丙型肝炎病毒(HCV)基因型1b的高变区1(HVR 1)的遗传变异性高于基因型3

丙型肝炎病毒(HCV)具有较高的遗传变异性，表现在宿主间和宿主内。然而，其在临床感染过程中的作用并不明显。本研究的目的是研究HCVHVR 1(高变区1)基因型1b和3在感染早期(HCV-RNA+，抗-−)献血员血浆和慢性感染患者血清中的遗传变异。测序错误被纠正，单倍型用ShoRAH软件推断。用DNA、SP和mega分析遗传多样性参数(宿主内变异数、核苷酸替换数和每个位点的多样性)。感染早期，基因型3组变异数显著低于基因型1b组(p<0.02)。基因型3慢性感染的宿主内变异数、核苷酸替换数和位点多样性均低于基因型3(p<0.0005)。此外，早期感染的特点是，与慢性感染相比，两种基因型的HVR 1变异值显著降低(p<0.04)。HVR 1变异的观察到的差异似乎代表了特定病毒基因型的固有特性。

丙型肝炎病毒(HCV)由于病毒RNA聚合酶的高误差率和宿主自身的免疫压力而具有较高的遗传变异性。因此，HCV宿主内群体表现出较高的多样性，表现为多个变异体的同时存在.通常情况下，在病毒传播到新宿主(称为传播瓶颈)后，随着患者进展到慢性，丙型肝炎病毒的多样性会扩大。1,2..在免疫压力的驱动下，宿主内群体的遗传变异使得病毒能够逃避体液免疫和细胞免疫反应，从而获得健康优势，从而导致病毒持续存在。3,4..因此，丙型肝炎病毒感染早期人群的组成和动态可能决定其结局。5,6,7,8..丙型肝炎患者之间的变异主要表现为不同基因型的存在，从1到7不等。9..尽管它们所代表的物种是相同的，但它们的基因组差异可能高达31-33%。10..有趣的是，HCV基因型是否具有不同的宿主内变异性的问题仍未解决.这在一定程度上是由于用于分析病毒多样性的方法的技术局限性，如dna异源双工凝胶移位法、单链构象多态性或大量克隆测序。11,12,13..它们对微小变异检测的敏感性较低，在大多数研究中，变异频率检测限不超过3-15%。1,14..最近，新的方法允许深入分析病毒的多样性，如单基因组或下一代测序(Ngs)。2,15..它们为评估广泛的基因变异提供了一种工具，但与克隆测序相比，却以更大的测序误差为代价。16..同时，针对NGS误差校正和变体重构，提出了一种新的计算方法。15,17.

本研究的目的是推断hvr 1(高变区1)的遗传变异性，hvr 1是包膜2糖蛋白的高度可变片段，是特异性体液免疫应答的主要靶点。18，在一个独特的血浆样本从献血者的早期血清阴性阶段的1b或3型感染(HCV-RNA阳性，抗-HCV-阴性)使用下一代测序策略。本研究还分析了来自基因型匹配、血清慢性感染患者的样本。我们的研究表明，HCV基因型3在早期急慢性感染中表现出明显低于基因型1的HVR 1遗传变异。

共获得388202HVR 1序列，早期感染阴性者4006.8例(平均每个样本)，慢性感染患者3595.7例(平均每个样本)。对于基因型1b和基因型3的样本，在早期(4060.0)获得了相似的读取次数(测序深度)。VS3947.2)和慢性感染(3217.3)VS4033.7).

这些读取被进一步纠正错误，并重建成单倍型使用ShoRAH。在早期感染患者中，每个样本检出1~31种变异(基因型1b为3~31，基因型3为1~16)，慢性感染患者为5~114(基因型1b为5~114，基因型3为5~39)。在实施0.5%的重组变异后，早期感染患者(1b基因型1~14，基因型3 1~10)和慢性感染患者(基因型1b 5~36，基因型3 1~21)每样本保留1~14个变异。因此，基因型3感染患者的核苷酸变异数明显低于1b基因型感染者，两者均为早期(3.5)。VS5.9；p=0.002)和慢性(8.5)VS19.5；p<0.0001)感染。1)。同样，与一致序列相比，基因型3的群体内核苷酸替换数显著减少(7.0)。VS17.7 p=0.02)和慢性(13.9)VS43.8，p=0.0004)感染。同样，慢性基因型3的π位点核苷酸多样性显著低于1b基因型(0.0318)。VS0.0701；p<0.0001)。早期感染基因型3也较低，但差异无统计学意义(0.0184)。VS0.0439；p=0.053)。总结的结果在图中以图形形式呈现。1.

在应用0.5%(虚线棒)和1%(普通条)频率截断后，早期和慢性感染患者HVR 1、HCV变异体的核苷酸变异参数分别为1b型和3型。(A)HVR 1核苷酸变异数，(B)核苷酸替换数，(C)每个位点的核苷酸多样性。各部分所示的参数(B,C)根据一致序列(样本中最具代表性的序列)进行计算。横条上的数字代表p值.

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在早期和慢性感染比较中，1b型和3型HCV变异数、替换数和核苷酸多样性程度均显著高于后者(p<0.04)。

为了验证观测到的影响是否是由低频错误变量引起的，我们在将截止值提高到1%后，重新评估了这些变异参数。早期和慢性感染的变异数均有所减少，但差异仍有统计学意义(P=0.0 1，P<0.0 1，P<0.0 1)。1)。与慢性基因型1b感染相比，慢性基因型3的替换数和核苷酸多样性程度仍显著低于慢性基因型1b(p=0.0004和p<0.0001)。在早期3型感染的情况下，这些参数也较低，但无统计学意义(p=0.08和p=0.16)。

对宿主内群体的比较表明，基因型3 hvr 1的显性变异(即最频繁)的频率贡献率高于基因型1b(平均为84.9%)。VS早期感染占72.4%，p=0.004和62.2%。VS慢性感染占33.3%，P=0.0003)。图中给出了0.5%截止率下1b型和3型感染主要变异体的频率分布。2.

两种HCVHVR 1变异株在早期感染1b型中的平均频率(A)和基因型3(B)和1b基因型慢性感染(C)和基因型3(D)。每个变异的频率由Shorah套件的Lucture决定，并从高到低排列。其次，计算每个病人的两个最高频率变量(蓝色和橙色)和其余“其他”变体(灰色)的平均值。截止频率为0.5%。

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我们的研究旨在深入研究丙型肝炎病毒1b和3基因型的宿主内遗传变异，这两种基因型都发生在血清转换前的早期感染阶段，反映了在没有体液压力的情况下病毒的自然复杂性，以及一组血清呈阳性的慢性感染患者。从HCVRNA阳性、抗-HCV阴性供者那里获取样本，为研究早期病毒相关事件提供了一个独特的机会。这些样本代表了非常早期的感染阶段，每百万捐款中就有18.5个样本被检测到。19.

我们发现，在早期感染中，感染基因型3的人的HVR 1变异数明显低于1b基因型的患者。重要的是，观察到的效果与阅读次数和病毒滴度无关。此外，在0.5%和1%两种不同断口下的分析结果是一致的。HCV基因型1b和3 hvr 1的检测差异是显著的，据我们所知，以前的研究没有讨论过这个问题。

为了确定hvr 1变异是否受到血清学反应的影响，对一组血清呈阳性的慢性感染患者进行了类似的比较。由于这两种基因型之间的差异仍然存在，因此在整个感染过程中，3型HVR 1的进化动力学似乎低于基因型1b。然而，慢性感染的hvr 1变异参数明显高于早期感染，这与早期发现的瓶颈效应是一致的，因为只有一些丙型肝炎病毒变异体有选择性传播。2,8,13..随后，宿主内种群逐渐扩大，最终会受到环境压力或病毒的健身成本的影响。1,20.

重要的是，在早期和慢性基因型3感染中，变异体的宿主内频率结构与基因型1b不同，主要(即最常见)变异体的频率贡献较高。这意味着基因型3形成较小频率变异的能力较低，在环境压力下，如免疫系统或治疗所施加的压力下，可以提供健身优势。可以推测，这就是为什么3型感染的特点是对干扰素和利巴韦林的免疫调节治疗有更好的反应。21..HVR 1基因变异的差异也可能对感染的自然过程有临床意义。一些观察表明，虽然3基因型是导致大多数社区获得性hcv感染的原因，但在感染的早期阶段，其慢性感染的可能性比其他基因型(尤其是1b)要低。19,22..黄氏研究等人67个急性输血后丙型肝炎患者中，1b基因型患者比其他基因型患者更容易发生慢性肝炎(89.7%比64.3%；p=0.019)。23..同样，Amoroso等人..结果显示，丙型肝炎病毒1b基因型患者的慢性进展率为92%，而暴露于基因型3的患者为50%。6..这些数据证明HCV基因型可能在HCV暴露后的临床感染过程中起着重要作用。我们在血清阴性早期观察到的3型基因型的较低的遗传变异可能与病毒自发消除的机会更高有关，因为免疫系统可能更有效地针对“一致”病毒群体。3.

虽然NGS是评价遗传多样性的一个非常有用的工具，但它很容易出现测序错误。因此，我们以hvr 1质粒插入为模板，对整个过程中固有的原始测序误差进行了广泛的评估。24，采用后续纠错和频率截止。重要的是，在两个不同的断口(0.5%和1%)观察到了这种差异。

值得注意的是，虽然我们发现基因型1b和基因型3之间存在明显的差异，但这些观察仅限于免疫重要的单个和小的基因组区域，而不可能扩展到hvr 2和hvr 3等其他高变区。25..值得注意的是，新的高变区HVR 495和HVR 575在基因型3中存在，而在1a、1b、2a或6a基因型中不存在。26..由于它们也是阳性的免疫选择，因此需要进一步的研究来确定它们在早期和慢性感染中的变异特征。

结论：基因型3组HVR 1基因变异参数低于1b基因型组。考虑到这些差异可以观察到急慢性感染，这一现象似乎不是由于免疫压力，而是可能代表一个特定的病毒基因型的固有特性。

病人

本研究涵盖了60名献血者在献血时发现的HCVRNA阳性和抗-HCV阴性的血浆样本。由于他们在3-6个月前采集的样本中HCVRNA和抗-HCV均为阴性，因此他们被认为是最近才被感染的。重要的是，上次献血后1b型和3型感染献血者的HCV-RNA和抗-HCV阴性的时间相同(中位数为3个月，p=0.838)。这些样本是在1999-2013年作为波兰献血中心和血液学研究所进行的献血者常规筛查的一部分进行的。

本文还对华沙传染病医院的41例HCVRNA阳性、抗-HCV阳性治疗、1b、3基因型慢性丙型肝炎患者的血浆标本进行了分析。虽然感染的确切时间尚不清楚，但从最初诊断出HCV感染的时间相似(1b基因型的平均3.9年)VS3基因型3年)。

该研究议定书遵循了2013年“赫尔辛基宣言”的道德准则，并得到华沙医科大学生物伦理委员会的批准(核准号为KB/17/2013和KB/107/2010)。所有患者均提供书面知情同意。研究对象的一些临床和病毒学特征见表。1.

HVR 1扩增

如上文所述，进行了HVR 1扩增。27..简单地说，用改进的硫氰酸胍-苯酚/氯酚法(LifeTechnologies，Carlsbad，CA，USA)从2 5 0μ1的血浆中提取总RNA。用AccuScript高Fidelity逆转录酶(Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA)和随机检测者(Life Technologies)，在37°C下进行RNA逆转录30分钟。利用FastStart高Fidelity Taq dna聚合酶(美国印第安纳波利斯罗氏)，利用目标特异性引物，在两步PCR中扩增出包含hvr 1的基因片段(表)。2)。此外，第二轮PCR中使用的引物含有gs初级测序平台和标准的10核苷酸多重标识符所识别的标记。27.

焦测序

相当于3×10的DNA量7用GS初级钛emPCR Lib-A试剂盒(454生命科学，美国，布兰福德)对扩增产物进行乳液PCR。焦测序是根据制造商的使用GS初级系统的放大器协议(454生命科学)进行的。

数据分析

测序错误(错配、插入和删除)得到纠正，并通过ShoRAH软件的diri_sampler程序推断出单倍型(https://www1.ethz.ch/bsse/cbg/software/shorah)17..它采用了一种基于概率聚类算法的局部重建模型来修正误差。28..这是通过对所有重叠于基因组长度大致相等于读取长度的区域的所有读取进行聚类来实现的。每个簇的一致序列表示获得错误读取的原始单倍型。ShoRAH的特征不是一个生成模型来校正indels，而是依赖于序列对齐。每个读取与引用对齐，并从这组成对齐构建多个对齐。如果给定的模型在足够数量的读取中存在(即，如果模型将其识别为真实的变化而不是排序错误)，则它将出现在一个或多个单倍型中。

在我们先前的研究中，克隆衍生的扩增和焦测序的原始错误率为1.5%(以最常见的错误变体的频率来衡量)。24..然而，ShoRAH的误差修正将此误差降低到0.5%，因此在我们的分析中实现了这一截止。然而，为了验证我们的结果，我们用1%的截止时间重复了分析。

用LStructure提取后验概率>95%且至少有10条读码的单倍型。https：/github.com/ozagordi/LocalVariants/blob/master/src/LStrucre.py)。随后，将单倍型与HCV参考序列(基因型1b的GenBank登录号AJ 406073和基因型3的EF 442261.1)进行比对，并修剪成相同的长度。29..用dna SP版本5评估了遗传多样性参数(即变异体的内部数目、核苷酸替换数和每个位点π的核苷酸多样性)。http://www.ub.edu/dnasp/)30和mega 5.029.

统计分析

以Kolmogorov-Smirnov正态性检验为基础，采用未配对T检验或Mann-Whitney U检验，对HVR 1序列多样性和临床资料(ALT、病毒载量)差异的显着性进行检验。采用Fisher‘s精确试验检测HCV基因型间性别分布的差异。当P值<0.05时，所有p值均为二尾值。

所有HVR 1序列都可以在Zenodo存储库(https://doi.org/10.5281/zenodo.3266795).