CEACAM1的丢失与胃癌患者的不良预后和腹膜播散有关 - ELISA试剂盒,酶免试剂盒,酶联免疫吸附试验, ELISA实验,ELISA,双抗体夹心法,科研蛋白,抗体,细胞系,武汉新启迪生物科技有限公司

摘要

CEACAM1与各种癌症的恶性潜能有关。目前的研究旨在阐明癌胚抗原相关细胞粘附分子1 (CEACAM1)表达与胃癌恶性潜能之间的关系，并探讨CEACAM1胞质结构域同种型平衡是否调节胃癌细胞的特性。对235例接受手术的胃癌患者进行CEACAM1免疫组化分析。基于胃癌组织中CEACAM1的表达，计算总生存率和腹膜转移的危险因素。CEACAM1长型(CEACAM1-L)或短型(CEACAM1-S)胞质同工型优势的患者与CEACAM1无表达的患者在总生存率方面进行比较。通过侵袭试验和三维(3D)培养检测CEACAM1转染或敲除的胃癌细胞系NUGC3和MKN7细胞，以阐明CEACAM1是否调节胃癌细胞的侵袭、内腔形成和肿瘤生长。多变量分析表明，没有CEACAM1的胃癌是一个独立的预后因素和腹膜播散的危险因素。CEACAM1-S占优势的患者比CEACAM1-L的患者预后更好，CEACAM1-4L过度表达诱导NUGC3细胞侵袭性更小、内腔形成更多、肿瘤生长更少。CEACAM1-4S过度表达具有更少的侵袭和更多的管腔形成，但肿瘤生长并不减少。CEACAM1表达的敲除具有较少的侵袭性，但MKN7细胞的管腔形成也不少。CEACAM1的丢失与胃癌患者的不良预后和腹膜播散有关。CEACAM1在胃癌细胞中的表达调节侵袭性、内腔形成和肿瘤生长。

介绍

癌胚抗原相关细胞粘附分子1 (CEACAM1)属于免疫球蛋白超家族和癌胚抗原(CEA)家族，是一种跨膜蛋白和细胞-细胞粘附分子。它也被称为CD66a和胆汁糖蛋白1。CEACAM1与各种癌症有关，其表达水平和功能在各种癌症中是不同的。据报道，CEACAM1在乳腺中下调2，前列腺3和子宫内膜4癌症组织。CEACAM1似乎是一种肿瘤抑制剂。然而，CEACAM1过表达与皮肤恶性黑色素瘤的恶性程度有关5，肺腺癌6，晚期结肠癌7和肝细胞癌8。CEACAM1是癌细胞恶性表型的抑制剂还是启动子仍有争议。

在结直肠癌和肝细胞癌(HCC)中，我们报道了CEACAM1与侵袭、转移和不良预后相关7,8,9。CEACAM1在临床结直肠癌组织浸润前沿重新表达7。CEACAM1胞质长结构域亚型(CEACAM1-L)优势与淋巴结和远处转移以及预后不良相关7。CEACAM1长胞质结构域同种型(CEACAM1-4L)促进结直肠癌细胞的侵袭和迁移7。在结直肠癌肝转移中，在结直肠癌细胞上增强的CEACAM1短胞质结构域亚型(CEACAM1-S)与根治性肝切除术后复发相关9。我们还报道了ceaca m1-1与HCC病患者的无复发和疾病特异性生存率相关。CEACAM1-4L增强HCC细胞的侵袭和迁移8。在胃癌中，有可能通过CEACAM1的表达和胞质结构域同种型平衡发生类似的变化，如结肠直肠癌和HCC病。在胃癌中，据报道高水平的CEACAM1与血管生成有关10,11且CEACAM1和TGFβ共表达可能与血管生成相关12。然而，CEACAM1与胃癌患者临床病理特征之间的关系需要研究。CEACAM1细胞质同种型平衡的作用也不清楚。

在本研究中，我们研究了胃癌组织中CEACAM1表达与胃癌患者临床病理特征之间的关系，包括预后和腹膜播散，腹膜播散是胃癌患者的重要预后因素。然后我们检查了CEACAM1胞质结构域同种型平衡对胃癌患者的影响。此外，我们探讨了增强的CEACAM1胞质同种型(CEACAM1-4L或CEACAM1-4S)调节胃细胞系的恶性特性，如侵袭、内腔形成和肿瘤生长的概念。

结果

胃癌切除术后CEACAM1表达与恶性潜能的关系

235例患者中，157例(66.8%)胃癌细胞CEACAM1染色阳性。CEACAM1对有管腔的腺癌的管腔表面染色，而CEACAM1对没有管腔形成的腺癌的癌细胞膜染色(图1)。我们将肿瘤最深处有无CEACAM1表达的病例分为两组。CEACAM1表达组和非CEACAM1表达组之间临床病理变量的比较表明CEACAM1表达与弥漫型胃癌(p%3C 0.001)和静脉渗透(p= 0.022)(表1)。

表1 CEACAM 1-表达组和非CEACAM 1-表达组的临床病理变量。

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单变量分析显示，深度(%3ET3)、淋巴结转移、淋巴渗透、静脉渗透和非CEACAM1表达是总生存率的显著预测因素。基于多变量分析，选择深度(%3ET3)、淋巴结转移和非CEACAM1表达作为总生存率的独立预测因素(表2)。总体生存分析的卡普兰-迈耶方法表明，非CEACAM1表达组与较短的生存时间显著相关(图2)。

表2胃切除术后235例患者总生存率的单变量和多变量分析。

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CEACAM1表达与胃癌腹膜扩散的关系

胃癌的腹膜扩散是胃癌患者致命的复发模式。评估CEACAM1表达与腹膜播散的关系。单变量分析显示深度(%3ET3)、淋巴结转移、淋巴渗透、静脉渗透和无CEACAM1表达是腹膜播散的重要危险因素。在多变量分析的基础上，选择深度(%3ET3)和非CEACAM1表达作为腹膜播散的独立危险因素(表3)。

表3胃切除术后235例患者腹膜播散的单变量和多变量分析。

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CEACAM1亚型平衡与胃癌切除术后恶性潜能和生存率差的关系

在CEACAM1阳性标本中，81例患者(51.6%)观察到CEACAM1-4L的显性表达，76例患者(48.4%)观察到CEACAM1-4S的显性表达(图1)。3)。CEACAM1-4L、CEACAM1-4S显性表达组之间临床病理变量的比较表明CEACAM1-4L的显性表达与弥漫型胃癌(p= 0.019)和淋巴结转移(p= 0.022)(表4)。卡普兰-迈耶综合生存分析方法表明，CEACAM1-4L显性组比CEACAM1-4S显性组生存时间短(p= 0.005)。CEACAM1-4S显性组与非CEACAM1-表达组相比也有较好的预后(图4)。

表4 CEACAM 1-1显性表达组和CEACAM1-S显性表达组的临床病理变量

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CEACAM1表达与胃癌细胞侵袭

为了评估CEACAM1表达对胃癌细胞侵袭的影响，我们对CEACAM1-4L或CEACAM1-4S转染的NUGC3细胞和CEACAM1敲除的MKN7细胞进行了侵袭试验。与载体控制相比，CEACAM1-4L和CEACAM1-4S均显著抑制NUGC3细胞的侵袭。CEACAM1-4S比CEACAM1-4L更能抑制NUGC3细胞的侵袭。CEACAM1 shRNA抑制MKN7细胞的侵袭(图5B)。

CEACAM1在胃癌中的表达及管腔形成

在免疫组织化学中，大多数没有CEACAM1表达的病例被发现为弥漫型胃癌。因此推测CEACAM1可能参与胃癌细胞内腔的形成。为了评价CEACAM1表达与管腔形成之间的关系，我们观察了载体CEACAM1-4L或CEACAM1-4S转染的NUGC3细胞在三维培养中的形态学变化。与CEACAM1-4L和CEACAM1-4S相比，载体控制的NUGC3细胞管腔形成率显著降低。CEACAM1-4L和CEACAM1-4S之间没有显著差异(图5C，D)。CEACAM1 shRNA不抑制MKN7细胞内腔的形成(图5C，D)。

CEACAM1表达式和体内肿瘤生长

在NOD SCID小鼠皮下肿瘤模型中，CEACAM1-4L转染的NUGC3细胞比CEACAM1-4S或载体控制的细胞更能抑制肿瘤生长。相反，CEACAM1-4S和载体控制转染的NUGC3细胞在肿瘤生长方面没有显著差异(图1)。5E)。

讨论

在本研究中，有迹象表明胃癌中CEACAM1表达的缺失是腹膜播散的独立预后因素和独立危险因素。此外，CEACAM1-S显性组比CEACAM1-L显性组预后更好。CEACAM1-1显性组的总生存率与CEACAM1组的总生存率无显著性差异(图4)。CEACAM1-1优势所赋予的不良预后似乎与CEACAM1-S优势所赋予的更好预后相一致，导致整个CEACAM 1表达组所赋予的良好总体存活率(图1)。2)。据我们所知，这是CEACAM1表达与临床病理特征之间联系的第一份报告。

CEACAM1在胃癌细胞中的表达似乎可以调节肿瘤生长、侵袭和内腔形成。本研究表明CEACAM1-4L和CEACAM1-4S均抑制NUGC3细胞的侵袭。CEACAM1-4S比CEACAM1-4L抑制了更多的入侵。关于管腔形成，CEACAM1-4L和CEACAM1-4S均促进NUGC3细胞的管腔形成。然而，敲除MKN7细胞中的CEACAM1并没有显著抑制管腔形成。据推测，不仅CEACAM1诱导管腔形成，而且各种分子也会参与管腔形成。关于肿瘤生长，只有CEACAM1-4L，而不是短同工型，抑制NUGC3细胞的肿瘤生长。两种细胞质结构域亚型对胃癌细胞产生不同的作用。据报道，CEACAM1也与微环境有关13,14化疗15。需要进一步的检查来解决CEACAM1表达对胃癌细胞的影响。

在临床环境中，CEACAM1的丧失是其中存活最差的。另一方面，CEACAM1-S优势群的存活率最高。CEACAM1-1显性组比CEACAM1-S显性组总体存活率更低，表型更分散。在试管内进行了研究以阐明CEACAM1与临床观察相关的原因。CEACAM1缺失的NUGC3细胞侵袭性最强，管腔形成最差，肿瘤生长更多。很明显，CEACAM1表达的缺失是最高的恶性级别。另一方面，CEACAM1-4S诱导了对侵袭的抑制、更多的内腔形成和更多的肿瘤生长。CEACAM1-4S减弱了胃癌细胞除肿瘤生长外的恶性潜能。CEACAM1-4L怎么样？CEACAM1-4S和-4L的区别在于侵袭和肿瘤生长。CEACAM1-4L比CEACAM1-4S诱导更多的侵袭性和更少的肿瘤生长。癌细胞侵袭是恶性表型比肿瘤生长更重要的因素。我们已经报道了CEACAM1-4L促进结直肠癌和肝细胞癌的侵袭性，导致CEACAM 1-1显性表达与不良生存率相关。因此，CEACAM 1-1显示出比CEACAM1-S更差的总体存活率的原因可能是CEACAM 1-1诱导的侵袭性。桌子4表明CEACAM1-L优势与胃癌的扩散亚型更相关。我们的3D培养实验显示胃癌细胞约20%的内腔形成。其他80%的细胞不形成内腔。因此，CEACAM1-L表达细胞的侵袭性更强，而不是内腔形成，可能反映组织学表型。

迄今为止，我们已经报道CEACAM1胞质结构域平衡、长胞质结构域优势、促进迁移、侵袭、转移和不良预后。本研究表明CEACAM1在胃癌细胞中的表达可导致肿瘤抑制、侵袭性降低、内腔形成增多、腹膜播散减少和预后改善。然而，CEACAM1是癌症的好分子还是坏分子仍有争议。CEACAM1被认为是一种肿瘤抑制因子，但它在结肠癌组织中的表达下调16乳房2，前列腺3子宫内膜4。在当前的报告中，CEACAM1的肿瘤抑制功能与该数据一致。据推测，如果癌细胞没有CEACAM1表达，增强的CEACAM1表达会引起较少的癌症恶性表型，包括管腔形成13,17,18,19,20。另一方面，我们已经报道，如果癌细胞持续表达CEACAM1，例如结肠直肠癌和HCC，CEACAM1-L优势平衡促进恶性表型，包括侵袭、转移和不良预后7,8,9。

我们认为器官之间是有区别的。正常胃粘膜不表达CEACAM112，但非肿瘤肝细胞表达CEACAM121并且CEACAM1-1占正常结肠上皮细胞中CEACAM 1总表达的15-20%22。CEACAM1的生理表达因器官而异。因此，可以想象CEACAM1在胃、结肠、直肠和肝脏中的表达和胞质结构域同种型平衡的作用已经不同。大多数结直肠癌和HCC表达CEACAM1，结直肠癌和HCC很少不表达CEACAM1。在癌细胞基本表达CEACAM1的背景下，癌细胞调节CEACAM1胞质结构域优势，导致恶性表型如运动性、侵袭性、转移性和预后的促进。另一方面，在没有CEACAM1表达的癌细胞中，例如胃癌、前列腺癌和乳腺癌，CEACAM1-L可以起到肿瘤抑制因子的作用。一般而言，CEACAM1阳性的癌症如结肠直肠癌和HCC病不具有侵袭性，预后可预测，而CEACAM1阴性的癌症如胃癌具有侵袭性，预后不可预测。基于这个想法，CEACAM1基本上作为癌症的肿瘤抑制剂。在更晚期，CEACAM1的表达和胞质结构域同种型平衡参与促进癌细胞的运动和侵袭。

本研究表明CEACAM1的丢失与胃癌患者的不良预后和腹膜播散有关。胃癌组织中CEACAM1-S-显性表达表明胃癌患者的存活率高于没有CEACAM1表达和CEACAM1-L-显性表达的患者。CEACAM1可能成为胃癌腹膜播散患者的生物标志物。CEACAM1的表达，尤其是CEACAM1-S的表达，可能是胃癌患者腹膜播散的治疗靶点。进一步分析CEACAM1对胃癌细胞的作用，有助于胃癌患者的诊断和治疗。

方法

病人

从2006年12月开始，2005年1月至2006年12月在和歌山医科大学医院接受根治性手术的235名无远处转移的患者被纳入本研究。提交手术标本进行免疫组织化学。根据TNM分类，它们包括128例ⅰ期胃癌、59例ⅱ期胃癌、48例ⅲ期胃癌和0例ⅳ期胃癌。患者平均年龄为66.6岁，男性170例，女性65例。随访期为五年。无粘膜癌的ⅱ期和ⅲ期患者接受基于S1(口服氟嘧啶)的术后化疗，ⅰ期患者未接受化疗。本研究获得和歌山医科大学人类伦理审查委员会的批准(批准号1656)。我们按照赫尔辛基宣言、人类受试者医学研究伦理原则指南和和歌山医科大学伦理指南进行了所有实验。在和歌山医科大学的网页上以选择退出的形式获得了知情同意。

免疫组织化学

如前所述，使用链霉亲和素-生物素方法进行免疫组织学染色7,8,9。用福尔马林固定石蜡包埋块制作厚度为4微米的组织切片。切片脱蜡并在0.1 M柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中于121℃高压灭菌10分钟。内源性过氧化物酶活性通过在室温下在3%过氧化氢中孵育5分钟而被阻断。这些载玻片用PBS溶液洗涤，并在室温下用无血清蛋白封闭溶液(X0909，美国达科)孵育10分钟。然后，将切片与初级抗体、小鼠抗人CEACAM1单克隆抗体4D1/C2 (MABT65，Merc，稀释度1:200)或兔抗人CEACAM1长特异性多克隆抗体(稀释度1:500)或小鼠抗人CEACAM1短特异性多克隆抗体(稀释度1:500)一起孵育，这两种抗体均由约翰·希弗利产生，并且它们的特异性通过蛋白质印迹得到证实7在室温下将生物素化的二级抗体和来自组蛋白去乙酰化酶试剂盒(日本日瑞)的过氧化物酶结合的链霉亲和素施用30分钟。最后，切片在3’3-二氨基联苯胺中孵育10分钟，然后苏木精复染和载玻片固定。

免疫组织化学染色的评价

如前所述，通过对染色的强度和范围进行评分来评估表达状态8,12。染色强度分为0(阴性)、1(弱)、2(中等)、3(强)；组织中一般染色强度的范围分为0(0–5%)、1(6–33%)、2(34–66%)或3(67–100%)。然后将染色和强度分数的范围相加以获得总分数12。三个人对所有标本进行了两次盲检。如果出现差异，用多头显微镜观察样本并进行讨论，以达成共识。

细胞系

本研究中使用了人胃癌细胞系。NUGC3(未分化型)和MKN7(分化型)细胞购自日本生物资源研究中心(日本东京)。NUGC3和MKN7细胞在含有10%胎牛血清、100微克/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素的RPMI-1640(瓦科)培养基中于37℃在湿润的5%一氧化碳中培养2大气。

转染和核糖核酸干扰

转染和核糖核酸干扰技术先前已有描述7,8,9,15,20。CEACAM1-4L或-4S基因被克隆到β肌动蛋白载体中23，并与1μL Lipofectamine 3000(Invitrogen)混合至最终体积为100 μL的Opti-MEM培养基，并加入到在24孔板中生长至80%汇合的NUGC3细胞中。转染48小时后，加入G418溶液(罗氏，巴塞尔，瑞士)。稳定转染的细胞保持在上述培养基中。如前所述，设计用于靶向CEACAM1的短发夹核糖核酸质粒由萨博西恩斯(美国马里兰州弗雷德里克)合成7。如上所述，将每个质粒(0.8 μg)转染到MKN7细胞中。稳定转染细胞系的CEACAM1的表达水平通过逆转录聚合酶链式反应来评估(图1)。5A)

入侵检测

入侵检测是使用生物燕麦基质胶入侵室(BD Biosciences)进行的，之前已经描述过相关技术7,8。每次测量一式四份。侵入百分比计算为通过基质凝胶膜的细胞数量与通过对照膜迁移的细胞数量之比。

基质文化

先前已经描述了基质凝胶3D培养20。将基质凝胶(200升，BD生物科学，贝德福德，马萨诸塞州)镀在24孔板上，并在37℃下固化15分钟。基质凝胶固化后，将0.5毫升细胞悬浮液置于含有2 × 10的培养基中4将/毫升直接接种到每个孔中，并在37℃下在5%湿润的CO2气氛中孵育2小时。孵育后，将基质凝胶(200升，50%浓度)加入上层，并在37℃下固化15分钟。然后加入完整的培养基，并将平板在37℃下在5%湿润的CO2气氛中孵育。在培养过程中，定期监测细胞生长和管腔形成，通过管腔的存在与否来评分。培养基每三天更换一次，直到第15天。

体内肿瘤小鼠模型

六周大的NOD。CB17-Prkdc锡特/J (NOD SCID)小鼠购自日本志贺查尔斯河实验室日本公司。所有动物实验都是根据国家生物医学创新、健康和营养研究所的机构指导方针进行的。NUGC3细胞(100 l，5 × 106将转染了CEACAM1载体对照、CEACAM1-4L或CEACAM1-4S的细胞/毫升接种到小鼠背部皮下。肿瘤大小每周测量两次，分别是长度(左)、宽度(西)和高度(高)。肿瘤体积按体积=(1×W×H)/2计算。所有动物实验均按照日本政府的《动物保护和管理法》(第105号)和《实验动物护理和管理及疼痛缓解标准》(第88号)以及和歌山医科大学动物实验指南进行。这项研究获得和歌山医科大学动物实验委员会(批准号878)和基因重组委员会(批准号29–13)的批准。

统计分析

总生存率的单变量cox回归用于临床病理因素的统计分析。这些因素也通过多变量cox回归进行分析，并为每个因素计算95%置信区间的优势比。卡普兰-迈耶方法被证明可以评估总体生存率。采用对数秩检验来确定这些数据的统计显著性。所有数据均以平均标准差表示。P-值%3C 0.05被认为具有统计学意义。统计计算采用SPSS软件程序ver进行。18.0(伊利诺伊州芝加哥市SPSS)。