微管靶向剂对转化生长因子β介导的蜗牛表达的影响
观察了微管蛋白在乳腺癌细胞中快速阻断转化生长因子-β介导的转录因子表达的能力，并与其他微管靶向剂的作用进行了比较。目的是评估这些药物对乳腺癌中EMT的关键驱动因素的早期、初步影响，从而解释微粒子逆转患者EMT的能力和临床前模型。19,20本实验设计使用微管靶向剂对细胞进行2h预处理，其浓度与临床相关，并可导致最大程度的微管断裂。82ng/mL浓度的转化生长因子-β足以诱导稳定的蜗牛蛋白。1A)和Snai 1转录表达(图1.1B和补充图。S1a，b)血清饥饿的TNBC细胞在2~3h内。用载体(Vehicle、eribulin，ERI)、长春瑞滨(VIN)、紫杉醇(Paclitaxel)或依沙伯酮(IXA)预处理细胞2h后，观察其对TGF-β诱导的蜗牛表达的影响。结果表明，微管失稳剂利布林和长春瑞滨对转化生长因子-β诱导的BT-549、HCC 1937、MDA-MB-231和Hs578T细胞的Snail表达均有抑制作用。1C和补充图。S1c，d)。微管稳定剂依沙伯酮也能抑制蜗牛在4种细胞系中的表达。相比之下，紫杉醇对转化生长因子-β诱导的蜗牛在这些细胞系中的表达没有影响。1D和补充图。S1e，f)。在无外源性转化生长因子-β的填充培养基中观察到类似的作用，但信号低于急性途径刺激(补充图)。S2)。为了确定微管靶向药物对蜗牛的影响是否由转录改变所介导，我们评估了蜗牛转录本，Snai 1..灯盏乙素、长春瑞滨和依沙伯酮对大鼠肝细胞增殖有明显的抑制作用。Snai 1BT-459和HCC 1937细胞中的BT-459和HCC 1937细胞。1D)但只有利布林和长春瑞滨减少。Snai 1MDA-MB-231和Hs578T细胞的转录(附图)。S1e，f)。这些结果表明，在某些情况下，先用利布林、长春瑞滨和依沙伯酮预处理2h，就足以抑制转化生长因子-β靶基因的转录激活。Snai 1，导致蜗牛表达减少。
图1转化生长因子-β可引起蜗牛的快速诱导，微管靶向剂对此有不同程度的抑制作用.a血清饥饿18 h BT-549和HCC 1937细胞裂解物的westernblot分析，然后在规定的时间和浓度下用转化生长因子-β刺激。对钉螺和GAPDH进行了免疫印迹检测。b细胞内mRNA表达分析Snai 1BT-549和HCC 1937细胞。血清饥饿18h后，用2ng/mL的转化生长因子-β刺激细胞。数据平均为两个独立的实验(±SEM)。c血清饥饿BT-549和HCC 1937细胞全细胞裂解液中Snail和GAPH的westernblot分析，用微管靶向剂预处理2h，再用转化生长因子-β(TGF-β)刺激3h。dmRNA分析Snai 1血清饥饿18h细胞转录本，微管靶向剂预处理2h，转化生长因子-β刺激1h(BT-549细胞)，N=3)或2小时(HCC 1937细胞，N=4)。数据是独立实验的平均值(±SEM)。采用单因素方差分析和邓尼特后专案试验，比较了β刺激的车辆控制细胞(*)的统计学意义。p < 0.0001, ***p < 0.001, **p < 0.01, *p < 0.05). e, f..BT-549和HCC 1937细胞经siRNA瞬时敲除Smad 2/3蛋白后，血清饥饿18 h，微管靶向剂预处理2h，转化生长因子-β刺激3h，免疫印迹法检测Smad 2/3、Snail和GAPDH。g, h用Westernblot分析血清饥饿18 h，微管靶向剂预处理2h，转化生长因子-β刺激45 min(BT-549)或1h(HCC 1937)。对总Smad 2/3及其磷酸化形式和GAPDH进行了检测。
微管靶向剂对Smad 2/3核定位的影响
探讨一些微管靶向剂如何抑制Snai 1观察转录及其对上游事件的影响。Smad 2/3/4蛋白是典型的转化生长因子-β途径介导因子，是转录机制的一部分。Snai 1表情。用siRNA介导的Smad 2/3缺失技术研究了微管靶向剂对Smad 2/3的影响。Snai 1是由这个规范途径介导的。与图中的结果一致。1而紫杉醇对转化生长因子-β诱导的模拟转染细胞中蜗牛的表达有抑制作用。1E，f)。Smad 2/3缺失完全抑制转化生长因子-β-介导的蜗牛在BT-549和HCC 1937细胞中的表达(图1)。1E，f)(上带-SMAD 3，下带-Smad 2)。这些结果表明Smad 2/3是蜗牛表达所必需的，这种信号是通过典型的转化生长因子-β途径产生的。
标准通路执行的第一步是转化生长因子-β刺激后Smad 2/3的磷酸化和激活，提示这可能是微管靶向剂对该通路的抑制点。然而，结果(图)。1g，h表明微管靶向剂对TGF-β刺激后的Smad 2/3磷酸化水平没有影响，提示微管靶向剂抑制Snail表达的能力并不是由于Smad 2/3的初始激活(磷酸化)改变所致。
激活后，Smad 2/3蛋白从细胞质转移到细胞核，启动转录。由于细胞质Smad 2/3沿微管向细胞核输送，因此呈dynein依赖性。14,15,16微管靶向剂已经被证明可以抑制其他转录因子的核运输，26观察了微管靶向剂对转化生长因子-β诱导的Smad 2/3核蓄积的影响。转化生长因子-β诱导BT-549和HCC 1937细胞Smad 2/3在1h内呈明显的时间依赖性增加(附图)。S3)。然而，与TGF-β刺激的对照组相比，与TGF-β刺激的细胞相比，在硝基苯胺或长春瑞滨预处理的细胞中，TGF-β介导的Smad 2/3核定位受到明显抑制，在这两个细胞系中，Smad 2/3的胞浆定位更加分散(图2/3)。2和补充图。S4)。相比之下，紫杉醇对这两种细胞系的Smad 2/3定位均无影响，而依沙伯酮可降低BT-549细胞的Smad 2/3核定位，而不影响HCC 1937细胞的Smad 2/3定位。利布林和长春瑞滨介导的抑制核Smad 2/3定位的能力与其减弱的能力是一致的。Snai 1转录和蜗牛蛋白表达。
图2微管靶向剂对转化生长因子-β介导的Smad 2/3核蓄积有不同程度的抑制作用。a, b用免疫荧光法检测血清饥饿18 h、微管靶向剂预处理2h、转化生长因子-β刺激45 min(BT-549)或1h(HCC 1937)细胞Smad 2/3定位。图像是用小歌剧™高含量成像仪获得的，是四个独立实验的代表。c, d测定BT-549和HCC 1937细胞核内Smad 2/3的表达率。数据是四个单独实验的平均值，每个实验有四个重复(平均±扫描电镜)，N=16)。采用单因素方差分析与邓尼特的后特设试验相比较的统计学意义，并与转化生长因子-β刺激的车辆对照组进行比较.(*)p < 0.0001, ***p < 0.001, **p < 0.01, *p < 0.05)
微管靶向剂对Smad 4依赖的蜗牛表达的影响
除了Smad 2/3，Smad 4是转录机制中不可或缺的一部分。Snai 1表情。观察Smad 4缺失对TGF-β诱导的蜗牛表达的影响.与Smad 2/3基因敲除相一致，Smad 4的缺失抑制了转化生长因子β介导的蜗牛表达。3A，b和补充图。S5a，c)和Snai 1成绩单3C，d和补充图。S5b，d)在所有处理条件下的所有四个细胞系中。Smad 4与Snai 1用芯片-qPCR技术对启动子进行鉴定。Smad 4在Smad结合元素上的富集Snai 1采用转化生长因子-β(TGF-)刺激载体处理细胞，观察其启动子的表达。3E)。有趣的是，Smad 4在Snai 1与载体相比，微粒子处理细胞中的启动子甚至更高(见图)。3E)，即使Snai 1微珠蛋白抑制表达。在另一个Smad依赖基因的启动子上也观察到Smad 4与珠蛋白预处理前结合增加的趋势，Id1(补充图。S6a)。Smad 4抗体的特异性被这些抗体缺乏浓缩所证实。Snai 1和Id1mda-mb-468细胞中不表达smad 4的启动子区27(补充图。S6B)。总之，这些数据表明，在存在珠蛋白的情况下，Smad 4保留了定位到细胞核并与核结合的能力。Snai 1启动子。然而，铁蛋白介导的抑制Smad 2/3转运到细胞核，导致缺乏Smad 2/3/4依赖的转录激活，可能导致Smad 4在启动子区域积累。因此，Smad 4绑定到Snai 1启动子是必要的，但不足以诱导Snai 1转化生长因子-β刺激后的转录。这可以解释为什么增加Smad 4的招募Snai 1启动子不能克服利布林介导的抑制核内Smad 2/3的积累，导致蜗牛表达降低。
图3Smad 4是蜗牛表达式所必需的。a, bSmad 4在Bt-549和HCC 1937细胞中被siRNA击倒后，血清饥饿18h，微管靶向剂预处理2h，转化生长因子-β(TGF-β)刺激3h，细胞裂解物进行免疫印迹，检测Smad 4、Snail和GAPDH。c, dQRT-PCR分析Snai 1siRNA介导的Smad 4基因敲除后的转录本。血清饥饿18 h，微管靶向剂预处理2h，转化生长因子-β刺激1h(BT-549)或2h(HCC 1937)。数据为两个独立实验的平均值(±SEM)。每种情况下Smad 4基因敲除的统计学意义均采用与Holm-Sidak的多重比较检验的双向方差分析。(*)p < 0.0001, ***p < 0.001, **p < 0.01, *p < 0.05) e两种不同的芯片-qPCRSnai 1启动子区域血清饥饿18h后，将bt-549细胞分别用载体或珠蛋白预处理2h，再用tr-β刺激1h。染色质免疫沉淀法Snai 1P3和Snai 1TSS启动子序列为Smad 4或对照IgG。数据为平均值±扫描电镜(N=2)，并报告为每个序列的输入染色质百分比。
微管靶向剂对鼻塞表达的影响
除了蜗牛，鼻涕虫是另一种重要的转化生长因子-β反应转录因子，促进乳腺癌的上皮细胞移植。21,28与蜗牛一样，转化生长因子-β刺激后鼻涕虫表达呈时间依赖性增加，BT-549和HCC 1937细胞在3h内均有较强的表达(图一)。4A)。然而，与蜗牛不同的是，微管靶向剂对转化生长因子-β诱导的BT-549细胞段塞的表达没有明显的影响。4B)。相反，在HCC 1937细胞中，利布林和长春瑞滨引起了一种出乎意料的鼻涕虫增加(见图)。4B)和SNAI 2转录表达(附图)S7a)。紫杉醇和依沙伯酮均未见此作用。在HCC 1937细胞中，不受血清饥饿或转化生长因子-β-刺激的影响(补充图)。S7b，c，d).
图4微管靶向剂对乳腺癌细胞表达的影响。aBT-549和HCC 1937细胞经血清饥饿18 h后，用转化生长因子-β刺激后的Westernblot分析。bBT-549和HCC 1937细胞经血清饥饿处理18h后，用微管靶向剂预处理2h，再用转化生长因子-β刺激3h，用Westernblot分析BT-549和HCC 1937细胞裂解液中的段塞和GAPDH。c, dSmad 4在BT-549和HCC 1937细胞中被siRNA瞬时击倒。血清饥饿18 h，微管靶向剂预处理2h，转化生长因子-β刺激3h，细胞裂解液进行Smad 4、段塞和GAPDH免疫印迹。e对血清饥饿18h，微管靶向剂作用5h的HCC 1937细胞全细胞裂解物进行Westernblot分析，并对c-jun、段塞和GAPDH的全磷酸化形式进行免疫印迹检测。fmRNA分析君HCC 1937细胞经血清饥饿18 h后用微管靶向剂处理4h的转录本N=2)。数据为平均值±扫描电镜。与车辆控制比较的统计学意义采用单因素方差分析和邓尼特的后特别检验(*)来确定。p < 0.001). gHCC 1937细胞经血清饥饿处理18h后，用微管靶向剂作用5h，得到c-Jun和DAPI的免疫荧光图像。hc-jun在HCC 1937细胞中被siRNA瞬时击倒.小鼠血清饥饿18h，微管靶向剂作用5h，细胞裂解物免疫印迹c-jun、段塞和GAPDH。i载体或珠蛋白处理HCC 1937细胞7d后全细胞裂解物的westernblot分析。对鼻涕虫、c-军和GAPDH的免疫印迹进行了检测。
以前的研究表明，鼻涕虫的表达可以发生与Smad 4无关的方式。29因此，研究了Smad 4基因敲除对微管失稳剂介导的鼻塞表达增加的影响。Smad 4的缺失降低了转化生长因子-β诱导的鼻塞基因(附图)。S8a)和蛋白质表达。4C)在BT-549细胞中，是否存在微管靶向剂，与转化生长因子-β诱导的Smad 4在该细胞系中的表达一致。相比之下，在HCC 1937细胞中，Smad 4的耗竭并不抑制利布林或长春瑞滨诱导的鼻涕虫转录本的增加(附图)。S8b)或蛋白质水平(如图所示)。4D)。Smad 2/3耗竭也有类似的结果(补充图)。S-8c，d在HCC 1937细胞中，转化生长因子β非依赖性表达为Smad 2/3/4。综上所述，这些数据表明微管靶向剂在不同的分子环境下可以对鼻塞的表达产生不同的影响。这与微管靶向剂对蜗牛的影响不同，这在所有四个TNBC细胞系中都是一致的。
c-Jun在微管失稳剂介导的鼻塞上调中的作用
我们推测，珠蛋白和长春瑞滨对hcc 1937细胞中smad不依赖的弹状体上调的机制可能是由c-jun所致，c-jun是一种转录因子，对HCC 1937细胞有正调控作用。SNAI 2表达30经微管失稳剂诺考唑、秋水仙碱或长春新碱短期治疗后被上调。31,32在HCC 1937中观察了微管靶向剂对c-Jun表达的影响。4E，f)和Bt-549细胞(补充图)。S9a)。在每一种情况下，紫杉醇和异丙二酮均能增加c-jun和磷-c-jun的含量，而对紫杉醇和依沙伯酮则无明显影响。免疫荧光实验表明，c-Jun在铁蛋白处理的HCC 1937细胞中的核定位增强(图1)。4G)，它可以驱动目标基因的转录，包括SNAI 2..事实上，c-jun耗竭减弱的微珠蛋白介导的段塞在HCC 1937细胞中的上调作用(见图)。4H)。当hcc 1937细胞长期(7天)接受低剂量(1-6 nm)的eribulin处理时，还观察到了这些由eribulin介导的c-jun和slg的增加，这一实验范式已被证明可以逆转emt相关的表型。19(无花果)4I)。在BT-549细胞中，低浓度的灯盏花素慢性处理可增加c-jun的表达，但不能上调鼻塞的表达(附图)。S9C)，这与短期实验中这些细胞对珠蛋白的反应是一致的。
Smad 4表达水平与珠蛋白介导的鼻塞上调的相关性研究
为了了解为什么c-Jun基因表达增加导致HCC 1937细胞中的Smad 4表达增加，但BT 549细胞却没有，我们注意到HCC 1937细胞的Smad 4水平低于BT-549细胞(补充图1)。S9b)。这导致我们推测低的Smad 4水平会导致c-jun依赖的段塞表达，以响应微管的不稳定。为了扩大这一观察范围，我们对12株乳腺癌细胞系的Smad 4低表达与微管失稳剂介导的段塞上调之间的关系进行了研究。表达Smad 4最低水平的4株细胞分别为SUM185PE、HCC 1806、HCC 1937和MDA-MB-468。5A)。值得注意的是，hcc 1937、sum185pe和mda-mbb-468细胞是唯一种诱导上调hcc 1937细胞增殖的模型。SNAI 2治疗后的转录本(图)。5B和补充图。S10A)。重要的是，在smad 4-空mda-mb-468细胞中，smad 4减毒微珠蛋白的重新表达。SNAI 2升华(图)5C)。这些数据表明，Smad 4的低表达，特别是在更多的基底样TNBC细胞中，与微管失稳剂介导的鼻塞增多有关，而Smad 4的表达足以减弱这种反应。然而，也有例外，例如，mda-mbb-231细胞对珠蛋白的反应增加。SNAI 2尽管他们有较高的Smad 4水平，这表明其他因素可能与此有关。
图5铁蛋白诱导的鼻塞蛋白表达与内源性Smad 4的表达相关。a12株乳腺癌细胞系全细胞裂解物的westernblot分析。对Smad 2/3、Smad 4、蜗牛和鼻涕虫的免疫印迹进行了检测。作为加载控制，使用还原™试剂的总蛋白染色与标准化车道量化一起显示。b取乳腺癌细胞株血清饥饿18h，分别用利布林、紫杉醇处理4 h，qrt-PCR分析其mrna的变化。SNAI 2..数据是以热图的形式进行的两个独立实验的平均值.c用免疫印迹法检测BT-549、MDA-MB-468和Smad 4表达的MDA-MB-468细胞的全细胞裂解物对Smad 4和GAPDH的影响。dMDA-MB-468和Smad 4表达的MDA-MB 468细胞经血清饥饿处理18h后，分别用载体或灯盏花素处理4 h。SNAI 2用qRT-PCR分析mRNA。数据为两个独立实验的平均值(±SEM)。结果与未转染和药物处理的mDA-MB-468细胞比较，如图所示.5B，控制
METABRIC数据集24,25的变化对预后的价值。Smad 4和SNAI 2..利用2509例乳腺癌患者35年来的基因表达数据，Smad 4或SNAI 2mRNA表达改变分别为8%和13%。Smad 4的整体低表达和鼻塞的高表达与总存活率降低有关(补充图)。S11a)。此外，当对相同的METABRIC数据集进行评估时，有基因改变(包括突变和拷贝数改变)的患者的子集Smad 4(占所有病人的1.9%)和SNAI 2(12%的患者)被评估，有明显的整体生存率在该子集的患者(补充图)。S11b).
这些发现表明，Smad 4低表达的乳腺癌患者中，由于EMT促进转录因子段塞的上调，Smad 4低表达的乳腺癌患者可能不容易受到已知的利布林逆转效应的影响。因此，我们推测Smad 4的高表达可以作为一种潜在的生物学标记物，来评价微粒子在乳腺癌患者中逆转EMT的能力。
