CRISPR/Cas9基因编辑高效产生敲入/敲出旱獭胚胎 - ELISA试剂盒,酶免试剂盒,酶联免疫吸附试验, ELISA实验,ELISA,双抗体夹心法,科研蛋白,抗体,细胞系,武汉新启迪生物科技有限公司

摘要

转基因非人灵长类动物(NHP)是生物医学研究的有用模型。基因编辑技术使得目标基因敲除NHP模型得以产生。CRISPR/Cas9的靶基因-KO/敲入(KI)效率尚未在狨猴中广泛研究。本研究探讨了绒猴胚胎CRISPR/mRNA和CRISPR/核酸酶靶基因修饰效果的最佳条件。CRISPR/核酸酶比CRISPR/mRNA更有效地避免嵌合基因的改变。此外，利用CRISPR/Cas9和两种不同长度(36 nt和100 nt)的有义或反义单链寡核苷酸(ssODN)研究了产生KI旱獭胚胎的最佳条件。当CRISPR/核酸酶和36 nt有义或反义ssODNs注入胚胎时，观察到KIs。所有胚胎都表现出KI和KO的镶嵌突变，或不精确的KIc-kit。虽然KI策略需要进一步改进，但这些结果表明CRISPR/Cas9可以通过基因编辑来生产KO/KI旱獭。

介绍

小鼠靶基因敲入/敲出模型的使用对于理解基因功能和由基因突变引起的疾病的潜在机制以及开发这类疾病的新疗法非常重要。具体而言，对由基因功能丧失导致的靶基因KO模型表型的研究，可以使特定基因的功能得到澄清。目标基因KI模型是通过将特定基因或突变插入目标基因的特定区域而产生的。它们被广泛用于理解靶基因调控区的功能，如启动子区。通常，使用将靶基因KI/KO胚胎干细胞注射到植入前胚胎中的常规方法，通过嵌合动物产生靶基因KI/KO动物1。然而，能够产生嵌合动物的胚胎干细胞在除啮齿动物之外的大多数物种中被证明是难以捉摸的2,3,4,5,6,7。

最近，几种类型的基因编辑技术包括锌指核酸酶8转录激活剂样效应核酸酶9和簇状规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9 (CRISPR/Cas9)10,11已经开发出来了。所有这些技术都涉及人工核酸酶，并在目标基因组的特定基因中诱导双链断裂(DSB)。DSB修复可能导致非同源末端连接，导致移码，破坏目标基因的功能。这种基因改变技术可以应用于植入前胚胎，使得在许多动物物种中产生靶基因KO/KI模型成为可能，包括缺乏嵌合活性胚胎干细胞的NHPs12,13,14。

普通狨猴(竹蓟马土拨鼠)是一种多产的小型NHP，在相对较短的时期(1.5-2年)内性成熟，并且非常容易处理。由于这些生物学特征，狨猴被发展成为实验动物。利用慢病毒载体已经产生了几种表现出种系传播的转基因狨猴15,16,17。此外，还报道了通过将ZFN和距骨引入狨猴胚胎而产生表现出免疫缺陷的白细胞介素-2受体亚单位普通γKO狨猴14。然而，CRISPR/Cas9在旱獭胚胎中的功效尚未得到广泛研究。

通过CRISPR/Cas9进行的宿主基因修饰受到含有保守二核苷酸的原间隔基邻近基序(PAM)序列的限制，导致Cas9活化18。目前已经开发了各种不同的Cas9核酸内切酶，它们识别来自几种微细菌的不同PAM序列，例如化脓性链球菌(SpCas9)11,19,金黄色葡萄球菌(SaCas9)20和新凶手弗朗西斯菌21,22,23。最近的一项研究报告称，PAM识别序列可能通过Cas9修饰而改变24,25。此外，还报道了一种新的CRISPR/Cas9系统，它取代了靶基因特定部分的单个核苷酸，而不涉及宿主基因组的DSB26,27。尽管其靶序列受到PAM的限制，但CRISPR/Cas9系统由于易于引入、成本合理、基因修饰效率高而被广泛使用。因此，该系统的适用性正在迅速得到认可。

在本研究中，CRISPR/Cas9对两个靶基因c-装备和Shank3在狨猴胚胎中进行了研究，特别参考了其创建狨猴靶基因KO/KI模型的潜力。更具体地说，CRISPR/Cas9的基因修饰活性和镶嵌频率与c-装备和Shank3并研究了它们在绒猴胚胎中的镶嵌突变率。

原癌基因，c-kit，编码干细胞因子的受体酪氨酸激酶(KIT)。KIT受体由胞外结构域组成，包含5个免疫球蛋白样结构域、跨膜结构域和携带两个激酶结构域ⅰ/ⅱ的胞内膜结构域28。在人和小鼠中，KIT在造血干细胞、生殖干细胞和黑素细胞的增殖和分化中发挥重要作用28,29,30。基于这一知识，狨猴c-装备预计基因突变将显示出表型，如贫血、不孕和白色或白斑。因此，c-装备突变狨猴是研究造血细胞、生殖细胞和黑素细胞发育的理想模型。因此，c-装备被选为CRISPR/Cas9介导的基因修饰的靶标。为了评估CRISPR/Cas9介导的靶基因KI修饰，携带W37突变，导致外显子11的氨基酸替换(W37)的绒猴装备被引入来引发突变。

Shank3SHANK家族的一员，编码突触后多结构域支架蛋白，并将神经递质受体、离子通道和某些膜蛋白连接到G蛋白偶联信号通路和肌动蛋白细胞骨架上31,32。这Shank3突变与人类的自闭症和精神分裂症密切相关33,34,35,36,37和1227位的鸟嘌呤插入Shank3导致移码突变，产生截短的SHANK333。据报道，这种突变发生在表现出自闭症特征的患者身上，如严重的语言障碍和智力迟钝33。此外，Shank3已在患者中发现突变，如Q312R36和R656H37，由点突变和G440-P446缺失引起38。Shank3在一项行为研究中，突变小鼠与野生型小鼠相比表现出差异，例如生长过程中青少年社交互动受损39然而，这些小鼠在Shank3自闭症患者的表现并不容易显示出与自闭症相关的表型39。这一发现表明，由于物种的不同，很难在老鼠身上完全复制包括自闭症在内的精神疾病。NHP模型适合理解自闭症的病理机制，因为NHP模型显示了复杂的认知功能和社会行为。特别是，狨猴家族中的社会行为与人类相似40；因此，狨猴有望成为精神疾病的合适模型。在这项研究中，Shank3选择CRISPR/Cas9作为基因修饰的靶基因Shank3通过以下方式研究绒猴自闭症模型的创建Shank3柯。

据我们所知，这是第一次研究目的基因KI/KO的功效以及绒猴胚胎中CRISPR/Cas9相关的嵌合率。

结果

绒猴成纤维细胞靶基因改变率的sgRNAs验证

为了评价单导向核糖核酸(SG核糖核酸)修饰靶c-的有效性装备将4个sgRNAs，W37-1，W37-2，W37-3和W37-4中的每一个导入土拨鼠成纤维细胞中，并进行多克隆抗体(图1A和补充表格1)。指出了使用的聚合酶链反应引物和条件(补充表2和3)。通过凝胶电泳聚合酶链反应产物条带密度验证了细胞表面抗原的靶基因修饰活性。所有针对c-装备修饰目标基因，基因修饰率分别为13.7%、14.9%、12.2%和9.5%(图1B)。利用聚合酶链反应产物的亚克隆和测序，详细分析了靶基因修饰的效果。序列分析的结果表明在c-装备进入绒猴成纤维细胞的基因组。来自W37-1、-2、-3和-4 sgrna的总共79个子克隆的目标基因修饰率分别为20% (4/20克隆)、26% (5/19克隆)、10% (2/20克隆)和15% (3/20克隆)(图。1C，补充表4)。根据费希尔的精确测试，这些比率之间没有显著差异。在这79个克隆中，11.4%显示缺失，6.3%显示插入c-装备(补充表4)。

3个sgRNAs对抗Shank3Shk-A、Shk-B和Shk-C的基因修饰效率也进行了评估(图1A)。CEL-1分析的条带密度结果表明，分别有29.3%、0.9%和27.3%的细胞进行了基因修饰(图1B)。子克隆的序列分析表明Shank3Shk-A、-B和-C的修饰率分别为10% (2/20克隆)、0% (0/20克隆)和10% (2/20克隆)(图1)。1C，补充表5)。序列和靶基因修饰率分析的结果都没有表明引入绒猴成纤维细胞的sgRNAs之间存在显著差异。由于sgrna的目标基因修饰率之间没有显著差异，sgrna W37-1或Shk-A被用于后续实验，因为它们的序列最接近每个目标基因中的目标氨基酸位点。

CRISPR/Cas9对旱獭胚胎靶基因的修饰

接下来，在绒猴胚胎中研究了选定的sgRNAs和hCas9 mRNA (CRISPR/mRNA)以及crRNA、tracrRNA和Cas9核酸酶(CRISPR/核酸酶)的组合的靶基因修饰率(图1)。2A)。对20个注射了W37-1 CRISPR/基因的胚胎中的9个进行了分析(补充表6)。发现9个胚胎中有7个(78%)表现出c-装备通过CEL-1分析进行基因修饰(表1)。显示了CEL-1分析结果的一部分，以及从亚克隆序列分析中获得的代表性桑格测序色谱图(图1)。2B特区)。调查c-装备CRISPR/核酸酶的修饰率，用CRISPR/核酸酶对25个胚胎进行显微注射，并分析15个发育超过8个细胞期的胚胎。其中，通过CEL-1分析成功分析的9个胚胎显示100%的靶基因修饰率(表1)。

表1绒猴胚胎中CRISPR/Cas9对靶基因的修饰率。

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Shk-A和CRISPR/基因混合物的混合物被注射到22个旱獭胚胎中，6个存活足够长时间以达到晚期胚胎阶段(补充表6)。其中，5个被成功分析，4个(80%)胚胎在Shank3(表格1和图2B)。在注射了CRISPR/核酸酶混合物的26个胚胎中Shank3，14个发展超过8细胞阶段，其中12个被分析。所有12个胚胎(100%)显示Shank3(表格1)。注射CRISPR/核酸酶的胚胎CEL-1分析的部分结果Shank3并显示了子克隆的代表性桑格测序色谱图(图2B特区)。费希尔精确检验表明，CRISPR/mRNA注射液和CRISPR/核酸酶的靶基因修饰率之间没有显著差异。

为了确定靶基因修饰如indels的序列，随机选择了3个全胚胎(8细胞胚泡期)聚合酶链反应样品进行亚克隆和序列分析。当c-装备从注射CRISPR/mRNA的胚胎和注射CRISPR/核酸酶的胚胎获得的克隆中，分别有66.7%(插入20%和缺失46.7%)和93.9%(插入49.0%和缺失44.9%)显示靶基因的进一步修饰(表2，补充表7)。当...的时候Shank3作为靶，分别有79.1%和96%的CRISPR/mRNA和CRISPR/核酸酶注射胚胎显示缺失突变克隆(表2，补充表8)。这些序列分析的结果表明，与CRISPR/mRNA相比，注射CRISPR/核酸酶的胚胎显示出明显更高数量的靶基因修饰(费希尔精确试验，p%3C 0.01)。

表2分裂卵裂球的亚克隆序列分析。

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通过单卵裂球分析估计镶嵌率

为了估计不完全修饰如镶嵌突变的发生率，研究了注射CRISPR/mRNA和CRISPR/核酸酶的胚胎的每个卵裂球中的靶基因修饰(图3A)。注射CRISPR/mRNAs或CRISPR/核酸酶5天后，将达到5-16细胞阶段的胚胎分成单个卵裂球，对每个卵裂球进行CEL-1分析，并通过序列分析进行基因修饰分析(图1)。3B)。序列分析表明，在CRISPR/基因注射胚胎中，靶基因占51.2% (c-装备)和54.5%(Shank3)的卵裂球进行了修饰(表3和补充表格9)。在这些经修饰的卵裂球中，36.6%和45.5%的c-型卵裂球存在双等位基因修饰装备和小腿c-3的单等位基因修饰分别为14.6%和9.1%装备和小腿3(图3C，表格3)。此外，所有的胚胎都注射了CRISPR/mRNA装备或者Shank3携带2种以上不同序列的卵裂球，除了注射CRISPR/mRNA的野生型基因胚胎Shank3(补充表格10和11)。这些序列分析表明，所有注射CRISPR/mRNA的胚胎都具有抗c-装备展现出马赛克。另一方面，5个胚胎中有4个(80%)注射了CRISPR/基因Shank3显示马赛克，一个没有显示任何修改(表3，补充表9)。

表3 CRISPR/Cas注射到绒猴胚胎后卵裂球的序列分析。

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在CRISPR/核酸酶注射中，82.5%的胚胎卵裂球靶向c-装备87.5%的胚胎卵裂球Shank3展示了靶基因修饰，所有修饰的卵裂球携带双等位基因突变(图3C，表格3)。注射CRISPR/核酸酶的胚胎中的双等位基因突变率明显高于接受CRISPR/mRNAs注射的胚胎(费希尔精确试验，p%3C 0.01)。在这些双等位基因突变基因中，所有(100%)胚胎都以c-装备40%的胚胎目标是Shank3显示了2种以上的突变序列模式，表明这些是镶嵌胚胎。虽然修饰基因模式的数量比较(补充表12)表明CRISPR/mRNA和CRISPR/核酸酶注射胚胎中的嵌合突变率没有显示出显著差异，CRISPR/核酸酶显示出降低嵌合率的趋势。

c-的效率装备敲入式

在狨猴c-11外显子实现靶基因KI装备对应于W37目的基因KI的突变、功效进行了研究。四个不同长度(36和100个核苷酸)和链类型(有义和反义)的单链寡脱氧核苷酸用于本研究(补充表13)。将CRISPR/mRNA或CRISPR/核酸酶和ssODN的混合物注射到绒猴胚胎的原核和细胞质中。注射后，培养胚胎，直到它们达到12个细胞阶段。随后，使用单个卵裂球进行直接测序分析，以鉴定敲入靶序列的最有效ssODN。当将36 nt长度的ssODN(作为供体脱氧核糖核酸)和CRISPR/核酸酶注射到胚胎中时，观察到精确的靶基因KI(补充表14和15)。当将36 nt有义ssODN和CRISPR/核酸酶混合物注射到32个胚胎中时，发现13个分析胚胎中的4个(30.8%)含有精确的KI卵裂球(补充表16)。相比之下，当使用36 nt反义ssODN作为KI供体时，29个注射胚胎中有12个被分析，12个分析胚胎中只有1个(8.3%)携带精确的KI卵裂球(补充表16)。包括KI胚胎在内的所有注射胚胎都携带镶嵌突变(图4A，表格4)。在这些胚胎中也观察到一些不精确的KI卵裂球(图4B(d))，表格4和补充表格15)。注射sense 36 nt ssODN后，每个胚胎的精确KI卵裂球率分别为50%、42.9%、50%和33.3%(补充表14)，对应于分析的卵裂球的31.6%(表4)。卵裂球中精确的KI效率在36 nt ssODN意义上明显更高(p%3C 0.01，费希尔的精确测试，瑞安的多重比较)。

表4 c-的效率装备CRISPR/Cas9的基因KI。

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在这些分析中，还检测到20个不精确的KI卵裂球(表4，补充表15)通过序列分析(补充表16)由36 nt感测和反感测ssODN组成。有趣的是，在同一胚胎中没有观察到精确KI和不精确KI。不精确的KI在c-下游的第六个氨基酸上产生一个终止密码子装备，E579，随后导致c-装备KO突变(图4B)。

潜在非目标地点的预测

使用在线工具CRISPOR(http://crispor.org)。分析了与每个sgRNA序列相比包括3个或更少错配的非靶位点。结果显示在补充表中17。没有在所有sgRNAs中检测到0、1和2个与NGG识别不匹配的非靶位点；然而，每个sgRNA检测到3个不匹配的非靶候选物(补充表17)。我们根据sgRNA序列中的错配位置，评估了非靶得分，即出现意外靶位点的概率。在这个分数中，值“1”表示与sgRNA完全匹配，表示作为离靶位点的高电位，值“0”表示没有作为离靶位点的电位41。得分大于0.2被认为是偏离目标的站点41。W37-1、-2、-3和-4 sgrna得分大于0.2的非靶位点数量分别为4、6、3和4。为Shank3Shk-A、-B和-C sgRNAs，6、8和4个离靶候选人的离靶得分分别大于0.2。

讨论

在本研究中，CRISPR/Cas9对两个靶基因c-装备和Shank3，在绒猴胚胎中进行了研究。此外，为了预测第一代靶基因KO/KI动物是否可以显示客观的表型，在CRISPR/mRNA或CRISPR/核酸酶注射后，对卵裂球中的靶基因修饰进行了分析，以验证胚胎中的镶嵌性。尽管CRISPR/核酸酶在绒猴整个胚胎中对两种靶基因都显示出100%的修饰，但是通过CEL-1测定确定的修饰率与CRISPR/mRNA的修饰率相比没有显著差异，因为两种人工核酸酶注射在靶基因修饰中都显示出高度的效率(表1)。对来自整个胚胎的亚克隆聚合酶链反应产物的序列分析表明，在注射CRISPR/mRNA和CRISPR/核酸酶的胚胎中都观察到靶基因的镶嵌修饰。尽管CRISPR/核酸酶显示出减少镶嵌修饰的趋势，但这两种条件下的镶嵌修饰率没有显著差异(图3C，表格3和补充表格12)并且靶基因或sgRNA之间没有显著差异。

CRISPR/Cas9诱导的嵌合突变已在几个物种中报道13,42,43。在具有完整基因以及靶基因KO/KI突变的镶嵌动物中，靶基因KO/KI突变的基因表型可能被完整基因拯救，导致它们回复到野生型表型。在小鼠中，这种显示并不显著，因为第二代动物在2-3个月内就能产生，第二代动物也是非镶嵌型的，并显示出客观的表型。然而，这不适用于需要2至5年以上时间才能开始繁殖的国家人类发展计划；即使土拨鼠也需要2到3年才能产生第二代。因此，靶基因KO/KI NHP模型最好不携带完整的靶基因。当铂TALEN用于KO白细胞介素受体普通γ基因(il2rg)，所有雄性动物都表现出免疫缺陷表型14。相比之下，il2rg杂合子(WT/indel)修饰的雌性狨猴表现出野生型表型，因为完整的靶基因拯救了突变表型14。最近的报告表明，Cas9核酸酶与crRNA和tracrRNA一起在小鼠中显示出较高的KI率(46%)，而Cas9 mRNA在小鼠中显示出较高的KI率(13%)，其中51.4%的F1后代显示出KI基因型，这表明在创始人代中嵌合突变水平较低44。因为CRISPR/核酸酶不需要从基因翻译，所以它能引起快速DSB并减少胚胎中的镶嵌现象。由于这些原因，并且由于其减少镶嵌变化以及保留完整基因的趋势，CRISPR/核酸酶似乎更适合于生产目标基因KO狨猴。另一方面，Cas9核酸酶注射的绒猴胚胎在卵裂球中也表现出几种靶基因修饰模式。例如，有几个卵裂球在一个等位基因中携带相同的indel序列，但在另一个等位基因中携带不同的indel序列。这可以通过CRISPR/Cas9介导的DSB在胚胎中从单细胞阶段持续到卵裂阶段来解释。结果，当注入胚胎时，Cas9核酸酶产生高比率的双等位基因靶基因KO，由于基因功能的丧失，这可能对胚胎是致命的。胚胎中如此高的双等位基因靶基因KO率需要开发新的方法来改变靶基因。工会以及其他人。报道说Cas9当与泛素蛋白酶体信号结合时，减少了食蟹猴靶基因修饰的镶嵌性45。这种新设计的CRISPR/Cas9导致Cas9的早期降解，因此CRISPR/Cas9在注射后不能在发育的猴胚胎中发挥作用。因此，掺入泛素蛋白酶体信号的Cas9可能减少旱獭胚胎中的嵌合突变，并产生同质靶基因修饰的动物。此外，为了减少人类胚胎中的镶嵌突变，马以及其他人。报道称，在CRISPR/Cas9与精子共注射到M期卵母细胞后，98.2%的胚胎在校正后显示出非镶嵌变化MYBPC3人类胚胎中的突变46。这种高比例均匀胚胎的原因似乎不仅是在M期注射过程中获得的，也是因为sgRNA是专门针对突变体设计的MYBPC3，但不是野生型靶基因。此外MYBPC3突变特异性sgRNA似乎可以修复MYBPC3使用母体野生型等位基因作为模板，而不是注射ssODNs，通过同源定向修复进行缺失突变46。尽管使用突变特异性sgRNA很难将突变基因诱导为野生型靶基因，除非靶基因中存在单核苷酸多态性，但是Cas9结合泛素蛋白酶体信号和CRISPR/Cas9注射到M期卵母细胞的方法可能对旱獭胚胎中的靶基因修饰和嵌合突变减少有用，并且可能导致显示表型的遗传修饰旱獭的有效产生。

目前的研究还试图将旱獭c-KIT中的579谷氨酸替换为赖氨酸(AAG)，赖氨酸是已知能产生W37突变小鼠47,48用CRISPR/Cas9和供体ssODN靶向基因KI。对注射胚胎的单个卵裂球分析显示，当使用36 nt有义ssODN作为供体时，精确的KI突变被有效地修饰，而当使用CRISPR/mRNA时，没有观察到精确的KI突变(补充表14)。此外，尽管CRISPR/核酸酶在特定条件下显示了靶基因KI的高效性，但所有这些胚胎也含有c-装备基因KO卵裂球。从序列中，这些胚胎会显示W表型，但表型不同于W37。几个卵裂球在ssODN序列的5’端以胞嘧啶和腺嘌呤插入的形式表现出不精确的KI突变(图4B，补充表15)。在大鼠模型中报道了使用CRISPR/Cas9和ssODN的KI策略49。Yoshimi以及其他人。假定宿主基因组中的DSB可能由于5’核酸外切酶活性而导致5’至3’末端切除，并且供体ssODN也同样被切除，因此导致不精确的KI49。他们进一步推测，当ssODN通过微同源介导的末端连接(MMJ)整合时，可能会引发意想不到的基因修饰，如indel。基于上述研究的发现，推测我们错误突变的假定原因可能是不当的MMJ事件。产生具有有义链-ssODN的高效精确KI的准确原因尚不清楚，但是我们的数据表明，当CRISPR/核酸酶和有义链-SSodn用于c-时，不太可能出现MMJ误差装备外显子11 KI修饰。当使用长长度ssODN (100 nt)和CRISPR/核酸酶时，c-装备在第11外显子，也不是c-装备经常观察到(图4和补充表格14)。在这个系统中，低效的靶基因切割可能导致靶基因KI事件减少。因此，我们推测共注射供体ssOND长度可能影响CRISPR/Cas9的切割活性。

潜在的非目标站点使用网络工具和50个非目标站点进行预测装备和46个非目标站点Shank3被观察到。除了W37-2、W37-4和Shk-C sgRNA的几个非靶位点外，这些潜在的非靶位点出现在绒猴染色体的内含子或基因间区域。在本研究中，W37-1和Shk-A sgRNA被用来修饰胚胎基因，以建立靶基因KI/KO模型狨猴。因此，所选择的sgRNA似乎适合为这些靶基因建立KI/KO狨猴模型。

本研究表明CRISPR/Cas9能有效修饰旱獭胚胎中的靶基因。然而，由此产生的基因改变将是镶嵌修饰。此外，这种镶嵌修饰似乎是由旱獭胚胎中Cas9核酸酶的长期活性引起的，其导致靶基因KO的双等位基因修饰，导致基因功能的完全丧失。这种基因功能的丧失对发育成模型狨猴的胚胎可能是致命的。因此，选择CRISPR/mRNA或CRISPR/核酸酶对于建立旱獭靶基因KO模型非常重要。此外，尽管CRISPR/核酸酶在特定条件下对靶基因KI表现出高度的效率，但胚胎也含有靶基因KO卵裂球。这表明，为了获得精确的KI动物，而不是错误修饰的卵裂球，需要对靶基因KI条件进行广泛的检查。定义明确的初步研究将为获得客观的NHP模型铺平道路，并通过CRISPR/Cas9减少基因编辑失败动物的安乐死。

方法

guideRNA和Cas9表达载体的构建

为了构建sgRNA转录载体，根据制造商的建议，使用T4多核苷酸激酶(新英格兰生物实验室，M0201)磷酸化靶序列的有义和反义链寡核苷酸(由FASMAC有限公司(日本神奈川)合成)。互补的磷酸化寡核苷酸对在95℃孵育2分钟，冷却至25℃以每秒0.1℃退火。退火的脱氧核糖核酸被插入BsaU6-sgRNA表达载体的I位点，之前已有描述50并用于绒猴成纤维细胞中sgRNAs的验证。为了合成显微注射到绒猴胚胎中的基因，退火的基因被插入到绒猴胚胎中Bsa携带T7启动子的DR274载体(地址基因#41815)的位点在试管内抄写。列出了sgRNAs的寡核苷酸序列(补充表1)。人源化Cas9表达载体(PST 1374-NLS-标志-接头-Cas9，地址#44758)51包含CMV启动子和T7启动子的序列用于绒猴成纤维细胞的验证和基因合成。

供体脱氧核糖核酸

单链寡核苷酸(ssODNs)作为KI实验的供体，被设计用于在旱獭c-中引入点突变装备，对应于W37变异老鼠。旱獭c-装备序列是从以前报道的旱獭基因组数据库中获得的52。在狨猴c-装备吉恩，W37突变体参与外显子11突变。36 nt和100 nt长的有义链ssODN (36 nt-S，100 nt-S)和反义链ssODN (36 nt-AS，100 nt-AS)需要将突变引入c-装备基因外显子11被设计成氨基酸残基579被谷氨酸赖氨酸(AAG)取代(补充表13)。所有单点登录都包括沉默突变，以避免KI后CRISPR/Cas9识别。用高效液相色谱法合成并纯化了这些单核苷酸。

绒猴成纤维细胞CRISPR/Cas9活性的验证

绒猴成纤维细胞以5 × 10接种412孔培养板的每孔细胞含有杜尔贝科改良的鹰培养基+谷氨酰胺马克斯(赛默飞舍科学，10566-024)，其中含有10%的FBS (Biowest)、青霉素-链霉素混合物(赛默飞舍科学，15240-062)，并在37℃，5%的一氧化碳下培养16-18小时2。根据制造商的方案，使用带有PLUS试剂的脂转染胺LTX试剂(Thermo Fisher Scientific，15338-100)和Opti-MEM (GIBCO，31985-062)将包含靶序列和hCas9表达载体的U6-sgRNA表达载体转染到培养的细胞中。质粒的脱氧核糖核酸浓度如下:将0.5g SGrna表达载体和0.5g hcas 9表达载体放入孔中。转染后，细胞在37℃，5%一氧化碳下孵育22天内，按照制造商的说明(西格玛，G1N70-1KT)，使用基因标记哺乳动物核酸制备试剂盒从收获的细胞中提取收获的基因组核酸。提取的基因组脱氧核糖核酸用于检测靶基因修饰，如下所述。这些检查包括对每种sgRNA进行3次试验，并且使用ImageJ软件使用CEL-1分析的突变提示带密度来计算修饰效率。使用ImageJ计算CEL-1分析的每个条带的强度，并基于条带强度确定修饰细胞的百分比。

动物、卵母细胞收集和在试管内施肥

所有动物实验都获得了中央实验动物研究所动物护理和使用委员会(CIEA: 11028)的批准，并按照CIEA标准指南进行。CIEA标准指南符合日本科学委员会确定的正确进行动物实验的指南。成年狨猴(2-4.5岁；本研究中使用的体重300-450克)是从一家实验动物饲养公司(日本CLEA公司，日本东京)购买的。卵母细胞收集和原核期胚胎生产通过以下方式进行在试管内如前所述的受精14,53。简而言之，旱獭生泡期卵母细胞是通过手术从卵巢刺激的雌性旱獭中收集的，其卵巢周期根据血浆孕酮水平进行监测。

卵泡刺激按如下所述进行。每隔一天向雌性狨猴肌肉注射25国际单位的人卵泡刺激素(hFSH，富士制药)，注射时间为9天。随后，在手术前17-20小时肌内注射75 IU人绒毛膜促性腺激素(hCG，ASKA制药)。GV卵母细胞通过使用一次性注射器从麻醉的雌性狨猴中吸取卵来收集。收集的卵母细胞在5%胎牛血清、0.15国际单位/毫升氢化硫和10国际单位/毫升氢化硫的聚甲醛培养基(功能肽研究所)中在37℃和5%一氧化碳下成熟27-29小时2，5% O2，90%氮2。野生型雄性狨猴的精子通过体外受精引入成熟卵母细胞。精子通过物理刺激从健康雄性狨猴中收集，稀释至3.6 × 106TYH培养基中的精子/毫升(LSI Medience，DR01031)。成熟卵母细胞和稀释精子在TYH培养基中与5%一氧化碳在37℃共孵育10-16小时2，5% O2，90%氮2。体外受精后，获得原核期胚胎用于实验。

绒猴胚胎CRISPR/Cas9活性的验证

为了验证CRISPR/Cas9在旱獭胚胎中的靶基因修饰，在试管内sgRNA的转录在包含每个sgRNA靶序列的DR274载体上进行。这些向量被线性化为雌鹿三(新英格兰生物实验室，R0104)，用QIAquick凝胶提取试剂盒纯化(Qiagen，28706)。线性化载体脱氧核糖核酸被用作基因合成的模板，使用巨型短脚本T7转录试剂盒(Ambion，AM1354)、mMessage Machine T7 Ultra试剂盒(Ambion，AM1345M)和MEGAclear试剂盒(Ambion，AM1908)。所有程序都是根据制造商的说明进行的。注射到胚胎中的CRISPR/Cas9基因混合物由50纳克/微升的sgRNA和100纳克/微升的Cas9基因组成。注射前，将CRISPR/Cas9核酸酶注射混合物在37℃下孵育30分钟，该混合物由16.7 ng/μL CRISPR核糖核酸(Cr核糖核酸)、33.3 ng/μL反式激活Cr核糖核酸(TraCr核糖核酸)、100 ng/μL Cas9核酸酶(集成脱氧核糖核酸技术，1074181)和0.1 × Tris-EDTA pH 8.0缓冲液组成。crRNAs序列与sgRNA序列相同(补充表1)；crRNA和tracrRNA在FASMAC有限公司合成，使用气压微注射器(FemtoJet，Eppendorf)将大约4-8pl的注射混合物注射到狨猴原核期胚胎的细胞质中。在KI实验中，首先将50 ng/μL ssODN注射到绒猴胚胎原核中，然后将CRISPR/Cas9注射到细胞质中。注射后，胚胎在顺序清洁培养基(Origio，83040010A)中在37℃和5%一氧化碳下培养2，5% O2，90%氮2、直到8细胞期发育阶段。随后，将发育好的胚胎置于补充有10%胎牛血清、2.18毫摩尔谷氨酰胺(GIBCO，25030-081)的顺序爆破培养基(Origio，83060010 A)中，并在37℃下用5%一氧化碳连续培养2，5% O2，90%氮2。为了验证胚胎中的基因修饰，用PBS()洗涤培养的胚胎，并用酸化酪醇溶液去除透明带(Origio，10605000)。将每个裸胚胎收集在0.2毫升的聚合酶链反应试管中，并直接用作聚合酶链反应模板来检测靶基因修饰。

卵裂球分析

CRISPR/Cas9注射胚胎培养约5天，直到达到5-16细胞胚胎期。胚胎用PBS()洗涤，去除透明带。然后使用玻璃毛细管将裸胚胎分裂成单个卵裂球，并在37℃下在胚胎活检培养基(欧文科学，90103)中浸泡15分钟。将每个单个卵裂球作为模板收集在0.2毫升的聚合酶链反应管中，并进行没有基因组提取的聚合酶链反应以检测靶基因修饰。

目标基因修饰的检测

为了检测靶基因修饰，使用以下条件进行巢式聚合酶链反应和细胞因子-1分析。对于聚合酶链反应，制备由1X聚合酶链反应缓冲液、0.2毫摩尔脱氧核糖核酸、0.5毫摩尔每种引物、2.5毫摩尔KOD-Plus-Neo (TOYOBO，401)和模板脱氧核糖核酸组成的反应混合物。分别从旱獭成纤维细胞、全胚胎和卵裂球中提取的20纳克基因组DNA用作聚合酶链反应模板。本研究中使用的引物组和聚合酶链反应条件列于补充表中2和3。所有扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳，以确定聚合酶链反应是否成功。CEL-1分析能够检测目标基因的修饰，根据制造商的协议，使用检测器突变检测试剂盒(整合的脱氧核糖核酸技术，706020)进行。Cel-1核酸酶消化前的错配反应使用了8 μL的聚合酶链反应产物。为了使用单个卵裂球分析从CEL-1测定中检测纯合突变，将4 μL来源于卵裂球的聚合酶链反应产物与4 μL来源于野生型组织基因组的靶位点扩增的脱氧核糖核酸混合，并进行错配反应和CEL-1测定。用Cel-1核酸酶消化的脱氧核糖核酸溶液被施加到含有10% TBE凝胶的孔中(Invitrogen，EC62752BOX)，并在170伏下进行电泳60分钟。电泳后，用嵌入核酸染色溶液(GelRed，Wako，518-24031)对三丁基锡化合物凝胶进行染色，该溶液在蒸馏水中稀释1∶10000，并通过紫外辐射可见。使用用于序列分析的零钝拓扑聚合酶链反应克隆试剂盒(Invitrogen，450245)获得聚合酶链反应产物的亚克隆。使用3130遗传分析仪对亚克隆和聚合酶链反应产物进行序列分析。

潜在非目标地点的预测

使用在线工具CRISPOR(http://crispor.org)54。

统计分析

基因修饰效率的统计分析是通过费希尔精确试验进行的。KI-卵裂球的产生效率通过单向方差分析和瑞安多重比较试验进行评估。与平均值%3C 0.05的差异被认为具有统计学意义。