植物受体样激酶的偶联膜S-酰化可能是偶然的，不一定会影响功能 - ELISA试剂盒,酶免试剂盒,酶联免疫吸附试验, ELISA实验,ELISA,双抗体夹心法,科研蛋白,抗体,细胞系,武汉新启迪生物科技有限公司

植物受体样激酶的偶联膜S-酰化可能是偶然的，不一定会影响功能

摘要

S-酰化是一种常见的膜蛋白半胱氨酸残基翻译后修饰，具有多种调节作用.与跨膜结构域相邻的S-酰基化在文献中被描述为影响多种蛋白质性质，包括周转、转运和微区分配。然而，所有这些数据都来自哺乳动物和酵母系统。在这里，我们研究植物病原体跨膜区附近的S-酰化作用，感受到受体样激酶FLS 2。令人惊讶的是，FLS 2在跨膜结构域附近的S酰化并不是FLS 2转运或信号传递功能所必需的。将这一分析扩展到更广泛的植物受体样激酶家族，我们发现在受体样激酶结构域附近的S酰化是常见的，影响到约25%的拟南芥受体样激酶，但通过进化在同源物之间的保守性较差。提示该位点受体样激酶的S-酰化可能是偶然突变导致半胱氨酸发生的结果。由于跨膜结构域和半胱氨酸残基是S-酰化发生的常见结构域，而且许多S-酰基转移酶的底物特异性较弱，我们认为一旦偶然突变在该位点引入半胱氨酸，许多受体样激酶就会发生S-酰化。有趣的是，一些类似受体的激酶在同系物之间显示了S-酰基化位点的保守性，这表明S-酰基化已经发挥了一定的作用，并在进化过程中得到了积极的选择。最显着的例子是在ERECTA类家族中，ERECTA在所有ERECTA同系物中都会发生S-酰基化，而在亲本ERECTA类CLADE中则不发生。这表明ERECTA在被子植物进化过程中出现时发生了ERECTA的S-酰化，可能是ERECTA类蛋白对ERECTA新功能化的贡献。

导言

S-酰化是一种翻译后的蛋白质修饰，脂肪酸，如棕榈酸或硬脂酸，通过硫代酯键与特定的半胱氨酸共价连接。没有描述S-酰化的一致序列，也没有描述css-Palm等预测软件的输出。1离可接受的可靠还有一段路要走。然而，出现了一个结构基序：跨膜结构域细胞质表面的半胱氨酸。在哺乳动物系统中，半胱氨酸残基在单程受体样部分跨膜结构域附近的S-酰化似乎是一个共同的特征，对蛋白质的功能很重要。旁侧跨膜S-酰化已被证明能影响Toll样受体(Toll样受体，TLR 2)向质膜的转运，从而调节T细胞信号。2..炭疽毒素受体TEM 8的s-酰化使其在质膜上与其同源的E3泛素连接酶cbl分离，从而控制TEM 8内吞，并靶向溶酶体。3..LRP 6参与Wnt信号通路，要求跨膜(juxta-tm)半胱氨酸的S-酰化。4..S-酰化诱导LRP 6跨膜的倾斜，防止疏水氨基酸在内质网转运过程中暴露于水环境中。缺乏s-酰基化的lrp 6由于疏水失配而被内质网的质量控制机制所认可，并且是以泛素介导的降解为目标的。4..我们最近从拟南芥中鉴定出许多蛋白质是通过蛋白质组学筛选得到的S-酰化的。5..包括在这组S酰化蛋白是受体样激酶(RLK)超家族的成员。受体样激酶与哺乳动物的单程受体样蛋白(如TLR 2)有关。6在哺乳动物中，受体样激酶的S-酰化被认为是以类似于单程跨膜蛋白的方式发挥作用的。然而，鉴于植物和动物之间的进化距离和膜组成的差异，不应假定跨膜区S-酰化在植物和动物王国中具有相同的作用。

RLK是拟南芥中最大的基因家族之一，约有440个成员。6它们在各种植物过程中的作用都有很好的特点。这包括通过油菜素甾体激素受体bri 1及其辅助受体bak 1的植物生长和发育。7，并通过ERECTA控制器官的形成和细胞的命运。8..其他的rlk，如feronia和erulus，是由油菜素甾体介导的细胞增殖以及花粉和根毛伸长所必需的。9,10..此外，细胞壁相关激酶(Waks)与细胞壁相互作用，是植物发育过程中细胞扩张所必需的。11..RLK还通过调节ABA和渗透胁迫信号的RPK 1和控制ABA-和H的GHR 1参与非生物应激反应。2O2-保护细胞中受调控的阴离子通道。rlk超家族的其他成员参与植物-微生物相互作用：xa 21来自稻谷是第一个RLK在植物中的特征，并参与细菌的病原体抗性。12..其他特征良好的受体，FLS 213和EFR14发现细菌衍生肽鞭毛素和伸长因子-Tu，而CERK 1和LYK 4参与几丁质真菌诱导子的识别。15..虽然对RLK超家族成员了解甚多，但对S-酰基化在RLK功能中的具体作用知之甚少。

根据原始蛋白质组学筛选得到的数据，我们在模型中确定了共济-tm S-酰基化位点。拟南芥RLK FLS 25..这些数据随后通过正交代谢标记策略得到验证，即FLS 2的S-酰化作用在这些位点上是毫无疑问的。16..这两项研究都表明，这些半胱氨酸的突变可以消除S-酰化，我们描述了它们的突变对AtFLS 2介导的过程的轻微影响。5..然而，这项工作是与mGFP 6标记版本的AtFLS 2表达的35S启动子。从那以后，我们确定了许多标签，当附加到AtFLS 2后，会对atfls 2函数产生不可预测的影响，在pmdc向量序列中，mGFP 6会产生不可预测的影响。17用于对AtFLS 2函数特别有害18..其中一些效应显然可以通过剂量补偿来掩盖。18比如在我们最初的研究中使用35s启动子5..因此，我们决定更深入地回顾我们先前的工作，使用表示接近本地水平的无标记形式的AtFLS 2，以准确地衡量共济会-TM-S-酰化对AtFLS 2功能的作用和贡献。

结果

AtFLS 2功能不需要偶联跨膜结构域S-酰化

在AtFLS 2 C中，我们曾提出AtFLS 2跨膜(juxta-TM)S-酰化的缺失。830,831S突变体在100-300 x正常水平下表达为c端mGfp 6融合，对鞭毛素信号输出有轻微的负面影响。5..我们已经确定，当atfls 2在生理水平上表达时，表位融合，特别是mGFP 6，可能对atflf 2的功能产生有害和不可预测的影响，这使这些数据的生物学相关性受到质疑。18..以确定AtFLS 2和AtFLS 2 C之间是否观察到AtFLS 2函数的细微差异830,831smgfp 6标记线是我们生成的真品。FLS 2/proAtFLS 2：AtFLS 218和FLS 2/proAtFLS 2：AtFLS 2 C830,831S显示相似AtFLS 2和AtFLS 2 C的品系和选定的植物830,831S蛋白表达水平(补充图)1A)。继flg 22后，AtFLS 2与其辅助受体BAK 1异二聚体形成一个活跃的信号复合体。这种信号复合体启动复杂的细胞内信号级联，以促进植物免疫。MAPK激活是fg 22感知之后最早可检测到的信号事件之一。19..经过FIG 22治疗后，FLS 2/AtFLS 2PRO*AtFLS 2和FLS 2/AtFLS 2：AtFLS 2 C830,831S植物系MAPK 6/3的激活与Col-0无明显差异，而FLS 2未见MAPK 6/3激活。1A)。MAPK依赖基因(NHL 10，WRKY 40)在Col-0中同样被激活，FLS 2/AtFLS 2PRO*AtFLS 2和FLS 2/AtFLS 2：AtFLS 2 C830,831S植物系(图1.1B、C，补充图。1B、C)。为了测试其他信号通路是否受到AtFLS 2共价甲基化的影响，Phi-1，钙2+对flg 22诱导防御标记基因进行了检测。再一次，Phi-1诱导升高FLS 2/AtFLS 2：AtFLS 2 C830,831S与Col-0和FLS 2/AtFLS 2PRO*AtFLS 2控制线(图1.1D，补充图。1D). PR1，它是水杨酸(SA)介导的基因诱导和持续信号传递的标志。FLS 2/AtFLS 2：AtFLS 2 C830,831S植物系(图1.1E，补充图。1E)。长期暴露于flg 22，SA信号增强，胼胝质，一种β-葡聚糖多糖沉积，以加强细胞壁和防止细菌渗透。胼胝质沉积FLS 2/AtFLS 2：AtFLS 2 C830,831S和FLS 2/AtFLS 2PRO*AtFLS 2控制线与col-0相似，在所有情况下都比FLS 2(无花果)1F，补充图。1F)。这表明，丢失共济会-TM半胱氨酸不会对任何由flg 22介导的atFLS 2信号输出产生不利影响。长期接触flg 22的反应之一是抑制幼苗的生长，这通常被用作AtFLS 2激活的整体联合信号输出和长期效应的代表。生长抑制实验显示AtFLS2C无不良影响。830,831与COL-0或AtFLS 2表达对照线相比，S对幼苗生长抑制反应有影响(图1)。1g)。这表明，与以前使用标记AtFLS 2 C的结论相反830,831S线5，ATFLS 2不需要跨膜S酰化。

RLK超家族S-酰基化不限于偶联-Tm半胱氨酸

上述关于AtFLS 2共价Tm S-酰化的发现，使我们怀疑为什么AtFLS 2在这些位点上是S-酰化的，如果不像报道的那样，在动物中出现S-酰化。3,4,20，对功能没有明显的影响。S-酰化蛋白的蛋白质组学筛选5我们从拟南芥中鉴定出16种受体样激酶(补充表)。1)与AtFLS 2一样，它们的单个跨膜结构域C-末端的5个氨基酸中都含有至少一个半胱氨酸(根据Aramemnon数据库中的定义)。21)。这强烈表明，像AtFLS 2一样，这些半胱氨酸可能是S-酰化的位点。拟南芥基因组中所有RLK超家族成员的邻体-TM区分析6(补充图。S2)表明，总共有108个含有与TM相邻的半胱氨酸(在TM/细胞质界面之后的5个细胞质氨基酸中)。这些半胱氨酸代表S-酰化的高概率候选位点。3..含有这些半胱氨酸的RLK分布广泛，没有任何明显的进化模式，贯穿拟南芥RLK超家族(补充表)。2)。克隆了两种含有共济素-TM半胱氨酸的受体样激酶AtLYK 4和AtERECTA，并与AtFLS 2一样，发现S-酰化阳性。2A)。使用最近设计的更灵敏的S-酰化法22为了确定AtFLS 2在拟南芥中表达的S-酰化状态，我们观察到虽然AtFLS 2 C中S-酰化明显降低830,831S变种人它没有像前面所描述的那样被废除。5,16..这表明AtFLS 2含有额外的或替代的S-酰基化位点，占用率较低。因此，我们将AtLYK 4和AtERECTA表达为EGFP融合和包含juxta-TM半胱氨酸突变的版本(AtLYK 4 C)。295S，AtERECTA C602(S)在褐飞虱评估S-酰化状态。在这两种情况下，在半胱氨酸到丝氨酸突变体中仍可观察到S-酰基化(如图所示)。2A)。验证AtERECTA和AtLYK 4中的juxta-TM半胱氨酸确实是一个S-酰化位点，与AtERECTA、AtERECTA C对应的最小结构602S、AtLYK 4和AtLYK 4 C295S缺乏激酶结构域。在这些结构中，共济会-TM半胱氨酸是唯一留在蛋白质细胞质部分的半胱氨酸，因此是唯一可能变成S-酰化的半胱氨酸。对这些结构进行的S-酰化测试证实AtLYK 4和AtERECTA中的共价Tm半胱氨酸是S-酰化的。2B)。所有这些数据都有力地支持了AtFLS 2、AtLYK 4和AtERECTA除了跨膜结构域附近的S-酰基化位点外还含有S-酰基化位点的假设。因此，这些位点也可能存在于类似受体的激酶中，这些激酶不含共济会-TM半胱氨酸。为了验证这一点，我们克隆了FEI 1，FER(Feronia)，AtERL 1(AtERECTA-like 1)和BRI 1(油菜素甾体不敏感1)，作为不含juxta-TM半胱氨酸的受体样激酶的例子，并对其进行了S-酰化鉴定。我们再次发现，S-酰化是所有RLK测试的一个特征(图)。2C)表明rlk超家族的S-酰化比先前提出的要普遍得多。5，甚至可能是无处不在的，并且发生在除juxta-TM半胱氨酸以外的其他场所。

顺铂跨膜结构域半胱氨酸不控制受体样激酶的定位

哺乳动物和酵母系统的数据表明，juxta-TM半胱氨酸S-酰化可以帮助引导正确折叠的蛋白质从高尔基或ER出口到质膜，并防止TM螺旋与Golgi/ER膜之间疏水失配导致蛋白质周转。4..我们以前的数据表明atfls2s-酰化并不是PM目标所必需的。5上述数据表明，在拟南芥中，具有突变的副膜S-酰基化位点的AtFLS 2具有充分的功能，因此必须位于质膜上。为了确定aterecta和atlyk 4是否仅限于atfls 2，以确定juxta-tm S-酰化的缺乏影响，我们测试了aterecta和atlyk 4是否需要S-酰化才能传输到PM。共聚焦成像表明，在没有共济会-TM半胱氨酸的情况下，AtFLS 2、AtLYK 4和AtERECTA向PM的传输，而共频-TM突变体的胞内分布与野生型没有区别(图1)。3)。有趣的是，AtERECTA，无论有没有共济会-TM-S-酰化，都表现出配体介导的受体内吞的点状分布特征。作为ERECTA配体，EPF 2在叶片中产生，以防止表皮细胞分化为气孔系细胞。23所有叶表皮细胞都会暴露在不同程度的EPF 2中。根据其他RLK的模型24,25，可促进受体内吞，并可解释ERECTA结构所观察到的点状分布。

同系物间不一定保守的共价膜S-酰化

如果共济会-TM-S-酰化是受体样激酶功能的主要或必要的决定因素，那么在进化的时间内，共济会-TM位点将受到很强的选择压力。因此，在RLK同系物之间存在/不存在共济-TM-S-酰基化的情况下，S-酰化的得失是明显的。如果偶联-TM半胱氨酸是通过随机突变产生的，并且没有特别的益处，那么它们将处于中性选择之下，它们的存在或多或少是随机的，没有明确的进化模式。利用被子植物膜蛋白的Aramemnon数据库，我们对含有共价Tm半胱氨酸的拟南芥RLKs进行了同源性的检测，通过蛋白质组学和S-酰化实验检测了拟南芥RLKs的同源性，并对其进行了共价Tm半胱氨酸的检测。如补充图所示。3，使用先前定义的进化受体样激酶亚家族分组。6在不同物种的受体样激酶亚家族之间或内部，均不存在特定的共济素-TM半胱氨酸的发生模式。然而，一些同系物，如ERECTA，TMK 3或1，似乎显示了跨物种的共济会-TM半胱氨酸的保守性。有趣的是，ERECTA的近亲ERECTA-样1和2(ERL 1/2)在任何被检查的物种中都不含有共济塔-TM半胱氨酸。这表明ERECTA的副半胱氨酸出现在ERL 1/2的分化点，此后一直维持在所有现存被子植物系中。鉴于这些数据，以及S-酰化是如何在拟南芥受体样激酶家族树中零星发生的(补充图)。3我们认为，在植物进化和受体样激酶家族的多样化过程中，受体样激酶共价TM-S-酰化已经出现和丢失了好几次。根据我们的数据，我们认为许多含有共济素-TM半胱氨酸的类似激酶，如AtFLS 2，其中的同系物-TM半胱氨酸不是保守的，可能是偶然的S-酰化，但S-酰化可能成为一个固定的特征，如果它提供有益的功能。

讨论

我们对AtFLS 2的S-酰化的研究表明，S-酰化的缺失对AtFLS 2的功能有很小的影响。5..自从完成这项工作以来，我们发现atfls 2的不同表位标记形式的行为是不可预测的，从基本完全功能到几乎不起作用。18..在我们最初的研究中使用的标签5，mGFP 6在类似于内源性AtFLS 2的水平上表达时，对AtFLS 2的功能有显著的影响。18但是这些效果可以被过度表达所掩盖。5..鉴于这一工作，我们重新评估了我们以前的数据使用无标记形式的AtFLS 2缺乏共济会-TM-S-酰化，表达水平类似于内源性AtFLS 2。利用这些谱线，我们发现AtFLS 2共价甲基化的缺失对被测的任何FLS 2介导的功能或输出没有明显的影响。这一令人惊讶的结果使我们得出结论，AtFLS 2的共价甲基化很可能是偶然的.这与许多有文献记载的例子形成鲜明对比，说明在动物中贩运、功能或调节多种单通道跨膜受体所需的共济塔-tm S-酰化是必需的。2,3,4,20..然而，这种基于已发表数据的比较可能是观察偏差的结果，因为含有共济素-TM半胱氨酸的哺乳动物蛋白质在突变时对功能没有影响，因此在文献中不太可能被报道为阴性结果。

S-酰化似乎不只是由初级序列所指定；相反，二级和三级结构也可能决定是否发生S-酰化。S-酰化的常见结构模式包括跨膜结构域，其次是一个或多个胞浆半胱氨酸残基。相邻跨膜结构域的半胱氨酸可能进化为S-酰基化基序，因为S-酰基转移酶的活性位点位于细胞膜-胞浆界面，将活性位点和S-酰基接受半胱氨酸置于同一平面上。26..由于13/61个编码密码子(~21%)可以改变为半胱氨酸的密码子，且只有一个碱基的改变，因此相对来说，JUXTA-TM半胱氨酸可能是偶然出现的。此外，这13个密码子(phe，tyr，gly，ser，arg，trp)编码的氨基酸在α螺旋跨膜结构域和跨膜结构域与水环境之间的连接中过度表达。27在受体样激酶中发现S-酰化半胱氨酸的区域。我们提出，偶然突变可能经常导致半胱氨酸发生在跨膜区域附近，在那里，它们可以很容易地被S-酰基转移酶识别为“TM和juxta-TM半胱氨酸”基序。通过S-酰基转移酶来识别这些新的底物是很有可能的，因为这个基序在已经存在的S-酰基化蛋白中是常见的。20以及许多S-酰基转移酶的特异性比较松懈28,29..这与哺乳动物和真菌蛋白质组中非功能性磷酸化位点的报道和许多蛋白激酶的松散底物特异性相似。在这些研究中，进化保守的磷酸化位点比保守性较差的位点更有可能发挥功能。30..这些数据都表明，蛋白质组中的许多翻译后修饰可能实际上没有功能。

由于半胱氨酸的反应活性，半胱氨酸残留物通常不存在于表面暴露区域，除非它们是特定生物功能所必需的，否则往往处于负选择压力之下。31..然而，S-酰化在本质上限制了半胱氨酸的残留，并阻止了与其他细胞成分的反应.只要S-酰化不对受体样激酶功能产生负面影响，半胱氨酸就会在中性选择下持续存在。我们建议，在Cys 830和831处，AtFLS 2的S-酰化反应属于这一类，因为它们对功能没有明显的影响，也不存在ATFLS 2的同源性。十字花科的绝对序列和位置守恒紫锥菊很穷。这似乎也是LYK 4的情况，因为S-酰基化的LYK 4同系物是不保守的。例如，在补充图中对四种双子叶植物和三种单子叶植物进行了检查。3表明LYK 4同系物S-酰基化可能是发生在双子叶植物和单子叶植物的最后一个共同祖先中，并随后丢失在三果草(P.trichcarpa，S.lycopers图标)和Z.Mays血统或独立出现多次(拟南芥，C.梅洛, 讽刺O.和B.远距离)。然而，如果S-酰基化赋予受体样激酶一个有益的功能或特性，那么它将在进化的时间和距离中被积极地选择和维持。我们假设ERECTA就是这样。ERECTA类受体激酶家族存在于所有胚胎植物中，并产生了ERECTA亚类。32在所有现存被子植物的最后一个共同祖先发生全基因组复制事件之后33..有趣的是，我们已经研究过的所有ERECTA同系物(补充图)。3)含有位置保守的共价Tm半胱氨酸，表明ERECTA在其起源点上是S-酰化的。对ER和ERL同源物的检查进一步支持了这一点。三果小球藻，被认为是现存被子植物的姐妹群。34，显示相同的模式。我们无法找到任何裸子植物基因组中编码ERECTA类clade juxta-TM半胱氨酸的证据。这表明ERECTA S-酰化与AtFLS 2不同，具有一定的用途，我们假设S-酰化使ERECTA在所有现存被子植物的共同祖先中产生并具有新功能化特征。我们目前正在研究S-酰基化作为ERECTA功能中潜在的进化驱动因素的有趣作用。这项工作还揭示了所有类似受体的激酶似乎都是S-酰化的位点，不依赖于任何共济会-TM半胱氨酸。这一令人兴奋的发现表明，受体样激酶的S酰化是超家族的一个普遍特征，而不是少数人好奇的特征，我们目前正在确定这些附加位点的身份和作用。

材料和方法

植物品系与生长条件

所有拟南芥系均为Col-0生态型。FLS 2(t-dna插入线Sack_691C4)35)，以及FLS 2/AtFLS 2PROAtFLS 218植物线已经被描述过了。在含有0.8%(w/v)琼脂的0.5x Murashige&Skoog(MS)培养基上生长拟南芥植株材料。种子在4°C下分层48 h，在20°C下16/8h光/暗循环下萌发。[医]底氏烟草作为质膜标记表达Morange-LTI6b荧光蛋白的植物36)共焦成像。转基因野生型[医]底氏烟草植物在商用堆肥中生长，在16/8h光/暗循环条件下，白天最高温度26℃，夜间22°C保存4~5周。

构造

AtFLS 2PRO*AtFLS 2 C830,831S(PK7WG0)37)构造是使用相同的启动子和开放阅读框架创建的，如FLS 2/AtFLS 2PRO*AtFLS 2前文所述18..利用Q5位点定向突变(NEB)技术，产生半胱氨酸密码子突变和阅读框截短。转基因拟南芥株系根癌农杆菌-介导的花DIP转化38并选择在T3时进行纯合性鉴定。从基因组Col-0 DNA中克隆额外的受体样激酶，在测序前不加终止密码子克隆到pENTR D-Topo中，重组到pK7FWG2中。37或pGWB 173935S启动子的表达分别为C端EGFP或4xMYC融合。

褐飞虱的瞬时表达

4-5周龄野生型和Morg-LTI的叶片36表达[医]底氏烟草植物被注射器浸透根癌农杆菌gv 3101 pMP 90在p19旁边含有每个受体样激酶的表达质粒，每个pMP 90位于OD处。6000.1。在试验前，植物在标准生长条件下维持48~60h。

基因表达分析

基因表达水平分析如前所述。18,40..用定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析基因表达。10株基因型幼苗在萌发后10d，用1mfg22在2 mL 0.5xMS液体培养基中进行指示时间处理。RNA的提取采用RNeaseMini试剂盒和柱上DNase酶消化，按照制造商的指示(QIAGEN)进行。2利用大容量cDNA反转录试剂盒(应用生物系统)对gRNA进行反向转录。表达水平PEX 4(电话：5G2576041)。使用ΔΔC计算相对量化T方法42..错误条表示RQ马克斯和RQ敏根据学生的t检验，三次技术复制构成95%的置信区间.

MAPK激活

MAPK激活试验如前所述。43..6株基因型幼苗在萌发后10d移栽到含有2 mL 0.5x MS液体培养基的12孔板上24 h，然后在2 mL 0.5x MS培养基中用100 NM flg 22处理。每样装载30g总蛋白。

蛋白质水平的免疫印迹分析

如上文所述，从幼苗池中提取蛋白质。22用sds-PAGE法分离pvdf膜，用湿法将pvdf膜转移到pvdf膜上。43或AtFLS 222..使用的抗体如下：α-P42/44 MAPK：CST(#9102)；α-MPK 6：Sigma-Aldrich(A 7104)；α-EGFP：Roche(11867423001)；α-MYC：Thermo(MA1-21316)。

胼胝质染色

胼胝质染色是按照先前的描述进行的。44..在黑暗中用苯胺蓝染色3小时后，对幼苗进行一夜的脱色。用1mflg 22或水处理子叶10d，处理12h。将子叶装在50%甘油中，在Leica DMLFS显微镜下用5x物镜和UVD滤镜对子叶进行成像。在斐济使用图像处理宏对callose进行了量化。45改编自46..分析前将彩色图像转换为8位灰度。

幼苗生长抑制

如上文所述，幼苗生长受到抑制。18,47..种子萌发4天后，将每种基因型的10株幼苗转移到含有2 mL 0.5x MS液体培养基的12孔板上，其中含有或不含1 Mflg 22，保证子叶不被浸没。幼苗再生长10天，每种基因型的杂交苗的干重和鲜重均称重，并计算出平均重量。

s酰化试验

s-酰基化试验如前所述。22..样品在液氮中粉碎成细粉，再悬浮在2 mL溶解缓冲液中(50 mm Tris HCl，pH7.2，5 mm EDTA，150 mm NaCl，2.5%SDS，10 mm N-乙基马来酰亚胺，5 mr L.ml)。−1蛋白酶抑制剂[P 9599，Sigma-Aldrich]，100 mg PVPP)。样品在室温下轻轻混合10 min，在16，000×G离心1 min。保留上清液，用BCA法测定总蛋白浓度。用裂解缓冲液(不含PVPP)将1mg蛋白质稀释至1mL，室温温和混合孵育1h。12份样品中加入1，2，3-二甲基-1，3-丁二烯，在25℃摇床中孵育1h，去除未反应的NEM。1/10TH在每个样品中加入体积氯仿，进行短暂的涡旋和离心，以实现相分配。保留上相，分裂成2个0.5mL样品，一个用1M羟胺处理，另一个用等量水处理。然后从每个样本中取出10L负荷控制，在RT中孵育1h，然后与10 l2x减少SDS-PAGE加载缓冲液联合使用。在剩余样品中加入50%硫丙基Sepharose 6b预膨胀料浆(不含NEM)20 ml，室温下温和混合1h。微球在裂解缓冲液(无NEM)中洗涤3次，每次5分钟，最后冲洗后取上清液。蛋白在25 l2x还原SDS-PAGE负载缓冲液37°C下洗脱30 min。

共焦成像

用尼康A1R共聚焦激光扫描显微镜对细胞进行成像，显微镜上装有近红外APO 40×0.8W水浸透镜和GaASP探测器。图像是假的颜色，单共焦截面或Z-堆栈的最大投影使用NIS-元素AR软件。GFP在488 nm处激发，发射集中在500-530 nm，同时在663-738 nm处收集叶绿素荧光。Morange在561 nm处被激发，发射集中在570~620 nm。

生物信息分析

生物艺术48用于查询EnsemblPlants49并提取Shiu和Bleecker工作中定义的609拟南芥RLK超家族蛋白序列。6..自定义Perl脚本用于提取ARAMEMNON数据库中定义的TM域序列。21再加上TM域结束后的10个残基。然后使用自定义脚本来鉴定在TM结构域末端的−1、+5区域中含有半胱氨酸的蛋白质。图是使用自定义脚本和ESPript 3生成的。50.

加入号

加入号如下：FLS 2，At5g46330；ER，At2g26330；LYK 4，At2g23770；FER，At3g51550；BRI 1，At4g39400；FEI 1，At1g31420；ERL1，At5g62230；NHL 10，At2g35980；WRKY 40；PHI-1，At1g35140；PR1，At2g14610；PEX 4，At5g25760；MPK 6，At2g43790；和MPK 3，At3g45640。

数据可用性

在本研究期间生成和/或分析的数据集被公布。5，可作为补充数据或在合理要求下从相应作者处获得。