非天然单糖研究表明Esrb O-GlcNAcylation对小鼠胚胎干细胞的多能性有调节作用 - ELISA试剂盒,酶免试剂盒,酶联免疫吸附试验, ELISA实验,ELISA,双抗体夹心法,科研蛋白,抗体,细胞系,武汉新启迪生物科技有限公司

非天然单糖研究表明Esrb O-GlcNAcylation对小鼠胚胎干细胞的多能性有调节作用

摘要

非天然单糖，如叠氮糖，可以代谢结合到细胞糖，目前是一个主要的工具，糖成像和糖苷蛋白组分析。作为提高细胞膜透性和细胞吸收的一种常见做法，非天然糖是每-O-乙酰化，然而，它可以引起一个长期被忽视的副反应，非酶S-糖基化.在此，我们开发了1，3-二酯化。N-叠氮乙酰半乳糖胺(GalNAz)作为代谢性糖聚糖标记的新一代化学报告。都是1，3-di-O-乙酰化GalNAz(1，3-ac)2)和1，3-di-O-丙酰化GalNAz(1，3-Pr)2GalNAz(GalNAz)无人工S-糖基化反应，对蛋白O-GlcN酰化有较高的标记效率.应用1，3-Pr2在小鼠胚胎干细胞(MESCs)中，我们发现Esrb是一种重要的多能转录因子，是一种O-GlcNAcylated蛋白。我们证明EsrbO-GlcNAcylation对mESC的自我更新和多能性是重要的.机械地说，Esrb是由O-GlcNAc转移酶在丝氨酸25上的O-GlcNAcylated，稳定Esrb，促进其转录活性，并促进其与两个主要多能调节因子OCT 4和NANOG的相互作用。

导言

摘要自90年代末代谢糖聚糖标记(MGL)技术发展以来，它已成为一种广泛应用的标记活细胞内糖聚糖的方法。1,2,3..非天然单糖或非天然糖-含有生物正交官能团的单糖类似物(如叠氮化物或炔烷)-被注射到被细胞吸收的培养基中，在培养基中被糖基生物合成酶所接受，从而代谢成细胞糖聚糖。随后的生物正交反应，如Cu(I)催化的叠氮炔环加成反应(CuAAC或Click化学)。4,5，用于选择性地将标记的糖聚糖与所需的探针结合。MGL的一个关键设计原则是对各自的非天然单糖的糖基生物合成途径的耐受性，这些途径现在包括叠氮或/和炔基类似物。N-乙酰甘露醇(ManNAc)，岩藻糖，N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)，以及N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。值得注意的是，这些不自然的单糖通常是按-O-乙酰化形式，以改善细胞膜通透性和细胞摄取。一旦进入牢房，每个人-O-乙酰化的非天然糖可能被胞浆酯酶水解，释放出不受保护的非天然糖以进行代谢结合。6,7.

最近，我们发现大部分人-O-乙酰化单糖及其叠氮/炔基类似物可通过非酶S-糖基化反应与胞内各种蛋白质的半胱氨酸(Cys)残基发生非特异性反应。8..这种被忽视了20年的人工化学反应，可能会干扰糖蛋白组学的分析，例如，在O-连接的GlcNAc修饰蛋白的蛋白质组学鉴定中产生假阳性。通过O-GlcNAc转移酶和O-GlcNAcase两种酶的动态调节，O-GlcN酰化以β-O连接的GlcNAc单糖调节细胞内各种蛋白的特定丝氨酸或苏氨酸残基，调节许多重要的生物学过程，如转录和应激反应。9,10..每-O-乙酰化GalNAz(AC)4(GalNAz)和PER-O-乙酰化6-叠氮-6-脱氧-GlcNAz(ac36 AzGlcNc)是两位目前使用的O-GlcNAc记者；11,12它们都可以非特异性地S-糖基化各种细胞内蛋白，包括一些已鉴定的O-GlcNAcylated蛋白。8..应该注意的是-O-乙酰化单糖类似物具有不同的S-糖基化反应活性.例如，ac36 AzGlcNAc在细胞裂解物中的S-糖基化标记比其他几种方法(如ac)要弱得多。4加尔纳兹8..相应地，siRNA敲除了AC中的OGT。36 AzGlcNAc处理的细胞导致大部分标记丢失。13..然而，即使是轻微的非特异性S-糖基化，也可能干扰O-GlcNAcylated蛋白的蛋白质组学鉴定，特别是当修饰位点未被确定时。虽然赤裸或不受保护的单糖类似物，如N-叠氮乙酰半乳糖胺(GalNAz)，可以避免S-糖基化，它们需要在毫升范围内使用高浓度的药物。7,8.

在此，我们报告了下一代非天然单糖的发展，这些单糖可以被高效的细胞吸收，更重要的是，它不会诱导人工的S-糖基化。以GalNAz为测试例，合成和评价了一系列由乙酸或丙酸保护的不同数量羟基的部分酯化的GalNAz。其中，1，3-di-O-丙酰-N-叠氮乙酰半乳糖胺(1，3-Pr)2具有最高的标记效率和特异性。应用1，3-Pr2Galnz用于探讨小鼠胚胎干细胞(MESCs)中多能转录因子的O-GlcN酰化，我们发现Esrb是建立自我更新和多能性的关键转录因子。14，O-GlcNAcylated在Ser 25.ESRB O-GlcN酰化增强了ESRB与OCT 4的蛋白稳定性和结合能力，O-GlcN酰化增强了两种主要的多能调节因子NANOG。此外，在Esrrb上的O-GlcN酰化促进了其转录活性.Esrb O-GlcNAc的消融在细胞培养和小鼠畸胎瘤形成过程中都会损害其维持mESC自我更新和多能的功能。因此，本工作中开发的下一代非天然糖为探索O-GlcNAc生物学提供了一个改进的MGL平台。

结果

部分保护GalNAz的设计与综合

考虑到这一点-O-乙酰化GalNAz(AC)4(GalNAz)可以与Cys进行非酶反应，但GalNAz不存在这种非特异性的S-糖基化。8，我们想知道四个人O乙酰基对S-糖基化有不同贡献。如果是这样的话，一种理想的非天然糖将被部分保护，使导致S-糖基化的乙酰基移除，从而提高细胞膜的通透性，同时避免人工S-糖基化(图1)。1A).

为了测试我们的设计，我们化学合成了3，4，6-三-O-乙酰基-N-叠氮乙酰半乳糖胺(3，4，6-ac)3加纳兹化合物1)15，1，3，6-三-O-乙酰基-N-叠氮乙酰半乳糖胺(1，3，6-ac)3加纳兹化合物2)，1，3-di-O-乙酰基-N-叠氮乙酰半乳糖胺(1，3-ac)2加纳兹化合物3)，以及1，3-di-O-丙酰-N-叠氮乙酰半乳糖胺(1，3-Pr)2加纳兹化合物4)总收率分别为78%、17.9%、26.9%和29.1%。1B和补充说明1)。值得注意的是，具有较长烷基链的丙酰基被用于4进一步提高疏水性，提高膜透性。从3-羟基到4-和6-羟基的酰基迁移3和4在D2核磁共振波谱法(附图)1)。观察到轻微的乙酰迁移3从4小时开始。没有检测到4在长达48小时的时间里，与以前的研究一致，大量的酰基有较少的迁移倾向。16,17.

1，3-二酯化GalNAz的高效率和特异性

为检测人工S-糖基化作用，将HeLa细胞裂解物与单个非天然单糖共同孵育.用炔-Cy3键标记法和凝胶荧光扫描法检测叠氮糖与蛋白质的直接和非酶促反应。2A-d和补充图。2)。作为两个对照，ac4GalNAz在各种蛋白质上均有Cy3标记，而GalNAz可忽略不计的标记。与1-O-去除乙酰基，1对HeLa细胞裂解物的反应性比ac高得多。4GalNAz，表明失活氧的脱乙酰化促进了S-糖基化(图1).2A)。通过将三个乙酰基转变成1-，3-和6-羟基，2细胞裂解物的标记率低得多，但可以检测到(如图所示)。2B)。标记1, 2，和AC4用碘乙酰胺预处理裂解物，阻断半胱氨酸残基，完全消除GalNAz，证实Cys残基发生S-糖基化(附图)。3)。在保护1-羟基的同时减少一个乙酰基，3细胞裂解物中没有S-糖基化。2C)。重要的是，1-和3-羟基被更大的丙酰基保护，4未与HeLa细胞裂解物发生反应。2C)。对HEK293T细胞的裂解物也有类似的结果(附图)。4)。此外，3也不4与ac反应的纯化蛋白反应4加尔纳兹和1(无花果)二维空间和补充图。5)。此外，5毫米谷胱甘肽不与所有的叠氮糖发生反应，只是最具反应性的。1与谷胱甘肽有轻微的反应性(补充图)。6)。在细胞内谷胱甘肽浓度为1~10 mm的情况下18Cys S-糖基化可能与活性Cys残基周围的蛋白质微环境有关.综合起来，这些结果表明，1，3-酯化的GalNAz，3和4，不诱导非特异性S-糖基化。他们被称为ac2GalNAz和Pr2在下面的作品中。

接下来我们评估了ac的代谢标记效率。2GalNAz和Pr2加尔纳兹。用Ac培养HeLa细胞2加尔纳兹省2GalNAz或GalNAz在不同浓度下作用48h，然后与炔-Cy5进行单击反应，用凝胶荧光扫描法对细胞裂解物进行分析。双交流2GalNAz和Pr2GalNAz比GalNAz具有更高的掺入效率。2E)。用1mm GalNAz标记HeLa细胞可以合理有效地鉴定O-GlcN酰化蛋白和修饰位点。8..以此作为参考，200μM ac2GalNAz展示了类似的标记，Pr2在低至20μM的浓度下，GalNAz的标记强度相同(附图)。7A)。提高Pr浓度2在50~500μM范围内，Galnz以浓度依赖性的方式显著增加了Pr的掺入量，而且Pr的代谢参入量也显著增加。2GalNAz的孵化时间与时间有关(附图)。7b)。此外，Pr的比较2在HEK293T、CHO、Neuro-2a、HT 1080、SH-SY5Y、NCI-H 1299、A 549、NIH/3T3和MCF-7细胞中进行了GalNAz与GalNAz的比较。8)。在所有被检测的细胞系中，Pr2GalNAz显示出更高的标记效率，改进的倍数以细胞类型依赖的方式变化。

在细胞中，GalNAz进入GalNAz救助通路，形成Udp-GalNAz，并与udp-glcnz相互转化。11..因此，ac2加尔纳兹省2GalNAz和GalNAz应该同时标记O-GlcNAc和细胞表面的糖聚糖.过乙酰化2-乙酰胺-2-脱氧-5-硫代-D-葡萄糖(Ac)对OGT的抑制作用45 SGlcNAc)19Ac处理的HeLa细胞2加尔纳兹省2GalNAz或GalNAz导致叠氮化物标签的部分丢失，支持三种非天然糖可以同时标记O-GlcNAc和细胞表面糖聚糖(补充图)。9).

非天然单糖的细胞毒性

用不同浓度的HeLa细胞处理48h，评价了5种叠氮糖的细胞毒性。2F)。未观察到对ac有明显的细胞毒性。4浓度高达200μM，而μM AC为500μM。4GalNAz导致细胞活力急剧下降。根据S-糖基化反应活性，1表现出更严重的细胞毒性。为加尔纳兹，AC2GalNAz和Pr2GalNAz，浓度不超过1mm时，无细胞毒性或极小的细胞毒性。在HEK293T、CHO、Neuro-2a、HT 1080、SH-SY5Y、NCI-H 1299、A 549、NIH/3T3和MCF-7细胞中也有类似的结果(附图)。10)。这些结果表明，新开发的非天然单糖，ac。2GalNAz和Pr2GalNAz没有细胞毒性。此外，非天然单糖的细胞毒性似乎与人工S-糖基化有关。

O-GlcNAc位点的特异性和大规模鉴定

应用化学蛋白组学协议进行O-GlcN酰化分析8,20，我们对ac处理的HeLa细胞中的O-GlcNAc位点进行了大规模的鉴定。2GalNAz或Pr2GalNAz(附图)11)。采用含有酸解连接剂(烷炔-AC-生物素)的炔生物素标记，富集叠氮修饰肽，用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)进行电子转移离解(ETD)分析。在经200μM ac处理的HeLa细胞中，共鉴定出206个O-GlcNAc位点和4个S-糖基化位点。2GalNAz(图1.2G，补充图。12和补充数据1–3)。用Pr标记细胞2在100μM，AC的一半2GalNAz浓度，已鉴定出699个O-GlcNAc位点和10个S-糖基化位点(图).2G，补充图。13和补充数据4–6)。如先前报告所述8在1mM GalNAz处理的HeLa细胞中鉴定出312个O-GlcNAc位点和19个S-GlcNAc位点.在312个O-GlcNAc网站中，87%的网站被覆盖。2加纳兹识别名单。此外，宿主细胞因子1(HCF 1)的Cys 1139是以前在HEK细胞中发现的一个S-GlcNAc位点。21，也被Pr确认。2加尔纳兹。这些结果证明了Pr2GalNAz对O-GlcNAc的代谢标记具有极高的效率，不诱导人工的S-糖基化.

Pr揭示mESCs中Esrb O-GlcN酰化2加尔纳兹

我们下一次申请公关2目的：研究小鼠胚胎干细胞(MESCs)中的O-GlcN酰化反应.胚胎干细胞来源于囊胚的内部细胞团，是一种多能细胞，可以无限期地自我更新，分化为身体的所有细胞类型，因此具有很大的再生医学潜力。22,23..新出现的证据表明，O-GlcNAc对ESC的维护非常重要.奥格特基因敲除对小鼠胚胎是致命的，OGT对干细胞的存活和体细胞的存活是必不可少的。24,25..在mESCs中全面阻断O-GlcN酰化阻碍自我更新，而增加O-GlcNAc水平则抑制分化。26,27,28,29,30..mESC多能性的维持受转录因子(TF)网络的调控，该网络以三个主TFs(OCT 4、SOX 2和NANOG(OSN)为中心)。31,32..在mESCs中，OCT 4和SOX 2都是O-GlcNAcylated的。27,33,34..Oc-GlcN酰化调节其转录活性，从而促进多能性的维持。27..相反，SOX 2上的O-GlcN酰化能抑制多能性。34..网络的辅助Tf，如Esrrb、KLF 2、KLF 4和TBX 3，对于多能性也很重要。35..考虑到在HeLa细胞中发现OGT的广泛蛋白底物，我们想知道mESCs中的辅助性TFs是否也可以被O-GlcNAc修饰。

为了验证这一假设，mESCs与pr共同孵育。2GalNAz反应48h，与炔-PEG反应。4生物素，用链霉亲和素珠捕获。免疫印迹分析显示Esrrb明显富集，表明Esrb被O-GlcNAz修饰。3A)。进一步验证PR2GalNAz标记结果表明，mESC裂解物经突变半乳糖基转移酶(Y298LGalT 1)处理后，能识别包括O-GlcNAc在内的末端GlcNAc，并使用udp-galnz连接GalNAz结构。36..用炔聚乙二醇点击标记4生物素，随后链霉亲和素珠下拉，证实O-GlcNAc修饰内源性Esrb(图1。3B)。用可分辨质量标记O-GlcNAc定量测定Esrb的O-GlcN酰化化学计量比37，炔功能化聚乙烯缩水甘油2000(烷炔-聚乙二醇)2kD)，其改性率约为52%(如图所示)。3C)。此外，还使用了一种基于flim-fret的成像方法。38在HeLa细胞中原位观察到Esrrb上的O-GlcN酰化反应(附图)。14)。此外，HEK293T细胞高表达标志-Esrrb和EGFP-OGT的裂解物与一种抗标志抗体共同免疫共沉淀。在共免疫共沉淀中检测到EGFP-OGT，表明OGT与Esrb直接结合。三维空间)。这些结果表明Esrrb是mESCs中真正的O-GlcNAcylated蛋白.

为了鉴定Esrb的O-GlcNAc修饰位点，表达并纯化了带有他标记的Esrb。大肠杆菌 (大肠杆菌)共同表达39..LC-MS/MS对纯化的Esrb进行ETD片段分析，鉴定氨基酸16~30(IKTEPSSPSSGIDAL)为O-GlcN酰化肽。修改站点被映射到Ser 24或Ser 25(图25)。3E)。值得注意的是，小鼠的Esrb Ser 24和Ser 25在大鼠和人中保存得很好(补充图1)。15)。为了进一步确定确切的位置，Esrb突变体，EsrbS24A埃斯尔布S25A，和EsrrbS24AS25A表达并纯化。用O-GlcNAc特异性抗体rl2免疫印迹检测到野生型Esrb的O-GlcN酰化，有趣的是，在Esrb上有较强的O-GlcNAc信号。S24A(无花果)3F)。此外，RL2的结合被1M GlcNAc所竞争。埃斯尔布S25A和埃斯尔布S24AS25A显示极小的RL2绑定，表明Ser 25是Esrb的一个主要的O-GlcNAc修改站点.对Esrrb的O-GlcN酰化的重大损失S25A在HEK293T细胞中通过两种独立的O-GlcNAc检测方法Pr进一步验证。2GalNAz标记和Y298L基于GalT 1的化学酶标记(图)。3G，h)。为确定Esrb在mESCs中的O-GlcN酰化位点，mESCs稳定表达标志-Esrb和标志-EsrbS25A产生外源EsrbmRNA和蛋白表达水平为内源水平的1-2倍(补充图)。16)。用化学酶标记法测定，标志-EsrrbS25A标记强度明显低于标志-Esrrb，表明Esrb Ser 25在mESCs中是O-GlcNAcylated的。3I).

O-GlcNAc调节Esrb的稳定性和活性

考虑到O-GlcNAc能稳定许多蛋白质13,40,41，我们首先测试Esrb的表达水平是否受O-GlcN酰化的调控.定量RT-PCR(qRT-PCR)显示，ac对OGT有抑制作用。45 SGlcNAc不改变Esrrb的mRNA水平。17)。在稳定表达标志-Esrb的mESCs中，环己酰亚胺(CHX)阻断了蛋白质的合成，免疫印迹分析表明，OGT抑制能显著加速Esrb的蛋白质降解。4A)。此外，标志-EsrrbS25A稳定表达的mESCs比标志-Esrrb降解速度快。4B)。通过瞬时表达EGFP-Esrrb和EGFP-Esrrb，观察到了类似的结果。S25A在HEK293T细胞中含有相同数量的质粒。4C)。此外，Esrrb的加速退化S25A与泛素化增加有关(补充图)。18)。这些结果表明EsrrbO-GlcN酰化增强了蛋白质的稳定性.

在mESCs中，Esrrb可直接与oct 4和nnog结合，在调节它们的转录活性和维持自我更新中起着重要的作用。42,43..因此，我们询问Esrb O-GlcN酰化是否会影响其与OCT 4和NANOG的相互作用。稳定表达旗标的mESCs-Esrb和旗标-EsrbS25A用抗旗标抗体溶解、免疫沉淀，免疫印迹法检测共沉淀的内源性oct 4和nnog，表明oct 4和nnog与esrb的结合明显减少。S25A比野生型Esrrb(图1.4D)。共同表达的EGFP-Esrrb/EGFP-Esrrb也检测到了类似的结果。S25A带有标志-OCT 4或标志-NANOG在HEK293T细胞中(如图所示)。4E，f)。为了进一步验证O-GlcNAc对这些蛋白质相互作用的调节作用，OGA抑制剂Thiamet-G提高了HEK293T细胞中的O-GlcNAc水平。44..共免疫印迹分析显示，OCT 4和NANOG与Esrrb的结合明显增强。4G，h).

O-GlcN酰化发生在Esrb的AF-1结构域，赋予基本的反式激活。45,46..因此，我们研究了Esrrb O-GlcN酰化是否会改变Esrrb的转录活性.在HEK293T细胞中共转染了等量的Esrb反应元件驱动的荧光素酶和标志-Esrb质粒。Ac对OGT的抑制作用45如荧光素酶分析所示，ESRB的转录活性受到明显抑制。4I)。此外，Esrb的S25A突变体的转录活性降低(见图)。4J)。此外，还对稳定表达标志-Esrb的mESCs进行了RNA序列分析。威汤哥和旗帜-EsrrbS25A显示37个差异表达基因，其中25个先前被确认为Esrb靶基因。47(补充图。19和补充数据7)。这些结果表明，Esrb上的Ser 25 O-GlcN酰化调控其蛋白稳定性、与OCT 4和NANOG的相互作用及其转录活性。

Esrb O-GlcN酰化增强mESC多能性

在TF网络中，Esrrb对于保持mESCs的多能性非常重要。Esrb是NANOG和GSK 3信号通路的靶点。在含血清但不含白血病抑制因子(Lif)的培养条件下，esrrb的本构性过表达可使表皮干细胞(EpiSCs)恢复到esc样状态，并维持mesrb的自我更新和多能性。47,48..为了研究o-glcnac是否在此背景下调节Esrb功能，mESCs稳定地表达标志-esrb和标志-esrb。S25A在无LIF的血清中维持6天和9天，碱性磷酸酶(AP)染色检测未分化状态。5A和补充图。20a，b)。与以前的结果一致47野生型Esrrb的过度表达促进了AP阳性集落的形成，其中包括未分化的和混合的菌落。相反，EsrrbS25A导致未分化和混合菌落明显减少。此外，在Esrrb中，AP阳性集落的比例S25A-mESCs表达下降最快至9d，高于表达WT Esrrb的mESCs(补充图)。20C)。因此，mESC标记基因的表达水平包括10月4日, 纳诺和Rext 1表达Esrrb的细胞下降更快S25A在去除培养液中的LIF后，比WT Esrb表达细胞强(附图)。21).

当植入免疫缺陷宿主时，具有自我更新能力和多能性的ESCs可以分化为畸胎瘤，一种由所有三个生殖细胞层组成的肿瘤样形成。22,49..因此，我们测试了EsrbO-GlcN酰化是否影响免疫缺陷小鼠mESCs形成畸胎瘤的潜能.稳定表达标志-Esrrb的mESCs植入S25A与稳定表达标志-Esrb的mESCs形成的畸胎瘤相比，其体积明显缩小(见图)。c.和补充图。22)。此外，表达WT或S25A Esrb的mESCs产生的肿瘤具有相似的生殖层，包括外胚层、中胚层和内胚层(附图)。23)。这些结果提示EsrrbO-GlcN酰化在畸胎瘤形成过程中对mESCs的增殖和自我更新具有调节作用.

讨论

鉴于可点击的非天然单糖在细胞糖基化成像和分析方面的广泛应用，每-O-乙酰化诱导的非特异性S-糖基化引起了人们的担忧，在以前的研究中，一些假阳性可能被忽略了。O-乙酰化糖。虽然人工S-糖基化的程度及其可能引起的干扰程度可能因地制宜，但改善非天然糖化记者以避免人工S-糖基化是非常有价值的。在本研究中，我们根据部分的假设，开发了新一代的mgl非天然单糖。O-酯化可避免S-糖基化，同时保持足够的膜透性.

我们证明了O酯化是开发下一代非天然糖的一种令人满意的保护策略，对MGL不需要人工S-糖基化.两个部分保护的GalNAz，1，3-ac2和1，3-Pr2与无保护作用的GalNAz相比，GalNAz的标记效率明显提高。特别是，1，3-Pr2GalNAz利用烷基链较长的保护基团丙酰基来弥补保护基团数量的损失，具有极好的代谢标记效率。丙酰基的另一个好处是酰基从3-羟基迁移到4-和6-羟基的倾向较低。由于移民3-O-乙酰基，1，3-ac2Galnz可以自发地转化为含有1，3-ac的混合物。2GalNAz，1，4-ac2和1，6-ac2加纳兹在培养基中。这种转化可能不会显著影响标记的特异性和效率。尽管如此，1，3-Pr2GalNAz是一个更好的优化下一代非天然糖为MGL.

应该注意的是O-乙酰化GalNAz，3，4，6-ac3Galnz对cys有较高的反应活性，表明在ac的失活氧处脱乙酰基化。4GalNAz是非酶的S-糖基化所必需的，可能是一个限速步骤.此外，1，3，6-ac3GalNAz有轻微的S-糖基化，表明O酯化是完全消除副作用的关键。

3，4，6-ac3GalNAz诱导了严重的细胞毒性，Ac4高浓度的GalNAZ具有中度毒性。这些结果提出了S-糖基化可能是细胞死亡的原因之一。为支持这一假设，GalNAz，ac2GalNAz和Pr2无S-糖基化的GalNAz不具有细胞毒性。有趣的是，各种酯化的己糖胺分子已经被评估为抗癌活性。50,51,52,53,54..与我们的结果一致，3，4，6-三-O丁酰化ManNAz对肿瘤细胞转移的抑制作用最强。50..我们的结果值得在细胞死亡途径和抗癌药物发现的背景下，进一步研究可被S-糖基化靶向的关键Cys残基。

作为MGL使用pr的展示2GalNAz，我们鉴定了Esrrb在mESCs中是一种O-GlcNAc修饰蛋白.多功能tfs形成一个相互连接的网络，它涉及到各种蛋白-蛋白质相互作用和与相邻dna位点的协同结合。55..已发现OGT可以修饰同一蛋白质复合物的多个组分。13..OGlcNAc通过将TFs定位于网络层面来调节mESC的多能性，这一假设很有吸引力。除了之前确定的mESCs中的几个O-GlcNAcylated TFs之外，还包括OCT 4和SOX 2。27,34，我们的工作增加了Esrrb的名单，支持这一假设。

而O-GlcN酰化则增强了OCT 4的活性，抑制了SOX 2的活性。27,34我们发现O-GlcN酰化通过介导蛋白质的稳定性来调节Esrb的功能。在Ser 25处，Esrb O-GlcN酰化抑制泛素化，从而增强蛋白质的稳定性.此外，O-GlcN酰化也显著增强了Esrb与OCT 4和NANOG的结合.值得注意的是，以前有报道说Esrb通过其dna结合域与nnog结合。42..Ser 25 O-GlcN酰化位于AF-1结构域.Esrb O-GlcNAc可能通过调节蛋白质稳定性或/和构象而影响Esrb与NANOG之间的相互作用。通过稳定Esrrb，促进其与主多能TFs的相互作用，并促进其转录活性，O-GlcNAc增强了Esrb在维持mESC多能性和自我更新方面的活性。给出了关于O-GlcN酰化稳定修饰蛋白和蛋白质复合物形成的例子。13因此，研究O-GlcN酰化增强蛋白质稳定性是否是mESCs中多能TF网络的一种通用机制是很有意义的。

据报道，O-GlcNAc与磷酸化相互作用。56,57..ESRRA和ESRRG是雌激素相关受体家族的两个成员。58,59,60..例如，ESRRA的Ser 19磷酸化在Lys 14调控其转录活性和SUMO化。58,59..虽然Esrrb中相应的Ser和Lys残基位于Ser 25附近，但在靠近O-GlcNAc位点的地方并没有发现磷酸化位点。61..研究EsrbO-GlcN酰化是否与其他翻译后修饰有串扰是很有趣的。

O-GlcNAc正在成为ESC多能性和自我更新的关键调控者。转录调控是调节ESC状态的最关键机制。55..O-GlcNAc的最佳研究功能之一是通过修饰tfs来调节转录，而tfs在多种癌细胞中已经被研究过。9..干细胞中O-GlcNAc功能的研究尚处于起步阶段.对TFs进行O-GlcN酰化似乎是详细研究的合理选择。在这项工作中开发的下一代非天然单糖应该在干细胞以及其他细胞类型和生物体中得到广泛的应用。最后，1，3-二酯化策略可以很容易地应用于开发基于其他非天然糖的下一代化学报告，例如mannas，用于探索其他类型的糖基化。

方法

化合物合成

化合物的合成2, 3，和4见补充说明1在补充资料中。

细胞培养

R1小鼠胚胎干细胞(MESCs)在0.1%明胶(Sigma-Aldrich)包被细胞培养盘(Invitrogen)上生长。细胞在敲除中培养。TMDMEM(吉布科)添加15%FBS(HyClone)、1×非必需氨基酸(吉布CO)、1×GlutaMAXTM(GIBCO)、1000 U/mL白血病抑制因子(LIF)、100μM2-巯基乙醇(Sigma-Aldrich)、100 U/mL青霉素和100μg/mL链霉素(吉布科)。mESCs与0.1%胰蛋白酶(吉布科)分离，每3天传代1：15。R1mESCs由清华大学陈叶光教授提供。Hek 293 FT细胞由同济大学秦申教授提供。HEK 293FT，HeLa(ATCC®CCL-2)，CHO(ATCC®CCL-61)，Neuro-2a(ATCC®CCL-131)，HT-1080(ATCC®CCL-121)，SH-SY5Y(ATCC®CRL-2266)，NCI-H1299(ATCC®CRL-5803)，A549(ATCC®CCL-185)，NIH/3T3(ATCC®CRL-1658)，MCF-7(ATCC®HTB-22)，HEK293T(ATCC®CRL-11268)cells were obtained from American Type Culture Collection and cultured in DMEM(Gibco)supplemented with 10%FBS(Gibco)，100 U/mL penicillin，和100μg/mL链霉素(吉布CO)。所有实验细胞均在20代以内，无支原体污染。

质粒与转染

全长度奈诺用前引物5‘-CCCAAGTACTTATGATGGGGGTCCTGG-3’和反向引物5‘-GGTACCTATATACCTGGGGGGTCAC-3’，将r1 mESC cDNA亚克隆到p3xFLAG-CMV-10中。10月4日用前引物5‘-GGAATTCAATGCTGGACACCTGGC-3’和反向引物5‘-GGTACCTCATGAATGATGCATGGGAGC-3’，将r1 mESC cDNA亚克隆入p3xFLAG-CMV-10中。埃斯尔布从r1 mESC cDNA中亚克隆入p3xFLAG-CMV-10或pEGFP-C1，前引物5‘-CGATTCAATGCTGCTGAACCATGTC-3’和反向引物5‘-CGGGATCCTCACCTTGCCTCCA-3’；奥格特插入pEGFP-N1，前引物5‘-ACGCGGACGGATGCGTCTCCGTGGG-3’和反向引物5‘-CGGGATCCTTATGCTGACTCATGACTCAACAT-3’；全长埃斯尔布用前引物5‘-CGGGATCCATCTGCTGAACCGAATGTC-3’和反向引物5‘-CGATCTCACACACCTTGCCTCCA-3’，将r1 mESC cDNA亚克隆到PET-28a(+)中。埃斯尔布S24A用前引物5‘-GGAGCATCCAGCCCGGCCTCGGGCAT-3’和反向引物5‘-CCGCTGGATGCTCCGTCTTGATGA-3’插入PET-28a(+)。埃斯尔布S25A在pET-28a(+)或pEGFP-C1上插入前引物5‘-GCCATCCCCGGCCGCGGCATTGA-3’和反向引物5‘-CGGGGCTGGCTCCGTCTTGA-3’；埃斯尔布S24AS25A用前引物5‘-GCCATCCAGCCCGGCGGGCATTGA-3’和反向引物5‘-CGGGGCTGGCTCCGTCTTGA-3’插入PET-28a(+)。旗-Esrrb用正向引物5′-GGAATTCATGGACTACAAAGACGATGACGACAAGATGTCGTCCGAAGACAGGC-3′和反向引物5‘-CGGGATCCCCCCGCCTCCAGCATC-3’，将r1 mESC cDNA亚克隆入pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP中。旗-EsrrbS25A亚克隆自pEGFP-EsrrbS25A将pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP与前引物5‘-GCATCCACCCCGCGGGCATTGA-3’和反向引物5‘-CGGGGCTGA TGA-3’结合。本研究使用VigoFect(VigoFect)技术对所有质粒进行了翻译，这些质粒都是根据制造商的指示进行的。ESRB反应元件驱动荧光素酶报告质粒(11569ES03)是从Yeasen生物技术公司购买的。

抗体、试剂和设备

Antibodies included anti-ESRRB(Abclonal，A13977，1:500)，anti-DDDDK-tag(MBL，M185-3，1:5，000)，anti-GFP(Abcam，ab183734，1:5，000)，anti-HIS(CST，12698，1:3，000)，anti-RL2(Abcam，ab2739，1:1，000)，anti-OGT(Abcam，ab177941，1:2，000)，anti-HA(CST，3724，1:3，000)，anti-GAPDH-HRP(Sigma-Aldrich，G9295，1:10，000)，anti-streptavidin-HRP(Beyotime，A0303，1:3，000)，抗小鼠IgG-HRP(ABCAM，ab97023，1：5000)，抗兔IgG-HRP(ABCAM，ab6721，1：5000).免疫共沉淀的抗体结合磁珠为抗DDK标记(标志标记)mAb-磁性珠(MBL，M 185-11)和抗GFP-mAb-磁珠(MBL，D 153-11).炔聚乙二醇2KD(目录编号699802)，MG-132(目录编号：699802)。M 7449)和CHX(目录编号01810)是从西格玛获得的。炔聚乙二醇4生物素(目录编号)(A 105)，炔-Cy5(目录编号。(A 116)，炔-Cy3(目录号)。和烷炔-塔姆拉(目录编号：A 117)。TA 108)是从Click化学工具购买的。单糖来源于碳合成，三氟乙酸来源于Acros有机化合物，其他用于合成的化合物来自J&K科学公司。复配1，合成了2-[4-{(bis[(1-tert-butyl-1H-1，2，3-triazol-4-yl)methyl]amino)methyl}-1H-1，2，3-triazol-1-yl]acetic酸(Bta)和酸解生物素标记(炔-AC-生物素)。8,20,62..在LC-MS/MS分析中，从J&K科学公司购买二硫苏糖醇(DTT)，从Sigma-Aldrich购买碘代乙酰胺，从Promega购买测序级改性胰蛋白酶和胰蛋白酶再悬浮缓冲液。所有有机溶剂均作为分析级或以上。采用WATEERACQUITY型UPLC I类Sqd 2质谱计进行电喷雾电离(ESI)检测.1核磁共振，13在Bruker-500 MHz核磁共振仪上记录了CNMR、COSY、HSQC和HMBC谱。复配9用高效液相色谱法(Xbridge Prep C 18，5m，OBD 30×25 mm柱)进一步纯化。在傅里叶变换离子回旋共振质谱仪(APEX IV)上记录了高分辨质谱(HRMS).用ChemiDoc XRS+(Bio-Rad)和Tanon-5200Multi(Tanon)对SDS-PAGE凝胶和Westernblotting膜进行了成像。

细胞活力测定

每孔板含100 L的细胞约2 0 0 0个，在96孔上培养一夜，用不同浓度的载体或指示的非天然糖处理48h，每井加入10微升2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2，4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium，单钠盐(WST-8，增强型细胞计数试剂盒-8，Beyotime，C 0042)，在37°C下进一步孵育1 h，测定4 5 0nm的吸光度，并将其归一化到载体处理的细胞中。

人工半胱氨酸反应的体外测定

在37°C条件下，用不同浓度的非天然糖在37°C下孵育50 L裂解液(PBS中浓度为2mg/mL，pH 7.4)2h，再加入150 L甲醇、37.5L氯仿和100 L米利-Q水沉淀。离心(18，000 g，5 min)，去除水相，加入100 L甲醇。用1 mg/mL CFL 1、GAPDH或PRDX 1与纯化蛋白反应，在37°C下用1mm指示的非天然糖孵育2h，然后加入150 L甲醇、37.5 L三氯甲烷和100 L Milli-Q水，离心，去除水相，加入100 L甲醇。用离心法除去甲醇，再用50 L 0.4%SDS-PBS(wt/vol)进行凝胶内荧光扫描。预先阻断HeLa细胞裂解液中Cys-糖基化反应(pBS为2mg/mL，pH 7.4)，加入碘代乙酰胺(终浓度为25 mm)，37℃孵育1h，与细胞裂解液进行体外反应，进行凝胶荧光扫描。为分析纯化后的CFL 1与不同非天然糖探针的反应，在ACQUITY UPLCⅠ类Sqd 2 MS光谱仪上，采用16 min梯度(5%~90%乙腈，0.4 mL/min)，在BEH 300 C4活性柱(1.7μm，2.1×10 0mm)上对该反应体系进行了检测。为分析谷胱甘肽反应，将50 L谷胱甘肽(PBS为5mm，pH 7.4)与不同浓度的非天然糖在37°C下孵育48h，然后用500 L甲醇稀释，然后在ACQUITY UPLC I-类Sqd_2 MS上用6 min梯度(5~95%乙腈，0.3 mL/min)进行分析。

活细胞代谢标记

用不同浓度的非天然糖处理6孔板或15 cm培养皿的30%汇合处的细胞48h，用胰蛋白酶消化，用PBS洗涤3次。用冷RIPA缓冲液[1%NOINIDT P-40(vol/vol)，1%去氧胆酸钠(wt/vol)，150 mm NaCl，0.1%SDS(wt/vol)，50 mm三乙醇胺，无EDTA蛋白酶抑制剂混合物(Pierce)，pH 7.4]再悬浮于细胞内，用超声波溶解，4°C下离心10 min，去除碎屑，用BCA蛋白分析试剂盒(猪皮尔斯)调整蛋白浓度为2mg/mL。分别用6孔板和15 cm板的溶出物悬浮液进行凝胶内荧光扫描或富集O-GlcN酰化蛋白和珠上消化。在HeLa细胞中进行OGT抑制剂处理实验，将30%汇合在6孔板上的细胞与50μM ac共处理。45用不同浓度的SGlcNAc和不同浓度的非天然糖类标记48h，按上述方法采集，用于凝胶荧光扫描。

O-GlcNAcylated蛋白的化学酶标记

用RIPA缓冲液溶解6孔板或15 cm培养皿中的细胞，再悬浮于含有1%SDS(wt/vol)的20 mm Hepes缓冲液(pH7.9)中，终浓度为1mg/mL。100 L裂解液中，按顺序添加24.5 L米利-Q水，40 L标记缓冲液[125 mm NaCl，5%NOINIDT P-40(体积/体积)，50 mm Hepes，pH 7.9]，5.5L 100 mm MnCl。2，5L 500μM UDP-GalNAz，3.75L Y289L GalT1。阴性对照组省略Y289LGalT 1。混合物在4°C下轻轻旋转20h，并按上述方法沉淀蛋白质。蛋白在含有1%SDS(wt/vol)的50 L 50 mM Tris-HCl(pH8.0)中重新悬浮，进行凝胶荧光扫描。对O-GlcNAc蛋白的富集，以2mL 1mg/mL裂解物为起始物质，1mL为2mg/mL蛋白悬浮液，进行O-GlcNAcylated蛋白的富集和珠上消化。

凝胶荧光扫描

为观察体外反应样品，将上述50μL悬浮液与50 M CUSO共同孵育。4-BTTAA预混复合体(CUSO)4-BTTAA，摩尔比1：2)，100μM炔-Cy3，2.5mm新鲜抗坏血酸钠，37°C下单击反应2h，代谢标记样品用50μM CUSO孵育50μL悬浮液。4-BTTAA预混复合体(CUSO)4-BTTAA，摩尔比1：2)，100μM炔-Cy5，2.5mm新鲜抗坏血酸钠，在室温下进行点击反应2h，用50μM CuSO孵育50 L酶标液悬浮液，测定内源Esrb的O-GlcNAc化学计量比。4-BTTAA预混复合体(CUSO)4-BTTAA，摩尔比1：2)，100μ正炔-聚乙二醇2KD用2.5mm新鲜抗坏血酸钠37°C作用3h，再沉淀蛋白，再用30 L SDS负载缓冲液悬浮蛋白。样品经10%SDS/PAGE层析后，用Fla 9500台风成象。然后用考马斯亮蓝(CBB)染色或免疫印迹显示相同的负载量。

O-GlcNAcylated蛋白的富集及珠上消化

1，3-ac2GalNAz或1，3-Pr2GALNAz修饰肽、1mL代谢标记悬浮液与100 mm2烷烃-AC-生物素、BTTAA-CUSO共孵育。4混合物(50 MCuSO)4库索4-BTTAA 1：2(摩尔比为1：2)和2.5mm新制得的抗坏血酸钠在室温下沉淀2h，在−80°C下用10 mL甲醇沉淀。沉淀剂离心(4°C，4200 g，15 min)，用10 mL冰冷甲醇洗涤两次，再悬浮于含1.2%SDS(wt/vol)的1mL PBS(pH7.4)中。用1 mL PBS(pH7.4)洗涤100μL链霉亲和素微球3次，再悬浮于5 mL PBS(pH7.4)中，转至蛋白溶液中。得到的混合物在RT.下温和旋转孵育4h。然后用PBS(pH7.4)洗涤5次，用Milli-Q水洗5次。在PBS中加入500 L 6 M尿素，再加入25 L 200 mm DTT(65°C，15 min)和25 L 400 mm碘乙酰胺(35°C，30 min)。在PBS中用200 L~2M尿素、4μg/L胰蛋白酶(在胰蛋白酶再悬浮缓冲液中为0.5mg/L)和2L_(100 Mm)CaCl作缓冲液2加入后的混合物在37℃下孵育16h，然后进行酸裂解和LC-MS/MS分析。

为了检测Esrb O-GlcN酰化反应，将代谢标记或化学酶标记的1mL悬浮液与100 M异炔-聚乙二醇孵育。4-生物素，BTTAA-CUSO4混合物(50 MCuSO)4库索4-BTTAA 1：2(摩尔比为1：2)和2.5mm新制得的抗坏血酸钠在室温下沉淀2h，在−80°C下用10 mL甲醇沉淀。将沉淀剂离心(4°C，4200 g，15 min)，用10 mL冰冷甲醇洗涤两次，再悬浮于1 mL缓冲液A[4%SDS(wt/vol)和10 mm EDTA]和B[1%Brij 97(wt/vol)，150 mm NaCl和50 mm三乙醇胺(TEA)，pH 7.4]中，A：B=1：8，加入100 L链霉亲和素包被琼脂糖(Thermo Fisher Science，20353)，在RT.温和旋转4h。用2%SDS(wt/vol，pH7.4)、8M尿素(250 mm碳酸铵(ABC)、2.5M NaCl(pH7.4)、PBS(pH7.4)和Milli-Q水3次洗涤。琼脂糖微球用50 L SDS负载缓冲液重新悬浮，用10%SDS/PAGE溶解，免疫印迹法检测。

酸解

用PBS(pH7.4)和Milli-Q水冲洗5次，用200 L~2%甲酸(体积/体积)在水中裂解2次，旋转平缓，共2 h。收集上清液，在真空离心机中蒸发，再进行LC-MS/MS分析。

LC-MS/MS分析

所有的MS数据都是在OrbitRAP Elite质谱仪(Thermo Fisher Science)上获得的，它配备了4mC18散体材料(InnoSepBio)填充加载柱(100 m×2cm)、C18毛细管分离柱(75m×15 cm)和Easy-NLC 1000系统(Thermo Fisher Science)。用于映射1，3-ac2GalNAz或1，3-Pr2GalNAz修饰肽，在水中以0.1%甲酸(体积/体积)重组合，载于预柱上，用7-35%B洗脱柱分离，分离后120 min，用乙腈(体积/体积)中的0.1%甲酸(体积/体积)，乙腈(体积/体积)中的0.1%甲酸(体积/体积)进行分离，再进行ETD-LC-MS/MS分析。该仪器在FT模式下以60，000的分辨率进行全质量扫描(300-1，700 m/z)，然后对前10位最强烈的前体进行ETD MS/MS扫描(2+、3+或更高电荷)。ETD活化时间为150 ms。使电荷状态依赖时间、ETD的补充激活和动态排斥成为可能。

数据处理

瑞士港智人数据库和[医]肌肉数据库从UniProt下载(www.uniprot.org)2016年11月4日。1，3-ac2GalNAz或1，3-Pr2GALNAz修改后的肽，Etd原始数据文件被用MaxQuant进行数据库搜索。63软件套件(1.5.8.2版)与Andromeda搜索引擎集成。默认参数按报告的方式设置。8,20..简单地说，选择了仙女座评分≥40和δ评分≥8的修饰肽。在位点识别中，定位评分为≥0.75的光谱为高置信度位点.然后，位于膜蛋白或分泌蛋白胞外结构域的O-HexNAc位点被排除在O-GlcNAc位点列表之外。

Esrb和OGT在大肠杆菌中的重组表达大肠杆菌

表达载体pUCBAD-mbp-ogt和pet-28a(+)-esrb分别在大肠杆菌用0.5%阿拉伯糖(wt/vol)或/和0.5 mm IPTG(25°C)在摇瓶中诱导BL 21(DE3)(Transgen)和OGT或/和Esrrb的重组表达。39.

定量RT-PCR分析

用TRIzol提取mESCs R1总RNATM试剂(ThermoFisher Science，15596026)和1μgRNA是用PrimeScript进行反转录的。TMRT试剂盒用gDNA橡皮擦(Takara，RR047A)，然后用PowerUp SYBR Green(Thermo Fisher Science)进行定量PCR分析。本研究使用的引物如下：GAPDH(前引物5‘-TCACCATGGAAGGCCG-3’和反向引物5‘-TCTTCTGGGGGGGGGGGGGGC-3’)，埃斯尔布(前引物5‘-GGCTCGTCGACGCCAG-3’和反向引物5‘-GTACTCGCATTGATGCGGGGGTCC-3’)，10月4日(前引物，5‘-TCCTCTGACTGTCCGA-3’和反向引物，5‘-GAACGCCCAGGTGAGC-3’)，奈诺(前引物5‘-GCGCTGTTCTCTCAGGCC-3’和反向引物5‘-ACTCACTGTGCTGAGCCCT-3’)和Rext 1(前引物5‘-GACAGGCAGAAAGGGCC-3’和反向引物5‘-CCTCAGGAGGGCATCTTCCTC-3’)。

Esrb O-GlcN酰化位点的鉴定

Esrrb大肠杆菌OGT和Esrrb在10%SDS/PAGE上共同表达，用CBB染色。取Esrb带，用Milli-Q水冲洗，用50 mm ABC+乙腈混合液(体积比为1：1)处理30 min，再用乙腈脱水，在50 mm ABC中用10 mm DTT再水化45 min，56°C下用55 mm碘乙酰胺在50 mm ABC中处理45 min，黑暗中用55 mm碘乙酰胺处理45 min，再在乙腈中脱水。凝胶切片用糜蛋白酶(2ng/μL)消化，37℃下孵育16h，在含5%TFA的50%乙腈中洗脱两次，每次200μL，在真空离心机中蒸发。样品采用ETD破碎模式，用OrbitRAP精英质谱仪(ThermoFisher Science)对样品进行了检测。数据用203.079373 Da的HexNAc修改的Mascot软件(MatrixScience 2.3.02版)进行处理，并手工评估修改位点。

Flim-fret成像

之前曾描述过O-GlcN酰化在特定蛋白质上的细胞成像。38，并适应于这项工作。EGFP-Esrrb和1mm GalNAz转染48h后，HeLa细胞被洗涤、固定和渗透，然后用点击标记法进行Flim-fret成像。在TCS SP8X扫描共焦显微镜(Leica)上进行Flim-fret成像。用TCSPC软件(SymPhoTime 64软件，PicoQuant GmbH)获取荧光寿命的图像和分布直方图。

ChX治疗

约1×105每口井的mESCs被镀在6井上，隔夜培养，用dmso或ac预处理。45 sglcnac作用48h，与50μmchx共处理8h，检测标志-esrb蛋白降解情况。威汤哥和旗帜-EsrrbS25A，约1×105将mesc每井镀在一个6孔上，培养36h，与50μmchx共孵育12 h，检测egfp-esrb蛋白的降解情况。威汤哥和EGFP-EsrrbS25A，约4×105每孔HEK293T细胞被镀在6孔上，隔夜培养，用VigoFect转染相应的质粒，然后去除培养基，加入含50μM CHX的新鲜培养基12 h。

共沉淀试验

质粒转染后，用蔗糖-np 40缓冲液(250 mm蔗糖，150 mm NaCl，5 mm MgCl)溶解细胞。20.5%NOINIDT P-40(vol/vol)、10 mm NaF、1 mm DTT、1 mm PMSF和蛋白酶抑制剂混合物(PEAS)、25 mm Tris-HCl、pH7.5]超声处理，4°C离心10 min，4°C离心10 min，用BCA蛋白分析试剂盒(猪)测定蛋白质浓度。为检测ESRB在HEK293T细胞中的泛素化及ESRB与NANOG或OCT 4的相互作用，采用5 0 L GFP-磁珠(MBL，D 153-11)在4°C温和旋转2h，培养细胞裂解液1mL 3mg/mL。为检测OGT与Esrb在HEK293T细胞中的相互作用，并验证ESRB与NANOG或OCT 4在mESCs中的相互作用，采用5 0 L标记磁珠(MBL，M 185-11)在4°C条件下温和旋转培养1 mL3mg/mL细胞裂解物。然后用ip洗涤缓冲液[10%甘油(体积/体积)，150 mm NaCl，5mm MgCl]洗涤珠子。2，0.1%NONIDT P-40(vol/vol)，1mm DTT，0.2mm PMSF，25 mm Tris-HCl，pH 7.5]5次，用30 L SDS负载缓冲液重新悬浮。反应样品用10%SDS/PAGE分析，免疫印迹法检测。

表达Esrrb的mESCs的构建威汤哥或者EsrbS25A

对慢病毒的包装和加工，将pCDH-ef1-标志-esrrb的10g质粒转染HEK 293 FT细胞。威汤哥-T2A-copGFP(或pCDH-EF1-旗标-Esrrb)S25A-T2A-copGFP)，8g PAX 2质粒和4g MD.2G质粒在10 cm细胞培养盘中培养至60%左右。细胞培养72 h后进行过滤和收集，再加入香菇多糖(Lenti-X)。TM浓缩器(Clontech，631231)是根据制造商的指示提取慢病毒的。所得样品在pH7.4的PBS中溶解，当细胞生长到30%左右时，加入R1mESCs的细胞培养中。培养24h后，转化为新鲜R1细胞培养基。细胞培养两代，然后用流式细胞仪分选表达Esrb的mESCs。威汤哥或者EsrbS25A具有相同的GFP荧光强度。

荧光素酶分析

约2×105每孔板接种HEK293T细胞12孔，隔夜培养。在荧光素酶抑制实验中，HEK293T细胞共转染1μg Esrb反应元件驱动的荧光素酶质粒和1μg pCDH-EF1标志-Esrb-T2A-copgfp，分别与dmso或50μm ac共转染。45 SGlcNAc作用48h，用于荧光素酶活性检测。对wt和s25aEsrrb中荧光素酶的检测，HEK293T细胞共转染1μg Esrb反应元件驱动的荧光素酶质粒和1μg pCDH-EF1标志-Esrrb。威汤哥-T2A-CopGFP(或pCDH-EF1-旗标-Esrrb)S25A-T2A-copGFP(-T2A-copGFP)分析48h。用荧光素酶报告基因检测试剂盒(Yeasen BioTechnology，11401ES60)检测荧光素酶活性。

RNA测序与生物信息学

用TRIzol试剂提取总RNA。测序库是根据制造商的建议使用NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina(NEB)生成的。对Illumina HiSeq X 10进行测序。使用HISat v2.1.0对测序所得数据与小鼠基因组进行比对。64，该索引由MM 10基因组和GENCODE上的注释文件构建。得到的SAM对齐文件进行了质量过滤(-Q10)，转换为BAM格式，并使用Samtools v1.3进行排序。65..然后由PicardTools v1.140删除重复读取(http://picard.sourceforge.net)。与外显子对齐的读取用功能计数v1.6.3计数。66，用DESeq 2 v1.20.0进行了差分分析。67生物导体。

AP染色法

如报告所述47，简单地说，大约有500 mESCs表达mock，esrrb。威汤哥或者EsrbS25A将六孔板分别镀24 h，去除培养基，用PBS洗涤两次，加入不含LIF的新鲜培养基6d或9d，当培养基变黄后，及时刷新。根据AP染色进行菌落分析，采用StemgentAP染色试剂盒II(Stemgent，00-0055)。

裸鼠畸胎瘤的形成

约2×106表达Esrrb的mESCs威汤哥或者EsrbS25A分别于8周免疫缺陷裸鼠(生命河实验动物中心)两侧注射2周。然后对小鼠进行安乐死，并称重畸胎瘤。所有动物实验均经北京大学动物保护与利用机构委员会批准。

HE染色

畸胎瘤用4%多聚甲醛在4°C固定24h后，在PBS(pH7.4)中转储到30%(w/v)蔗糖中。组织被嵌入O.C.T.化合物(Sakura Finetek USA Inc.)并于10μm处切取显微冷冻仪(LeicaCM，1950)。组织切片用苏木精和伊红试剂盒(Beyotime，C 0105)染色，在倒置显微镜(Leica DMI 4000 B)上用数码显微镜(Leica DFC 420 C)拍摄数码光镜图像。

统计

两组比较采用双尾t检验进行计算。P价值。为了在多组间进行比较，采用单向ANOVAs和TUKEHSD后计算器进行比较。误差条代表平均±S.D。

报告摘要

有关研究设计的进一步资料，可参阅自然研究报告摘要链接到这篇文章。

数据可用性

rna测序的原始数据可在基因表达总括数据库中获得，登录号为GSE 131246..我们研究中的原始质谱数据可通过带有标识符PXD 015035的ProteomeXange获得[http：/Proteomecentry al.Proteomexchange e.org/CGI/GetDataset？id=PXD 015035]。图中的原始数据。2a-f，3A-d，3我-我，4阿杰，5A，c，以及补充图。2, 3, 4, 5一个,7a，b，8, 9, 10, 14b，16b、c、17, 18, 20c，21在源数据文件中可用。在本研究过程中产生或分析的所有其他数据，在合理的要求下，都可以从相应的作者那里获得。