脂钙蛋白2在天麻素介导的摄食量和体重减少中的作用

芹菜醇是一种瘦素敏化剂，对饮食型肥胖(DIO)小鼠有明显的抗肥胖作用.然而，介导谷草素诱导瘦素致敏的基因和途径尚未被完全了解。通过比较芹菜醇和载体处理的DIO小鼠下丘脑转录谱，我们确定了脂钙蛋白-2(Lipocalin-2)。Lcn 2)是被天麻醇最强烈地上调的基因。Lcn 2曾被认为是一种厌食和抗肥胖的药物。在下丘脑、肝脏、脂肪、肌肉和骨髓，以及血浆中，塞拉星醇都能增加Lcn 2蛋白的水平。然而，Lcn 2的基因缺陷并没有改变饮食诱导的肥胖的发展，也没有改变赛拉唑促进体重减轻和改善肥胖相关的平衡失调的能力。我们的结论是，Lcn 2对于高脂肪饮食诱导的肥胖和它的治疗性减少都是可有可无的。

普遍存在的肥胖症给全世界的人类健康带来了挑战。2015年，估计有1.077亿儿童肥胖，占全球儿童总数的5%1..到2025年，39%的成年人(18%的男性和21%的女性)预计会肥胖，其中15%(6%的男性和9%的女性)超过40公斤/米。2身体质量指数2,3..令人震惊的是，仅在2017年，据报道，全世界有400万人死于高BMI。1..尽管有这些事实，有效的非手术治疗肥胖症还没有在人类身上实现.

瘦素是一种脂肪细胞衍生的激素，能抑制食欲，降低瘦素缺乏时的体重，最初使人们对肥胖的有效治疗产生了希望。4,5,6,7,8,9,10..在最初发现瘦素后不久，人们就认识到大多数肥胖人群的血清瘦素水平很高，并且在减少食物摄入量和体重方面对外源性瘦素缺乏反应，这就导致了瘦素抵抗的概念。11,12..瘦素抵抗及其细胞因子抗性的研究进展13,14肥胖为肥胖的发展提供了新的见解，也是一种潜在的治疗途径。

我们先前鉴定了一种五环三萜，从雷神藤的根提取物中分离出来。雷公藤)，作为一种强效瘦素增敏剂和抗肥胖剂。15..最近的出版物也证实了这些意见。16..口服塞拉前列醇可使饮食型肥胖(Dio)小鼠的体重降低45%以上，这是迄今为止报道的最强的抗肥胖作用，并进一步改善了胰岛素抵抗/2型糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎(Nash)、高胆固醇血症和肝损伤。15..芹菜醇对瘦素受体突变小鼠不具有抗肥胖作用。达布/达布)，对瘦素缺乏(OB/OB)肥胖模型15,16..因此，芹菜醇是一种瘦素敏化剂，其功能依赖于完整的瘦素信号通路。

我们以前证明过，塞拉星能减少内质网(ER)的压力。15，它在瘦素抵抗的发展中起着核心作用。17,18,19,20,21,22,23,24,25,26..然而，塞拉星形醇降低ER应激和提高瘦素敏感性的主要靶点或途径尚不清楚。了解赛拉星形醇的作用机制，不仅可以深入了解瘦素信号转导和抵抗的生物学基础，而且还将为有效治疗肥胖开辟新的途径。

赛拉星醇提高Lcn 2水平

为了探讨塞拉星形醇抗肥胖和瘦素致敏作用的机制，我们探讨了天冬氨酸对下丘脑基因表达的影响。饮食诱导肥胖(DIO)小鼠，无论是车辆或芹菜醇治疗4天(100μg/kg，I.P.)。注射，每日一次)；提取下丘脑，并将mRNA用于前文所述的微阵列杂交。20..为了通过赛拉星醇鉴定基因，我们要求同时满足两个阈值标准：第一，每种基因的折叠向上或向下调节(折叠变化，fc)在塞拉星处理的小鼠与载体处理的小鼠中的表达均大于2(？log)。2(Fc)\x{e76f}>1)；第二，相关的P值小于0.001(-log)10(P)>3)(图中的“火山”图。1A)。结果表明，芹菜醇处理显著上调了40个基因，下调了6个基因。脂钙蛋白-2(Lcn 2)是腹腔注射DIO小鼠下丘脑中最上调的基因。1B，c).

Lcn 2是腹腔注射DIO小鼠下丘脑中最上调的基因。(a)火山图描述了腹腔注射对DIO小鼠下丘脑基因的调节作用。(b)具有fc>2并与之相关的顶级天冬氨酸调节基因的折叠变化(Fc)。P < 0.001 determined by two-tailed t测试一下。(c)热图显示DIO小鼠下丘脑中天冬氨酸调节基因(40个上调基因和6个下调基因)的相对折叠变化(100 g/kg，I.P.)。每天)4天。每一列代表一个单独的鼠标，n=每组4只小鼠。Lcn 2用红色表示。(d–g)DIO小鼠分别用Veh或CEL治疗6h(250μg/kg，I.P.)，或1天、4天或3周(100μg/kg，每日一次)和下丘脑。Lcn 2比较各组的mRNA水平。下丘脑Lcn 2mRNA水平b)6小时(Veh)n=18，CELn=18)，(c)1天(Vehn=15，CELn=16)，(d)4天(Vehn=19，CELn=20)或(e)3周(Veh)n=11、Cel n=9)。值表示平均值±S.E.M。P数值由双尾学生的t测试一下。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.

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此前有人认为Lcn 2通过其对黑素皮质素4受体(MC4R)信号的作用来降低食欲和体重。27..因此，我们研究了Lcn 2是否在芹菜醇介导的食物摄入和体重减少中起作用。我们首先研究了下丘脑的调节。Lcn 2用定量聚合酶链反应(QPCR)方法观察了2 5 0μg/kg、1 0 0μg/kg或3周(10 0μg/kg，每天1次)对DIO小鼠基因表达的影响。下丘脑Lcn 2在所有时间点，赛拉司洛尔的表达均显着增加(如图所示)。1D-g).

Lcn 2从骨髓分泌到血浆之前被认为是调节食物消耗和体重的中枢。27我们观察了环磷酰胺治疗后循环Lcn 2水平是否升高。腹腔注射西兰地尔6小时(2 5 0μg/kg)，1天、4天、3周(10 0μg/kg，腹腔注射)。注射，每日一次)，测定血浆Lcn 2。环磷酰胺治疗6小时后循环Lcn 2显著升高(P<0.01)。P < 0.05, Veh versus Cel) (Fig. 2A)，在三周内，与车辆处理的DIO小鼠相比，其水平维持在更高的水平(P < 0.01 after 1 day or 4 day treatment and P < 0.001 after 3 weeks treatment, Veh versus Cel) (Fig. 2B-d).

整体治疗可增加Lcn 2的表达。(a–dDIO小鼠腹腔注射Veh或CEL 6 h(250μg/kg，I.P.)，1天、4天、3周(10 0μg/kg，I.P.)。每日)和血浆Lcn 2水平进行分析。Veh或CEL治疗DIO小鼠血浆Lcn 2水平(ng/ml)a)6小时(Veh，n=18和CEL，n=18)，(b)1天(Veh，n=8和CELn=8)，(c)4天(Veh，n=28和CELn=28)或(d)3周(Veh，n=19和CEL，n=19)。(e–j)Lcn 2 mRNA和蛋白的表达水平。e)骨髓，(f)下丘脑，(g)肝脏，(h)腹股沟白色脂肪组织(WAT)，(i)棕色脂肪组织(BAT)和(j)用Veh或CEL(100μg/kg，I.P.)处理的DIO小鼠肌肉。每天)5天。mRNA结果是由三个不同的下丘脑队列(Veh，n=12和CEL，n肝脏(Veh，n=13和CEL，n13)和两个骨髓组(Veh，n=11和CEL，n=10)，Wat(Veh，n=8和CEL，n=8)，蝙蝠(Veh，n=8和CEL，n=6)和肌肉(Veh，n=7和CEL，n=7)。免疫印迹的定量结果是两个不同的骨髓队列的组合(Veh，n=6和CEL，n=5)，以及下丘脑的两个队列(Veh，n=5和CEL，n肝脏(Veh，n=5和CEL，n=5)，Wat(Veh，n=5和CEL，n=4)，蝙蝠(Veh，n=5和CEL，n=5)和肌肉(Veh，n=5和CEL，n=5)。值表示平均值±S.E.M。P数值由双尾学生的t测试一下。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.

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接下来，我们确定骨髓中的Lcn 2是否受塞拉唑的影响。Dio小鼠每天服用10 0μg/kg，1次/d)，连续5天，同时服用西兰地尔(100 g/kg，每天一次)。Lcn 2对骨髓中的基因表达和蛋白水平进行分析。塞拉司洛尔给药显著提高了Lcn 2基因表达及Lcn 2蛋白在骨髓中的表达P < 0.001, Veh versus Cel) (Fig. 2E)。此外，对下丘脑的基因表达和Lcn 2蛋白水平进行了分析。2F)、肝脏(图1.2G)，白色脂肪组织(WAT)。2H)，棕色脂肪组织(BAT)。2I)和肌肉。2J)显示这些组织中的Lcn 2水平均明显升高，提示其对Lcn 2的整体上调作用。

缺乏Lcn 2并不能加速饮食诱导的肥胖。

上述结果，以及Mosialou的上一次报告等人.27，导致我们推测，芹菜醇诱导的下丘脑或循环中Lcn 2的上调可能介导，或至少有助于塞拉星形醇的厌食和抗肥胖作用。因此，我们获得了脂钙蛋白2基因敲除小鼠(Lcn 2−/−)28来验证这个假设。基因组PCR和组织Lcn 2蛋白鉴定Lcn 2−/−老鼠和野生小白蚁(Lcn 2+/+)(图1.3A，b). Lcn 2−/−小鼠在不同组织和血浆中均未检测到Lcn 2的表达。3C)。喂HFD 20周诱发肥胖，Lcn 2+/+和Lcn 2−/−小鼠的体重增加相当(如图所示)。三维空间)。HFD喂养过程中24小时摄食量的分析(图1)。3E)，在12小时的光周期或暗周期中(如图所示)。3F)，或在禁食16小时后再喂食(如图所示)。第三代)显示Lcn 2+/+和Lcn 2−/−老鼠。与这些观察相一致，我们检测到血清瘦素水平在两组间并无显着性差异。Lcn 2+/+和Lcn 2−/−老鼠(图1.3H).

缺乏Lcn 2并不能加速饮食诱导的肥胖。Lcn 2击倒Lcn 2−/−)小鼠及其野生型(Lcn 2+/+用HFD喂养20周，诱导肥胖。测量体重和食物摄入量。(a)显示PCR基因分型的典型图像Lcn 2−/−和Lcn 2+/+老鼠。(b)Lcn 2和微管蛋白在下丘脑和肝脏中的代表性免疫印迹Lcn 2+/+和Lcn 2−/−小鼠腹腔注射(100μg/kg，每日1次)，连续3周。(c)血浆Lcn 2水平Lcn 2+/+和Lcn 2−/−16周后喂HFD小鼠。(d)体重变化Lcn 2+/+和Lcn 2−/−HFD喂养小鼠(Lcn 2+/+，n=13和Lcn 2−/−，n=23)。(e)平均每只老鼠24小时的食物摄入量。在d和e中的实验在两个队列中重复(总计)。n=25 inLcn 2+/+集团和n=30英寸Lcn 2−/−)。(f)轻、暗循环食物的摄取量Lcn 2+/+和Lcn 2−/−小鼠在10~14周的HFD喂养。(g)累积食物摄取量Lcn 2+/+和Lcn 2−/−小鼠禁食15小时后再喂养1，2，4，6，8小时。(h)Lcn 2+/+和Lcn 2−/−小鼠在不同周的HFD喂养。n=每组5。(伊克)Lcn 2+/+和Lcn 2−/−喂HFD 20周后的小鼠(Lcn 2+/+，n=13和Lcn 2−/−，n=23)：(i)瘦质量，(j)脂肪团和(k高脂饲料喂养20周后体脂质量的百分比。值表示平均值±S.E.M。P用Bonferroni的多重比较测验在d或双尾学生中进行双向方差分析。t测试(c和e-k)***P < 0.001.

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接下来，我们使用双能X射线吸收仪(DEXA)扫描来确定脂肪和瘦肉的数量。Lcn 2+/+对决Lcn 2−/−老鼠。与体重的趋势一致，在身体成分上没有发现任何差异，包括瘦质量(图1)。3I)、脂肪团(图1.3J)，和百分之身体脂肪质量(图一。3K)介于Lcn 2+/+和Lcn 2−/−20周后喂HFD小鼠。这些结果表明，Lcn 2缺乏并没有增加高脂肪饮食喂养过程中的食物消耗或肥胖程度。

Lcn 2缺乏对DIO小鼠葡萄糖稳态及肝功能的影响

为了评估Lcn 2缺乏对葡萄糖稳态的影响，我们进行了葡萄糖耐量(GTT)和胰岛素耐受(ITT)试验。GTT期间葡萄糖清除率与DIO相似。Lcn 2+/+和Lcn 2−/−老鼠(图1.4A，b，ITT提示两组胰岛素敏感性无差异(图二)。4C，d)。对照组与禁食组血糖水平无显着性差异(P>0.05)。Lcn 2−/−整个研究期间的老鼠。4E，f，g)。在20周的HFD喂养研究中，血浆胰岛素水平也没有明显的差异(图一)。4H)。DIO患者血浆天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)水平相似。Lcn 2+/+和Lcn 2−/−说明Lcn 2缺乏对小鼠肝功能也无影响(图1)。4i，j).

Lcn 2缺乏不会改变DIO小鼠葡萄糖稳态或肝功能受损。Lcn 2击倒Lcn 2−/−)小鼠及其野生型(Lcn 2+/+用HFD喂养小白蚁20周，诱导肥胖。(a)糖耐量试验(GTT)，喂饲14周，和(b)GTT图曲线下面积(AUC)分析。(cHFD喂养16周后胰岛素耐受性试验(ITT)；d)ITT图的AUC分析(Lcn 2+/+, n=13和Lcn 2−/−, n=23)。(e-g在HFD喂养过程中，在指定的时间点喂食6小时和15小时的空腹血糖水平。(h)血浆胰岛素浓度Lcn 2+/+和Lcn 2−/−小鼠在指定的时间点整个HFD喂养。(i)血浆天冬氨酸转氨酶(AST)和(j丙氨酸转氨酶(ALT)在HFD喂养16周后的水平，n=12Lcn 2+/+和n=7Lcn 2−/−；备选案文n=5Lcn 2+/+和n=3Lcn 2−/−)。值表示平均值±S.E.M。P用Bonferroni的多重比较检验进行双向方差分析(a和c)或双尾学生的t试验(b和d-j)

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Lcn 2不起调节塞拉星形醇抗肥胖作用的作用。

以上分析Lcn 2+/+和Lcn 2−/−小鼠未发现HFD引起的体重增加或相关代谢紊乱。然而，Lcn 2与减少食欲和体重有关。27,29，我们的数据文件表明，赛拉星醇增加了循环中Lcn 2的水平，以及不同的组织中的Lcn 2水平。因此，我们推测Lcn 2可能在调节塞拉星形醇的厌食和抗肥胖作用中发挥作用，例如缺乏Lcn 2可以减少塞拉星形醇的厌食效应，并降低其减轻体重的能力。为了验证这一假设，我们在Lcn 2+/+和Lcn 2−/−小鼠经高脂饲料喂养20周后，每组均给予维甲酸或芹菜醇(100μg/kg，每天1次)，连续3周。正如预期的那样，赛拉星醇治疗可使体重显著降低。Lcn 2+/+相对于汽车注射的老鼠Lcn 2+/+老鼠(P < 0.001, Veh versus Cel) (Fig. 5A，b)。然而，在两个不同的队列中，Lcn 2−/−使用塞拉司醇的小鼠体重下降，类似于西兰地尔治疗后的体重下降。Lcn 2+/+老鼠(P < 0.001, Veh versus Cel) (Fig. 5A，b和补充图。1A，b)。减少食物摄入量Lcn 2+/+和Lcn 2−/−小鼠腹腔注射后也没有显着性差异(图1)。5C和补充图。1C)。此外，对瘦肉总量、脂肪质量和体脂质量百分比的分析表明，肉桂醇处理后的瘦肉质量没有改变，体脂质量也降低了。Lcn 2+/+和Lcn 2−/−老鼠(图1.5D-f和补充图。1D-f) (P < 0.001, Veh versus Cel). In parallel, leptin levels were equivalently reduced in both groups by celastrol treatment (Fig. 5G和补充图。1g).

Lcn 2不介导塞拉唑的抗肥胖作用。Lcn 2+/+和Lcn 2−/−Dio小鼠灌胃(Veh)或赛拉司洛尔(CEL，100μg/kg，每日1次)，连续3周。(a)体重和(b)体重变化百分比Lcn 2+/+和Lcn 2−/−小鼠腹腔注射(n=6车辆及n=7Lcn 2+/+小鼠；n=11辆车和n=12Lcn 2−/−老鼠)。(c)平均24小时食物摄入量Lcn 2+/+和Lcn 2−/−小鼠在第一周的芹菜醇治疗。(D-f)腹腔注射3周后，DEXA：(d)精益质量，(e)脂肪团和(f)体脂质量百分比。(g)血浆瘦素水平(ng/ml)Lcn 2+/+和Lcn 2−/−腹腔注射1周后小鼠。实验在两个独立的队列中重复。n=6车辆及n=18Lcn 2+/+组；n=11辆车和n=19Lcn 2−/−)。值表示平均值±S.E.M。P用Bonferroni的多重比较试验进行双向方差分析。*P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001, n.s. not significant (P>0.05)。

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Lcn 2缺乏症不影响塞拉前列醇对葡萄糖稳态的改善作用

芹菜醇改善DIO小鼠葡萄糖稳态的实验研究15,16..因此，我们进行了GTT和ITT，以探讨天麻醇治疗对葡萄糖稳态的改善是否受Lcn 2缺乏的影响。在治疗的第二周，GTT显示塞拉司洛尔同样能改善葡萄糖耐量。Lcn 2+/+和Lcn 2−/−老鼠(图1.6a，b，补充图。2A，b)。ITT还记录到，塞拉司特治疗后胰岛素敏感性的增加与Lcn 2+/+和Lcn 2−/−小鼠，组间差异无显着性(图二)。6C，d，补充图。2C，d)。随着糖耐量和胰岛素敏感性的提高，血糖水平显著降低。Lcn 2+/+和Lcn 2−/−芹菜醇处理的小鼠，相对于他们的车辆处理的对照(图)。6E，补充图。(e-g)治疗结束时，治疗组血浆胰岛素水平无显着性差异(P>0.05)。Lcn 2+/+和Lcn 2−/−老鼠(图1.6f，补充图。2H)。谷丙转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)水平分析表明，塞拉Lcn 2+/+和Lcn 2−/−老鼠(图1.6g，h补充图2i，o)。最后，肝组织的组织学分析显示，塞拉唑能减少两种类型的肝骨病。Lcn 2+/+和Lcn 2−/−老鼠(图1.6I).

Lcn 2缺乏症不影响谷草素对葡萄糖稳态的改善作用。Lcn 2+/+和Lcn 2−/−Dio小鼠灌胃(Veh)或赛拉司洛尔(CEL，100μg/kg，每日1次)，连续3周。(a)GTT和(b)腹腔注射1周后GTT的AUC分析。(c)ITT和(d)腹腔注射2周后ITT的AUC分析。(e治疗1周后空腹血糖6小时。(f)治疗3周后血浆胰岛素水平。等离子体(g)AST和(h)谷丙转氨酶治疗3周后ALT水平。(i)苏木精和伊红(H&E)染色Lcn 2+/+和Lcn 2−/−小鼠经腹腔注射3周后。值表示平均值±S.E.M。在a-h中的实验是在两个独立的队列中重复的(总计)。n=6车辆及n=18Lcn 2+/+组；n=11辆车和n=19Lcn 2−/−)。P用Bonferroni的多重比较试验进行双向方差分析。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, n.s. not significant (P>0.05)。

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赛拉星醇提高血浆Lcn 2水平达布/达布老鼠。精益或达布/达布小鼠每日1次，每次1次，每次10 0μg/kg。每天测量体重和食物摄入量。每组小鼠随后接受一次剂量的塞拉唑(200μg/kg，I.P.)。第四天早晨禁食前6小时。(a)体重和(b)瘦小鼠平均每只小鼠24小时食物摄入量。(c4天后瘦小鼠血浆Lcn 2水平。n=9对Veh和n=10%。(d)体重和(e)平均每只老鼠24小时的食物摄入量。DB/db老鼠。(f)血浆Lcn 2水平DB/db小鼠腹腔注射4天后。n=8两组。值表示平均值±S.E.M。P用Bonferroni的多重比较测验(a，d)和双尾学生测验(a，d)进行双向方差分析。t试验(b，c，e，f)***P < 0.001, n.s. not significant (P>0.05)。

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芹菜醇能提高乳胶素不敏感的Lcn 2水平DB/db小鼠

天麻醇对瘦弱小鼠或瘦素受体缺乏的小鼠无厌食作用或促进体重减轻。达布/达布小鼠15..为了研究Lcn 2水平与细胞反应的关系，我们治疗了Lcn 2。达布/达布小鼠腹腔注射(100 g/kg，每天一次)，连续4天，测定血浆Lcn 2水平。芹菜醇治疗没有导致明显的体重下降(图一)。7A)或减少食物摄入量(如图所示)。7b)在瘦老鼠身上。然而，与DIO模型相似的是，赛拉星醇治疗显著提高了瘦小鼠血浆中Lcn 2的水平(P < 0.001, Veh versus Cel) (Fig. 7C)。塞拉司洛尔治疗后血浆Lcn 2水平也显著升高。DB/db老鼠(P < 0.001, Veh versus Cel) in which neither body weight nor food intake was reduced by celastrol treatment (Fig. 7D-f)。的正常反应Lcn 2−/−上述结果表明，Lcn 2不参与饮食诱导肥胖的发展，也不参与其治疗作用。

试剂

丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)颜色终点检测试剂盒是从Bio Science(奥斯汀，TX)购买的。从罗氏诊断学公司获得了BM化学发光印迹底物(POD)和10X阻滞剂。(印第安纳波利斯，IN)。赛拉星尔是从中银科学公司(纽约雪莉)购买的。iScript cDNA合成试剂盒和SYBR绿色超级混合物是从Bio-Rad(大力神，CA)购买的.从圣克鲁斯生物技术公司(SantaCruz，CA)获得辣根过氧化物酶(HRP)结合抗山羊抗体。GAPDH特异性抗体(#2118)和辣根过氧化物酶(HRP)结合抗兔抗体是从细胞信号技术(贝弗利，MA)购买的。从R&D系统(明尼阿波利斯，MN)中获得Lipocalin-2/NGAL抗体(AF 1857)、相应的ELISA试剂盒(MLCN 20)和重组小鼠瘦素蛋白(Leptin)。小鼠瘦素和超敏感小鼠胰岛素ELISA试剂盒是从水晶化学公司购买的.(唐纳斯格罗夫，伊利诺伊州)。TRIzol试剂来源于Invitrogen(Carlsbad，CA)。RNeaseMinElute清理套件是从奇根(#74101，巴伦西亚，加利福尼亚州)购买的。

动物与治疗

波士顿儿童医院动物护理和使用委员会批准了本研究中进行的所有动物实验(编号：16-05-3168 R)。所有动物实验均按照机构动物保护和使用委员会(IACUC)的标准操作规程(SOP)进行。

野生型C57BL6/J小鼠(股票编号000664)，DB/db小鼠(股票编号000697)，以及Lcn 2纯合基因敲除小鼠(股票编号024630)是从杰克逊实验室购买的。小鼠杂合子Lcn 2突变(Lcn 2+/−)是由杂交雄性产生的。Lcn 2纯合敲除Lcn 2−/−)野生型雌性小鼠。野生型(Lcn 2+/+)和纯合的小分子Lcn 2−/−突变是由杂交产生的。Lcn 2+/−老鼠。

为了获得饮食诱导肥胖(Dio)小鼠，野生型c57bl6/j小鼠和Lcn 2−/−或Lcn 2+/+雄性小鼠给予高脂饮食(HFD，45千卡脂肪；猫。D 12451，研究饮食，新不伦瑞克，新泽西州)4周龄时，保持相同的饮食16-20周.八周大DB/db瘦弱的老鼠被置于正常的饮食中(NCD，来自脂肪的13.5%的卡路里；猫)。0006973，实验室饮食，圣路易斯，密苏里州)。小鼠被安置在一个12小时的暗/光循环中，暗周期从晚上7点持续到早上7点。所有老鼠[医]锂除非另有说明，否则可获得食物和水。天麻醇溶于无菌DMSO(25μg)中，在暗周期前60~90 min腹腔注射(I.P)，除非另有规定。相应的车辆组注射I.P，总体积为25 ml无菌DMSO。

采血

用肝素化毛细管从尾静脉采集血液，然后转移到冰凉的Eppendorf管中，在4°C下每分钟3000 rpm离心30 min，血浆部分转移到新的小瓶中，保存在−80°C。

骨髓分离

为检测天麻素对小鼠骨髓表达水平的影响，分别用1 0 0μg/kg灌胃给药或1 0 0μg/kg腹腔注射给DIO小鼠。第5天开始光循环后60 min，分别给药2 0 0μg/kg和2 0 0μg/kg的塞拉唑(2 0 0μg/kg)。然后禁食6小时，用25毫米针和5毫升注射器将骨髓从股骨髓腔冲洗成15毫升的冰凉pbs管。细胞经1，000 rpm离心，4°C离心10 min后，上清液被丢弃。骨髓立即冷冻于液氮中，保存于−80°C，待分析。

取小鼠骨髓，分为三个独立组。第一组用15毫升管冲洗骨髓，冷冻2h后离心。这使得我们能够在队列中完成更多的组织收集，但是骨髓的质量受到了影响。因此，我们从这个队列中排除了骨髓分析的结果。在第二组和第三组中，为了保证样品的质量，我们将骨髓冲洗成15毫升的试管，立即离心，并在上清液取出后立即用液氮冷冻样品。

人体成分测量

我们用双能X射线吸收法(DEXA；月球PIXImus2，通用月球公司，麦迪逊，美国)评估了总瘦质量、脂肪质量和体脂百分比。

葡萄糖耐量试验(GTT)和胰岛素耐受试验(ITT)

GTT小鼠禁食15h(下午5时至上午8时)，给予葡萄糖1g/kg。分别于给糖前、给糖后15、30、60、90、120 min测定血糖水平。

ITT小鼠禁食6h(上午8：00~下午2：00)。重组人胰岛素(1IU/kg)腹腔注射。分别于给药前、给药后15、30、60、90和120 min测定血糖水平。

总蛋白提取与Westernblotting

下丘脑、棕色脂肪组织、腹股沟脂肪组织、肝脏、脂肪、肌肉和骨髓在冰冷组织溶解缓冲液(25 mm Tris-HCl，pH 7.4；100 mm NaF；50 mm Na)中进行匀浆。4P2O710毫米钠3Vo410 mm EGTA；10 mm EDTA；1%NP-40；添加磷酸酶和蛋白酶抑制剂后，在4°C下，以13，400 g离心30 min，用蛋白质分析试剂盒(Bio-Rad)测定蛋白质浓度。蛋白质样品与5xLaemmli缓冲液混合，在95°C下煮5 min，然后装在十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)上。电泳后，在4°C，100 V条件下，将蛋白转移到PVDF膜上2 h，用10%阻滞剂阻断TBS-0.1%吐温-20(TBST)膜。在含10%封闭试剂的TBST中，用原抗体隔膜过夜。原代培养后，用三次TBST冲洗20 min，用10%封闭试剂在TBST中用10%阻滞剂在室温下孵育1 h。在TBST中对膜进行三次清洗后，用化学发光分析系统开发了膜，并用ImageJ(NIH)定量了膜带强度。

总RNA提取及微阵列分析

DIO小鼠适应I.P。连续注射车辆(DMSO)4天。在此驯化期后，4只DIO小鼠和4只小鼠在暗周期前4天(100 g/kg)灌胃60~90 min。注射。15h后，小鼠再注射西兰地尔(200μg/kg)。6小时后，我们提取下丘脑并将其冷冻在液氮中。在−80°C保存至RNA提取。为了提取总RNA，我们从−80°C中取出下丘脑，在每个样品中加入5 0 0 1TRIzol。组织匀浆后，按TRIzol裂解试剂的指示提取下丘脑RNA。芯片分析用RNeaseMin清除试剂盒(74104，QIAGEN)清洗提取的总RNA，芯片用1g总RNA。

cDNA的合成及定量实时PCR

DMSO驯化小鼠7天后注射(I.P.)在需要的时间使用DMSO或赛乐星。最后一次注射和禁食后6h取出下丘脑、棕色脂肪组织、腹股沟脂肪组织、肝脏、肌肉和骨髓等组织。用TRIzol裂解试剂按制造商的程序从组织中提取总RNA。利用iScriptcDNA合成试剂盒(Bio-Rad)，以1μg总RNA为原料，根据生产厂家的生产工艺，合成了互补DNA。QPCR由SYBERGreen在QuantStudio™6 Flex实时PCR系统(LifeTechnologies)上进行.比较CT法计算感兴趣基因的相对表达。RN18S作为内源对照。用于检测基因的引物如下：

Lcn 2向前：5‘-TGCCCTGAGTGTCATGTG-3’

反向：5‘-CTCTTGTAGCTCATAGGTGC-3’

RN18S：前进：5‘-AGTCCCTCTTTGTACA-3’

反向：5‘-CGATCCGAGGGCCTCACTA-3’

小鼠血浆激素及代谢物测定

Lcn 2、瘦素、胰岛素、谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的测定采用相应的ELISA或试剂盒。Lcn 2 ELISA稀释DIO小鼠血浆100倍，瘦素ELISA稀释5-10倍。用血浆5μL进行胰岛素ELISA和AST测定，用10μL进行ALT测定。

苏木精和伊红染色

分别用10 0μg/kg的维甲酸或天麻醇治疗DIO小鼠3周后，将其肝脏解剖保存于10%福尔马林磷酸盐缓冲液中。石蜡包埋肝切片H&E染色。

统计分析

所有数据均为均值±S.E.M，统计显着性采用图所示的学生t检验(双尾)或双向方差分析(Bonferroni)的多重比较检验。P低于0.05的数值被认为是显著的。队列数和n图中显示了每个实验的数值。实验结束前死亡或生病的老鼠或统计异常值(根据格鲁布的离群点测试判断)最终被排除在外。没有盲目或随机化。在前人的实验和文献基础上，未采用统计学方法预先确定样品的大小和样本量。在被比较的组中，差异是相似的。

赛拉司他是迄今为止报道的最有效的抗肥胖药物。15，减少ER应激，这是瘦素抵抗的发展和过量热量消耗时对摄食和体重的调节的一个中心机制。17,25,26..因此，了解塞拉司洛尔抗肥胖效应所涉及的网络，可以揭示治疗肥胖的主要靶点，并为肥胖治疗学的发展开辟新的途径。排除某些潜在的塞拉星形细胞的作用，也是这个实验目标的关键。

Lcn 2是一种有效的抑菌剂，在免疫系统通过与铁载体结合来控制病原体的铁耗尽策略中起着重要作用。30,31..在中枢神经系统(CNS)中，有关Lcn 2的过程，包括其产生/分泌的细胞，其对细胞增殖和死亡的潜在影响，或对神经元可塑性和行为的影响，人们对此知之甚少。32.

关于Lcn 2基因敲除小鼠模型有关肥胖和代谢稳态的表型的文献中存在着相互矛盾的结果。Lcn 2的外周表达水平，包括在血浆和脂肪组织中的表达水平，已被报道与肥胖呈正相关。33,34..严等。艾尔。还报道了Lcn 2促进离体脂肪细胞和肝细胞的胰岛素抵抗。34..与上述结果相一致，提示lcn 2缺乏对hfd诱导的肥胖和胰岛素抵抗有一定的保护作用。35..然而，Moialou等人..已报告全球删除Lcn 2增加食物摄取量及体重27，以及郭等。艾尔。建议DIOLcn 2−/−小鼠易患肥胖症和葡萄糖不耐受。29..我们在体重上没有发现Lcn 2+/+和Lcn 2−/−老鼠。我们也没有发现在葡萄糖稳态参数之间有任何差别。Lcn 2+/+和Lcn 2−/−老鼠。在不同的动物设施中，从相似的小鼠模型或相同的小鼠模型中可以看到不同的表型，即使是在同一动物设施中维持的相同的小鼠模型，也会随着时间的推移而产生不同的表型。36..无论如何，我们注意到遗传的，系统性的Lcn 2缺乏可能促进我们和其他人研究过的小鼠的代谢适应。因此，组织和/或特定于时间的删除Lcn 2在未来的研究中，对于整合关于Lcn 2功能的不同发现，可能是一种有用的辅助手段。

Lcn 2在骨髓中表达丰富，从骨髓向血浆分泌lcn 2可增加脑中mc4受体的活性，减少摄食量和体重。27..考虑到我们自己的研究结果，芹菜醇增加骨髓和血浆Lcn 2，我们推测Lcn 2可能介导了塞拉星的抗肥胖作用。Lcn 2+/+和Lcn 2−/−Dio小鼠在治疗前进食HFD达到了同样程度的肥胖，尽管敲除小鼠没有任何可检测到的Lcn 2。我们认为，如果Lcn 2是一个重要的厌食因子，那么Lcn 2缺乏在一定程度上至少可以降低塞拉星醇的食欲抑制和抗肥胖作用。然而，Lcn 2−/−Dio小鼠对芹菜醇的反应完全正常。此外，我们还发现，塞拉星醇显著提高了无反应的塞拉星l血浆中的lcn 2水平。达布/达布小鼠，其中MC4R信号保持完整。人们还预计，被认为是MC4R激动剂的lcn 2循环水平的增加将抑制DB/db老鼠在某种程度上。然而，DB/db用赛拉司特治疗的小鼠与车辆处理的对照组并无不同。因此，我们得出结论，Lcn 2不太可能对厌食和抗肥胖信号产生重大影响，也不起任何作用，尽管其在治疗后骨髓和血浆中的水平增加，但却不起任何作用。

小鼠下丘脑微阵列的原始数据可用，登录号为GSE 84156。20..所有其他数据，以支持本研究的结果，可从相应的作者要求。