黑曲霉 和 烟曲霉 表现出与宿主天然免疫细胞相互作用有关的感染行为的差异。 的致病行为 A . 尼日尔 和 A . 烟熏鱼 我们应用了Knox的方法。 等人 .22 后脑室注射斑马鱼胚胎中真菌分生孢子。斑马鱼胚胎后脑室内形成一个内衬上皮的腔，通常用来模拟肺泡感染的情况。 24 ,25 ,26 ..这是一种感染途径，我们和其他人已经成功地用于研究巨噬细胞和中性粒细胞对细菌感染的反应。 25 ,26 ,27 ..使用这种方法，我们调查了对照胚胎的存活情况。 聚氨酯 .1 感染后注射吗啡的胚胎 A . 尼日尔 和 A . 烟熏鱼 ..吗啡击倒 聚氨酯 .1 造成骨髓造血阻滞，巨噬细胞和中性粒细胞的发育过程。 28 ，从而将 聚氨酯 .1 在实验期间，变形胚缺乏细胞天然免疫反应。我们的观察显示 A . 尼日尔 和 A . 烟熏鱼 在150个分生孢子的高传染性负担下，两种方法在96小时内均表现出较强的致病性(图一)。 1A )，在这两种情况下，先天免疫系统似乎提供了重要的保护，在控制和控制之间的风险比约为6。 聚氨酯 .1 词素 A . 尼日尔 超过14 A . 烟熏鱼 ..然而，虽然在实验结束时，即感染后96小时(Hpi)，这些高传染性负担的总体死亡率是相似的，但两者在存活率测定的时间发展上有着明显的差异。 曲霉 物种。而 A . 尼日尔 的特点是死亡率高达24小时，这是死亡率下降幅度最大的一例。 A . 烟熏鱼 发生在较晚的时间点。这表明这两种不同的真菌病原体感染的发展是不同的，导致死亡率的发生较晚。 A . 烟熏鱼 感染(图1. 1A，B )。降低真菌激发剂量表明 A . 尼日尔 更多地依赖于高传染性负担 A . 烟熏鱼 ，如 A . 尼日尔 注射50分生孢子，无致命性死亡，而 A . 烟熏鱼 在这个挑战剂量下仍然会导致显著的死亡(如图所示)。 1C )。这与一般的观点是一致的 A . 烟熏鱼 比 A . 尼日尔 ..宿主免疫系统的保护作用再次被证明为 A . 尼日尔 和 A . 烟熏鱼 免疫缺陷导致几乎完全死亡 聚氨酯 .1 变形虫。以控制和控制之间的危险比率来量化的保护效果 聚氨酯 .1 变体证实了这一观察； 聚氨酯 .1 变形虫死于50分生孢子的可能性是前者的24倍。 A . 烟熏鱼 在超过96小时的时间内，这个比率几乎是42。 A . 尼日尔 ..因此，注射真菌分生孢子与天然免疫系统的相互作用似乎决定了感染的结果，而天然免疫系统提供了更大的保护，以抵御低剂量的挑战。 A . 尼日尔 比相对 A . 烟熏鱼 ..由于我们希望研究侵染发育的萌发和菌丝生长阶段，在随后的实验中，我们继续使用150分生孢子的更高的挑战剂量。
图1 成活率分析 A . 烟熏鱼 和 A . 尼日尔 感染揭示了依赖于先天免疫细胞的病理发展的差异。( A )对照存活(不含吗啡基)和免疫缺陷 聚氨酯 .1 150分生孢子感染斑马鱼胚胎 A . 烟熏鱼 和 A . 尼日尔 28例HPF组于感染后24、48、72和96h进行生存监测。平均生存期24小时( A . 尼日尔 )，48 HPI( A . 烟熏鱼 ). (B )对照和免疫缺陷患者生存期的时间特异性统计分析 聚氨酯 .1 150分生孢子感染斑马鱼胚胎 A . 烟熏鱼 和 A . 尼日尔 根据下列文件中提供的数据，对24 HPI进行监测： A ). (C )对照生存(无吗啡诺)与 聚氨酯 .1 吗啡注射斑马鱼胚胎感染50分生孢子 A . 烟熏鱼 和 A . 尼日尔 ..每个图表显示来自三个独立生物复制的组合数据。( A ,C )用Mantel-Cox检验统计曲线比较，*p≤0，0001.危害比用Mantel-Haenszel法计算。( b) *p≤0，01；*p≤0，0001。
总之，这些存活率分析表明， A . 尼日尔 和 A . 烟熏鱼 当应用150个分生孢子的高传染性负担时，两者都表现出较强的致病性，但在感染的发展过程中存在时间上的差异， A . 尼日尔 在最初的24小时内导致强烈的死亡，同时 A . 烟熏鱼 需要更长的时间才能产生致命的结果。与生俱来的免疫系统对这两种动物都有明显的保护作用。 曲霉 ，但是，虽然先天免疫系统对此有更大的保护作用 A . 烟熏鱼 比 A . 尼日尔 在高剂量时，在较低的激发剂量下则相反。所有这些观察使我们得出结论： 曲霉 物种通过不同的途径发生感染，这种差异很可能与先天宿主免疫系统的相互作用有关。
这两种动物都有相似的白细胞迁移反应，但 烟曲霉 比吞噬细胞更有效 黑曲霉 我们希望研究的是，在感染进展方面，是否存在明显的差异。 A . 尼日尔 和 A . 烟熏鱼 这是由于它们与不同的天然免疫细胞亚群的相互作用不同所致。为了探讨这个问题，我们描述了这些相互作用在感染后的几个小时内的性质。为此，我们利用双报告斑马鱼系标记中性粒细胞。 29 巨噬细胞 30 分别是绿色和红色。由于mCherry信号标记的巨噬细胞是膜结合的，我们能够利用荧光信号的形态和亮度来区分巨噬细胞和真菌。 2B、C )。仔细检查共焦切片，我们可以确定两者吞噬效率的差异。 曲霉 种，早在感染后7小时(HPI)，分生孢子萌发前。我们发现 A . 烟熏鱼 比吞噬细胞更有效 A . 尼日尔 ..总的来说，平均7.3%的分生孢子 A . 尼日尔 在7 hpi时，被释放和未吞噬，而未被吞噬的只有1，2%。 A . 烟熏鱼 分生孢子 二维空间 )。采用同样的方法，我们调查了每个白细胞群体的迁移行为。再次，我们依靠荧光信号的形态和亮度来区分巨噬细胞和真菌。 3 )。为了研究随着时间的发展和评估真菌生命周期动力学的重要性，我们包括活和热杀死分生孢子，在7和24 HPI。定量结果表明，针对这两个物种的白细胞迁移行为非常相似。 曲霉 ..热杀孢子引起巨噬细胞迁移反应，表明萌发前巨噬细胞的初始反应可能与分生孢子的成熟和肿胀无关(图1)。 3 )。然而，24 HPI时，两种动物对活孢子反应的白细胞数量显著增加，但注射热致死分生孢子者的白细胞数已恢复到正常注射者的水平。结合存活率观察结果表明，注射后的小鼠能有效地吞噬细胞。 A . 烟熏鱼 不足以解决感染问题，而且中性粒细胞大量涌入的时间比 A . 尼日尔 .
图2 吞噬细胞吞噬效率的差异 A . 烟熏鱼 和 A . 尼日尔 感染后7小时分生孢子。( A )胚胎和图中所示区域的示意图。( B ,C )斑马鱼胚胎后脑注射150个分生孢子的单个共聚焦显微镜平面 A . 烟熏鱼 (B )和 A . 尼日尔 (C )感染后7小时(HPI)。巨噬细胞和中性粒细胞分别被法尼化膜结合mCherry和胞浆EGFP标记，和 曲霉 分生孢子与无膜结合的樱桃。下面显示了没有Brightfield的爆破图像，以说明吞噬细胞(用星号标记)和自由分生孢子(用标签标记)的不同外观。( D )7 HPI时未被吞噬细胞吞噬的激发剂量百分比 A . 烟熏鱼 (1.2%) A . 尼日尔 (7.3%)。棒材代表平均±S.E.M。结合3次生物复制，n=40~47，*p≤0，0001，经t检验，韦尔奇校正。
图3 感染早期和后期白细胞向后脑迁移的定量研究。( A ,C )TG的代表共焦栈( mpeg 1 :樱桃 ; mpx :绿色荧光蛋白 )斑马鱼胚胎分别以红色和绿色标记巨噬细胞和中性粒细胞，注射150分生孢子 A . 烟熏鱼 和 A . 尼日尔 在7小时内( A )和24 HPI。( C )堆栈构成了白细胞向后脑迁移定量的基础。用相同的荧光载体标记巨噬细胞和分生孢子，用信号强度和形态特征区分分生孢子和巨噬细胞。( B ,D )注射胚胎后脑白细胞迁移的定量 A . 烟熏鱼 或 A . 尼日尔 ，与对照注射(2%pvp/pbs)相比，在7 hpi(2%pvp/pbs)下，可存活或热致死(香港)孢子。 B )和24 HPI。( D *p≤0，05；*p≤0，01；*p≤0，001；*p≤0，0001。量化代表了一个更大的数据集的一部分，这是在补充图中完整地显示出来的。 1 ..提出的统计分析是基于完整的数据集。
黑曲霉 通常在细胞外萌发和生长菌丝。 烟曲霉 分生孢子持续存在，萌发，并从巨噬细胞中生长。 随着共聚焦时间延迟实验(4~24 HPI)的发展，侵染行为的初始差异仍然明显，随着分生孢子的萌发和菌丝生长的开始，传染行为的差异进一步扩大。在……里面 A . 尼日尔 感染，在每一次观察到发芽的时候，都是从非吞噬的分生孢子中发生的，萌发和菌丝的生长早在9-12 hpi就开始了(在3个独立的实验中注射了100多个胚胎发芽率观察)(见附图电影)。 SM1 , SM14 和 SM15 )。结果，就幼虫的存活而言，似乎取决于免疫细胞在随后的高度炎症反应中的成功程度，从而抑制菌丝的生长(图一)。 4B、C 和补充电影 SM1 , SM2 , SM14 和 SM15 )。观察到的更迅速的发展 A . 尼日尔 感染似乎与我们最初的观察结果一致 A . 尼日尔 比 A . 烟熏鱼 (无花果) 1 ).
图4 共聚焦显微镜捕捉不同的感染发展 A . 尼日尔 和 A . 烟熏鱼 . (A )胚胎和图中所示区域的示意图。( B )共焦时移显微镜下的静止图像(补充电影) SM1 )，描述了典型的快速发展。 A . 尼日尔 感染。150个分生孢子的5，10和15 HPI图像 A . 尼日尔 在TG( mpeg 1：EGFP )。15个HPI时，几个分生孢子萌发，菌丝生长明显。( C )数码放大补充电影中的静止图像 SM1 ，目的是捕捉大约9个HPI到13个HPI的两个分生孢子胞外萌发和菌丝生长的过程。( D )共焦时移显微镜下的静止图像(补充电影) SM3 )，描述了…的发展。 A . 烟熏鱼 注射150分生孢子后，5，10和15 HPI的感染 A . 烟熏鱼 在TG( mpeg 1：EGFP )。在时间流逝的最后，没有发现发芽的事件(补充电影)。 SM3 ). (E )高倍镜共聚焦显微镜显示 A . 烟熏鱼 TG后脑中的分生孢子( mpeg 1：EGFP 斑马鱼胚胎在150分生孢子感染后30h获得。在左面板，只有红色的荧光通道，可以看到几个菌丝突出从几个分生孢子(箭头)。在中央面板上，可以看到绿色通道巨噬细胞。在右面板上，绿色荧光通道明显地被吞噬并包含在巨噬细胞内。一种生长的菌丝可以伸展巨噬细胞(箭头)的膜。( B )在10个HPI图像中插入的白色框表示图像面板(C)中放大的区域。
自 A . 烟熏鱼 孢子在注射后即刻被巨噬细胞有效吞噬，其感染和致病性的发展与大鼠的不同是合理的。 A . 尼日尔 ..实际上，在分析的案例中， A . 烟熏鱼 发芽率和菌丝生长时间晚于 A . 尼日尔 (比较图) 4B，D )大约24-48小时(见补充电影) SM5 )。共焦显微镜显示，至少在某些情况下， A . 烟熏鱼 菌丝生长发生在被巨噬细胞吞噬的分生孢子上(见图)。 4E )。这是一个我们没有观察到的事件。 A . 尼日尔 感染，虽然我们不能排除它可能会偶尔发生。目的在时间推移电影中捕捉巨噬细胞吞噬后萌发和菌丝生长的事件，并进一步阐明中性粒细胞和巨噬细胞在防御中的作用。 A . 烟熏鱼 感染后，我们又进行了另一项实验，在24小时开始时间间隔采集，使用双荧光报告系跟踪巨噬细胞和中性粒细胞。持续时间为16小时(补充电影) SM5 )。在我们的解释中，这捕获了几个巨噬细胞，大量负载着 A . 烟熏鱼 分生孢子，吞噬巨噬细胞后，从巨噬细胞内萌发和生长菌丝的分生孢子。综上所述，这些观察表明这两种疾病的病理发展模式有着根本的不同。 曲霉 物种。鉴于 A . 尼日尔 似乎依赖于逃避先天免疫细胞足够长的时间来发芽和生长菌丝， A . 烟熏鱼 似乎能够抵御吞噬和生长菌丝，这将最终爆发通过吞噬细胞。这与成活率实验的结果吻合得很好，表明 A . 尼日尔 除非它的剂量能压倒免疫反应，否则几乎不会造成死亡。
半乳糖缺乏突变体 黑曲霉 和 烟曲霉 表现出弱毒力，但仍引起物种特异性天然免疫反应。 半乳糖，所有细胞壁的一种成分 曲霉 物种，已被证明存在于生命周期的所有早期阶段，包括休眠的分生孢子，萌发的分生孢子和生长的菌丝。 A . 烟熏鱼 31 ,32 ..不同的传染行为 A . 尼日尔 和 A . 烟熏鱼 ，我们希望研究与免疫系统相互作用的差异是否会影响gal的性质。 f 作为毒力因子。为了解决这个问题，我们比较了WT的致病性。 A . 尼日尔 和 A . 烟熏鱼 他们各自的Gal f 缺陷突变体 A . 尼日尔ΔUGMA 和 A . 烟曲霉ΔglfA )在控制和 聚氨酯 .1 击倒胚胎(图1. 5 )。结果清楚地表明，Gal f -两者缺乏症 曲霉 物种表现出弱致病性。就像WT菌株的情况一样，它对Gal的感染和致病性有保护作用。 F- 这两个物种的缺陷株显然依赖于功能正常的先天免疫系统，即免疫功能受损。 聚氨酯 .1 与免疫活性对照组相比，变形虫的死亡率明显增加(图1)。 5 )。时间推移共聚焦显微镜观察免疫细胞迁移反应 f 突变体似乎对它们各自的WT菌株产生类似的天然免疫反应(补充电影) SM6 –9 )。白细胞定量显示，与各自的亲本菌株相比，在7和24 HPI时，白细胞对突变体的迁移有相似的初始炎症反应(补充图)。 1 )。因此，Gal的致病性似乎并不减弱。 f 合成突变体与免疫细胞有着截然不同的相互作用。
图5 存活率分析显示半乳糖缺乏的致病性明显减弱。 曲霉 突变株对照存活(无吗啡)和免疫缺陷 聚氨酯 .1 150分生孢子感染斑马鱼胚胎 f 缺陷突变株 A . 尼日尔 或( A )和 A . 烟熏鱼 (B 28例HPF感染后24、48、72和96h进行生存监测(HPI)。每个图形显示三个独立生物副本的组合数据。用Mantel-Cox检验统计曲线比较，*p≤0，01；*p≤0，001*p≤0，0001.用Mantel-Haenszel法计算危险度。
半乳糖合成突变体毒力降低与菌丝生长缓慢有关 在研究突变真菌菌株的致病性时，值得注意的是，在Gal F- 两种缺失突变株 曲霉 物种，就像WT菌株一样，影响了几乎完全的死亡率。 聚氨酯 .1 在相同的传染负担下，它们的速度比WT菌株稍慢(图一)。 5A，B )。虽然胚胎的存活 f 缺乏真菌的菌株明显依赖于天然免疫系统的细胞，即使在缺乏功能性的天然免疫系统的情况下，这些真菌株的死亡率也有轻微的时间延迟，这表明真菌生理和生长所固有的元素是导致其毒力丧失的原因之一。有几种解释可以解释这一点，但很可能是Gal的致病性减弱。 f -缺乏 曲霉 菌株的萌发率下降或菌丝生长速率降低可能是引起菌丝生长的原因之一。 离体 增长率评估并没有显示Gal的增长率有任何重大的下降。 f 缺陷菌株(补充图) 2 )。为了在最合适的环境中，即在不受免疫细胞生长抑制的环境下，我们分析了同时获得的共焦延时视频，以跟踪wt和gal的萌发和生长。 F- 缺突变分生孢子 A . 尼日尔 和 A . 烟熏鱼 ，在 聚氨酯 .1 变形胚胎。对于每一种和每种基因型，我们根据第一次观察到的发芽事件来分析发芽的时间。 聚氨酯 .1 共聚焦时间推移显微镜捕捉的变形胚胎(图)。 6A，B )。这些试验结果表明，GAL在萌发时间上没有显着性差异。 f 这两种物种的缺失突变株和亲本菌株。平均发芽时间约14小时 A . 烟熏鱼 与宿主环境相比，在宿主环境中发芽所需的时间似乎更长。 A . 尼日尔 平均发芽时间为8h。在共焦时间推移显微镜序列中，分析帧间菌丝长度的增加，可以量化菌丝生长的近似速率。女孩 f 与WT相比，两种菌株的菌丝生长率均明显降低(图1)。 6C 和补充电影 SM10 –13 )。我们提出了Gal的衰减菌丝生长速率。 f -缺失突变株是其致病性下降的最可能原因。
图6 时间间隔显微镜 体内 半乳糖缺乏的发芽率和生长率表型分析 曲霉 突变株( A )注射150分生孢子后菌丝生长速率的时移显微镜观察。 A . 烟曲霉∆glfA 突变体 聚氨酯 .1 变形胚胎。上面的面板显示用红色荧光通道覆盖的明亮的场图。下面的面板显示一个特定区域的爆破，标记在上面的面板上，从红色荧光通道发出白色的信号。分析单个共焦重叠的平行时间间隔获取，以估计菌丝生长速率。(另见补充电影SM10 –13 ). (B )共焦堆叠中萌发时间的分析-时间推移显微镜实验比较 A . 烟熏鱼 和 A . 尼日尔 给他们各自的Gal f 在约150个分生孢子的传染性负担下缺乏突变株。在WT和GAL之间没有统计学上的显着性差异。 f 这两种物种中都存在缺陷菌株。( C )共焦堆菌丝生长速度的近似分析。从17-21独立菌丝生长测定得到的7-8种不同的地块 聚氨酯 .1 来自三个独立生物复制体的变形胚胎。两种半乳糖缺乏突变体 曲霉 菌丝伸长率明显降低。 体内 . (B ,C )每个散点图描述了从7-8个人生成的17-21个数据点。聚氨酯 .1 变形胚覆盖三个生物复制的每种和基因型。*p≤0，0001采用未配对t检验，威尔士校正。
