CLADE B包括与软骨和放射线鱼的Cx 32相对应的序列，以及石棺中的Cx 32序列。此外，分析还阐明了这些序列与放线菌序列之间的骨科关系。这一发现与主要脊椎动物系之间的微同步分析是一致的(图)。2B)。事实上，Cx 32基因共有几个基因，表明了一个共同的起源。然而，鸟类和哺乳动物之间的模式比放线动物更为保守，这可能是由于基因组重排造成的。基因命名Cx27.5和Cx 31.7在真核生物中，ohnolog基因是从影响这些生物体基因组的世系特异性基因组复制事件中衍生出来的。15,16.

羰基化基序在A和B两类中都存在，在B类中，这个基元几乎是普遍存在的。有趣的是，在CLADE A中，有两个重要的分支已经失去了：非哺乳动物，羊膜。Cx 30和放射线Cx 30.3..有趣的是，Cx 30.3在鱼类耳蜗中的作用可能类似于哺乳动物的Cx 26。17..旗鱼有一个不寻常的羰基化基序：它拥有Arg 104和Lys 125，但序列中有两种脯氨酸(Pro124，Pro123)。我们研究过的任何其他脊椎动物的任何序列都没有这个序列，考虑到两个脯氨酸残基所带来的空间限制，Lys 125是否能在羰基化之后正确地定向到Arg 104，这是值得怀疑的。因此，甲酰基化基序绝对存在于所有颚口的祖先中，并且可能也是在无齿突中进化的，尽管其形式有很大的改变。在这两个序列中，几乎所有的序列都有一个长的C端尾.唯一值得注意的例外是羊膜Cx 26(绿色盒子，图)。1，亦见补充表2，补充图。1)其中C末端的尾巴被截短成几个氨基酸。

Cx 26半胱氨酸对CO的敏感性2

序列比较表明，石棺鱼和四足鱼中都存在甲酰化基序。因为我们已经建立了CO2-哺乳动物和鸟类基因编码的Cx 26半基因的敏感性6,18，我们测试了爬行动物的Cx 26半骆驼(切洛尼亚和盖科)、两栖类(非洲爪蟾)和肺鱼(鳞翅目警报器)，也展出CO2-依赖开启。为了评估这一点，我们使用了我们建立的和验证过的染料负载试验。6,12,18,19,20,21为了测试我们是否能检测到羧基荧光素进入hela细胞，在CO中表达这些cx 26基因。2挑战(图1.3)。作为阳性对照检查半透明膜的功能表达，我们使用的是零钙。2+对CO开启半胱氨酸有效的刺激2-独立的机理，并提供了一个最大染料负荷的措施，以比较CO。2-依赖染料负载。所有四个被检测的Cx 26基因都有一个羰基化基序，与人类Cx 26非常相似(图6)。3A)。然而，只有表达爬行动物Cx 26的HeLa细胞表现出CO。2-依赖染料负载(图1.3b，c)。然而，表达这四个基因的HeLa细胞显示出了向零钙的染料负载。2+刺激显示功能性半胱氨酸的存在(见图。3b，c)。我们通过全细胞膜片钳的记录证实了这些结果，以证明CO的存在。2表达HeLa细胞的依赖电导切洛尼亚和盖科Cx 26，但在HeLa细胞中不表达非洲爪蟾Cx 26或未转染的HeLa细胞。4)。因此，Cx 26半胱氨酸非洲爪蟾和鳞翅目警报器对CO不敏感2..因此，在测试的物种中，只有来自羊膜的Cx 26半汗腺含有CO。2敏感。

羊膜Cx 26半汗腺可被CO打开2. a羊膜、两栖动物和肺鱼共有CO。2羰基化基元(高亮框)。bCO对染料负载的响应图像2，以及零Ca2+阳性对照。c总结资料显示爬行动物Cx 26半胱氨酸向CO开放2但那些非洲爪蟾和鳞翅目警报器不要(表示为与控制35 mmHg PCO相比像素强度的变化)。2)。比较用Mann Whitney检验。盒子和胡须情节：方格，第一和第三四分位数；水平线，中间；胡须，距离中间四分位数不超过1.5倍的最远点。每个点是独立转染后像素强度的中位数变化。标尺20米

全尺寸图像

全细胞膜片钳记录显示2表达HeLa细胞的敏感电导切洛尼亚和盖科Cx 26，但在未转染的亲代HeLa细胞或表达HeLa细胞的HeLa细胞中不存在非洲爪蟾Cx 26红棒表示使用55毫米汞柱高二氧化碳盐。细胞阻断在−50 mV，步骤为−40 mV以评估整个细胞的电导.Kruskal-Wallis方差分析。盒子和胡须情节：方格，第一和第三四分位数；水平线，中间；胡须，距离中间四分位数不超过1.5倍的最远点。每个点代表一个独立的膜片钳记录(复制)。

全尺寸图像

C端尾控CO2-Cx 26的敏感性

关于两栖类、体腔棘皮类的检验(图一)。5A)和肺鱼Cx 26氨基酸序列，发现Cx 26的C末端尾明显长于羊膜中的Cx 26。因此，我们测试删除这个扩展的C端尾是否能恢复一氧化碳。2Cx 26在这些物种中的敏感性。我们截断了非洲爪蟾Cx 26，并改变最后两个残基，使其与哺乳动物Cx 26相同，以改善贩运(xtCx 26，Δ，PV)。表达这种截短的Cx 26的HeLa细胞现在显示了这两种CO。2-依赖染料负载(图1.c.)和CO2-依赖电导变化(图1.6)。相反，添加非洲爪蟾C-端尾至人Cx 26(hCx 26+)申(CT)有效地废除了CO2人Cx 26半胱氨酸的敏感性(图1.c.)。最后，进化为我们做了同样的操作：拉蒂莫里亚(腔棘皮)有三个不同的同系物Cx 26，其中两个有一个长的C末端尾巴，在第三个C末端被截断到与人类基因相同的长度(图一)。5A)。因此，我们测试了是否截断了拉蒂莫里亚Cx 26基因编码CO2-敏感的半胱氨酸。我们发现表达这一截短基因的HeLa细胞确实表现出CO。2-依赖染料负载(图1.c.)和CO2-依赖于全细胞电导的变化(图)。6)。因此，我们得出结论认为，CO的两个关键标准2Cx 26半胱氨酸的敏感性主要表现为C末端的延伸和羰基化基序的存在。这一条件是符合Cx 26的许多羊膜物种。

非羊膜肉瘤C末端延伸尾对CO的抑制作用2Cx 26半胱氨酸的敏感性a羊膜与非羊膜脊椎动物Cx 26 C末端尾的比较。b去除非洲爪蟾的C端尾，用pv替代最后两个残基(xtCx 26Δpv)，使改性的cx 26得到良好的表达，并显示出CO的增益。2敏感。增加非洲爪蟾C-端尾至人Cx 26(hCx 26+)申CT)引起CO损失2敏感。在……里面拉蒂莫里亚，cx 26基因没有C端尾的一个拷贝是co。2敏感。1.XP_014348762.1，2.ENSLACG 0000000007568。c摘要数据显示55毫米汞柱PCO的染料负荷增加2零钙2+刺激(表示为与对照35 mmHg PCO相比像素强度的变化)。2)。盒子和胡须情节：方格，第一和第三四分位数；水平线，中间；胡须，距离中间四分位数不超过1.5倍的最远点。每个点代表对照生理盐水(35 MmHg Pco)像素强度的中位变化。2)独立转染。标尺20米

全尺寸图像

全细胞膜片钳记录显示2表达xtCx 26Δpv和pv的HeLa细胞的敏感电导拉蒂莫里亚Cx 26红棒表示使用55毫米汞柱高二氧化碳盐。盒子和胡须情节：方格，第一和第三四分位数；水平线，中间；胡须，距离中间四分位数不超过1.5倍的最远点。每个点代表一个独立的膜片钳记录(复制)。

全尺寸图像

协和2-Cx 32半胱氨酸的敏感性

我们以前已经证明，大鼠的Cx 32半汗腺可以被CO打开。2，但需要更高水平的PCO2比Cx 266..检查Cx 32在各种放线鱼和软骨鱼中的氨基酸序列显示了一个与人类非常相似的羰基化基序。Cx 32(无花果)7)。这意味着这个主题已经存在于Chondrichthyes和Osteichthyes的共同祖先中。不像Cx 32, Cx 26在放射线鱼中，除了很少有原始鱼类的情况外，鱼没有羰基化基序(图1)。1，补充表2，补充图。1)。此外，Cx 32(比如Cx 30，也就是CO。2-敏感的)有一个长的C端尾，在Cx 26废CO2敏感。

鱼体中的Cx 32半胱氨酸可以被高浓度的CO打开。2. a人Cx 32中的羰基化基序(粉红色盒)和延伸的C端尾序列，丹尼欧和犀牛..注意每个物种的延伸C末端尾中存在脯氨酸残基。b染料负载实验表明，55 mmHg CO的染料负载量很小2，以及70 mmHg PCO的大量负载2零钙2+. c盒子和胡须情节：方格，第一和第三四分位数；水平线，中间；胡须，距离中间四分位数不超过1.5倍的最远点。所有点的中位数变化像素强度从35毫米汞柱控制生理盐水。每个点代表独立转染的结果。标尺20米

全尺寸图像

因此，我们测试了是否丹尼欧(斑马鱼)及犀牛(鲸鲨)Cx 32半胱氨酸为CO2敏感(图1.7)。我们发现有少量的CO2PCO上的依赖染料负载255毫米汞柱，和强大的染料负荷在PCO270毫米汞柱。7b，c)。与人类Cx 32半胱氨酸一样，鱼类同系物对CO也很敏感。2但需要比羊膜cx 26高得多的刺激才能打开它们。6.

这就引出了一个有趣的问题：为什么cx 32中扩展的C端尾不废除CO？2半汉耳的敏感性，而在Cx 26则是如此。通过检查Cx 32我们注意到，与两栖动物和肺鱼不同Cx 26，C末端有多个脯氨酸残基。8A)。由于脯氨酸在构象上会限制一个非结构肽序列，我们假设由此产生的结构可以防止cx 32的C端尾干扰CO。2-依赖于半汉字的开口。因此，我们将所有脯氨酸残基突变为甘氨酸。8)人类Cx 32的C末端尾。这完全消除了Cx 32半胱氨酸对CO的敏感性。2(无花果)8B，c)。我们还进行了逆向实验：cx 26鳞翅目警报器对CO不敏感2..探讨C端尾中脯氨酸的引入是否增加了CO的含量。2-敏感鳞翅目警报器Cx 26，我们将延伸的C末端的两个甘氨酸残基转变为脯氨酸。8A)。值得注意的是，C端尾中脯氨酸的存在赋予了CO。2敏感开启鳞翅目警报器Cx 26半直角图(图1)。8B，c)。我们得出结论，Cx 32和Cx 30的半特征线都是CO，它们都扩展了C端尾。2敏感，因为脯氨酸残留物的存在可以防止延伸的尾巴干扰CO。2结合到羰基化基序或随后的构象变化，导致半通道开放。

延伸C终端尾部的脯线，允许CO2半汉字的敏感开口。a修饰人Cx32C末端序列，以甘氨酸代替脯氨酸；鳞翅目警报器Cx26C末端尾，显示已转变为脯氨酸的糖类。b人Cx 32半汗腺可被CO打开2..C末端延伸尾中脯氨酸的突变2敏感性(人脯氨酸对甘氨酸)。在“公约”中引入两条脯氨酸鳞翅目警报器C端尾给出了一个CO的增益。2敏感性(与图相比)。3B，c). c显示中位像素强度与对照(PCO)相比的变化的汇总数据(PCO)235 mmHg)，每个连接蛋白有5个独立的复制。Kruskal-Wallis ANOVA，两两比较Mann Whitney.盒子和胡须情节：方格，第一和第三四分位数；水平线，中间；胡须，距离中间四分位数不超过1.5倍的最远点。每个点代表独立转染的结果。标尺20米

全尺寸图像

羰基化基序的祖先功能

羰基化基序存在于Cx 32，包括Cx 32关于鲨鱼，暗示了一个非常古老的进化起源，至少是所有颚口的祖先。这个母题在同系物中也是保守的。Cx 26(两栖动物和肺鱼)半壁江山不含CO的2敏感。值得注意的是，只需要一个碱基的改变就能影响破坏CO的k125r突变。2灵敏度12..该基元已保存超过400米，暗示选择压力，以维持一个重要的生物学功能。这反过来又表明，Cx 26中的母题的最初功能肯定不是打开半通道。

我们最近发现了适度升高的一氧化碳2对哺乳动物Cx 26有两种作用：(1)半通道的开启；(2)间隙连接的关闭。13..这种突变消除了半通道向CO开放的能力2同时去除CO的能力2关闭Cx 26间隙连接，CO2Cx 26间隙结的依赖闭合似乎依赖于CO。2与打开半通道的相同残基结合，即羰基化基序。为了探讨缝隙连接关闭是否是cx 26中羰基化基序的祖先功能，我们研究了cx 26中是否存在CO。2可能关闭鳞翅目警报器Cx 26间隙连接

我们测试了暴露在不同水平的PCO中2可能会影响荧光示踪剂从单个细胞(通过贴片移液管加载)通过缝隙连接到耦合细胞的运动。PCO255毫米汞柱刺激阻止染料扩散鳞翅目警报器只有当盐被转变为PCO时，染料才会发生缝隙连接和渗透。235毫米汞柱。9A-c)。这表明鳞翅目警报器Cx 26间隙连接被CO关闭2即使半边是不敏感的(如图所示)。3B，c)。因此，扩展的C-尾不影响CO的结合。2对于羰基化基序，或这导致的构象变化，在缝隙连接关闭它。推测C端尾可以阻止构象变化导致半通道开放。通过关联，我们推断cx 32的间隙结对CO也是敏感的。2..令我们惊讶的是，我们发现荧光示踪剂在所有水平的PCO中都以极快的速度透过缝隙连接。2测试(图1.9d，e)。因此，与Cx 26不同的是，Cx 32的间隙连接对CO不敏感。2在这些剂量下。

Cx 26中的羰基化基序的祖先功能是关闭缝隙连接，而不是Cx 32。a图像显示nbdg(建立全细胞记录后1分钟内)通过鳞翅目警报器Cx 26间隙结2是35毫米汞柱。在图片中，红色显示了樱桃标记的分布。鳞翅目警报器Cx 26，绿色为NBDG荧光，黄色箭头表示细胞间的缝隙连接。右下角的数字是在建立全细胞记录配置数分钟后。标尺，20米。b由于PCO升高，NBDG通过间隙结的渗透被延迟。2..细胞灌流高二氧化碳盐(PCO)。255毫米汞柱)在突破后2分钟，然后转移到控制盐水(PCO)。235毫米汞柱)染料在偶联细胞中的明显渗透仅在6分钟左右。c显示PCO效应的汇总数据2延迟染料通过间隙连接到耦合电池的渗透。dCx 32隙结对CO不敏感2..nbdg(在建立整个细胞结构后的几秒钟内)通过各个级别的PCO的间隙连接迅速渗透。2. e摘要资料显示，不同水平的多氯氧偶联细胞间的染料转移所需时间并无不同。2. N=6次处理(独立复制)；方格图和晶须图显示中间和四分位数范围(IQR)，晶须指示距离中位数不超过IQR 1.5倍的最远点。染料转移的时间是当受体细胞达到供体细胞荧光的10%时。

全尺寸图像

通过研究CO2β连接蛋白在从鲨鱼到哺乳动物的许多不同的系统发育群中的敏感性，我们出乎意料地揭示了新的结构要求，决定了CO的作用。2在这些连接蛋白上。正如我们已经描述过的，羰基化基元是对CO的必要要求。2依赖调制12..这个母题的存在产生了CO。2-Cx 26缝隙连接的依赖关闭。对于cx 26半单峰，需要进一步的结构条件才能获得CO。2-依赖的开口：C端尾的截断。当这条尾巴存在时，它阻止了CO的开启作用。2..延伸的尾巴并不能阻止缝隙连接的关闭，这强烈地暗示尾巴不会干扰羰基化事件，或者确实不会干扰导致缝隙连接关闭的构象变化，相反，它会阻止在CO一次打开半峰所需的构象变化。2已经被束缚了。一个简明扼要的解释可能是，扩展的C端尾在CO时稳定了间隙结和半通道的闭合构象。2是注定的。

然而，我们的分析突出了CO的C端尾的另一个基本结构特征。2-依赖半通道开放。Cx 32的长尾仍然允许CO。2-依赖于Cx 32半透明孔的开启，尽管PCO的水平要高得多。2..在这条尾巴上有脯氨酸的存在允许半通道对CO的响应而开孔。2..将这些脯氨酸转化为甘氨酸可以消除CO2敏感性，并将脯氨酸引入非敏感的C端尾。鳞翅目警报器Cx 26给出了函数的增益并允许CO2-依赖于半通道的开口。据推测，脯氨酸残基会在C末端引入一定程度的构象限制，从而防止延伸的尾巴干扰半通道开放。

考虑到羰基化基序结闭合和半通道开孔有两种功能，这个基元最初的祖先功能是什么？我们的发现是一些Cx 26的同源词(非洲爪蟾，lungfish)拥有这个基序，但不对增加的CO开放。2，强烈提示间隙连接活动的调节可能是其最初的功能。这得到了我们的进一步的支持，我们的论证表明，lungfish cx 26缝隙连接确实可以被co关闭。2.

PCO水平2在这项研究中测试的(55毫米汞柱)比典型的PCO水平更高。2在肺鱼和两栖动物中发现的。这剂量的PCO2Cx 26接近饱和状态，在哺乳动物和鸟类中对PCO的变化很敏感。2超过20-60毫米汞柱6,18..通风鳞翅目警报器对PCO变化的响应2在21-42 mmHg范围内，由对pH和PCO都敏感的中央化学感受器控制。222..吸气山羊草(Rana Catesbeiana)对PCO变化的响应2从6-42毫米汞柱23..而这两种物种的半特征对CO不敏感。2，鳞翅目警报器间隙连接被PCO完全关闭。255毫米汞柱。因此，CO有可能2-低水平PCO时Cx 26间隙连接(即部分闭合)的敏感性2可能有助于对这些物种的通风进行化学感觉控制。需要进一步的实验数据来验证这一命题。

Cx 32的间隙连接对PCO水平不敏感。2在本研究中使用。这表明，在Cx 32中，羰基化基序的最初功能是打开半链。Cx 32半透明鱼和人类可以通过足够高的PCO水平打开。2(55~70 mmHg)。在完全有水呼吸的脊椎动物中，如弹性分支或放射线鱼，全身性PCO。2仅略高于环境24..因此，系统性的PCO是非常不可能的。2将达到55-70毫米汞柱的范围，足以打开Cx 32半汗腺。因此，鱼中的cx 32半胱氨酸很可能不被用作系统的CO。2用来调节呼吸的传感器，就像Cx 26在哺乳动物中使用的那样。CO的可能功能2-Cx 32的敏感性仍然是个谜。在长时间的进化过程中，Cx 32中的羰基化基序被保存下来，这表明CO确实有一些重要的生理功能。2-这种连接蛋白的敏感性。一种可能的假设是，cx 32半峰对于检测本地产生的一氧化碳很重要。2..我们推测一组代谢活跃的细胞(如肝细胞)大量表达cx 32。25,26,27)可能会产生很高的局部CO浓度2那就足够打开Cx 32半直角了。

我们假设(图1)。10)Cx 32和Cx 26类的连接蛋白祖先可能具有羰基化基序，而且这个基序很可能是允许CO的。2在高水平的PCO水平下打开祖先的半通道2(70 MmHg)。当两个clade分离时，cx 26类clade获得了新的coc功能。2在较温和的PCO水平上封闭缝隙连接2(55毫米汞柱)但同时失去了旧的功能-CO的能力2打开半汉字。在羊膜的进化过程中，当Cx 26类基因复制给Cx 26和Cx 30时，进一步的进化创新发生了-从Cx 26的羊膜子群中丢失了C末端的尾巴。这使得cx 26半音箱能够在适度的PCO水平下开启。2，在一个适合于系统CO的敏感范围内。2感知，并保留CO的能力2关闭缝隙连接。

CO的推断演化2-Cx 32和Cx 26类CLADS中的依赖功能。Cx 32和Cx 26样基因(PreCx 32)的共同祖先最有可能具有羰基化基序(CM)。我们假设这最初是用来调节半汉字的打开；CM和这个功能在Cx 32中一直保持到现在。Cx 26样基因的出现伴随着CO的CM增益的新功能。2-依赖的间隙连接关闭，但代价是失去CO2-依赖半通道开放。在羊膜前世界中，不同的基因产物具有开启半侧汗腺和关闭缝隙连接的功能。随着羊膜的进化，Cx 26样基因被复制成Cx 26和Cx 30。Cx 30有一个长的C末端尾，在许多情况下失去了羰基化基序。羊膜中Cx 26失去C末端尾，恢复CO能力2打开半通道。(绿色方框表示在某些物种中几乎普遍存在羰基化基序，而在其他物种中则不存在。)

全尺寸图像

令人惊讶的是，Cx 26半胱氨酸具有允许CO打开的结构特征。2到目前为止只在羊膜中发现。1，补充表2)。同样值得注意的是，非哺乳类羊膜的Cx 30缺乏羰基化基序。因此，普遍的CO2羊膜中的传感器是Cx 26的半通道，而不是Cx 30。进化CO的关键附加步骤2-敏感的Cx 26半汗腺在羊膜中被截断延伸的C末端尾。这使羰基化基序从关闭Cx 26缝隙连接(两栖类和肺鱼Cx 26中的一种功能)重新定位到另一种功能：打开半通道。在羊膜Cx 26的情况下，越少越多：截断的连接蛋白提供了一个CO。2-门控通道，能够将ATP释放到细胞外空间，在细胞间信使或神经递质的作用下，表达PCO水平。27,12..现存的羊膜可以追溯到那些在二叠纪-三叠纪灾难中幸存下来的人的共同祖先。这一地质事件发生在约250 MYA，涉及到全球气温上升约6°C，导致70%以上的陆地居住形式灭绝。28,29,30..考虑到截断CO的广泛存在2-在羊膜中敏感的Cx 26，我们假设这种适应可能是在所有现存的羊膜细胞的祖先中产生的，这些羊膜在这场灾难中幸存下来。

现存的羊膜只能通过呼吸空气来交换气体-它们没有通过水交换气体的能力。一升空气的含氧量大约是O的30倍。2同样体积的水。因此，羊膜比有水呼吸的动物有更低的通气率。由于这些较低的通气率，呼吸空气的脊椎动物会累积更高水平的一氧化碳。2(与水呼吸者相比)。例如，哺乳动物通常有PCO。2动脉血中的~40 mmHg，而呼吸水的鱼则有PCO。2~5毫米汞柱24..羊膜已经适应了高水平的PCO2通过保持更高的浓度[数学处理误差]${\mathrm{<span\; style="font-family:微软雅黑;font-size:16px;">H</span>}\mathrm{<span\; style="font-family:微软雅黑;font-size:16px;">C</span>}\mathrm{<span\; style="font-family:微软雅黑;font-size:16px;">O</span>}}_{\mathrm{<span\; style="font-family:微软雅黑;font-size:16px;">3</span>}}^{<span\; style="font-family:微软雅黑;font-size:16px;">-</span>}$，从而调节其血液pH值，使其达到所需的生理水平。然而，对于羊膜，CO的调节排泄。2因此，酸碱平衡的均匀度控制是寿命的关键限速步骤。因此，羊膜改变了呼吸的主要调节，而不是O的检测。2对CO的检测2pH值31..而pH敏感的中枢呼吸药敏机制显然很重要。10,32,33,34，CO的进化创新2能在CO中释放ATP的传感器(Cx 26的半传感器)2依赖时尚6可能对羊水特别有价值。

哺乳动物和鸟类吸热，有较高的代谢率(因此CO的比率很高)。2(生产)维持其升高的体温。虽然爬行动物是恒温动物，但它们会利用晒太阳的行为来提高体温(以及新陈代谢率)。动脉PCO2爬行动物的体温非常依赖，但通常在20毫米汞柱以上，在日光浴蜥蜴中可以达到30-40毫米汞柱。35，在海龟中可以超过40毫米汞柱。36,37..海龟的呼吸对PCO的变化有反应2超过20-55毫米汞柱38，CO2-Cx 26半侧汗腺的敏感性因此可能与控制各种羊膜物种的呼吸有关。非常重要的是，欧盟委员会50Cx 26半通道与PCO的生理静息值非常接近。2在各种各样的物种中18..我们的数据表明，有很强的选择压力来维持CO。2Cx 26(羰基化基序和短C末端尾)对现存羊膜系的敏感性。