半胱氨酸氧化对人肺泡ⅱ型细胞DJ-1细胞保护功能的影响 - ELISA试剂盒,酶免试剂盒,酶联免疫吸附试验, ELISA实验,ELISA,双抗体夹心法,科研蛋白,抗体,细胞系,武汉新启迪生物科技有限公司

摘要

DJ-1是一种多功能蛋白质，具有细胞保护功能。它位于细胞质、细胞核和线粒体中。DJ-1中106位(Cys106)的保守半胱氨酸残基作为氧化还原状态的传感器，可以被氧化成亚硫酸盐(-SO2−)和磺酸盐(-SO3−)表单。DJ-1与CyS106-s02−具有细胞保护活性，但高水平的活性氧可诱导其过度氧化为Cys106-SO3−。我们发现从肺气肿患者中分离的肺泡ⅱ型(ATII)细胞氧化应激增加，由4-HNE表达确定。DJ-1与CyS106-s03−通过质谱分析在这些细胞中检测到。此外，Cys106-s0的泛素化3−DJ-1被鉴定，这表明这种氧化亚型是蛋白酶体破坏的目标。此外，我们使用氢进行控制氧化2O2用CRISPR-Cas9策略产生DJ-1敲除的A549细胞。DJ-1致敏细胞对氢诱导的细胞凋亡缺乏2O2如通过流式细胞术分析使用膜联蛋白V和碘化丙锭检测的。这种治疗还降低了线粒体脱氧核糖核酸的数量和线粒体ND1 (NADH脱氢酶1，亚单位1)基因的表达，并增加了线粒体脱氧核糖核酸的损伤。与过氧化DJ-1细胞保护功能下降一致，重组Cs106-s03−DJ-1表现出热解折叠转变的损失，光盘光谱学中二级结构的轻微减少，以及皮秒-纳秒时间尺度动力学的增加，这是用核磁共振测定的。总之，我们的数据表明肺气肿患者ATII细胞中极高的氧化应激诱导DJ-1过度氧化为Cys106-SO3−形式，导致增加的蛋白质灵活性和其细胞保护功能的丧失，这可能有助于这种疾病的发病机制。

介绍

肺气肿是一种威胁生命的疾病，主要由吸烟引起1,2,3。它与肺泡壁破坏有关，对这种疾病的有效治疗非常有限。肺泡ⅱ型(ATII)细胞具有干细胞潜能，它们在损伤后增殖并恢复上皮4。香烟烟雾中活性氧的过量产生和它们通过抗氧化防御系统的消除之间的不平衡会导致氧化应激5,6,7。活性氧可以靶向并改变细胞大分子，如蛋白质、脂质和脱氧核糖核酸，并导致肺病，包括肺气肿的发展8,9。ATII细胞具有非常高的新陈代谢率，因此，它们的功能在很大程度上依赖于线粒体10在能量生产、新陈代谢、氧化应激调节、细胞增殖和死亡中起着至关重要的作用11。活性氧可以破坏线粒体蛋白质，导致蛋白质错误折叠和聚集。已经表明氧化和受损线粒体蛋白的积累与肺部疾病有关12。

DJ-1位于细胞质、细胞核和线粒体中，可以在不同的隔室中发挥特定的细胞保护功能13。据报道，这种蛋白质在氧化应激条件下转移到线粒体，有助于神经保护14。它还通过参与氧化应激反应参与线粒体动力学的调节15。人DJ-1有三个半胱氨酸残基:半胱氨酸46、半胱氨酸53和半胱氨酸1613。Cys106是最具活性的残基，允许DJ-1作为细胞氧化还原状态的传感器16,17。Cys106突变为丙氨酸(C106A)导致DJ-1对氧化应激的细胞保护活性丧失13,18。部分原因是其pK低a值，Cys106作为反应性硫醇盐存在19可以被氧化成亚硫酸盐(-SO2−)16,20或磺酸盐(-SO3−)表单17。DJ-1容易氧化成Cys106-s02−形式，它是一种稳定的形式，与DJ-1的细胞保护活性相关21。然而，由非常高的氧化应激诱导的DJ-1过度氧化导致Cys106至CyS106-s0的改变3−17。这种不可逆的形式被认为可以使DJ-1功能失活22,23,24；然而，这一机制还没有得到很好的理解。循环s106-s0的累积3−DJ-1与氧化应激是病理生理学一部分的疾病发展相关25。我们最近报道了DJ-1对吸烟者ATII细胞损伤的细胞保护作用26。在从肺气肿患者分离的ATII细胞中观察到低DJ-1水平和高脱氧核糖核酸损伤27,28。此外，我们报道了暴露于香烟烟雾中的DJ-1 KO小鼠比野生型小鼠具有更高的炎症反应。然而，DJ-1在线粒体中发挥作用的分子机制及其对肺氧化应激的反应仍然很难确定。

在这里，我们使用了从对照器官捐献者和肺气肿患者中获得的人类原代ATII细胞，并首次报道了DJ-1在这种疾病中的过度氧化。此外，我们还发现了Cys106-s0的构象变化3−DJ-1，其可降低DJ-1对香烟烟雾诱导的氧化应激的细胞保护功能。

材料和方法

从对照器官捐献者和肺气肿患者中分离ATII细胞

肺是通过生命礼物基金会(宾夕法尼亚州费城)、国家疾病研究交流中心(NDRI)和国际医学进步研究所(IIAM)从不适合移植的器官捐赠者那里获得的。对照非吸烟者是指从不吸烟的人，对照吸烟者至少有3年每天0.5-1包的吸烟史。肺气肿患者的肺是通过坦普尔生物银行(宾夕法尼亚州费城坦普尔大学)获得的。我们使用了每组3-7个人的肺组织，55-69岁，包括女性和男性。我们如前所述分离了ATII细胞29。简言之，在滴注12.9 U/ml弹性蛋白酶(沃星顿，莱克伍德，新泽西州)后，将肺切碎，然后离心收集细胞悬浮液。用Optiprep(纽约韦斯特伯里精确化学科学公司)制造的密度梯度过滤和纯化细胞。如我们所报道的，我们使用EpCAM(米尔顿尼生物技术有限公司，奥本，加利福尼亚州)阳性选择，并且通过流式细胞术分析使用前SP-C抗体测定，分离的ATII细胞的纯度高于90%29。肺气肿受试者在手术前提供了使用这些标本的书面知情同意书以及研究所需的相关临床和放射数据。这项研究是根据赫尔辛基宣言进行的，并得到了伙伴医疗保健机构审查委员会和坦普尔大学人类受试者保护委员会的批准。

DJ-1敲除细胞系

A549细胞系是ATII细胞的模型，保存在杜尔贝科改良的鹰培养基(DMEM)中，补充了10%胎牛血清(来自新罕布什尔州汉普顿费希尔科学公司)和100 U/ml青霉素-链霉素(宾夕法尼亚州匹兹堡通用健康生命科学公司)。使用CRISPR-Cas9系统和pX330载体(马萨诸塞州沃特敦Addgene)建立DJ-1敲除(KO)的A549细胞，该载体编码Cas9核酸酶表达盒和引导核糖核酸克隆盒。使用CRISPR设计选择外显子2中靶向5ʹ-AGTACAGTGTAGCCGTGATG-3ʹ和3ʹ-TGCAAGCGCAAACTCGAAGC-5ʹ的两种DJ-1导向RNA，并将其连接到pX330 CRISPR核酸酶载体中。用产生的pX330-RNAg载体转染A549细胞24小时。收获细胞并使用FACS-VantageSE/DiVa细胞分选仪(新泽西州富兰克林湖，BD)分选GFP阳性克隆。DJ-1 KO单克隆A549细胞系通过使用DJ-1抗体的蛋白质印迹验证(德克萨斯州达拉斯圣克鲁斯生物技术公司)。用4 × 10平板法比较对照A549细胞和DJ-1 KO培养的A549细胞的生长情况4每1.9厘米细胞数2放在平板上分析3天。

野生型全长DJ-1序列被克隆到pcDNA3.1 His标签质粒中。C106A突变体是通过定点诱变在106位用丙氨酸取代半胱氨酸而产生的。质粒使用Midi制备试剂盒(生物科学、派拉蒙、加州)纯化。使用1∶12质粒∶聚乙烯亚胺(PEI 25K；宾夕法尼亚州沃林顿多科学公司)，并在转染前在室温下孵育15分钟30。用PEI 25 K复合物和质粒转染细胞，并在37℃下孵育24小时。转染效率通过荧光显微镜(宾夕法尼亚州奥林巴斯中心谷)使用麦克亨利-N1表达质粒(加州山景城克隆技术实验室有限公司)测定。

用1毫摩尔氢处理A549细胞和含有DJ-1 KO的A549细胞2O2(西格玛，圣路易斯，密苏里州)如前所述31,32,33,34用于分析DJ-1氧化的指定时间。用50 M博莱霉素(开曼化学公司，安阿伯，密歇根州)处理细胞2小时。用0.01毫克/毫升Hoechst 33342和0.001毫克/毫升碘化丙锭(PI；来自密苏里州圣路易斯西格玛)。在三个独立实验中，我们使用荧光显微镜(奥林巴斯，中央谷，宾夕法尼亚州)分析了300个细胞。

蛋白质印迹

匀浆的肺组织或细胞裂解物补充磷酸酶和蛋白酶抑制剂(均来自金生物技术公司、奥利韦特公司、密苏里州)。蛋白质印迹是按照我们之前描述的进行的26。简而言之，使用8-16%的聚丙烯酰胺凝胶(加利福尼亚州卡尔斯巴德的Invitrogen公司)来分离蛋白质。我们使用了GAPDH(马萨诸塞州剑桥市阿卡姆)、4-HNE(加利福尼亚州伯林加姆市珀西皮奥生物科学公司)、Cys106-氧化DJ-1(加利福尼亚州赫拉克勒斯市Bio-Rad市HCA024)。β-肌动蛋白(西格玛、圣路易斯、密苏里州)、层粘连蛋白B1、汤姆20、DJ-1、His-tag、VDAC1、IKBα、COX和PDI(均购自德克萨斯州达拉斯圣克鲁斯生物技术公司)。辣根过氧化物酶结合的亲和驴IgG是从杰克逊免疫研究(宾夕法尼亚州西格罗夫)获得的。然后根据制造商的说明(美国制药生物技术公司，新泽西州皮斯卡塔韦)，使用增强化学发光蛋白质印迹试剂盒开发印迹。使用ImageJ软件对图像进行定量。

氧化谷胱甘肽(GSSG)/谷胱甘肽(谷胱甘肽)测量

A549细胞用1毫摩尔氢处理2O2在指定的时间。孵育后，用磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞。氧化谷胱甘肽(GSSG)与总谷胱甘肽(谷胱甘肽)的比率是根据制造商的说明使用Glo分析(普罗姆加，麦迪逊，威斯康星州)估算的。

线粒体基因数量与线粒体基因损伤

线粒体脱氧核糖核酸(mtDNA)量和mtDNA损伤通过定量聚合酶链反应进行评估，并计算为Ct比值短mtDNA片段/Ct短核脱氧核糖核酸片段和Ct长mtDNA碎片/Ct短mtDNA片段，各自地35,36。基因组脱氧核糖核酸是从A549细胞和DJ-1 KO A549细胞中分离出来的。使用SYBR绿色主混合物和第一步实时聚合酶链反应系统(应用生物系统公司，加利福尼亚州福斯特市)在下列条件下进行定量聚合酶链反应扩增:95℃/10分钟，随后是45个95℃/15秒、58℃/60秒和68℃/150秒的循环，在熔化曲线95℃/15秒、60℃/15秒+ 3%增量至95℃之前。显示了mtDNA量和mtDNA损伤的定量分析。

实时聚合酶链反应

根据制造商的建议，使用快速核糖核酸微制备(酵母研究，欧文，加利福尼亚州)从A549细胞和A549细胞中分离总核糖核酸，其中DJ-1 KO。核糖核酸用上标ⅳ第一链合成系统转化为互补脱氧核糖核酸。DJ-1和ND1的表达通过使用SYBR绿色主混合物的逆转录聚合酶链反应和使用下列条件的第一步实时聚合酶链反应系统(应用生物系统，加利福尼亚州福斯特市)来测定:95℃/10分钟，随后是45个95℃/15秒、58℃/60秒和68℃/20秒的循环，在熔化曲线95℃/15秒、60℃/15秒+ 3%增加到95℃之前https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/)并从Invitrogen(加利福尼亚州卡尔斯巴德)订购。引物的序列在补充表中提供1。基因表达的相对倍数变化用2ddCt方法。

亚细胞级分制备

亚细胞级分如前所述制备37。简而言之，A549细胞被重新悬浮在含有10毫摩尔HEPES、0.5毫摩尔EGTA、2毫摩尔乙二胺四乙酸、250毫摩尔蔗糖、10毫摩尔差热、蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(金生物技术公司，奥利韦特，密苏里州)的分级缓冲液中。细胞裂解物以1000 ×离心g20分钟。收集上清液，通过顺序离心和超速离心步骤分离细胞溶质、线粒体和内质网部分。将细胞沉淀重新悬浮在由20毫摩尔HEPES、400毫摩尔氯化钠、1毫摩尔乙二胺四乙酸、1毫摩尔EGTA、1毫摩尔差热、蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物组成的缓冲液中，并以14，000转/分钟离心10分钟，得到作为核级分的上清液。层粘连蛋白B1和κB-α、柯克斯和PDI抗体(圣克鲁斯生物技术)分别用于检测核、细胞质、线粒体和内质网部分。

免疫组织荧光

分析了氧化DJ-1形式在用1mM·H处理的培养A549细胞中的定位2O2如上所述。细胞用4%多聚甲醛固定，用0.2% Triton X-100渗透，用3%正常驴血清封闭(杰克逊免疫研究，宾夕法尼亚州西格罗夫)。将细胞与Cys106氧化的DJ-1(加利福尼亚州，大力士州，生物拉德)和Tom20(德克萨斯州，达拉斯，圣克鲁斯生物技术公司)抗体孵育过夜。将二级抗体阿列克谢·弗洛488和阿列克谢·弗洛594 IgG(加利福尼亚州卡尔斯巴德的Invitrogen)施用1小时。然后将细胞用含有DAPI(马萨诸塞州剑桥的阿卡姆)的维克塔什菲尔德培养基固定，并使用荧光显微镜(奥林巴斯)进行分析。我们还使用从不吸烟者、吸烟者和肺气肿患者身上获得的肺组织分析了ATII细胞中DJ-1的氧化。切片被固定在4%多聚甲醛中(电子显微镜科学，哈特菲尔德，宾夕法尼亚州)，包埋在石蜡中，脱蜡并水合，然后如我们前面所述进行抗原回收27。使用SP-A(诺维斯，生物制品，利特尔顿，一氧化碳)鉴定ATII细胞，然后如上所述与阿列克谢·弗洛647孵育。

质谱分析

使用DJ-1抗体进行免疫沉淀，通过质谱分析分析其在来自对照非吸烟者、吸烟者和肺气肿患者的新分离的ATII细胞中的氧化状态。在第二种方法中，使用这种方法，从培养的A549细胞获得的线粒体部分用于测定23 kDa和15 kDa条带中的蛋白质含量。质谱分析采用标准蛋白质鉴定策略38,39。胰蛋白酶消化用于分析由液相色谱-质谱/质谱(液相色谱-串联质谱)运行产生的质谱/质谱(串联质谱)。

流式细胞术分析

氢处理DJ-1 KO对野生型A549细胞和A549细胞的生存力2O2使用与Alexa Fluor 488共轭的膜联蛋白V和1 μg/ml碘化丙锭(PI)测定24小时。如我们之前所述，在染色前，按照制造商的说明对细胞进行胰蛋白酶处理和PBS洗涤6。细胞死亡用LSR-ⅱ流式细胞仪(加州圣何塞生物科学公司)和弗洛乔(树之星)进行分析。我们还使用DCF-DA (2，7-二氯荧光素二乙酸酯，西格玛，圣路易斯，密苏里州)探针测定了活性氧的产生。简而言之，用质粒构建体(pcDNA3.1空载体、WT DJ-1和C106A DJ-1)转染含有DJ-1 KO的A549细胞24小时2O2或者50 M博莱霉素。如上所述，使用LSR-ⅱ流式细胞仪进行分析。

DJ-1纯化和Cys106控制氧化

未标记且一致15如前所述表达和纯化标记的人DJ-121,40。简而言之，DJ-1在pET15b(德国达姆施塔特EMD Millipore)中由异丙基β-表达D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)在BL21(DE3)中的诱导大肠杆菌鲁利亚-贝尔塔尼培养基用于生产未标记的蛋白质和含有20%葡萄糖和0.1%(重量比)的M9基本培养基15新罕布什尔州4氯(剑桥同位素，特克斯伯里，马萨诸塞州)用于均匀生产15核磁共振用标记蛋白质。用镍纯化DJ-12+-NTA金属亲和树脂(西格玛，圣路易斯，密苏里州)和六组氨酸标签用凝血酶除去，如前所述41。DJ-1在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中以单一条带形式运行，并储存在储存缓冲液(25毫摩尔HEPES-NaOH pH 7.5，100毫摩尔KCl，3毫摩尔二硫苏糖醇)中。

将DJ-1氧化成Cys106-s03−形式，储存缓冲液中的DTT通过对储存缓冲液进行透析来去除。H2O2(马萨诸塞州沃尔瑟姆热费希尔科学公司，30%)加入到最终摩尔比为100∶1小时2O2:DJ-1单体和样品在室温下孵育2.5小时。通过使用P6-DG树脂(Bio-Rad，Hercules，CA)离心脱盐除去未反应的过氧化物。在内布拉斯加州氧化还原生物中心质谱核心设施中，蛋白质的氧化状态通过完整质量和胰蛋白酶化电喷雾质谱得到证实。质谱确认Cys106被氧化成–s03−并且另外两个半胱氨酸残基(C46和C53)被%3C5%氧化。

DJ-1核磁共振弛豫测量

二维(2D)1H-15如前所述，在37℃收集异核单量子相干(HSQC)光谱42,43来自统一15被标记的DJ-1被还原或过度氧化成CyS106-s03−2D1H-15HSQC光谱是在700兆赫的布鲁克·阿凡斯三号光谱仪上收集的，该光谱仪装有一个5毫米的四重共振QCI-珀低温探针(1h .13c .15n，和31p)与z-轴梯度。订单参数(S2)是从化学交换饱和转移(CEST)导出的r1和r2使用快速无模型的弛豫速率和异核NOE值44如前所述42。

DJ-1的二级结构及热稳定性分析

简化或循环s106-s03−DJ-1透析到10毫米磷酸钾缓冲液中，缓冲液的酸碱度= 7.0，稀释到12.5微米单体浓度，并置于1毫米光程的石英试管中，以获得远紫外圆二色光谱。使用雅斯库J-815光盘光谱仪(雅斯库公司，美国马里兰州伊斯顿)采集光盘光谱，并如前所述标准化为总蛋白质浓度40。

如前所述，使用扫描荧光测定法和赛普罗橙测定热稳定性40。荧光随温度变化的一阶导数图(dF/dT)用于可视化熔化转变。

统计分析

我们使用单向方差分析来评估实验组之间的统计差异。的价值P%3C 0.05被认为是重要的。数据显示为至少三个独立实验的平均s.e.m .

结果

肺气肿患者ATII细胞中DJ-1的过度氧化

分析了来自不吸烟者、吸烟者和肺气肿患者的新分离的ATII细胞中的氧化应激(图1a)。与对照组不吸烟者相比，我们发现在从肺气肿个体分离的ATII细胞中4-HNE表达更高，这是脂质过氧化产物的标志1b)。DJ-1具有氧化还原敏感的Cys106，这对于其细胞保护功能至关重要，并且可以被氧化13。我们免疫沉淀DJ-1，通过质谱分析确定其在新分离的ATII细胞中的氧化状态和Cys106翻译后修饰。我们检测到106-100秒3−在DJ-1肽AICSO3肺气肿患者中的AGPTAL(图1c)。我们的数据显示赖氨酸在DJ-1肽ILKEQENRK的99位泛素化Ub胶质细胞(图1d)。值得注意的是，我们没有在ATII细胞中检测到这些DJ-1翻译后修饰，这些修饰是从对照的不吸烟者或吸烟者获得的。我们的结果还表明了Cys106-s0的存在2−在国际建筑学会SO2对照组吸烟者中的精氨酸加压素肽(补充图1)。我们没有通过质谱分析检测到这种DJ-1形式的泛素化，这表明这种活性蛋白形式对氧化还原稳态的扰动有反应。Cys106-SO2−在从不吸烟者中分离的ATII细胞中没有观察到DJ-1。从非吸烟者、吸烟者和肺气肿患者中鉴定出ATII细胞中不同的Cys106氧化状态，确定DJ-1的处理不会导致Cys106的人为过度氧化，否则在对照ATII细胞中不会观察到Cys106的减少。我们的结果表明肺气肿ATII细胞中的高氧化应激可能导致DJ-1过度氧化为Cys106-SO3−表格。

肺气肿ATII细胞线粒体DJ-1的氧化

由于检测到DJ-1在ATII细胞中的氧化，我们想确定DJ-1在线粒体部分的氧化状态，线粒体部分来自对照组非吸烟者、吸烟者和肺气肿患者的肺组织。我们通过蛋白质印迹发现在该疾病中存在裂解的DJ-1和氧化的Cys106(图1e，f)。我们只看到了社会性别歧视的趋势2−而且——所以3−使用重组蛋白和该抗体的氧化状态(补充图2)。我们在人肺组织中进行免疫组化荧光，使用甲状旁腺素作为ATII细胞的标记物，用Tom20来鉴定线粒体(图。第一代)。与对照组相比，我们发现肺气肿ATII细胞线粒体中Cys106-氧化的DJ-1水平较高，如氧化的DJ-1与Tom20共定位所示(图。1h)。我们的结果表明肺气肿的氧化应激导致线粒体DJ-1氧化，这可能导致线粒体功能障碍。

DJ-1的细胞保护作用

野生型A549细胞系被用作确定DJ-1氧化的生物学后果的模型。我们发现1毫米高2O224 h后A549细胞活力显著下降(图2a)。为了进一步了解DJ-1的作用，我们通过蛋白质印迹法测定了它在A549细胞裂解物中的表达。我们分析了还原DJ-1和Cys106-氧化DJ-1的表达(图2b)。我们发现在3小时后和用1毫摩尔氢处理4小时后，氧化DJ-1与还原DJ-1的比率有统计学上的显著增加2O2(图2c)。

我们进一步关注了由氢引起的细胞损伤的早期事件2O2以确定DJ-1功能的机制。在用1毫摩尔氢处理的A549细胞中测定氧化应激2O2在指定的时间。GSSG/谷胱甘肽比率(图2d)表明其以时间依赖的方式增加，我们发现在2、3和4小时后氧化应激水平有统计学意义。我们还通过逆转录聚合酶链反应分析了A549细胞中DJ-1的水平。如图所示2e用氢处理细胞2O22、3和4小时后DJ-1基因表达增加。我们的数据表明DJ-1在氧化应激下介导的细胞反应。

Cys106在DJ-1中的作用

我们使用CRISPR-Cas9策略产生了DJ-1敲除的A549细胞(A549 DJ-1 KO)(补充图。3)以进一步确定DJ-1中Cys106的功能。我们用1毫摩尔的DJ-1 KO处理A549细胞和A549细胞2O2随后进行流式细胞术分析(图2f)。与对照细胞相比，我们发现DJ-1敲除显著增加A549细胞的细胞死亡(图2g)。此外，用氢处理后，DJ-1 KO A549细胞的细胞死亡增加2O2。由于这些结果表明DJ-1对氧化应激有细胞保护作用，我们也想确定Cys106在DJ-1介导的细胞保护中的作用。我们用野生型DJ-1或C106A突变DJ-1质粒转染DJ-1 KO A549细胞。使用麦克亨利质粒证实转染效率(补充图4)。DJ-1在A549细胞中的过表达通过蛋白质印迹得到证实(补充图5)。因为我们在用1毫摩尔小时处理细胞后检测到高GSSG/谷胱甘肽水平2O2(图2d)，我们还使用DCF测定了活性氧的生成。用野生型DJ-1转染A549 DJ-1 KO，然后用1mM·H处理2O2与对照组相比，2小时内活性氧水平显著降低(图2h，I)，但没有减少细胞死亡(补充图6)。另一方面，与野生型DJ-1质粒相比，我们在用C106A突变DJ-1转染的细胞中检测到更高的活性氧生成。我们还用50 M博莱霉素处理细胞，使用不同的触发因子来确定活性氧的产生，并且我们获得了相似的相关性(补充图7)。我们的结果表明DJ-1在氧化应激反应中的诱导表达以及Cys106对DJ-1细胞保护功能的重要性。

氧化应激和DJ-1消融降低mtDNA量，增加mtDNA损伤

对照A549细胞和A549 DJ-1 KO细胞用于这些实验。我们发现用氢处理A549细胞2O2从0.5 h开始，早期时间点的mtDNA量减少(图3a)。令人惊讶的是，我们在晚些时候，即暴露24小时后，观察到DJ-1 KO A549细胞中的mtDNA量较低。我们还检测到DJ-1 KO A549细胞与对照细胞相比生长较慢(补充图8)。

在用氢处理1、2、3和24小时后，在A549细胞和DJ-1 KO A549细胞中检测到较高的mtDNA损伤2O2(图3b)。与对照细胞相比，我们观察到DJ-1 KO中的mtDNA损伤显著增加。此外，我们检测了编码呼吸链复合体一个亚单位的线粒体ND1 (NADH脱氢酶1)表达2O2通过逆转录聚合酶链反应进行0.5、1、2和3小时(图3c)。用氢处理的对照A549细胞2O2仅在0.5 h处理后ND1表达降低。这表明与对照细胞相比，DJ-1缺乏的细胞线粒体恢复能力较低。我们的结果表明，DJ-1 KO降低mtDNA量，并使细胞对氧化应激诱导的mtDNA损伤敏感，这可能导致细胞生长延迟。

氧化应激下DJ-1的定位

我们进行亚细胞分离，并通过蛋白质印迹法测定核、细胞质、线粒体和内质网部分的纯度，蛋白质印迹法分别使用层粘连蛋白B1、IKBα、环氧化酶ⅳ和PD1抗体(补充图。9)。我们观察到在处理1小时和2小时后，核馏分中DJ-1水平显著增加(图4a)。DJ-1仅在处理2 h后在胞质溶胶中表达较高(图4b)。我们还发现在2小时后线粒体部分DJ-1水平增加(图4c)。我们的数据表明DJ-1在氧化应激反应中的早期上调。

DJ-1在Cys106氧化成线粒体内的磺酸盐

除了用1毫摩尔小时处理细胞后在线粒体部分23千道尔顿检测到的DJ-1条带外，我们还发现了15千道尔顿的蛋白质条带2O2持续3小时(图4c)。我们进行了质谱分析以进一步鉴定这种DJ-1亚型。将染色的23 kDa或15 kDa条带切下，胰蛋白酶化，并进行液相色谱-质谱/质谱分析。我们的结果证实了DJ-1在两个波段的存在(图4d，e)。我们还检测到了Cys106-s03−DJ-1仅在15 kDa波段(图4e)。这表明高氧化应激诱导DJ-1过度氧化和裂解。此外，我们从用氢处理的A549细胞中分离线粒体部分2O2验证质谱分析获得的结果，并通过蛋白质印迹法测定氧化Cys106的DJ-1水平(图4f)。Cys106-氧化DJ-1的最高表达在2 h和3 h观察到(图4g)。此外，我们进行免疫组织荧光分析细胞经氢处理后线粒体中Cys106氧化DJ-1的表达2O2(图4h)。在暴露1小时和2小时后，我们检测到Cys106氧化的DJ-1和Tom20的更高共定位(图4i)。我们的结果表明氧化应激诱导线粒体DJ-1过度氧化和分裂。

Cys106-s0的形成3 −DJ-1体外去稳定化

重组DJ-1是在还原的且主要是Cs106-s0中制备的3−通过电喷雾质谱验证的形式(补充图2)。圆二色性光谱表明Cys106-s03−DJ-1与简化形式相比，二级结构略有减少(图5a)，与以前的报告一致25,45。用热荧光分析法进行热稳定性分析46显示了Cys106-s0的形成3−显著降低热解折叠转变的幅度，表明蛋白质的整体不稳定(图5b)。这种不稳定与在16号周期观测到的DJ-1的12℃稳定形成鲜明对比2−形成47表明在Cys106这两种相似的氧化修饰对DJ-1稳定性有不同的影响。

我们用核磁共振测量了DJ-1的皮秒-纳秒(PS-ns)时间尺度酰胺骨架动力学。与临界尺寸和热稳定性分析大体一致，我们发现Cys106-s03−导致蛋白质的几个区域变得更易移动(硫含量较低2订单参数)，尽管其他领域的动态性较低(较高2订单参数)(图6a)。我们评估了这些骨架酰胺顺序参数，以确定DJ-1与CyS106-s0如何增加柔韧性3−影响赖氨酸残基。底物蛋白的赖氨酸残基在泛素化中起作用，泛素化以错误折叠的蛋白为降解目标48,49。DJ-1有16个赖氨酸残基，我们发现这种蛋白质过度氧化增加了几个赖氨酸残基的主链PS–ns时间尺度迁移率，而DJ-1的形式减少了，包括K12、K89、K93、K99、K132、K182和K188(图。6b)。这些结果与我们发现的肺气肿ATII细胞K99处DJ-1泛素化一致(图。1d)。通过映射差序参数(δS2)在DJ-1的结构上，显然CyS106-s03−形成增加了蛋白质外部的PS–ns迁移率，尽管在CyS106-S0中蛋白质核心区域的迁移率稍低3−DJ-1比还原蛋白中的要高(图6c)。总的来说，我们的数据表明，在16-20世纪3−地层使DJ-1不稳定，并使暴露在溶剂中的二级结构元素在PS–ns时间尺度上更加灵活，这可能会影响这种蛋白质细胞保护功能。

图6:在S106-s0中皮秒-纳秒(PS-ns)时间尺度动力学的核磁共振弛豫分析3−DJ-1。

讨论

DJ-1是一种多功能蛋白质，保护细胞免受氧化应激50。它的氧化主要通过直接向反应性Cys106残基中加入氧来进行，这可以形成多种氧化物质。在本研究中，我们发现Cys106优先过氧化成磺酸盐(CyS106-s03−)在肺气肿的ATII细胞中，其可影响DJ-1细胞保护功能。

氧化应激已被证明是肺气肿发病的原因之一，肺气肿的特征是肺泡壁的破坏3,51。这种疾病还存在氧化剂-抗氧化剂失衡52。我们以前报道过从重度吸烟者中分离出的ATII细胞中DJ-1表达较低26。值得注意的是，我们发现DJ-1过表达在这些个体中恢复了其细胞保护功能26。在这里，我们发现与对照组吸烟者和非吸烟者相比，从肺气肿患者中分离的ATII细胞具有更高的氧化应激。Cys106是人类DJ-1中三个半胱氨酸残基中对氧化应激最敏感的，并且调节DJ-1作为活性氧传感器的功能17。然而，非常高的氧化应激导致Cys106过度氧化成磺酸盐13。我们的数据表明高度氧化的Cys106-s03−在这种疾病中，DJ-1亚型存在于ATII细胞中，但在从对照非吸烟者或吸烟者分离的细胞中未检测到，我们在这些细胞中仅观察到减少或Cs106-s02−DJ-1。然而，可能需要具有组学技术和先进计算方法的化学工具来进一步研究氧化DJ-1形式。我们的结果表明DJ-1的过度氧化降低了其在肺气肿中的细胞保护作用。已经表明，循环s106-s03−代表不可逆的过氧化DJ-1形式53。Cys106-SO3−在帕金森病患者的血液和红细胞中也发现了DJ-1，表明高度氧化的DJ-1与疾病发病机制之间有更广泛的联系54,55。

这种不可逆的过氧化DJ-1形式容易降解24。Cys106-SO的分子基础3−-DJ-1诱导的不稳定和细胞机制，导致高度氧化的DJ-1降解仍然不清楚。利用核磁共振弛豫测量，我们发现Cys106-s0的形成3−导致DJ-1表面几个区域PS–ns时间刻度迁移率增加。此外，Cys106-s0的形成3−导致DJ-1的任何观察到的热熔化转变的损失，尽管只有次要结构的轻微损失。中存在分辨率良好的共振1H-15硫代硫酸钠的HSQC核磁共振谱3−DJ-1最终确定这种蛋白形式在37℃时折叠良好，然而，基于其熔化行为，它似乎明显不稳定。这里进行的核磁共振弛豫实验只对PS–ns时间尺度动力学敏感，并且在16-10周期中，较长时间尺度动力学可能受到更严重的扰动3−DJ-1。我们建议增加CyS106-s0的动力学和降低的稳定性3−DJ-1是DJ-1泛素化增加的分子原因，我们在肺气肿的ATII细胞中观察到DJ-1在高氧化负荷下泛素化增加，以及在线粒体中分裂。此外，增加了Cs106-s0的灵活性3−DJ-1解释了为什么这种高度氧化的同工型不结晶，而同时还原和循环s106-s02−DJ-1容易形成晶体。据报道，DJ-1与CyS106-s03−能促进DJ-1与泛素连接酶的相互作用56这可能导致DJ-1细胞保护功能的丧失。此外，其他观察表明DJ-1和其他氧化还原敏感蛋白的氧化形式容易降解56与我们的发现一致。需要进一步研究来确定亚细胞区室和细胞外微环境的氧化还原信号如何影响DJ-1翻译后修饰。

我们的结果与Cys106氧化对DJ-1结构和动力学影响的联合计算和体外评估相关，两种方法都注意到DJ-1迁移率在几个区域的增加是CyS106-s0的结果3−形成25。然而，一个显著的不同是Kiss等人。25从S106-s0开始，DJ-1热稳定性没有变化2−to -SO3−使用差示扫描量热法，我们观察到CyS106-S0的熔化转变完全丧失3−DJ-1使用热荧光分析法。这两种实验方法通常具有相当的熔化温度(Tm)DJ-1的值47，所以这种差异的原因还不清楚。我们的结果表明氧化还原敏感的Cys106残基受到不同的生理相关修饰，这些修饰通过关键Cys106口袋中蛋白质灵活性、稳定性和相互作用电位的变化来双向调节DJ-1的细胞保护功能。

我们使用A549细胞作为模型，进一步确定细胞周期s106-s0的细胞后果3−DJ-1在控制条件下使用1毫米氢形成2O2如前所述31,32,33,34。我们在用氢处理的A549细胞中发现高氧化应激2O2由GSSG/谷胱甘肽比率决定。谷胱甘肽是细胞中最丰富的小分子硫醇，是防御活性氧生成的关键因素57,58。GSSG是谷胱甘肽的主要氧化态59。我们使用A549细胞进一步测定DJ-1的功能，DJ-1 KO使用CRISPR-Cas9策略产生。我们的结果表明DJ-1消融降低了用氢处理后的细胞活力2O2与对照A549细胞系相比。用野生型DJ-1转染A549细胞可降低活性氧水平并恢复细胞保护。有趣的是，用C106A DJ-1转染细胞也降低了活性氧水平；然而程度较轻。这表明C106A突变并没有完全消除DJ-1的细胞保护功能，这与其他研究一致60,61。总之，我们的结果表明DJ-1在感知和激活细胞对活性氧的反应中的关键作用。这些观察结果与我们先前发表的研究一致，该研究表明，与野生型小鼠相比，暴露于香烟烟雾中的DJ-1 KO小鼠具有更高的促炎性反应27。其他研究表明，DJ-1缺乏的胚胎干细胞对氧化应激的敏感性增加62。此外，活性氧在毒素处理的细胞中的积累导致损伤，最终导致凋亡死亡。

DJ-1位于细胞质、细胞核和线粒体中13并且在没有定位序列信号的情况下被转移到细胞隔室50,63。这表明这种蛋白质的翻译后修饰如氧化可以影响其亚细胞定位。然而，这些过程背后的机制和DJ-1的细胞保护功能，仍有待充分阐明。事实上，首先，我们发现DJ-1和CyS106-s03−在用氢处理细胞后的线粒体中2O2其次，我们通过质谱分析检测到DJ-1形式的裂解。DJ-1的Cys106氧化和裂解发生在A549中，是氧化应激的早期事件。然而，CyS106-过度氧化和裂解的DJ-1的表达在肺气肿患者中持续存在。这种积聚可能是由闵等人报道的慢性阻塞性肺疾病中蛋白沉积失衡造成的。64。此外，我们发现在用氢处理的DJ-1 KO A549细胞中，mtDNA损伤更大，ND1表达减少2O2与对照细胞相比。值得注意的是，DJ-1缺乏降低了mtDNA量和细胞生长。据报道，线粒体功能障碍和线粒体含量低会导致细胞生长缓慢65。消除受损mtDNA的延迟也可以用线粒体质量控制的缺陷(例如有丝分裂)来解释66。据报道，在肺部疾病的病理生物学中，线粒体受损导致线粒体质量和三磷酸腺苷产生减少67。活性氧还能诱导mtDNA损伤和线粒体功能障碍，导致细胞死亡68。我们的发现显示了Cys106-s0的形成2−吸烟者ATII细胞中的DJ-1也表明，这种活性DJ-1形式可能通过消除活性氧介导的受损线粒体而具有细胞保护作用。总之，我们显示了CyS106-s0的构象变化3−DJ-1，表明肺气肿ATII细胞中DJ-1细胞保护活性的丧失。需要进一步研究来确定DJ-1在肺部疾病线粒体中的功能。