基于人iPSC源性皮层神经元转录谱的阿尔茨海默病药物再定位

阿尔茨海默病是一种复杂的疾病，包括多种病理特征与相关的遗传和分子罪魁祸首。然而，基于目标的治疗策略到目前为止已经被证明是无效的。这项研究的目的是开发一种方法，利用与阿尔茨海默病相关的转录变化，开发一种高含量的定量疾病表型，可用于重新利用现有药物。首先，对阿尔茨海默病基因的表达情况进行了界定，包括严重疾病阶段、早期病理进展、认知衰退和疾病动物模型，并选择了一套153种倾向于在永生化的人类癌细胞株背景下抵抗疾病相关变化的药物。选择的化合物随后在IPSC衍生的皮层神经元培养的生物相关性更强的环境中进行了测定。研究表明，其中51种药物的表达变化与阿尔茨海默氏病的变化相反。人们希望IPSC简介将作为一个有用的资源，在神经退行性疾病的背景下药物重新定位，并潜在地帮助产生新的多目标治疗策略。

全球基因表达谱可以被认为是一种高含量的定量表型指标。1，例如，细胞在大脑的异构环境中的类型。2,3,4并揭示出以前认为是同质的种群中的多样性5..此外，生物状态动力学可以通过表达的时间模式来建模。6..在治疗方面，已经证实疾病相关的表达变化可以区分疾病状态，并且在独立的数据集上是一致的，从而有助于确定健壮的生物标记物。7..疾病相关基因的改变指向调节的通路和受影响的细胞类型，从而提供了对机制的有价值的洞察。8..有趣的是，转录表型的数量特性使得疾病可以直接映射到潜在的治疗方法。9,10,11,12..在这里，显而易见的假设是，倾向于逆转疾病状态下的表达变化的药物可能会逆转与疾病本身相关的生物变化。这里一个重要的警告是，与阿尔茨海默病(AD)相关的一些表达变化实际上可能是补偿性的和有益的。药物的重新用途或重新定位已经导致了跨越几种疾病的成功举措。13,14,15,16,17,18,19..此外，对本项目更感兴趣的是，具有与AD基因变化显著负相关的特征的药物已被证明具有明显的神经保护作用。12..在最近的一项研究中，疾病相关基因表达的变化已开始从基因型组织表达库的基因组风险变异数据中推断出来。20并被用来预测主要精神疾病的重新定位候选人21..虽然在这种方法中，候选药物有一些耐人寻味的心理治疗联系，但预测的转录微扰与疾病脑组织中的转录微扰没有重叠[G.Williams，未发表的观察]。在没有进一步验证预测的基因变化的情况下，我们必须依靠来自病人样本的数据。

目前还没有既定的治疗AD的疾病治疗药物，也没有针对AD的新的症状治疗许可超过20年，新兴的治疗方案也非常有限。以目标为基础的药物在AD的研究已经导致了许多关于该疾病的洞察，并为研究社区提供了有用的工具化合物。然而，在实验室中看到的有希望的结果到目前为止还没有被带到诊所，这导致研究人员四处寻找新的、非目标的方法。22..基于转录的药物发现的主要目的不是目标发现，而是基于其全球转录活性的具有疾病调节作用的药物的发现。该方法的一个特别吸引人的方面是，它自然有助于重新定位现有药物，从而绕过新实体在通往诊所的道路上必须克服的障碍。摘要AD在病理和认知功能衰退后的表达变化方面得到了广泛的研究。23,24,25,26..大量的数据表明与疾病相关的一致和特征性的变化，从而使得重新定位策略特别有吸引力。

目前，基因表达谱在药物重新定位中的应用受到限制，因为只有在一组受限制的永生化细胞系上才能获得完整的药物图谱。这些数据是由宽带研究所连通性地图项目(CMAP)提供的。11..在多种诱导多能干细胞(IPSC)衍生细胞(包括神经干细胞和分化皮层神经元)上，已经发现了一种更广泛的药物集。但是，这些数据构成了Lincs项目。27是基于对1000个里程碑基因的分析，然后使用优化的线性映射生成完整的剖面图。这激发了目前的倡议，以确定CMAP候选药物在与AD相关的IPSC衍生皮层神经元中的全部表达谱。然后可以将新的表型与CMAP图谱进行比较，并更有针对性地对疾病谱进行评分，以确定它们是否保留或增强了它们与AD的反相关性。在此背景下，ipsc衍生的皮层神经元已被建立为神经疾病研究的模型系统，特别是追踪疾病相关基因变异的影响。28,29,30,31..该模型提供了一个有效的中等吞吐量平台，以评估候选药物的转录效应，在更多的神经系统背景下。但是，必须记住，AD是一种复杂的病理，也涉及多种细胞类型，如小胶质细胞和星形胶质细胞。在这种情况下，在分离的IPSC培养物中检测药物干扰有助于对该疾病的重要但有限的了解。

本文所述工作的动机是建立一个神经元特异性的化合物转录数据库，以便药物在AD和其他神经退行性疾病中重新定位。最初的化合物集是基于CMAP剖面来组装的，它显示了一种逆转AD相关表达变化的趋势，这些变化是通过各种独立的研究观察到的。然后，研究人员分析了候选药物对IPSC衍生的人皮层神经元的转录效应。结果表明，在全球一级，CMAP和IPSC剖面之间存在一定程度的对应关系。此外，这些药物中有51种具有与AD相反的驱动转录变化的特征。调控一致的基因与AD相关基因相对应。希望这些药物的转录数据将对更广泛的对神经退行性疾病感兴趣的研究人员有帮助，并促进进一步的重新定位工作。

AD相关转录景观

国家CBI GEO数据库32被询问的序列中含有从死后AD患者大脑中提取的样本，用于疾病的各个阶段。同样，根据相关查询关键词：5xFAD、3xTg、阿尔茨海默病+小鼠，采集AD模型小鼠脑标本。配置文件是根据非疾病和疾病状态样本平均值的相对水平生成的，比例折叠级别被定义为f=⟨d⟩−⟨c⟩⟨d⟩+⟨c⟩$f=\frac{⟨d⟩-⟨c⟩}{⟨d⟩+⟨c⟩}$，其中括号表示控件的平均值(c)和疾病(d)样品。统计意义用学生的t试验中，95%置信区间以下的褶皱和<20%的褶皱下降。人类疾病与对照AD集包括来自13个系列的21个配置文件(NCBI GEO登录：GSE 84422)。24，GSE 3726333，GSE 3698034，GSE 3942035，GSE 129723、GSE 2937836，GSE 4835037、GSE 1522225，GSE 2697238、GSE 3726439、GSE 2814640、GSE 528141、GSE 1321442)根据显着性(学生的回归得分)显示剖面内一致性t试验p < 0.05) correlations, see Supplementary Table 1..为了捕捉大脑区域的可变性，配置文件的数量要大于系列的数量。在补充表中2研究结果表明，在许多情况下，脑区剖面的变异性大于独立序列之间的差异。认知能力下降是基于最低心理状态检查(MMSE)的下降。43由两个独立系列和临床痴呆评分(CDR)中的两份资料代表44一个系列的简介。同样，与AD小鼠模型相对应的系列是从5xFAD小鼠和3xTg小鼠中收集的，得到了三个系列的七个剖面(NCBI GEO登录号：GSE 50521)。45、GSE 11975646、GSE 10114447、GSE 7757448)8系列中的5 xFAD集和9份配置文件(NCBI GEO登录：GSE 31624，GSE 15128)49、GSE 36237、GSE 9292650、GSE 60460、GSE 6091151，GSE 3698134，GSE 35210)，用于3xTg集。与Braak分期进展相对应的系列(NCBI GEO登录：GSE 1297、GSE 84422、GSE 48350、GSE 106241)52)采用线性混合模型分析方法，将样本间的基因表达水平拟合为Braak阶段的线性函数，并以细胞类型和性别为协变量。结果的残差相关Z对Braak阶段的基因表达评分构成Braak谱。与全布拉克进展相对应的剖面不被认为与来自同一系列的显性疾病剖面有很大的不同，后者的疾病分配也是基于Braak分期的。然而，基因表达的变化驱动轻微的Braak病理应该捕捉早期的疾病生物学在显性档案中看不见。总共有6个对应于轻度Braak病理的剖面，0级到3级，形成了轻度Braak AD集。为精神病措施MMSE和CDR编制了类似的简介(加入国家CBI GEO：GSE 48350、GSE 1297、GSE 84422)。在MMSE配置文件中，随着MMSE评分随着疾病的进展而下降，回归迹象被逆转，见表。1用于配置文件集的总体比较。

每组具有代表性的图谱都是基于各组成图谱上一致变化的基因。特别是，显着调控基因的感官变化(上调和下调)被总结在剖面上，只有那些绝对调控分数大于20%的基因被保留下来，并且有显著的调控统计量。t试验p < 0.05. Owing to the categorical nature of the representative profiles, correlation with the iPSC profiles was based on an enrichment analysis. The enrichment score was generated based on a binomial probability sum with gene probabilities scaled according to their frequencies in SPIED53.

Cmap剖面图

Cmap数据从广连接地图站点下载(www.宽带网/连通性-地图-cmap) 11..这由每个样本的探针集组成，每个样本按照相对于批处理控制的表达式级别排列。数据包括6100份样本，包括1260份药物和4种细胞类型。相对探针表达式排序，定义为1−2R−RminRmax−Rmin$1-2\frac{R-R_{\mathrm{m}\mathrm{i}\mathrm{n}}}{R_{\mathrm{m}\mathrm{a}\mathrm{x}}-R_{\mathrm{m}\mathrm{i}\mathrm{n}}}$，在哪里R在给定基因的表达变化的等级(R马克斯是最高的R敏)，平均复制忽略单元类型，并使用单样本学生的显着性对其进行过滤。t测试一下。对于具有多个探针的基因，最大显着变化的探针被映射到该基因上。这使得CMAP中的每种药物都有了独特的特征。复合数据可以通过SPIED查询。53.

IPSC剖面图

采用优势CMAP处理方案，细胞培养6h，复合浓度为10μM，在人基因组U133+2.0阵列平台上获得表达样品。

人iPSC来源的大脑皮层神经元(HyCCNs；Axis 0026)按照制造商指南进行培养(www.axolbio.com/page/neural-stem-cells-cerebral-cortex)。每种药物在10μM浓度下处理6h，分别在3个独立培养物(平均浓度为300 K/cm)上进行。2)和RNA从每个处理好，通过直接细胞裂解和回收使用绝对RNA微准备试剂盒(Agilent，按照制造商的指导方针)。每个药物治疗盘也由一套仅限车辆控制的三式三份的培养物组成。用Agilent生物分析仪根据制造商的指示测定总RNA的完整性，只有RNA完整性数>7的样品才能进行转录组分析。用Nugenov2标记系统测定了受候选药物影响的转录组改变(https://www.nugen.com/products)人类U 133+2基因芯片按照制造商的指示(www.thermofisher.com/order/catalog/product/900466).

NCBI GEO在这个平台上托管了145，000个样本，使它成为最流行的阵列芯片。收集GEO数据和iPSC对照数据探针的相对表达水平。最高表达探针的等级为零，最低的为单位。每个探针的相对秩被定义为r0−rr0$\frac{r_0-r}{r_0}$为r < r0和r0−r1−r0$\frac{r_0-r}{1-r_0}$为r < r0，在哪里r和r0分别是IPSC样品和在GEO上沉积的样品的平均探针等级。然后将探针定位到基因，在简并的情况下，探针与该基因的相对秩映射最大。基因等级谱与IPSCs的相对基因表达有关。

药物治疗方案是根据药物治疗组和对照组的统计过滤比率而制定的。这些数据是基于554个样本的组合而产生的，这些样本是鲁棒的多阵列平均归一化的。样品分布在23个板上，并与相应的二甲基亚砜对照。153种药物的转录谱是在对平板控制正常的基础上生成的，多个平板药物复制作为单独的图谱保存。该药物集用于CMAP的抗AD电位(153)。雷帕霉素具有明确的转录特征，可作为阳性对照.表达的变化要么是用缩放的褶皱来测量的，而后者是为了显示学生的意义。t测试或ASZ分数，根据Z..根据显性探针反应，将简并探针定位到基因上。

与广告相关的表达式更改

为了尽可能多地捕捉AD的转录状况，根据显性疾病与健康状况、早期病理和认知测量后的特征以及“材料和方法”中所描述的动物模型，定义了不同的类别。公开的AD档案与认知下降后的档案有很好的重叠程度，见表。1，但它的理由是，有足够的变异性，以产生独特的药物候选人，见一节‘CMAP候选人’。早期布拉克阶段的资料与公开或认知衰退的资料几乎没有重叠，见表。1因此，预计这些资料将有助于阐明不同的早期病理和早期治疗干预。动物模型数据自然分为基于5xFAD的数据，这与补充表中的AD是一致的。3，以及基于3xTg的文件，与AD配置文件或内部一致性几乎没有重叠。Hargis和Blalock也进行了类似的分析，包括AD大鼠模型。54..动物模型数据包括在本研究中，因为在模型系统中看到的表达变化已经确定了原因，即插入突变，5 xFAD或3xTg在我们的情况下。因此，逆转这些变化的候选药物可能具有更集中的作用机制。此外，神经保护的证据在很大程度上来自动物模型的实验。

Cmap候选

一般来说，基于转录的重新定位会导致在构成cmap的1000多种药物中，有几十种候选药物。13,14,15,16,17,18,19..相对较少的化合物提出了严格的生物分析，以建立更坚实的证据，疾病调节潜力，当然，反映了实验所需的资源。本项目的基础是选择候选人，以填充IPSC档案数据库的药物偏向于他们预测的抗AD和更广泛的神经保护活动。因此，有理由认为，必须放宽将一种药物视为重新定位候选人的门槛，以便有100多名候选人能够继续前进。为此，针对CMAP，分别询问了五组捕获疾病不同方面的AD特征集，并应用了三种选择标准。首先，收集了每种化合物的反相关等级的数据，其中的化合物在任何一种被认为是候选的配置文件中都有很高的排名，参见补充表。4完整的候选人名单。第二种选择是基于每组中各剖面间反相关的一致性，最后在集合中加入一些与个别剖面显著负相关的化合物。化合物的全部清单载于补充表。4由153个化合物组成。有趣的是，在这些药物中建立了神经保护实体和AD治疗学，见下文。

IPSC剖面图

作为建立模型细胞系统表型的第一步，通过spIED公开保存的基因表达谱数据库查询了ipsc转录谱。12,53，见“材料和方法”。iPSC排名前1000个基因包括959个上调基因和41个下调基因，这是SPIED搜索中的一个查询。也许这里值得指出的是，特定细胞类型所特有的基因表达水平相对于由多种组织类型组成的背景而言往往会升高。一个比喻是在分工的背景下，一个人的特点是他不做什么。最高的spIED点击率显示与人脑样本高度相关，验证了细胞的谱系，参见补充表。5.

IPSC和CMAP文件的比较

IPSC配置文件与其CMAP等价物的关联程度可以通过查询CMAP数据库和IPSC配置文件并对CMAP等价物排序来评估。广泛研究的雷帕霉素微扰根作为阳性对照，产生8个独立的图谱，以评估这些图谱在CMAP中的一致性程度和与雷帕霉素谱的一致性。雷帕霉素配置文件之间的重叠程度一直很高，但与CMAP配置文件的重叠程度较低，在CMAP查询中，只有一个回归的雷帕霉素是最受欢迎的，排名第七，参见补充图。1..在附图中。2，IPSC和CMAP配置文件对显示了四个最高的CMAP查询级别。总体上，有30个显著相关和8个反相关对。IPSC和CMAP剖面的总体比较可以用对等效化合物HIT等级的富集分析来表示，其意义可以用Kolmogorov-Smirnov(KS)统计量来评估，即偏离零富集对角线的最大偏差。KS统计为IPSC配置文件的稳健性提供了一个客观的度量，并建议IPSC配置文件基于Z分数阈值Z>3，有关详细信息，请参阅“材料和方法”，获取大多数与化合物相关的更改。富集是在CMAP中，给定的IPSC复合分数的等级。浓缩图如图所示。1..KS统计量具有很高的显着性，随机组合的概率超过了p=5.1E−6。

对于每种药物，IPSC和CMAP档案之间的相关性与CMAP数据集档案的其余部分进行了排序。要想在这些配置文件之间达成良好的协议，人们会期望在较高的排名中获得丰富的分数，这就是IPSC配置文件的情况。最上面的图显示了等级分布在50，明显偏向于高等级分数的回收箱。底部图是与非富集对角线形成对比的等级累积分布。这一意义是通过mc模拟随机排序和计数峰值偏离对角线超过原始富集的次数来衡量的。

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iPSC剖面与AD的关系

为了进一步评估化合物在肿瘤细胞株和分化皮层神经元中组织类似表达变化的程度，至关重要的是测试药物是否也在神经元环境中以抗AD的方式起作用。为此目的，药物简介对五种有代表性的AD重新描述进行了评分，其来源于上文定义的AD集合，详情见“材料和方法”。表2列出与典型AD剖面至少有两个显著的反相关的化合物，这将称为AD命中化合物(ADC)。与其他iPSC配置文件对相比，ADC集显示了相对较高程度的剖面内相关性，参见图。2..回归的平均相关性Z得分：ADC组2.43分，其他组0.77分。因此，看看ADC集在多大程度上规范了一套共同的成绩单，这是令人感兴趣的。在图中。3，常见的ADC靶基因与一组明确定义的上调和下调基因序列具有高度的一致性。为了了解ADC所干扰的底层生物网络，对ADC集合中的每一个剖面进行了路径富集分析。在“补充表”中分别给出了在上调和下调基因集中富集所定义的一致的正调控和负调控的途径。6这些都指向与AD相关的关键过程，这些过程是药物潜在治疗作用的基础。AD、帕金森病和线粒体通路在正调控基因中的富集是由于细胞色素c氧化酶、泛醌氧化酶和ATP合成酶的上调所致。这些都是线粒体功能的关键因素，而线粒体功能在AD中被认为是被破坏的。55,56，越来越多的证据表明，影响线粒体功能的基因变异可能在AD中起作用。57,58..被下调的设定似乎不那么一致。尽管如此，免疫相关通路的富集表明候选药物可能具有抗炎活性.有趣的是，据报道，下列药物具有神经保护作用：氟西奈德59卡文60,61,62,63尿囊素64双嘧达莫65,66,67、雌三醇68左旋咪唑69霉酚酸70新斯的明71丙磺舒72,73氯丙嗪74，苯氧基苄胺75，Xamoterol已经被报道可以改善5 xFAD小鼠的神经炎症和病理。76对唐氏综合征小鼠模型的认知增强作用77..非典型抗精神病药利培酮治疗AD精神疾病在缺血动物模型中显示了神经保护作用78..此外，胆碱酯酶抑制是治疗AD的一种方法。79在候选名单上有两种这样的抑制剂，一种是加兰他明，另一种是既定的AD疗法。80而新斯的明表现出较弱的血脑屏障外渗性，因此不适用于AD的临床应用。似乎没有任何基因表达特征的区别化合物与报告的神经保护活性与其他ADC化合物。这是预期的，因为并不是所有的化合物已经被检测到神经保护和生物活性并不是完全编码在转录组中。

相关性Z分数显示在热图与ADC组件分开，以突出显示增强的相关性。内部ADC配置文件的平均相关性为2.43，而对于所有其他对则为0.77。

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基因选择的依据是它们的和感变化率>33%。具体来说，和意义变化率被定义为1P∑i=1,…,Psign(gi)$\frac{1}{P}{\sum }_{i=1,\dots ,P}\mathrm{s}\mathrm{i}\mathrm{g}\mathrm{n}\left(g_i\right)$，在哪里gi是基因在i侧写。这些化合物用UPGMA算法进行聚类，并在左边显示相应的树状图。

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神经退行性疾病提出了一个治疗挑战，因为难以建立一个明确的蛋白质或机械罪魁祸首的经典目标为基础的干预。另一个障碍是疾病进展的时间范围和在公开症状出现之前可能需要治疗的结果。这是设计临床试验时的一个特殊问题。考虑到这一点，人们越来越多地寻求以目标为基础的方法的替代办法。最近的一份报告比较了来自挪威处方数据库的帕金森病(PD)发病率和慢性治疗使用数据(www.norpd.no)，表明沙丁胺醇的使用降低了PD的风险81..目标和流行病学方法之间的中间点是一种基于从病理状态中观察到的基因表达变化中收集到的疾病表型的方法。这种方法的基础是观察到疾病状态可以有效地由特征表达变化来表示，即这些变化是一致的，并且可以作为高含量的定量生物标记物。药物重新定位的一种途径是使用这些转录表型，并假设表型上的反相关表明该化合物的治疗潜力。虽然神经变性，尤其是AD的转录前景已经有了很好的特征，但是相应的化合物数据要么局限于定义在非神经元增殖细胞上的完全轮廓，要么局限于iPSC衍生神经元细胞的部分轮廓。本研究的基础是以某种方式来填补化合物相关转录组中的这一空白，重点放在具有抗AD潜力的药物上。

在确定候选药物的神经治疗潜力的背景下，进一步的发展将是用化合物治疗野生型或突变型AD小鼠，并按照药物基质项目的思路，测量大脑中的表达变化。82..这种方法的优点是包括了导致AD病理的非神经元因素，如炎症。然而，实际的考虑限制了小剂量药物的整体动物方法，因此将构成随后工作的一部分，其基础是根据IPSC数据选择的一组更有限的候选药物。

在目前的工作中，我们已经建立了一个AD转录剖面景观，并表明这具有高度的内部一致性。这种疾病相关的转录景观是从CMAP的癌细胞株谱数据库中选择一系列候选药物的基础，然后对这些药物对iPSC衍生的皮层神经元的转录效应进行检测。IPSC配置文件显示出与相应的CMAP配置文件有一定程度的重叠，在CMAP的IPSC查询中所观察到的级别的总体比较非常显著。在153份iPSC药物谱中，被称为ADC集的51份与AD中的转录变化有高度的反相关关系。对每组ADC进行的通路富集分析表明，与线粒体功能相关的通路通常被上调，而通常下调的通路则代表免疫相关的通路。有趣的是，这些病理特征发现在多种神经退行性疾病，如PD和亨廷顿病，并将有兴趣研究这些化合物是否可能有更广泛的治疗潜力。值得注意的是，18种ADC药物已经在已发表的研究中确立了神经保护能力。虽然我们预计对AD档案的初步CMAP筛选导致发现倾向于逆转IPSC培养环境中与AD相关的表达变化的化合物的可能性增加，但这只能通过为从CMAP数据库中随机选择的一系列化合物生成iPSC谱来严格评估，这不在本研究的范围之内。总之，迫切需要找到范围更广的AD候选治疗方法。因此，预期iPSC数据库将作为一个有用的平台，用于对多种神经病理疾病和AD进行药物重新定位。