的主要障碍。在这里，我们发现caspase-11，细菌内毒素的胞浆受体(脂多糖：LPs)，增强了GVHD的严重程度。Allo-HSCT显著增加LPS-caspase-11的相互作用，导致Gasdermin D(GSDMD)的断裂.caspase-11和GSDMD介导白细胞介素-1α(IL-1α)在异源HSCT中的释放.删除caspase-11或格斯德抑制脂多糖-caspase-11的相互作用，或中和IL-1α，均能降低异源HSCT肠道炎症、组织损伤、供体T细胞增殖和死亡率.重要的是，caspase-11缺乏并不降低移植物抗白血病(GVL)活性，这是防止癌症复发的关键。这些发现对allo-HSCT有重要意义，因为药物干扰caspase-11信号可能降低GVHD，同时保持GVL活性。

异基因造血干细胞移植(allo-hsct)是治疗造血恶性肿瘤和遗传性造血疾病等疾病的标准疗法，其成功与否受到与移植物抗宿主病(Gvhd)相关的死亡率和发病率的限制。1,2..在allo-hsct中，照射或化疗诱导的胃肠道(GI)损伤可以使细菌或脂多糖(Lps)从胃肠道转移到全身循环。脂多糖是革兰氏阴性菌的主要细胞壁成分。1,3..血清和组织内毒素水平与GVHD的严重程度和死亡率密切相关。3,4..LPS拮抗在保护移植物抗白血病(GVL)活性的同时降低GVHD5..此外，抗lps或革兰阴性菌抗体可显著降低临床试验中gvhd的发病率。6,7..有人认为LPS或革兰氏阴性菌通过Tol-like Receptor 4(TLR 4)增强GVHD，TLR 4是一种成熟的细胞表面LPS受体。然而，表达信号缺陷的allo-hsct受体小鼠TLR 4突变体发展为暴发性gvhd，与野生型(WT)相比，肠损伤增加。8..这些观察表明，LPS或革兰氏阴性菌可能通过TLR 4无关的信号通路增强GVHD。

caspase-11是一种细胞内脂多糖受体，能感知各种革兰氏阴性菌感染。9,10,11,12,13,14,15..caspase-11在细胞内被LPS激活后，将caspase-11寡聚成蛋白复合物，并酶切Gasdermin D(Gsdmd)，形成造孔肽，导致细胞死亡，称为下垂。16,17,18..这一过程破坏了微生物的细胞内生态位，并通过释放alarmins(如白细胞介素-1α(IL-1α)引发炎症。12,13,15..caspase-11的缺失使小鼠容易受到假马氏伯克霍尔德菌，一种东南亚特有的革兰氏阴性菌，可引起类鼻疽。12..然而，过度激活caspase-11在内毒素血症或多微生物败血症中会导致器官损伤和致命性。10,19,20,21,22..caspase-11的调节异常激活也参与了老年性黄斑变性的发病机制。23..基于这些发现和LPS在GVHD发生发展中的作用，我们推测caspase-11信号参与了ALO-HSCT中GVHD的发病机制。

本研究表明，LPS-caspase-11相互作用在异源HSCT中GVHD的发生发展中起重要作用.Caspase-11对LPS的识别导致GSDMD的断裂，而GSDMD对骨髓移植后IL-1α的释放至关重要。破坏LPS-caspase-11相互作用，删除caspase-11或格斯德，即IL-1α的中和作用能明显降低肠道炎症、供体T细胞的增殖和死亡率。此外，caspase-11缺乏症不会损害GVL效应。这些结果提示，Caspase-11信号通路的药理抑制作用可能在降低GVHD的同时，又能保持ALO-HSCT中GVL的活性。

caspase-11增强allo-hsct中的gvhd

为探讨caspase-11在异源hsct后GVHD中的作用，将wt小鼠T细胞(在BALB/c背景下，h2d)与bm一起移植到致死辐照的主要组织相容性复合物(Mhc)错配WT或wt中。caspase-11-缺乏受体小鼠(B6背景，H2B，由匹兹堡大学提供)。我们观察到caspase-11在接受者中，存活率明显提高(见图)。1A)。这些发现是在我们使用另一种不同的caspase-11-缺乏的小鼠(背景为B6，来自杰克逊实验室)或它们的WT小白蚁(如图所示)。1B)。此外，也有类似的观察时，小鼠被预先条件的布舒凡和环磷酰胺(BU/CY)化疗(图一)。1C). caspase-11-缺乏的受体有明显的较少的病理损伤(在肝脏，肺，小肠和结肠)(图)。1D与WT对照组相比，GVHD病理评分明显降低(图1)。1E和补充图。1A)。然而，移植前的辐射导致了类似的体重减轻和组织损伤。caspase-11-缺乏受体及其WT对照(附图)。1B，c)。接下来我们研究了供体细胞中的caspase-11是否参与了GVHD的发病机制。纯化T细胞和BMcaspase-11-用BALB/c背景(H2d)将缺乏的小鼠(B6背景，H2B)移植到照射过的小鼠体内。删除caspase-11在供体细胞中，WT受体的死亡延迟和GVHD病理评分略有改善(图1)。1F和补充图。1D，e)。我们发现，在非造血细胞中表达的caspase-11在异源造血干细胞(allo-hsct)促进GVHD死亡中起主导作用，而在造血细胞中表达的caspase-11则起次要作用(附图)。1F). caspase-11受者和供者骨髓细胞的缺乏进一步降低了异基因T细胞介导的致死性(补充图)。1F).

Caspase-11(Caspase-11)增强异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)的移植物抗宿主病(GVHD).a成活率卡斯普11+/+受体小鼠卡斯普11−/−接受小鼠(BALB/c→C57BL/6联合)接受BALB/c骨髓和T细胞。n=每组12人)。(*)P用对数秩检验分析动物存活率的差异。b生存卡斯普11+/+和卡斯普11−/−(JAX)接受BALB/c供者在TBI(全身照射)基础上的预处理后的异源HSCT的受体显示。n=每组10人)(*P用对数秩检验分析动物存活率的差异。c生存卡斯普11+/+受体小鼠卡斯普11−/−实验结果表明，接受化疗后BALB/c供体异源HSCT(BU/CY)的受体小鼠(BU/CY)。n=每组12人)。实验进行两次，数据汇总。(*)P < 0.0001, differences in animal survival were analyzed by log-rank test). d从两个单独实验中的一个有代表性的实验中，描绘了描述疾病平均记分形态学的显微照片。标度：100μm。BM代表接受BALB/c BM组的C57BL/6受体。卡斯普11+/+和卡斯普11−/−受体为BALB/c BM组和T细胞组小鼠。e大鼠小肠、大肠和肝脏的组织学分析卡斯普11+/+和卡斯普11−/−受体小鼠于第14天接受BALB/c BM和T细胞的GVHD严重程度测定，数据为均值±SEM。*P < 0.05. An unpaired Student’s t试验(双面)。f野生型受体小鼠(C57BL/6→BALB/c联合)的存活卡斯普11+/+对决卡斯普11−/−有T细胞或不含T细胞的BM。实验进行了两次，结果汇总。卡斯普11+/+对决卡斯普11−/− (**P=0.0054；用对数秩检验分析动物存活率的差异。

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caspase-11促进供体T细胞增殖

与GVHD相关的组织损伤是由异基因供体T细胞激活引起的。为了检测caspase-11是否促进异基因供体T细胞的增殖，我们使用了表达与β-actin启动子连接的荧光素酶的BALB/c供体T细胞。两周后，caspase-11-接受生物发光(生物发光成像，BLI)检测供体T细胞增殖。量化全身或肠道的Bli强度表明，caspase-11-与WT受体相比，缺乏的受者明显减少了T细胞的增殖(图1)。2A，b)。同种异体T细胞的活化与干扰素-γ(IFN-γ)和其他促炎细胞因子(如IL-17)的产生有关。中性粒细胞在组织中的吸收促进了异基因供体T细胞的增殖，并加重了gvhd相关组织的损伤和死亡率。1..根据这些发现，血清干扰素-γ水平和中性粒细胞浸润caspase-11-缺乏的受体明显低于WT受体(图1)。2C，d). caspase-11受体小鼠的缺乏也与血清IL-17和IL-6水平显著降低有关(补充图)。2A-C)跟踪所有的HSCT。删除caspase-11显著抑制CD4 T细胞辅助性T细胞1型(Th1)和小肠Th17极化(附图)2D，e)。总之，我们的数据表明，Caspase-11促进中性粒细胞浸润，肠道炎症，组织损伤，供体T细胞的扩张和死亡率的异源HSCT。

Caspase-11促进异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)供者T细胞的增殖.a移植后14天，卡斯普11+/+和卡斯普11−/−接受BALB/c骨髓和T细胞的受者接受腹腔注射荧光素素，并进行全身生物发光成像(BLI)。用实时图像软件对感兴趣区域进行门控和信号归一化。平均代表全身图像，平均生物发光强度±扫描电镜。(*)P=0.0040；未配对学生的t试验(双面)。b移植后14天，卡斯普11+/+和卡斯普11−/−接受BALB/c骨髓和T细胞的受者接受腹腔注射荧光素素和全身BLI，然后进行第二次荧光素酶注射、安乐死、器官摘除和移植物抗宿主病(GVHD)靶器官移植。生物发光采用全器官感兴趣区门控和信号归一化的活体图像软件进行量化。平均代表活体器官图像，平均生物发光强度±SEM。(*)P=0.0089；未配对学生的t试验(双面)。c干扰素-γ(IFN-γ)在接受骨髓和T细胞小鼠血清中的作用a、BALB/C(供体)、C57BL/6(受体)模型，ALO-HSCT后第5天。数据(平均±扫描电镜)来自两个独立的实验(*)P < 0.0001, an unpaired Student’s t试验(双面)。d典型结肠组织切片卡斯普11+/+受体小鼠卡斯普11−/−接受小鼠(BALB/c、→、C57BL/6联合)接受BALB/c骨髓和T细胞。棕色染色指的是髓过氧化物酶的染色，如各组织所示。Caspase 11缺失受体的髓过氧化物酶阳性细胞(MPO+)在高功率场(HPF)中的频率明显低于野生型受体(WT)。数据为平均值±扫描电镜(*)。P=0.0008，未配对学生的t试验(双面)。标尺：100μm

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lps-caspase-11相互作用增强gvhd

caspase-11是一种在肠道组织中构成性表达的胞浆型LPS受体。24..为了评估lps-caspase-11在allo-hsct中的相互作用，我们进行了近距离连接试验(PLA)，观察了两个分子之间的物理相互作用。22..Allo-HSCT能明显增强WT小鼠肠道内LPS-caspase-11的相互作用(图1)。3A)。如预期的那样，由于基因缺失而失去了相互作用。caspase-11(无花果)3A)。LPs-caspase-11复合物主要与上皮标记物共同定位(补充图)。3A)，进一步支持在非造血细胞中表达的caspase-11在异源HSCT后促进GVHD中起主导作用的观点。caspase-11对脂多糖的识别需要鸟苷酸结合蛋白(Gbps)。13,25..与此相一致的是，当gbpchr 3 ko(基因敲除)小鼠时，肠上皮中没有观察到lps-caspase-11的相互作用。13缺乏GBP 1、2、3、5和7的HSCT受体(图1、2、3、5和7)。3B)。我们还观察到Gbps在受体中的缺失明显改善了患者的生存率(如图所示)。3C)，并显著降低血清干扰素-γ水平，以及中性粒细胞浸润到结肠(补充图)。3B，c)。因此，GBPchr3KO受体与WT受体相比，GVHD病理评分有明显改善(图1)。三维空间和补充图。三维空间)。GBPchr3KO受体还显示T细胞增殖减少到类似于caspase-11-缺乏的接受者(如图所示)。3E，f).

脂多糖(LPS)-caspase-11相互作用增强异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)的移植物抗宿主病(GVHD).a近距离结扎法(PLA)观察caspase-11与LPS的物理相互作用。卡斯普11+/+和卡斯普11−/−受体小鼠接受BALB/c骨髓和T细胞。标尺：10μm。数据为平均值±扫描电镜(*)。P < 0.001, an unpaired Student’s t试验(双面)。bcaspase-11与LPS的物理相互作用表现为PLA在肠组织中的红斑。Gbpchr 3+/+和Gbpchr 3−/−受体小鼠接受BALB/c骨髓和T细胞。标尺：10μm。数据为平均值±扫描电镜(*)。P < 0.01, an unpaired Student’s t试验(双面)。cC57BL/6小鼠的存活情况如下(Gbpchr 3+/+对决Gbpchr 3−/−, **P用对数秩检验分析动物存活率的差异。d观察了C57BL/6小鼠接受BALB/c骨髓和T细胞(BALB/c→C57BL/6)后组织病理学GVHD的严重程度。Gbpchr 3+/+对决Gbpchr 3−/−)。数据表示为平均数(*)P < 0.01; ***P < 0.001; an unpaired Student’s t试验(双面)。e移植后14天，Gbpchr 3+/+和Gbpchr 3−/−受体接受腹腔注射荧光素酶，并对全身生物发光成像(BLI)进行了描述.平均代表全身图像和生物发光强度±扫描电镜(*)P=0.0013；未配对学生的t试验(双面)。f移植后14天，Gbpchr 3+/+和Gbpchr 3−/−受体接受腹腔注射荧光素素、全身注射和肠内注射。平均有代表性的活体器官图像和平均生物发光强度±SEM(*)P=0.0034；未配对学生的t试验(双面)。g成活率Gbpchr 3+/+和Gbpchr 3−/−光合细菌脂多糖对BALB/c小鼠骨髓和T细胞的影响红杆菌(LPS-RS)或生理盐水显示。用对数秩检验分析动物存活率的差异。(Gbpchr 3+/++生理盐水Gbpch 3−/−+生理盐水，*P<0.0001；Gbpchr 3+/++生理盐水Gbpchr 3+/++脂多糖-RS，*P<0.0001；Gbpchr 3+/++生理盐水Gbpchr 3−/−+LPS-RS，*P<0.0001)。h成活率Gbpchr 3+/+和Gbpchr 3−/−接受小鼠多次注射LPS或生理盐水。用对数秩检验分析动物存活率的差异。(Gbpchr 3+/++生理盐水Gbpchr 3−/−+生理盐水，*P=0.0004；Gbpchr 3+/++生理盐水Gbpchr 3+/++LPS，*P < 0.0001; Gbpchr 3+/++生理盐水Gbpchr 3−/−+LPS，*P=0.0002)

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为了进一步证实caspase-11与LPS的相互作用促进gvhd的发生，我们用光合细菌LPS处理小鼠。红杆菌(lps-rs)，一种五酰基化的脂多糖，竞争性地抑制脂多糖-caspase-11的相互作用。22(补充图。3A)。LPS-RS治疗能显著促进异丙肾上腺素HSCT后小鼠的存活，但对GBPchr 3 KO受体小鼠无明显促进作用(图1)。第三代)。相反，腹腔内(I.P.)应用allo-hsct后给予LPS可显著提高vhd在WT的致死率，但对hsct无明显影响。caspase-11-缺乏或GBPchr3KO受体小鼠(如图所示)。3H)。口服环丙沙星可显著降低循环脂多糖水平(附图)。4A，b)。因此，环丙沙星治疗能显著改善WT患者的生存率，但不能提高患者的生存率。caspase-11-缺乏受体小鼠(附图)。4C)。综上所述，这些数据表明LPS-caspase-11相互作用增强了ALO-HSCT中的GVHD.

caspase-11通过GSDMD增强GVHD

GSDMD是一种caspase-11底物，它直接触发下垂。16,17..Allo-HSCT可导致WT受体肠内GSDMD的断裂.删除caspase-11或Gbps对受体小鼠的GSDMD切割明显降低，在allo-HSCT(图)。4A)。LPS-RS治疗能明显抑制和增强ALLO-HSCT后肠GSDMD的断裂(见图)。4A)。接下来，我们确定caspase-11是否通过MHC-不匹配的allo-HSCT中的GSDMD增强GVHD.删除格斯德显着地改善了存活率(见图)。4B)，并显著降低血清干扰素-γ水平(补充图)。5A)和肠道中性粒细胞浸润(补充图。5B). 格斯德缺乏症显著改善GVHD的病理评分，类似于caspase-11缺乏症(图1.4C和补充图。5C如图所示，使用荧光素酶表达的T细胞与T细胞的增殖减少有关(如图所示)。4D)。LPS-RS治疗能显着地促进WT的存活，但对移植瘤的存活无明显格斯德Ko受体小鼠在allo-HSCT期间(见图)。4E)。此外，LPS治疗显着地提高了WT的致死率，但在格斯德Ko受体小鼠在allo-HSCT期间(见图)。4F)。这些发现表明caspase-11通过GSDMD促进GVHD在allo-HSCT中的表达.

Caspase-11通过Gasdermin D(GSDMD)增强异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)的移植物抗宿主病(GVHD).a野生型肠内GSDMD和β-actin免疫印迹(C57BL/6)Gbpchr 3−/−或Gsdmd−/−光合细菌脂多糖(LPS)或脂多糖(脂多糖)对受体小鼠的影响红杆菌(LP-RS)。bGsdmd生存+/+对Gsdmd−/−接受小鼠(BALB/c、→、C57BL/6联合)接受BALB/c骨髓和T细胞。实验进行了两次，结果汇总。格斯德+/+对Gsdmd−/−, ***P =0.0002；用对数秩检验分析动物存活率的差异。cGsdmd小肠、大肠和肝脏的组织学分析+/+和Gsdmd−/−第14天接受BALB/c骨髓和T细胞移植，观察GVHD的严重程度。**P < 0.01; *P < 0.05. An unpaired Student’s t试验(双面)。d移植后14天，Gsdmd+/+和Gsdmd−/−接受BALB/c骨髓和T细胞的受者接受腹腔注射荧光素素，并进行全身生物发光成像(BLI)。平均代表全身图像和平均生物发光强度±SEM。数据为平均值±扫描电镜。未配对的学生t试验(双面)。**P < 0.01(compared with vehicle-treated controls). e成活率格斯德+/+和格斯德−/−接受小鼠接受BALB/c骨髓和T细胞(BALB/c、→、C57BL/6)联合LPS-RS或生理盐水治疗。用对数秩检验分析动物存活率的差异。(格斯德+/++生理盐水格斯德−/−+生理盐水，*P<0.0001；格斯德+/++生理盐水格斯德+/++LPS-RS，*P < 0.0001; 格斯德+/++生理盐水格斯德 −/−+LPS-RS，*P < 0.0001). f成活率格斯德+/+和格斯德−/−接受小鼠接受BALB/c骨髓和T细胞(BALB/c→C57BL/6联合)多次注射LPS或生理盐水。用对数秩检验分析动物存活率的差异。(格斯德+/++生理盐水格斯德−/−+生理盐水，*P=0.0005；格斯德+/++生理盐水格斯德+/++LPS，*P < 0.0001; 格斯德+/++生理盐水格斯德−/−+LPS，*P=0.0004)

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caspase-11和gsdmd介导白细胞介素-1α的释放

caspase-11的激活和GSDMD的切割导致内毒素血症和细菌脓毒症中IL-1α的释放。10,16,22..接下来我们确定caspase-11和GSDMD是否在GVHD中介导IL-1α的释放.血清IL-1α水平在A1HSCT组显著升高(图1).5A-C)。删除caspase-11或格斯德在受体中，IL-1α的释放明显减少，说明caspase-11和GSDMD-表达的非造血细胞(如上皮细胞)是ALLO-HSCT后IL-1α的主要来源。5A-C)。血清IL-1α水平与小鼠模型的GVHD病理评分相关(图1)。5D)。重要的是，我们前瞻性地分析了50例进行补充表治疗的患者的血清水平。1结果发现，重型GVHD患者血清IL-1α水平明显高于无或轻度GVHD患者(见图)。5E)。这些结果表明caspase-11和GSDMD在GVHD中介导IL-1α的释放.

Caspase-11和Gasdermin D(GSDMD)介导移植物抗宿主病(GVHD)白细胞介素-1(IL-1α)释放.a–cC57BL/6小鼠全身照射(1100 CGy)，然后移植5×10。6野生型(WT)BALB/c T细胞缺失骨髓(TCD-BM)细胞单独或除5×10外6第0天T细胞总数。移植后5天，血清进行细胞因子分析，测定血清中IL-1α的浓度。卡斯普11−/− (a) Gbpchr 3−/− (b)和格斯德−/− (c)接受者。未配对的学生t试验(双面)。**P < 0.01; ****P < 0.0001 (compared with vehicle-treated controls). d血清IL-1α水平卡斯普11+/+和卡斯普11−/−接受过异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)的受者与GVHD的严重程度相关。未配对的学生t试验(双面)。**P < 0.01; ***P < 0.001. e血清IL-1α水平与GVHD严重程度(GVHD 0级)相关。n=13；GVHD I-II级，n =17；GVHD三至四年级，n =20)ALLO-HSCT后患者。****P < 0.0001. An unpaired Student’s t试验(双面)。病人的特征详见补充表。1

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中和IL-1α减弱GVHD

接下来，我们测试caspase-11信号是否通过释放IL-1α来增强allo-HSCT中的GVHD.用单克隆抗体中和IL-1α，使血清中的IL-1α几乎完全耗尽。6A)，导致GVHD死亡率显著提高，GVHD病理评分显著降低(图一)。6B，c)。同时，应用IL-1α中和抗体可显著降低血清IFN-γ水平。6d)，并减少了供体T细胞在全身和小肠的扩张，与它们的WT短时相比(见图)。6E，f)。重要的是，中和IL-1α可显著改善WT小鼠异源hsct的存活，但对小鼠的存活无明显影响。caspase-11-不足的接受者(附图)。6A)。caspase-11和gsdmd引起的下垂导致钾外流，导致nlrp 3炎症体的激活。16..该事件介导IL-1β的成熟，其生物学功能与IL-1α相似.与先前的研究一致26, NLRP 3受体缺乏延迟，但注射10只小鼠并没有降低死亡率。6异基因供体T细胞caspase-11-在相同的实验环境中，缺乏显著降低了死亡率(附图)。6B)。Caspase-11和GSDMD也是IL-18在allo-HSCT(补充图)中释放的关键因素.6C，d)。然而，基因缺失伊-18未能影响生存(附图)。6E)。这些观察表明，caspase-11信号增强GVHD，至少部分通过IL-1α。

中和白细胞介素-1α(IL-1α)可减轻移植物抗宿主病(GVHD).a在异基因造血干细胞移植(allo-hsct)的第1天(第1天)和第1天(第1天+1天)，检测小鼠骨髓中IL-1α水平，或每只小鼠注射4 g抗IL-1α单克隆抗体(Ab)或同类型对照抗体(−+1)。散点图代表卑鄙，n=4(BM)，n=10(IL-1αAb)和n=7(同型控制)，由两个独立实验的结果汇集而成。****P < 0.0001, unpaired Student’s t测试(双面)bC57BL/6受体(BALB/c、→、C57BL/6组合)的存活情况是用抗IL-1α单克隆抗体或同类型对照抗体接受BM/Tc(BM/T细胞)。BM/Tc+同型控制抗体n=11)与BM/Tc+抗IL-1α单克隆抗体(n=10)，*P =0.0065。用对数秩检验分析动物存活率的差异。c抗IL-1α单克隆抗体和同类型对照抗体小鼠第14天小肠、大肠和肝脏的组织学分析。数据为平均±扫描电镜。未配对的学生t试验(双面)。*P < 0.05; **P < 0.01. dBM/Tc+同工型对照抗体(BM/Tc+)血清干扰素-γ(IFN-γ)水平(英文)n =9)和BM/Tc+抗IL-1α单克隆抗体受体小鼠(n =9)第5天。****P < 0.0001. An unpaired Student’s t试验(双面)。e移植后14天，对BM/Tc+同型对照抗体和BM/Tc+抗IL-1α单克隆抗体受体进行腹腔注射荧光素和全身生物发光成像(BLI)。平均代表全身图像，平均生物发光强度±扫描电镜。未配对的学生t试验(双面)。**P < 0.01 (compared with vehicle-treated controls). f移植后14d，取BM/Tc+同型对照抗体和BM/Tc+抗IL-1α单克隆抗体受体，腹腔注射荧光素钠、全身注射和肠内注射。平均代表活体器官图像，平均生物发光强度±SEM。未配对的学生t试验(双面)。***P=0.0003(与车辆处理对照)

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接下来我们研究了IL-1α促进供体T细胞增殖和GVHD严重程度的机制.应用IL-1α中和抗体可显著减少异源HSCT肠道中性粒细胞浸润。7A)。与先前的研究一致1使用抗Ly-6G抗体的中性粒细胞耗竭显着地改善了供体T细胞的存活，并明显抑制了供体T细胞的增殖。7b，c)。这些发现提示，IL-1α促进中性粒细胞浸润在异种HSCT中，这是供体T细胞扩张和严重程度的关键.

caspase-11缺乏症保留GVL活性

摘要GVL活性是防止肿瘤复发的关键，也是allo-hsct成功的关键。27..因此，我们接下来决定是否caspase-11受体缺失影响GVL的维持，采用ALO-HSCT模型辅助EL4小鼠T淋巴瘤细胞转染荧光素酶/neo质粒(EL4-Luc)进行BLI肿瘤追踪。在MHC-不匹配的allo-HSCT 6周后，GVHD与肿瘤死亡率的区别在于BLI信号(指示肿瘤负荷)和体重减轻(指示GVHD的发生)。如预期的那样，所有的EL4-Luc和BM受体在4周内死于肿瘤(如图所示)。7A)。异基因T细胞的WT受体在异基因T细胞移植后第30天全部死于GVHD，同时伴有明显的体重减轻(图1)。7b)。这些小鼠缺乏肿瘤的BLI信号和可见的肿瘤(如图所示)。7C)。删除caspase-11在接受者中，体重维持和生存都有明显的改善(图一)。7A-c)。值得注意的是，caspase-11-缺乏的小鼠死于肿瘤(如图所示)。7A和补充图。8)。这些发现表明caspase-11缺乏症并不影响ALO-HSCT的GVL效应。

caspase-11缺乏保留移植物抗白血病(GVL)活性。a生存卡斯普11+/+ (n=12)和卡斯普11−/−(n(11)接受致死性照射(1100 CGy)并移植5×10。6单独或除3×10以外的Balb/c T细胞缺失骨髓(TCD-BM)细胞63×10 BALB/c小鼠总T细胞5在BM移植(BMT)时，EL4荧光素酶介导的淋巴瘤细胞被发现.用对数秩检验分析动物存活率的差异。**P=0.0039(卡斯普11−/−与车辆处理对照)。b 卡斯普11+/+ (n=12)和卡斯普11−/− (n(11)在整个试验期间，每隔3至5天监测一次受体体重的变化。c肿瘤扩张卡斯普11+/+和卡斯普11−/−接受受者腹腔注射荧光素素(Luciferin)，每14天一次全身生物发光成像(Bli)。

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综上所述，本研究证实阻断caspase-11信号在保持GVL活性的同时，降低了GVHD。在这种情况下，循环的LPS或革兰氏阴性菌通过Gbps激活caspase-11，导致GSDMD依赖的IL-1α释放.通过遗传或药理学方法靶向这一途径可以减少异源HSCT中肠中性粒细胞的浸润、组织损伤和供体T细胞的增殖。结合最近的一项发现，肠道微生物对肠组织中性粒细胞的吸收促进了供体T细胞的活化，并参与了GVHD的发病机制。1，我们的数据提供了机械洞察肠道微生物如何促进GVHD在allo-HSCT.肠道微生物群对GVHD的重要贡献是在20世纪70年代首次发现的。然后，使用口服抗生素对异源hsct患者进行肠道去污已成为一种常见的做法。27..最初的报告是有希望的，但随后的研究无法证实其益处。27..广谱抗生素的使用甚至会导致gvhd失调。28..此外，肠道微生物源代谢物，如丁酸酯，改善上皮内细胞的连接完整性，减少凋亡，并减轻gvhd。29..因此，药物靶向肠道微生物引起的炎症反应，如caspase-11信号，可能是一个更有效的选择，病人进行异源HSCT比消除细菌菌落在胃肠道通过抗生素。

1型干扰素信号转导对caspase-11的激活有重要作用。11,13,15..以类似于双链rna病毒的方式诱导1型IFN产生的双链RNA模拟物PolyI：C能显著促进LPS诱导的caspase-11的激活和肺内皮细胞的凋亡。21..此外，多聚I：C可显著提高内毒素血症患者caspase-11的致死率。19,20..最近的进展显示，随着时间的推移，病毒感染在allo-hsct之后逐渐扩大。30..特别是双链核糖核酸病毒(Picobirnavirus)，与严重的肠病毒gvhd密切相关。30..这些发现提出了一个有趣的可能性，即所有HSCT相关病毒感染可能通过caspase-11-GSDMD信号增强GVHD。值得注意的是，caspase-1也介导GSDMD的切割.肠道微生物群和病毒感染都能通过典型的炎症体激活caspase-1。因此，caspase-1在GVHD发病机制中的作用值得进一步研究.

GVHD仍然是推广使用allo-hsct的主要障碍。1,2..到目前为止，大多数预防严重GVDH的治疗或预防策略包括T细胞耗竭，药物抑制T细胞活化和增殖，以及干预T细胞依赖的效应期。27..这些方法不可避免地损害了全球宿主免疫，从而损害了由供体T细胞介导的GVL活性，而T细胞是allo-hsct后总体结果的主要决定因素。27..在目前的研究中，我们发现缺乏caspase-11信号可以在保持GVL活性的同时降低GVHD。因此，我们的数据对allo-HSCT有着重要的意义，因为caspase-11信号的药理抑制可能完全减少不必要的嫁接反应和宿主反应，同时也保留了在allo-HSCT中有益的GVL活性。

人类主体

根据中南大学湘雅医院研究伦理委员会的批准，在GVHD诊断后30~80天采集血清标本。所有患者都对数据收集提供了知情同意，以供研究。病人特征见补充表1..GVHD评分按GLucksberg分级标准进行。

小鼠

C57BL/6(H-2kb，Thy-1.2)和BALB/c(H-2Kd，Thy-1.2)小鼠购自湖南SJA实验动物公司。(中国长沙)。Caspase 11−/−, 伊-18−/−从Jackson实验室购买BALB/c小鼠。这个Caspase 11−/−小鼠22由TimothyR.Billiar(宾夕法尼亚州匹兹堡大学医学中心外科学系)捐赠。这个GBPchr 3−/−小鼠31由PETR Broz(巴赛尔大学生物中心感染生物学)捐赠。这个格斯德−/−小鼠32由厦门大学细胞应激生物学国家重点实验室细胞信号网络生命科学学院捐赠。这个NLRP 3−/−小鼠33由中国科学技术大学生命科学学院中国科学院天然免疫与慢性病重点实验室周荣斌捐赠。除L2G85小鼠外，本研究使用的BALB/c小鼠均以C57BL/6为背景，均处于中国CSU实验动物系无致病菌的特定条件下。小鼠在6周至12周龄之间使用，只使用性别匹配的供受体对。所有的工作都是根据中南大学动物保护和使用机构委员会的动物实验指南进行的。

BMT模型

骨髓移植受者被给予5×106BBM细胞(生物素抗体CD 90.2，eBioscience；MACS阴性分选，干细胞，加拿大)：11 Gy(2×5.5Gy，间隔4h)照射后，分别在中国→C57BL/6组合和C57BL/6→/c组合中分别照射8Gy(2×4.0Gy至4h)和8Gy(2×4.0Gy~4h)。T细胞剂量(生物素抗体CD11b/TER119/B 220/CD49b/CD 24/CD19b，eBioscience；MACS阴性富集，干细胞，加拿大)因移植模型C57BL/6≥BALB/c(8×10)而异5)和BALB/c≥C57BL/6(2-5×10)6).

急性GVHD的组织病理学评分

第14天采集小肠和大肠标本，用苏木精/伊红染色，由经验丰富的病理学家对治疗组进行评分。GVHD分级体系为：肝级0.5(局灶性门脉淋巴浸润)、1级(广泛门脉淋巴浸润)、2级(局灶性胆管浸润或细胞损伤)、3级(胆管损伤和再生多灶)、4级(广泛损伤和破坏)。小肠和大肠-0.5级，腺体或隐窝中偶有或罕见的坏死细胞；1级，腺体或隐窝中坏死细胞的多发灶；2级，涉及多个隐窝或腺体内有局灶性脓肿形成的坏死；3级，广泛存在的伴有局灶性腺体破坏的隐窝脓肿；4级，有肉芽组织反应的粘膜丢失。

T细胞淋巴瘤模型

为了研究转移的供者T细胞的GVL活性，我们使用了转荧光素酶基因的EL4(EL4-Luc)T细胞白血病。Balb/c→B6受体5×103荧光素酶/neo质粒介导的EL4T细胞淋巴瘤细胞(EL4-Luc)在BMT时表达。肿瘤死亡率和GVHD死亡率用BLI区分为肿瘤负荷和体重减轻，以显示GVHD。用活体图像软件(Xengen)对BLI数据进行分析和量化。

化疗治疗

小鼠BU(10 Mg Kg)−1天，日−1第7天至第4天；Busilvex，Pierre Fabre pharma，德国)和CY(100毫克千克)−1天，日−1从第三天−3到−2；内皮素，巴克斯特保健，美国)I.P.(BU/CY)。干细胞注射的天数为第0天，干细胞注射前的天数为向后数。

药物治疗

小鼠注射I.P.。每只小鼠用4g/只单克隆抗小鼠IL-1α抗体(BIOLegend，德国)或同型对照抗体(大鼠IgG2a，BIOLegend，德国)，分别于照射前24 h和BMT后24 h注射生理盐水100μg。

BLI成像

在BLI研究中，小鼠被注射I.P.。含荧光素酶(10克)−1体重)10分钟后，用IVIS 100电荷耦合器件(Ccd)成像系统(Xenogen，Alameda，CA)成像5分钟。膨胀量用光子表示。–1厘米–2..利用活体图像软件(Xenogen)对成像数据进行分析和量化。

常规组织学与免疫组织化学

石蜡包埋切片5米厚安装在显微镜下.固定后，采用美国ABCAM抗MPO抗体。然后将切片与特定的次级生物素化抗体孵育。按制造商的指示使用链霉亲和素辣根过氧化物酶和3，3‘-二氨基联苯胺(ABCAM，美国)，并用苏木精(Thermo Science，USA)对切片进行染色。

细胞因子测定

采用EBioscience炎症试剂盒(eBioscience，USA)检测血清中IL-1α和IFN-γ水平，并按生产厂家的指示使用。

Lamia固有淋巴细胞的分离

处死小鼠，用PBS冲洗肠道。钙/镁-脂肪和肠系膜组织解剖及Peyer‘s贴片切除后。(0.5厘米)纵向打开和PBS片钙/镁-洗涤肠用含2mm EDTA、10 mm HEPES、5%胎牛血清(FBS)和1mm二硫苏糖醇的Hanks平衡盐溶液(HBSS)孵育。在37°C摇床上孵育15 min后，用100μm滤器分离上皮内淋巴细胞和上皮细胞。组织在HBSS中消化Ca+/Mg+介质(热费舍尔科学)，含10毫米HEPES和5%FBS(37°C，5%CO)2培养0.5h后，用小肠分离程序m_肠和肠LPL分离试剂盒(批号：130-097-410，Miltenyi，Miltenyi)分离肠固有淋巴细胞(LPLs)。

流式细胞术

用纯化的抗CD 16/32抗体在饱和时进行染色，阻断非特异性染色。在37℃下，用1×PhosphoFlow Lyse/Fix缓冲液溶解固定15 min，然后用PhosFlow Perm缓冲液在冰上渗透1h(所有试剂均来自美国EBioscience)。

近端结扎术

采用PLA试剂盒(Sigma，USA)研究了小鼠肠道组织中LPS与caspase-11的相互作用.这种独特的方法能够在原位显示分子间的相互作用。经4%甲醛固定和0.1%Triton渗透10 min后，与LPS(小鼠单克隆2D7/1)或Caspase-11(大鼠单克隆17D9)原抗体孵育一夜。简单地说，与原抗体孵育后，细胞用相应的PLA探针孵育，次级抗体与寡核苷酸(小鼠+和大鼠负向LPS和caspase-11相互作用)结合。随后，当PLA探针与聚合酶和寡核苷酸紧密结合时，加入连接酶，形成环状DNA链，允许滚动循环扩增。荧光染料标记探针序列互补滚动圆扩增产物与滚动环扩增产物杂交。因此，每一对蛋白质都会产生一个斑点，可以用荧光显微镜观察。图像用Leica共焦激光扫描显微镜拍摄，用ImageJ软件进行分析。在一些实验中，细胞与抗小鼠泛细胞角蛋白(克隆：AE1/AE3，Lot：2086277；Thermo，美国)的抗体共同孵育。

免疫印迹

从肠组织中提取蛋白质。采用12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质样品，并将其转移到PVDF膜上。抗小鼠GSDMD抗体(ABCAM，美国)在1：1000使用。印迹被标准化为β-actin(cst，USA)的表达.

统计分析

使用GraphPad棱镜软件(6.01版)对所有数据进行分析。用学生的数据进行分析t两组比较试验。生存资料用对数秩检验进行分析。一个p所有实验均认为值<0.05有统计学意义。所有值均表示为平均±SEM(误差条)。

提交人声明，支持本研究结果的所有数据均可在文章及其补充资料档案中查阅，或应相应作者的合理要求提供。