重叠基因对的分布与基因内SD基序 我们首先计算分析了720个细菌和考古学基因组中重叠基因对的含量和组织结构(见方法)。一方面，这些物种是为了代表所有主要的原核生物群，另一方面是为了避免对研究较多的群体进行过度抽样。对于每个基因组，我们确定了共方向重叠基因对(与任何长度的重叠)具有翻译耦合的潜力(补充数据)。 1 )。图形 2 显示24组原核生物共定向重叠基因对的平均分数。在这些群体中，这类基因对的比例接近15%。 蓝藻 ，<10%，4组均>20%，重叠率最高，为30%。 水族 ..因此，在大多数原核生物中~30%的基因和~60%的 水族 是以共同方向重叠的基因对组织起来的。
图2 24组原核生物720个基因组重叠基因对。部分重叠基因对(%)。显示了平均值和标准差。
为了进行比较，我们估计了“引导基因”的部分，即从相应上游基因的末端至少分离出200 nt的部分，从而排除了翻译耦合，并且需要重新启动。主要基因的比例一般在40%左右，其中25%在 水族 超过50% 蓝藻 (补充图。 1 )。重叠基因对和引导基因的部分加起来并不是100%，因为所有在给定基因和上游基因之间小于200 nt的不重叠基因都不包括在这些组中。
接下来，我们估计了位于上游基因3‘区域的SD基序重叠基因的部分，这意味着终止-重新启动。所有720种的结果包括在补充数据中。 1 ，24组原核生物的平均分数如图所示。 3A ..在24组中的20组中，组分在50%以上或在50%左右，在10组中，分数在70%以上或70%左右。因此，当基因重叠时，下游基因的起始密码子通常先于大多数古细菌和细菌的SD基序。只有三组的SD含量较低，即， 拟杆菌 10%， 衣原体 30%，以及 蓝藻 40%。因此，在这些组中，无论是否存在平移耦合，平移(Re)起始通常不需要SD基元。
图3 24组原核生物720个基因组的SD序列。 a 含有下游基因上游的SD基序的部分重叠基因对，位于上游基因的3‘-区域。给出了平均值和标准差。 b 先于SD基序的领先基因的分数。给出了平均值和标准差。 c 中所示值的商数 a 和 b ，它代表了重叠基因对下游基因的sd基序相对于领先基因的相对重要性。
为了进行比较，我们估计了先于SD基序的主要基因的分数。图形 3B 结果表明，主基因值的变化远大于重叠基因值。只有四组的平均值为70%或更高( 费米克特 , 镰刀菌 , 协同 ，和 温差 )，显示SD通常参与5‘-UTRs的新启动。五个组的分数约为20%或更少，即 晕古菌属 (包括。 阿西甸 和 硫虫 ), 拟杆菌 , 衣原体 ，和 蓝藻 .
为了预测SD基序在重叠基因对重新启动和引导基因重新启动中的相对重要性，计算了上述值的比值(商)(图1)。 3C )。对24组中的18组，商数约为1，表明SD基序在重叠基因的重新启动和5‘-UTRs重新启动的重要性相同。值得注意的是，没有一个群体有相当大的商<1.0。相反，四组的值为2.0或更高，表明SD基序对重新启动的重要性高于新生启动。
晕古菌和细菌不使用SD基元来重新启动。 26 ,27 它们的相关商值分别为3.5和2.0，似乎低于预期(图1)。 3C )。对SD基序组分的过度预测可能是造成这一差异的潜在原因。我们用16 SrRNA结合能<−8.4kcal/mol计算了“强”SD基序的组分。 28 ..对于重叠的基因对，强SD基序在所有已识别的SD实例中所占的比例相对较小(补充图)。 2A )，使群体之间有更好的区别。领先基因的下降更为明显(补充图)。 2B )。的值 晕古菌 和 细菌 接近于零，更好地符合人们的期望。为了探讨强SD基序在重叠基因和新生启动中的相对重要性，我们估算了这两个组分的商数(补充图)。 2C )。有6组的商数低于1.0，提示强烈的SD基序对新生启动的重要性高于对再启动的重要性。相对于24组中的12组，其值大于2.0，这与强SD基序对重启动的重要性大于新生启动的重要性相一致。
终止-在重叠基因的重新启动 H.火山ii 生物信息学分析表明，所有的原核生物都含有大量的重叠基因对。我们选择了两种模式生物进行实验，以确定(严格的)翻译耦合是否是原核生物中典型的重叠基因对。第一种是 H.火山ii ，是晕古菌的一个模式种，第二个种是 大肠杆菌 ，是研究最深入的细菌(见下文)。
四个基因对是从 H.火山ii 有四个核苷酸最常见重叠的基因组( A UG A )和五个或六个核苷酸的强SD基序。基因对编码脲酶的两个亚基，一个氨基酸结合蛋白/高丝氨酸脱氢酶和两对核糖体蛋白(补充表)。 1 )。上游基因和下游基因的5‘部分被克隆到表达载体中 H.火山ii ..下游基因被克隆为翻译融合到 DHFR (二氢叶酸还原酶)基因，常用作报告基因 H.火山ii 27 ,29 ,30 ..此外，突变版本的产生，其中包含一个停止密码子的5‘-部分的上游基因(图一)。 4A )。这种过早的停止阻止核糖体将上游基因翻译到基因重叠处。在所有情况下，DHFR的特异性活性用酶法进行量化(补充图)。 3A )，以及 DHFR 转录水平用Northernblotting定量(补充图)。 3B )。这些值被用来计算平移效率，在所有情况下，转换效率都被归一化为缺少停止密码子的版本(如图所示)。 4B )。在所有4种情况下，包含终止密码子的翻译效率接近于零，表明在这4对基因上存在严格的翻译偶联，下游基因的翻译完全依赖于上游基因的翻译。值得注意的是，下游基因的dd基序没有发生新的启动，这与以下事实一致：在哈洛古菌中，dd基序在5‘-utrs的新翻译启动中是不起作用的。 27 ..为了扩展这一分析，我们选择了另外一个没有重叠的基因对，而是一个短的10 nt的基因间区。 亚麻1 -亚麻A2 )(补充表 1 )。与重叠基因对相似的是，在这种情况下，翻译效率的量化结果表明下游基因的翻译严格依赖于上游基因的翻译。 4B ).
图4 通过Tere机制的平移耦合 H.火山ii 和 大肠杆菌 . a 的构造示意图概述 H.火山ii ..本机重叠的基因对以洋红和蓝色表示， DHFR 报告基因显示为绿色。基因内的SD基序由一个黄色的条表示。指出了设计的早熟终止密码子。 b ..没有早熟终止密码子(-)和终止密码子变异体(+)的自然基因对的归一化翻译效率。基因对的名称显示在下面。给出了三种生物复制的平均结果及其标准偏差。源数据作为源数据文件提供。 c 构造的示意图 H.火山ii ..本地上游基因在洋红中显示， DHFR 报告基因显示为绿色。基因内的SD基序由一个黄色的条表示。指出了设计的早熟终止密码子。 d 不存在早熟终止密码子(−)和终止密码子变异体(+)的自然基因的归一化翻译效率。基因的名称显示在底部。给出了三种生物复制的平均结果及其标准偏差。源数据作为源数据文件提供。 e 的构造示意图概述 大肠杆菌 ..本机重叠基因对以洋红和蓝色表示，glpD报告基因以紫色表示， DHFR 报告基因显示为绿色。基因内的SD基序由一个黄色的条表示。指出了一个停止密码子的存在。 f 归一化 glpD 缺乏终止密码子(−)和终止密码子变异体(+)的天然基因对的翻译效率。基因对的名称显示在下面。给出了三种生物复制的平均结果及其标准偏差。源数据作为源数据文件提供。 g 归一化 古萨 缺乏终止密码子(−)和终止密码子变异体(+)的天然基因对的翻译效率。基因对的名称显示在下面。给出了三种生物复制的平均结果及其标准偏差。源数据作为源数据文件提供
接下来，我们旨在阐明重叠基因对中的5‘-部分下游基因是否需要翻译偶联，或者耦合是否仅编码在上游基因中。为此，我们选择了另外四个基因对，并将上游基因直接融合到 DHFR 记者基因(图1. 4C )。两个基因对有四个核苷酸重叠，一个有一个核苷酸重叠，另一个含有一个核苷酸的基因间区域(补充表)。 1 )。再次，突变被用于生成包含停止密码子的变体，以及 DHFR 转录和DHFR蛋白以及翻译效率被量化的所有8个变体(补充图)。 3 、图1. 4D )。在所有四个基因对中，下游 DHFR 当核糖体被过早阻止密码子到达重叠时，基因就没有被翻译出来。这些结果表明，上游基因的序列足以进行偶联。这些发现共同验证了9个被分析的基因对中的9个严格的翻译耦合。 H.火山ii ..据我们所知，这些结果是第一次在古细菌中进行翻译耦合的实验演示。
终止-在重叠基因的重新启动 大肠杆菌 平移耦合 大肠杆菌 在某种程度上，过去一直是如此。然而，通常情况下，在这样的实验中，病毒或真核细胞基因被使用，而转录水平没有被分析。因为文字记录的稳定性 大肠杆菌 受到翻译效率的显著影响 31 ,32 ,33 目前尚不清楚，这些先前的研究是否真的量化了翻译耦合，或转录稳定性，或两者的混合物。因此，我们决定对基因对的翻译偶联进行量化。 大肠杆菌 具体考虑如下：(1)对天然细胞基因对进行了研究，(2)使用了最常见的四个核苷酸重叠的基因对，(3)定量了转录水平和蛋白质水平，(4)选择了不同强度的SD基序。
选择5个基因对进行实验分析(补充表) 1 )。基因对编码氢化酶的两个亚基、脱氢酶的两个亚基、生物素合成酶的两个亚基、两个假想的蛋白质和一个威胁蛋白生物合成酶的两个亚基。将这五个基因对的重叠区域克隆到一个双报告基因载体中。 4E )。因此，在 glpD 上游基因报告基因和报告基因下游基因报告基因 古萨 ..同时，对于 大肠杆菌 分别制备并比较了含有终止密码子和终止密码子缺失突变体的基因对.最初，使用基因对的整个orfs。然而，事实证明，含有终止密码子的转录本受到了强烈的破坏，以至于无法检测到完整长度的双顺反子转录本，从而阻碍了翻译效率的量化。因此，将克隆的区域修剪到上游基因的最后99 nt和下游基因的前30 nt。这种安排稳定了转录本，同时仍然保证核糖体在假定的终止和重新启动过程中完全与本地基因序列结合。对所有10个结构，用酶法测定GlpD和Gusa蛋白水平，用Northern blotting定量双顺反子转录本的水平。 glpD -和 古萨- 特殊探针(附图) 4 )。为 喜福 基因对，一个终止密码子的引入极大地破坏了双顺反子转录本的稳定性，而相反，它稳定了双顺反子转录本。 门冬氨酸 基因对。另外三对基因的转录水平相近。这些结果强调了文本水平分析在衡量翻译效率时的重要性。
蛋白质和转录水平被用来计算翻译效率。 4F，g )。对于所有基因对，含有终止密码子的变异体中的GlpD水平至少与缺乏终止密码子的变异体一样高。令人惊讶的是，在 喜福 ，一个停止密码子的引入使GlpD的数量增加了四倍以上。最有可能的解释是HyfH的C末端降低了融合蛋白中GlpD的特异性活性。
量化 古萨 翻译效率没有产生一致的结果。在三种情况下，下游基因在含有终止密码子的变异体中的翻译量极低或无法检测，这表明存在较强的翻译耦合。 喜福 , astDB ，和 ydbh/ynbE ..为 门冬氨酸 基因对翻译偶联约占下游基因启动率的60%，而近40%依赖于新启动。转换耦合似乎不发生在 生物BF 基因偶联，但当核糖体没有达到包含终止密码子的变异体的重叠时，可观察到完全的翻译效率。这个结果特别令人惊讶，因为 生物F 基因之前有一个非常弱的SD基序，它不会被期望介导有效的新的启动(补充表)。 1 )。总之，除了一个例外，分析的基因对来自 大肠杆菌 在双报告基因系统中表现出翻译偶联。
Shine-Dalgarno基序在终止-再启动中的作用 我们的下一个目标是分析上游基因中的sd基因内基序是否对终止-重新启动是重要的，甚至是必要的。 H.火山ii 和/或在 大肠杆菌 ..为此，从7个基因对中去除了sd基序。 H.火山ii (补充表) 2 ，以及无花果。 5A，c )。如上所述，DHFR蛋白水平和 DHFR 转录水平量化(补充图)。 5 )。除了一个例外，文字记录的水平几乎是一致的。将SD基元移除 rpl 15 导致成绩单水平增加了三倍以上，再次强调了成绩单分析的重要性。这些结果被用来计算平移效率(图)。 5B，d )。在任何情况下，下游基因的翻译都没有被消除，表明sd基序不是终止-重新启动所必需的。 H.火山ii ..重新启动效率是高度可变的，并取决于单个基因对。在两种情况下，在没有SD基元的情况下重新启动的效率降低了大约80%，这表明SD母题的重要性很高(GLNP 和 H.P )。在三种情况下，重新启动效率降低了约50%，在一种情况下，只有20%。SD基序的贡献与SD模体长度或SD基序与起始密码子之间的距离等特征之间没有相关性。例如, GLNP 和 CNA 两者都含有一个5 nt的SD基序，SD基序和起始密码子之间的距离相同，但重启动的效率差别很大(图1)。 5D )。令人惊讶的是，在其中一个案例中， rpl30/rpl15 基因对，SD基序的突变导致重组效率显著提高(图一)。 5B )。似乎SD母题对终止重新启动的效率的贡献 H.火山ii 是高度可变的，这意味着额外的序列，可能是那些围绕SD基序，实质上影响平移耦合。这些结果也强调了分析多对天然基因对理解翻译耦合机制的重要性。
图5 SD主题对于终止-重新启动的重要性。 a 的构造示意图概述 H.火山ii ..本机重叠的基因对以洋红和蓝色表示， DHFR 报告基因显示为绿色。基因内的SD基序由一个黄色的杆状体表示，该条在SD突变体中是交叉的。 b 含有(+)或缺失(−)SD基序的天然基因对的归一化翻译效率。基因对的名称显示在下面。给出了三种生物复制的平均结果及其标准偏差。源数据作为源数据文件提供。 c 的构造示意图概述 H.火山ii ..本地上游基因在洋红中显示， DHFR 报告基因显示为绿色。基因内的SD基序由一个黄色的杆状体表示，该条在SD突变体中是交叉的。 d 包含(+)或缺少(−)的SD基序的规范化翻译效率。基因的名称显示在底部。给出了三种生物复制的平均结果及其标准偏差。源数据作为源数据文件提供。 e 的构造示意图概述 大肠杆菌 ..本机重叠基因对以洋红和蓝色表示，glpD报告基因以紫色表示， DHFR 报告基因显示为绿色。基因内的SD基序由一个黄色的杆状体表示，该条在SD突变体中是交叉的。 f 归一化 glpD (+)或不含(−)SD基序的天然基因对的翻译效率。基因对的名称显示在下面。给出了三种生物复制的平均结果及其标准偏差。源数据作为源数据文件提供。 g 归一化 古萨 (+)或不含(−)SD基序的天然基因对的翻译效率。基因对的名称显示在下面。给出了三种生物复制的平均结果及其标准偏差。源数据作为源数据文件提供
其次，SD主题对于终止-重新启动的重要性 大肠杆菌 用5个基因对的无SD突变体进行分析。 5E ，补充表 2 )。对本地基因和无SD突变体的转录和蛋白质水平进行了量化(补充图)。 6 )。转录水平非常相似，只有一个例外。将SD基元移除 门冬氨酸 导致成绩单水平增加了两倍以上。这表明，仅仅6个核苷酸对一个大约2000 nt的大转录本的稳定性有多大的影响。蛋白质和转录本的定量结果被用来计算翻译效率。 5F，g )。一个基因对( ydbh/ydbe )，SD主题被证明是重新启动所必需的。在其他三种情况下，去除SD使重新启动的效率降低了60-90%，显示出SD主题的高度重要性。 生物BF 基因对再生无影响。然而， 生物BF 是唯一的情况，因为对停止密码子变体的分析表明，至少在被分析的结构中，没有发生平移耦合，而是将 生物F 重新启动(图1. 4G ).
加在一起，类似于 H.火山ii ，得到的结果与5 大肠杆菌 基因对还表明，SD基序对终止-再启动的贡献取决于单个基因对，从严格意义上说是基本的，也可能是不重要的。尽管如此，在5个分析中有4个大肠杆菌 基因对、SD基序的去除大大降低了再启动的效率。
Tere的推测机制 大肠杆菌 在……里面 H.火山ii ，SD基序在5‘-UTRs上不起作用，因此，没有理由相信它会在重叠的基因对上介导新的启动。相反，在 大肠杆菌 SD基序在5‘-UTRs处介导新的启动，因此，在基因重叠的基因内SD基序也可能发生新的启动。因此，必须防止在这些地点重新启动，以实现平移耦合。我们假设局部RNA结构可能会阻止下游基因的重新启动，为了验证这一假设，将5个基因对的克隆区域折叠在Sio(补充图)中。 7 )。为 喜福 , astDB ，和 ydbh/ynbE ，稳定的双链结构预测在或非常接近TIR，这可以解释DO新启动在各自的下游基因(补充图)。 7 )。预测结构 生物BF 不包括延伸双链区域周围的国际公路(补充图)。 7 )，这与实验观察到的新起爆是一致的。预测结构 门冬氨酸 包括中间长度的双链区域(附图)。 7 )，这可能是部分抑制的原因。总之，5对基因重叠周围的mRNAs结构预测结果与实验结果一致。
