一种检测唾液中Thc的快速响应电化学生物传感器

根据1970年美国控制物质法案，大麻被列为附表一物质。随着越来越多的美国州和美国以外的国家寻求合法化，对识别受大麻影响驾车的人的要求也越来越高。目前还没有用于确定大麻损伤的路边酒后驾车测试，因此其优点在于检测大麻中主要和最受欢迎的精神活性化合物四氢大麻酚。唾液总谐波含量与血液总谐波含量相关，使其成为快速总谐波含量检测的非侵入性介质。亲和生物传感通过目标四氢大麻酚和四氢大麻酚特异性抗体之间的化学反应被用于四氢大麻酚生物标记物检测，以测量与目标生物标记物浓度相关的信号输出。在这里，我们提出了一种新的快速电化学生物传感器，用于检测唾液中的四氢大麻酚，作为大麻路边酒后驾车试验，检测下限为100皮克/毫升，动态范围为100皮克/毫升–100纳克/毫升。所开发的生物传感器是第一种通过阻抗测量利用亲和检测的生物传感器，快速检测时间不到一分钟。傅里叶变换红外光谱分析证实了THC固定化分析在生物传感平台上的成功固定化。ζ电位研究提供了关于不同唾液酸碱度缓冲液中四氢大麻酚免疫测定的稳定性和电化学行为的信息。我们已经证明了在不同唾液酸碱度下稳定的、剂量依赖的生物传感。一个二进制分类系统显示了高的综合性能(AUC = 0.95)被用来预测人类唾液中四氢大麻酚的存在。与低功率电子器件和便携式唾液拭子集成的生物传感器用作路边酒后驾车手持平台，用于快速识别从人类受试者获得的唾液样本中的四氢大麻酚。

大麻因其刺激和兴奋作用，通常被用作娱乐性药物。四氢大麻酚是大麻中主要的精神活性化合物，作用于中枢神经系统的内源性大麻素系统1,2。它对大麻素受体的激动作用改变了各种神经递质(如多巴胺和去甲肾上腺素)的浓度，这些物质与四氢大麻酚对情绪和意识的影响密切相关2。吸食大麻的影响包括但不限于:愉悦、减压、增加幽默和音乐欣赏、元认知和创造力3。当吸食大麻的剂量超过精神阈值时，焦虑和/或恐慌发作是吸食大麻最常见的副作用4。吸食大麻时，这些影响可以在几分钟内完全显现出来，持续1-3小时4。而口服大麻大大延长了药效产生的时间，随后由于肠道吸收较慢而减弱4。四氢大麻酚是一种亲脂性分子，会非特异性地结合到其他含脂肪的身体部位，如脂肪组织3。因为四氢大麻酚可以储存在脂肪组织中，所以与其他娱乐药物相比，其消除半衰期(EHL)更长。此外，EHL还依赖于新陈代谢和使用的数量/频率。事实上，四氢大麻酚从组织到血液的再分布是其代谢途径中的限速步骤3。

经常使用大麻表明上瘾和使用其他非法药物的风险增加5。有证据表明，长期吸食大麻可能会导致大约9%的吸食大麻者上瘾5,6。某些群体上瘾的风险更高；青少年时期开始吸食大麻的人有六分之一的机会患上大麻依赖症，每天的吸食者依赖率在25%到50%之间5。这精神疾病诊断和统计手册，4th第四版(DSM-IV)显示，在符合任何非法药物依赖标准的510万人中，超过一半的病例是由大麻引起的6。除了上瘾的风险之外，吸食大麻还会损害神经连接，导致学习和记忆丧失、警觉性和自我意识下降，以及习惯和日常管理的退化7。

大麻是路边随机筛查中最常见的毒品之一5。血液四氢大麻酚浓度增加和最近吸烟(2小时内)与更高的撞车和过失风险密切相关8。这些风险的出现是因为THC干扰视觉和听觉以及关键的精神运动能力4。2012年对大麻消费的审查发现，在大麻的影响下驾驶与机动车碰撞风险增加近两倍相关，尤其是在致命碰撞中9。另一项研究发现，大麻是美国地区一级创伤中心收治的机动车事故受害者中最常发现的毒品之一10。在现场，尽管尿液是最近大麻使用的一个不良指标，但是对四氢大麻酚的路边检测通常是在尿液中进行的。取而代之的是，执法部门正在努力利用唾液作为检测介质，因为唾液总谐波含量与血液中的水平密切相关11。

尿液和血液是最常见的用于测试大麻使用的体液基质。然而，唾液、汗液和头发也被用于替代性的、侵入性较小的测试12。每个矩阵的检测窗口和截止极限变化很大。血液中的四氢大麻酚最高可检测到5小时，其临界值为10纳克/毫升；尿液中的四氢大麻酚最高可检测到95天，其临界值为15纳克/毫升；唾液中的四氢大麻酚最高可检测到34小时，其临界值为0.5纳克/毫升13,14。然而，这些数值仅仅基于一些开创性的研究，因为大麻等非法产品的检测很难获得批准。在废除大麻禁令的辩论中，缺乏可靠的测试和对中毒的限制是常见的话题。此外，可变的EHL和新陈代谢使得设定尿液检测的截止浓度变得更加困难，因为检测窗口可能因受试者而异15。这些大的检测窗口在零容忍政策有效的工作场所可能是有益的，但是对于路边酒后驾车检测，检测窗口应该与中毒水平密切相关。

人们普遍认为，口服液中四氢大麻酚的存在是最近大麻使用的一个指标16。吸食大麻时，四氢大麻酚通过与口腔粘膜直接接触而沉积在口腔中；血液中的唾液也会被重新吸收，但其影响微乎其微16。此外，四氢大麻酚在第一次吸入后立即出现在血液中，并在8分钟内达到峰值13。尽管唾液中总谐波含量仅在血液中对总谐波含量的直接贡献微不足道，但这两种生物液体中的时间进程遵循非常相似的浓度分布16。这一发现表明唾液是积极使用药物的良好指标。

其他关于唾液样品中四氢大麻酚电化学检测的报告也有报道12,16。这里，我们提出了一种基于亲和力的生物传感器，它利用非法拉第阻抗谱来检测人唾液样品中牛血清白蛋白-四氢大麻酚半抗原的存在。亲和生物传感器通过识别元件利用生物标记检测，该识别元件专门针对感兴趣的生物标记。然后，目标生物标记和识别元件之间的化学反应被转换成与目标生物标记的浓度相关的测量信号输出。朝向THC的亲和生物传感器已经作为家用试剂盒侧向存在11然而，为了保持精确的读数，这些测试需要:高精度的样品体积、用户小心的试剂处理以及通常相对较长的结果等待时间11。这里介绍的电化学生物传感器可以简化测试过程，消除任何样品制备的需要，并减少等待时间，因为传感器不依赖于缓慢的扩散限制过程。此外，生物传感器作为一种更灵敏和更特异的基于亲和力的测试，证明了早期的可行性。

传感器制造过程

利用电子束沉积技术在聚对苯二甲酸乙二醇酯基底上制备生物传感器。电极使用电子束物理气相沉积在压力为5∑10−6torr$\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">5</span>}<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">\sum </span>{\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">10</span>}}^{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">-</span>\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">6</span>}}\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">t</span>}\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">o</span>}\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">r</span>}\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">r</span>}$。电极图案用125nmAu到预清洁的聚酯基底上。制造后，用70%异丙醇(异丙醇)和蒸馏水(去离子水)冲洗金电极和聚酯基底的表面，以去除有机残留物。然后用惰性氮干燥电极2为免疫测定的自组装准备表面的气体。免疫测定的构建首先将接头分子化学吸附到电极表面，然后结合捕获抗体，用于随后检测THC-BSA半抗原的动态范围。我们生物传感器特有的接头分子是胺反应交联剂二硫代双(琥珀酰亚胺丙酸酯)。数字信号处理器有一个N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯，与富含抗体的伯胺高度反应，分子间隔臂上有一个可断裂的二硫键，通过金-硫醇相互作用与电极表面相互作用17。数字信号处理器形成高度有序的自组装单层18其固定了抗THC捕获抗体。四氢大麻酚-牛血清白蛋白半抗原对抗四氢大麻酚抗体具有高亲和力，允许快速结合相互作用。

ζ电位评估作为四氢大麻酚-牛血清白蛋白半抗原的酸碱度的函数

马尔文ZetaSizer纳米ZS用于测定作为酸碱度函数的四氢大麻酚-牛血清白蛋白的ζ电位。通过加入0.1 M盐酸或0.1 M氢氧化钠滴定至不同酸碱度后，在0.001 M KCl制备0.05克/升的四氢大麻酚-牛血清白蛋白样品。使用扩散阻挡技术将样品装载到折叠的毛细管单元中19。首先，将700升0.001米KCl装入DTS1070毛细管中，然后使用凝胶加载移液管将100升0.05克/升的总谐波含量为0.05克/升的总谐波含量-牛血清白蛋白加入毛细管细胞的底部。这种扩散屏障将样品悬浮在比色皿的底部，将THC-BSA半抗原与电极分离，保护分子免受与电极接触的损伤。ζ电势使用电泳迁移率技术测量，电泳迁移率技术测量电场影响下的粒子速度，然后通过方程式中给出的斯摩鲁乔斯基方程计算ζ电势。1以下内容:

在哪里μ$\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">\mu </span>}$代表电泳迁移率，ϵ$\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">ϵ</span>}$是KCl分散剂的介电常数，ζ$\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">\zeta </span>}$ζ电位，以及η$\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">\eta </span>}$是KCl分散剂的粘度(用粘度计测量)。

通过电化学阻抗谱评估剂量依赖性响应

电化学阻抗谱作为一种快速、无标记的方法，被用来研究基于亲和作用的六六六半抗原检测。通过电极-电解质界面介电性质的非法拉第变化来分析THC-BSA半抗原与结合到传感器表面的抗THC抗体的结合。Gamry参考600恒电位仪用于测量交流阻抗响应。在工作电极上施加输入10毫伏正弦电压，DC偏置为0.3伏，然后在1赫兹–1兆赫的频率范围内扫描。测量时间是交流阻抗扫描所用频率周期的函数。从1赫兹到1兆赫的一次扫描可以在大约1分钟内完成。测量所得电流响应，并将复阻抗计算为输入电压与输出电流之比。

首先通过在1x PBS中稀释四氢大麻酚-牛血清白蛋白半抗原以获得100皮克/毫升至10微克/毫升之间的浓度来进行电化学阻抗谱实验，以建立四氢大麻酚-牛血清白蛋白半抗原与电极的基线电化学相互作用。在1x PBS中建立响应后，将THC-BSA半抗原稀释在pH 4和pH 6的合成唾液中，以确定pH4如何影响传感器的动态响应。类似地，校准剂量响应曲线是通过在商业上获得的人唾液中加入100皮克/毫升至10克/毫升的四氢大麻酚浓度来建立的。在评估了合成唾液中的传感器响应后，在从人类受试者收集的人类唾液样本上测试传感器，以评估其作为唾液DUI数据集的性能。所有唾液样本都是通过达拉斯德克萨斯大学机构审查委员会的批准，按照相关指南和规定收集的。唾液捐献前，所有参与者(所有18岁或以上的参与者)都要获得知情同意。在传感器上孵育15分钟后，响应于孵育加入不同剂量四氢大麻酚(100皮克/毫升、10纳克/毫升和100纳克/毫升)的人唾液，再次进行电化学阻抗谱测量。图1示出了概述THC生物传感器工作原理的详细示意图1。

概述THC生物传感器工作原理的示意图。

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电化学阻抗谱实验的最佳工作频率选择

当解释非法拉第阻抗谱数据时，许多研究人员根据对这些频率下占主导地位的化学过程的假设，自行选择分析的频率范围20。这一决定在很大程度上取决于电极、电解质和感兴趣生物标志物的电阻和电容性质。因此，在尝试提取信息之前，应该了解一些系统特性的初始知识。研究人员通常通过寻找测试样品和对照(不存在分析物)之间具有最大信噪比的频率来确定传感器工作的最佳频率20。在电容或电阻效应占主导地位的情况下，选择最佳频率。因此，将它们的分析偏向电化学响应的一个方面，而忽略光谱的其余部分。虽然这是一种广泛接受的做法，但分析物的存在可能同时改变低频双层电容(或电荷转移电阻)和高频溶液电阻。

通过为降低数据维数而开发的特征选择方法的系统的、无偏的方法，采用了下选择最佳频率的方法。基于快速相关的滤波器(FCBF)21,22用于识别哪些特征组合包含关于输出的最大辨别信息。使用FCBF，只有当特征有条件地独立于不同的预测类别时，它们才被认为是无关紧要的。FCBS已被证明比其他常用的滤波方法提高了学习算法的速度和精度。通过从频谱中去除不相关或高度相关的频率，减少了冗余，这提高了算法在新数据集上的预测能力的泛化能力。

此外，通过移除不需要的数据，算法的学习率显著提高，允许更快的训练和部署22,23。FCBF被用来删除输出类别预测不佳或与“更好”输入特征高度相关的特征。FCBF算法的目标是从1)原始阻抗数据集，2)标准化为抗体的数据集，和3)标准化为合成唾液的数据集中识别最佳特征，同时确保这三个特征彼此不相关。

二元分类tetrahydrocannabinol 四氢大麻酚+/-人类唾液样本

这里优化了四种二进制分类算法来分离THC+$\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">T</span>}\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">H</span>}\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">C</span>}<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">+</span>$输入(任何含有%3E100皮克/毫升四氢大麻酚的唾液样本)来自THC−$\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">T</span>}\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">H</span>}\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">C</span>}<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">-</span>$输入(不含四氢大麻酚的样品)。从没有添加和添加不同剂量四氢大麻酚(100皮克/毫升、10纳克/毫升和100纳克/毫升)的人类受试者收集的唾液样本用于分类研究。二元逻辑回归24模型——一个没有交叉验证，一个有交叉验证25–和两个支持向量机26(SVM)–一个是线性核，一个是径向偏置核26–已经开发出来。对于每种型号，百分比为THC+$\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">T</span>}\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">H</span>}\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">C</span>}<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">+</span>$正确识别的样本被计算为真阳性率，而THC+$\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">T</span>}\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">H</span>}\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">C</span>}<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">+</span>$被错误分类的样本称为假阳性率(FPR)。

接收器工作特性(ROC)曲线在y轴上用热功率比或灵敏度绘制，在x轴上用FPR绘制27。ROC曲线下面积(AUC)通过探索所有可能的阈值参数为模型的分类能力提供了总体性能。因为AUC是分类阈值不变的，所以它通过检查两个类别之间的整体可分离性来指示分类器的质量27。ROC曲线是基于算法对未知数据点的预测能力进行评估的。对于给出的第一个逻辑回归模型，通过从数据集中随机抽样20%的测量值来生成测试，以便在训练阶段坚持下来(也就是80/20训练/测试分割)。对照组使用92个样品，实验组使用180个样品。为了提高分类算法的泛化能力，对其余三种算法进行了十倍交叉验证。这里，数据集被分成10个相等的分区，每个分区被迭代地用作测试集，而剩余的数据被用来训练模型。这允许在训练和测试过程中使用每个数据点，通过惩罚表现出过度拟合或高选择偏差的解决方案来获得更好的性能25,27。

SVM的一个强大优势是，该算法可以在高维空间中搜索，使用核函数创建非线性决策边界28。核函数在高维空间中构造一个线性决策边界，然后投射回输入空间的维度。线性核支持向量机假设数据在输入空间(即2D空间中的一条线，三维空间中的一个平面)中是线性可分离的。第二个SVM模型使用径向偏置函数核。径向基函数核使用高斯分布来描述从支持向量到分离超平面的距离，允许绘制非线性、弯曲的决策边界。

傅里叶变换红外光谱法表征电极表面改性

在实现用于四氢大麻酚检测的生物传感器之前，用傅里叶变换红外光谱验证了数字信号处理器交联剂和抗四氢大麻酚抗体在金电极表面的化学吸附。使用电子束气相沉积在聚酯基底上沉积金薄膜，其参数模拟了用于传感器制造和用于红外光谱分析的参数。电极表面的功能化如前一节所述进行。在傅里叶变换红外光谱测量之前，用去离子水彻底冲洗每个样品，然后用氮气干燥2去除表面任何可能干扰分析的未结合材料的空气。用尼科莱iS50红外光谱仪记录了表面改性样品的红外光谱。以4厘米的扫描分辨率获得吸光度光谱测量值—1对于4000厘米光谱范围内的64次扫描—1到600厘米—1。记录与数字信号处理器分子结合的正电子发射断层扫描金表面和通过数字信号处理器连接分子连接的抗THC抗体的金表面的吸收光谱。

在图2的数字信号处理器光谱中观察到的吸光度峰值2在1786厘米处—1和1749厘米—1表示NHS酯的对称和不对称羰基伸展。此外，峰值在1212厘米—1确认NHS酯的不对称碳氮碳拉伸的存在，而峰值在1069厘米—1可以识别为琥珀酰亚胺氮碳氧拉伸。最后，峰值在1170厘米—1表示羰基酯拉伸。这些峰的存在是自组装单层数字信号处理器的特征，证实了数字信号处理器对金表面的化学吸附17。

(a)固定在金表面的数字信号处理器交联剂，(b)与数字信号处理器交联剂缀合的抗THC抗体。

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NHS基团与抗体伯胺基团之间的反应可以在抗THC谱中发现。氨基磺酸酯的碳氧键断裂，与抗体的伯胺反应，产生稳定的酰胺键26。抑制与氨基磺酸酯相关的峰(1799厘米—1，1724厘米—1，1251厘米—1)观察到，而峰值在约1644 cm处—1约1552厘米—1表示酰胺ⅰ和酰胺ⅱ峰。这些结果表明，通过抗THC抗体与数字信号处理器功能化表面的结合，免疫测定形成稳定。

THC-牛血清白蛋白半抗原ζ电位与酸碱度的关系分析

使用石墨板棱镜中的非线性回归模型将乙状线拟合到实验ζ电位值(图。3)。对于THC-BSA半抗原，所得乙状结肠曲线的R平方值为0.9288，由此等电点被插值为3.756。为乙状结肠曲线建立了上下95%的置信区间，以估计IEP的边界为4.27和3.40。乙状结肠曲线可分为三个区域:稳定的正ζ电位、稳定的负ζ电位和过渡阶段。四氢大麻酚-牛血清白蛋白在低于pH 3时表现出正ζ电位(18.73毫伏至12.60毫伏)，在高于pH 6时表现出负ζ电位(5.67毫伏至12.26毫伏)。四氢大麻酚-牛血清白蛋白的过渡相在pH3–5之间。pH3–5相也是分子最不稳定的pH区域，因为其电荷最接近0 mV。

合成唾液在不同酸碱度下的ζ电位测量(a)THC-BSA半抗原和(b)无共轭的牛血清白蛋白。

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为了分离半抗原分子的电化学性质，还在相同的条件下进行ζ电位测量，其中牛血清白蛋白未与四氢大麻酚生物标志物结合。对于牛血清白蛋白的ζ电位测量(无四氢叶酸偶联)，拟合一条类似的乙状结肠曲线(均方根值为0.9785)，计算其IEP值为4.53，95%置信区间为4.85和4.21(图1)。3)。文献报道牛血清白蛋白的理论和实验IEP值分别约为4.7和4.629。

四氢大麻酚-牛血清白蛋白和牛血清白蛋白外推IEP值的95%置信区间中存在非常少的重叠，因此四氢大麻酚的存在很可能主导了四氢大麻酚-牛血清白蛋白半抗原的电化学特征。这一发现支持使用电化学生物传感器测量的交流阻抗信号响应是由四氢大麻酚分子而不是牛血清白蛋白的存在驱动的。此外，四氢大麻酚-牛血清白蛋白半抗原的ζ电位在人唾液的正常酸碱度范围内(6.2–7.6)显示出相对稳定的反应，表明四氢大麻酚-牛血清白蛋白的电荷和稳定性在所有样品中应该相对稳定。

电化学阻抗谱分析剂量依赖性响应

由四氢大麻酚-牛血清白蛋白结合事件引起的电化学响应被报告为奈奎斯特电容图(图4a–c)来解析SAM偶极特性和离子介电常数。对于在1x PBS中进行的实验，奈奎斯特电容图显示了较高频率的半圆，随着THC-BSA半抗原浓度的增加，出现了不太明显的低频半圆。每个半圆对应于指示免疫测定经历两个弛豫事件的时间常数。随着四氢大麻酚-牛血清白蛋白生物标志物被引入传感器表面，观察到大半圆直径随之减小。半圆直径的减小对应于德拜弛豫过程的变化，这是由于免疫测定的延长以及离子进入电极表面的阻碍。随着与表面结合的THC-BSA浓度的增加，旋转障碍增加，从而减少免疫分析中针孔的大小和数量。阻抗值以10 Hz提取，并通过减去以下各项在重复中归一化(n = 4)Z∑${\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">Z</span>}}^{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">\sum </span>}$每个剂量步骤的0剂量步骤(图4a插图)。随着传感器上施用更高剂量，观察到阻抗响应增加。在pH6的合成唾液中进行的剂量反应实验也观察到类似的趋势(图3b)。当半抗原结合免疫测定时，观察到高频半圆直径的类似减小，第二个低频半圆具有类似的表现。当标绘归一化到0剂量步长后10 Hz的剂量响应时(减去Z∑${\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">Z</span>}}^{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">\sum </span>}$在每个剂量步骤的0剂量步骤中)，观察到与1x PBS和在pH6的合成唾液中的反应相同的趋势。这表明，尽管界面上存在不同的电容过程，但传感器能够可靠地检测不同剂量的THC-BSA半抗原。

校准剂量响应表示为奈奎斯特复阻抗图，带有校准剂量响应插图，用于(a)1x PBS(b)pH6的合成唾液(c)pH4的合成唾液(d)人类唾液。所有插入物代表在10 Hz提取的虚阻抗(相对于0剂量阶跃)的变化。

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在pH4时，合成唾液中的剂量反应表现出略微不同的界面特性，如图3所示4c。奈奎斯特电容图显示类似的高频半圆，对应于免疫测定的德拜弛豫。然而，低频响应主要是离子扩散到电极表面，如扩散尾部所示。部分原因可能是在接近IEP的酸碱度下，四氢大麻酚-牛血清白蛋白半抗原的表面电荷。半抗原在pH4(ζ* 2007年−5mV$\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">\zeta </span>}<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">*\; 2007年</span><span\; style="transition:none;text-align:inherit;">-</span>\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">5</span>}\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">m</span>}\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">V</span>}$)，减小第二德拜弛豫过程的影响，并允许离子扩散支配低频响应。然而，仍然观察到较高频率半圆直径的减少，表明THC-BSA半抗原的结合事件仍然在德拜松弛过程中发挥作用。虽然唾液的酸碱度在正常唾液酸碱度范围之外，因此并不代表正常样本，但重要的是要注意，唾液酸碱度可能在进食、饮水或感染后发生大的波动。

在10 Hz (n = 6次试验间和试验内复制)下，商业获得的人唾液(pH6.0–7.0)中四氢大麻酚的剂量响应，如图所示。4d，显示了从0剂量步骤开始的虚阻抗变化随着浓度的增加而增加的趋势，这可以与合成汗液pH 4和pH6获得的结果相关联。在100皮克/毫升至100纳克/毫升之间的较低剂量浓度下，阻抗变化彼此显著不同。在1微克/毫升和10微克/毫升的较高剂量浓度下，观察到阻抗与基线相比有细微变化，这可归因于电荷筛选效应，阻碍了在高离子人体缓冲液中检测到四氢大麻酚。然而，必须能够在较低的剂量下检测四氢大麻酚，即4纳克/毫升，这是根据SAMSHA指南设定的口服液体药物筛选截止限值。

经由FCBF的最佳工作频率选择

为了选择最具预测性的特征，FCBF使用对称不确定性来确定通过包括单个特征而获得的信息。FCBF算法也做了轻微的修改，加入了5个最佳特征(FCBFK)来查看其他高性能特征。两者都是简单的决策树19使用分类器和逻辑回归分类器来测试应用FCBF算法前后的性能。决策树是分类器，在给定特征和输入的随机子集的情况下，搜索最佳位置，将数据分成纯组。决策树算法是FCBF验证的良好候选，因为当选择具有最高信息增益的特征时，分类精度应该提高。表中评估和总结了决策树算法和逻辑回归算法在有和没有FCBF算法的情况下的预测性能1。

首先在原始数据集上单独评估FCBF算法，然后在包含标准化到抗体步骤的阻抗值的数据集上，最后在包含标准化到合成唾液步骤的阻抗值的数据集上，从每个数据中选择最具预测性的特征。通过去除噪声或相关变量，FCBF选择了性能最佳的特征，目的是提高决策树和逻辑回归分类器的精度。FCBF算法通过从每组中选择一个特征来改善原始阻抗数据和标准化到合成唾液测量的数据的性能:Z∑${\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">Z</span>}}^{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">\sum </span>}$在398.0赫兹时%dZφ$\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">\%</span>}\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">d</span>}{\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">Z</span>}}_{\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">\phi </span>}}$198.6赫兹–其中Z∑${\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">Z</span>}}^{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">\sum </span>}$表示原始阻抗模量，并且%dZφ$\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">\%</span>}\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">d</span>}{\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">Z</span>}}_{\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">\phi </span>}}$代表相对于合成唾液测量的相位变化百分比。

然而，在将特征空间减少到单个特征之后，标准化到抗体测量的数据的性能没有提高。该数据集中5个最佳要素的结果如图所示5。这dZ∑$\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">d</span>}{\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">Z</span>}}^{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">\sum </span>}$(阻抗模量相对于抗体测量的变化)在505.5赫兹时显示了THC+$\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">T</span>}\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">H</span>}\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">C</span>}<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">+</span>$用的平均值初始化THC−$\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">T</span>}\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">H</span>}\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">C</span>}<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">-</span>$类介于两种模式之间。数据的这种分布将大大增加算法的复杂性，因此dZ\ ' \ '$\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">d</span>}\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">Z</span>}\text{<span style="transition:none;text-align:inherit;"> ' '</span>}$(相对于抗体测量的虚阻抗变化)选择9.9赫兹作为按类别分离数据的最佳特征(THC+/−$\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">T</span>}\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">H</span>}\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">C</span>}<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">+</span><span\; style="transition:none;text-align:inherit;">/</span><span\; style="transition:none;text-align:inherit;">-</span>$)。

（a)小提琴图显示标准化分布和(b)相关热图，显示由FCBFK算法识别的最能预测标准化抗体步骤的5个特征的皮尔逊相关。

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实施FCBF算法后选择的最后三个特征是Z∑${\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">Z</span>}}^{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">\sum </span>}$在398.0赫兹时，%dZφ$\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">\%</span>}\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">d</span>}{\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">Z</span>}}_{\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">\phi </span>}}$(合成唾液)198.6赫兹，以及dZ\ ' \ '$\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">d</span>}\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">Z</span>}\text{<span style="transition:none;text-align:inherit;"> ' '</span>}$(wrt抗体)在9.9赫兹。数字6a显示这些特征都不相互关联6b演示数据点在缩小的特征空间中的分散性。

（a)相关热图和(b)FCBF和FCBFK算法后最后三个选定特征的3D散点图。

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二元分类tetrahydrocannabinol 四氢大麻酚+/-通过逻辑回归

构建了两个逻辑回归分类器对数据进行预测。第一个逻辑回归分类器是在一个随机子样本上训练的，该样本由80%的输入数据集组成，其余20%用于模型验证。第二个逻辑回归模型通过使用交叉验证将数据分成10个相等的箱来实现交叉验证。每个逻辑回归模型的性能都是根据测试数据集中存储的数据进行评估的。用于二进制分类研究的样品是根据内部评级法从人类受试者身上获得的，然后添加四氢大麻酚。下表概述了逻辑回归和SVM分类器的概要2。

当在没有交叉验证的情况下进行逻辑回归时，AUC为0.911。这一较高的AUC指向相对较好的泛化能力，在0.39的分类阈值下，模型的总概率为97.1%。然而，在这个阈值下，FPR是60%，表明大多数THC−$\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">T</span>}\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">H</span>}\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">C</span>}<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">-</span>$样本被错误分类。阈值0.722将FPR降至15%。然而，在对THC+$\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">T</span>}\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">H</span>}\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">C</span>}<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">+</span>$样本；提高阈值会将总生产率降低到88.6%。

使用交叉验证的逻辑回归模型的AUC为0.916。在分类阈值为0.303时，该模型的总生产率为97.1%，FPR系数为60%。通过将阈值提高到0.769，TPR和FPR分别下降到88.6%和10%。这表明，使用交叉验证，模型在预测THC+$\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">T</span>}\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">H</span>}\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">C</span>}<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">+</span>$然而，样品中AUC的小幅增加表明总体性能没有显著改善。

二元分类tetrahydrocannabinol 四氢大麻酚+/-通过支持向量机

在每个SVM模型中，核类型和正则化参数C作为SVM算法的附加输入被传递(γ也被指定用于径向基函数SVM)。对于线性核SVM，当拟合超平面时，设置正则化参数C = 1以减少离群数据点的影响。研究了碳的其他值，但是模型性能没有显著变化。径向基函数核SVM使用了100的C值。虽然这减小了容限大小，但是伽马参数的低值(设置为10)被用来通过增加支持向量的影响半径来阻止过度拟合。

线性核SVM与第一个逻辑回归模型几乎相同。两种模型都有相似的roc和等价的AuC。这并不令人惊讶，因为SVM使用了逻辑回归成本函数的线性近似。两个模型显示相似的TPR和FPR(在稍微不同的临界值)，然而线性核SVM并不比具有交叉验证的逻辑回归表现得更好。径向基函数核SVM具有最高的整体模型性能和泛化能力。如图1所示7b–d，大多数THC−$\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">T</span>}\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">H</span>}\mathrm{<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">C</span>}<span\; style="transition:none;text-align:inherit;">-</span>$数据点聚集在球形区域中。非线性决策边界更好地将哥伦比亚联合自卫军(0.951)起诉的两个类别分组。此外，在阈值为0.621时，SVM皇家银行的TPR和FPR分别为97.1%和15%。FPR通过将门槛值提高到0.797而降低到5.0%，同时仅将总生产率降低到94.3%。

Rbf核SVM分类性能指标。（a)ROC曲线，在阈值0.621(深蓝色)和0.797(浅蓝色)处识别出TPR和FPR。（b–d)2D截面的分类概率。

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我们已经开发了一种生物传感器，能够检测人唾液样本中的三羟色胺。这项工作利用非法拉第阻抗谱快速、准确地检测大量患者和患者样本中的THC-BSA半抗原，具有高特异性和灵敏度。此外，这项工作展示了使用FCBF算法确定最佳工作频率的快速、无偏的程序。降低输入维数和识别唾液总谐波含量传感器未来实现的关键测量值，可以缩短测量时间，并通过减少对数据集中噪声的过度拟合来增强泛化能力。

这项工作概述了一种能够检测唾液中四氢大麻酚的生物传感器，与样品间的可变性无关。实现非线性径向基函数核SVM算法来执行二进制分类在预测人类唾液中THC的存在方面表现出非常高的一般性能(AUC = 0.951)。这项技术展示了一种用于识别受大麻影响的司机的路边检测设备的概念验证。该传感器能在1分钟内快速测量四氢大麻酚，具有高度的特异性和灵敏度，这是执法部门在进行大麻损伤路边检测时所必需的。这项工作的发现可以转化为便携式电池供电设备，与一次性使用的唾液拭子接口，唾液拭子嵌入四氢大麻酚检测传感器，以便在使用低功率环境影响报告书硬件时更容易进行路边测试30,31,32,33,34,35。虽然这里介绍的工作集中在二进制分类，以确定四氢大麻酚的存在，不同的学习算法可以探索通过回归分析后，FCBF(钾)预测唾液中的四氢大麻酚浓度。回归分析有助于更准确地测量四氢大麻酚的致醉效果，并为受影响的驾驶等活动建立更精确的截止限值。此外，紧凑的传感器设计可以稍加修改，以包括多重检测，只需简单地将抗THC抗体换成对THC代谢物THC-COOH特异的抗体，以建立更复杂的模型来预测最近的消费时间。