神经母细胞瘤中环状RNA的定义揭示了MYCN的全局抑制功能

直到2012/2013年，发现环状RNA(circr nas)普遍表达、高度保守并参与基因调控，这类调控RNA在转录组分析中基本被忽略1,2,3。环状RNA是由非规范剪接产生的，称为反向剪接。它们缺乏5’和3’末端的环状结构使它们对外切核酸酶具有抗性，并且比线性RNA更稳定。对选定circRNAs的可能功能的研究中出现的发现暗示了与微小RNA的相互作用4和RNA结合蛋白(RBP)3,5,6或编码蛋白质产品7来调节基因表达8。因此，circrna可能直接影响癌症的生物学，正如几份报告所述，这些报告将所选circrna的失控表达与不同的癌症标志联系起来9。circRNAs的产生是组织特异性的，受RBPs调控10。据报道，从癌细胞分泌并与转移小生境制剂相关的外来体含有环核糖核酸11,12，表明circRNA可以影响非恶性细胞，从而影响疾病病理学。circRNAs在神经组织中最丰富，在神经元分化后表达受到严格调控13，表明它们在由外周神经元前体细胞产生的儿童癌症神经母细胞瘤的发病机理中的潜在相关性。

神经母细胞瘤是一种胚胎肿瘤，具有广泛的分子异质性肿瘤生物学和临床表现14。虽然一些神经母细胞瘤未经治疗会自然消退，但约50%的患者在诊断时存在高风险疾病，只有30-40%的患者能存活5年15. MYCN，在约20%的原发性神经母细胞瘤中扩增，并确定临床治疗分层的高风险16，是迄今为止鉴定的神经母细胞瘤的最重要的致癌驱动因子。最近基于分子的风险分类增加了ATRX突变和TERT重排作为进一步的基因组畸变定义了高风险17。信使RNA的表达在神经母细胞瘤中被广泛研究，而非编码RNA的研究主要局限于miRNAs18和lncRNAs19(在参考文件中审查。20).

这里我们将神经母细胞瘤转录组的定量扩展到circRNAs。一个无偏倚的测序方法应用于一个大样本队列，104例原发性神经母细胞瘤，代表所有临床定义的风险组。我们揭示了MYCN对高危神经母细胞瘤中环RNA生物发生的抑制作用。该功能与DHX9 RNA解旋酶的直接调节有关。将我们的神经母细胞瘤数据集与来自其他癌症和对照的RNA测序数据进行比较，确定了在神经母细胞瘤中特异性上调的circRNAs，其中circARID1A控制神经母细胞瘤细胞的存活和增殖。相互作用研究发现KHSRP作为一种重要的RBP介导circARID1A功能。我们的工作为circRNAs在神经母细胞瘤发病机制中的重要性提供了证据，并扩展了关于MYCN功能的知识，这意味着与这种癌基因改变的癌症有广泛的相关性。

神经母细胞瘤中circRNA表达的定量分析

从所有风险组收集神经母细胞瘤样本，以代表整个临床疾病谱(补充数据1).我们将转录组测序应用于104例患者样本中的每一个。测序方法被设计为同时分析circrna和信使RNA，包括那些从与circrna相同的基因座转录的RNA。总RNA测序文库平均每个文库产生1.163亿个原始读数，平均每个样品的72.7%被绘制到基因组上(补充图。1).按照标准方案，读数也被映射到可能的反向剪接点。这一程序确定了39，841个假定的环状RNA。正如所料，它们主要产生于外显子(33，459个，相比之下，4244个内含子衍生的阅读和2138个基因间阅读)。为了只检测强表达的circrna，我们使用了表达过滤器(在> 3个样品中有> 20个反向剪接接头读数和/或在> 25%的样品中有表达)，产生了5203个独特的推定circrna(补充数据2).在最高表达的circRNAs中，我们随机挑选了10个用于进一步验证。其中，7个比相应的宿主信使RNA对外切核酸酶处理更具抗性。用放线菌素D阻断转录后，10个中的9个也比宿主RNA更稳定(补充图。1).与文献一致3这些数据表明，我们检测到的5203个圆环RNA中的大多数是真实的圆环RNA。我们的数据表明，整个神经母细胞瘤转录组中有2302个基因表达circRNA，其中大多数基因产生一种主要的circRNA亚型(图。1a).大多数受体外显子(93.5%)位于蛋白质编码基因的编码序列中，少数位于3’非编码区(1.4%)或非编码区(5.1%)。一般来说，circRNAs包含很少的外显子，大多数候选基因只有2-4个外显子(图。1b).circRNA的丰度通常较低，但仅与给定肿瘤样品中其宿主基因表达的mRNA弱相关(r= 0.14;图。1c)，暗示独立的环状生物发生。

a–g对104个独立的神经母细胞瘤样本进行总RNA测序以检测circRNAs。a每个基因的circRNA亚型数量。b每个检测到的circRNA的外显子数量。c每个肿瘤样本中全局circRNA表达与同源mRNA表达的spearman相关性分布。显示了平均相关性。d每条染色体的circRNA亚型(蓝色)和mRNA亚型(黄色)表达的全基因组图谱作为Circos图。显示了circRNA同种型和mRNA同种型的比率(红色)。e与对照(橄榄)相比，产生环状RNA的基因的外显子的侧翼内含子长度的分布(蓝色)。f与对照(橄榄)相比，产生环状RNA的基因(蓝色)的外显子的侧翼内含子中重复元件的分布。g方差比率的分布:肿瘤中circRNA(蓝色)和mRNA(橄榄色)表达的转录本表达的平均值。源数据作为源数据文件提供。

全尺寸图像

我们试图确定基因组座位产生更多的循环比线性转录。对于45个基因，circRNA与mRNA同种型的比率> 1.2(图。1d，补充图。1，补充数据3)，其中包括XRN2(比例:5)，GRK3(比例:4)和NBAS(比例:1.55)。每个肿瘤样本中表达的circRNA根据它们是否来源于circRNA/mRNA亚型比率> 1.2的基因进行分层，我们称之为产生环状RNA的基因。全基因组测序数据(64104名患者，补充图。1)用于综合分析，以确定产生拷贝数变化的基因组畸变是否在以下领域更常见产生环状RNA的基因。大多数circrna来自拷贝数中性区，产生少量或大量circrna的基因频率没有显著差异。只有拷贝数丢失的基因组区域含有稍少的产生环状RNA的基因 (p < 0.05). Our data support that high circRNA expression from single genes does not result from underlying genomic aberrations.

产生环状RNA的外显子侧翼的内含子比不参与环状RNA产生的内含子更长(平均值:22，383.94 bp)(平均值:18，862.01 bp，图。1e)，并用低复杂度区域和重复(例如Alu)元素(p < 1e−16; Fig. 1f)根据报道的重复元件和长内含子与环状RNA生物发生的关联2.

通过短阅读测序预测的所有检测到的circrna的中值长度为844 nt(仅考虑外显子circrna时为728 nt)。我们的目的是通过使用我们最近为牛津纳米孔长阅读测序平台开发的方案对circRNAs进行全长测序来评估这种估计21。我们对六种不同的神经母细胞瘤细胞系进行了测序，并检测到一个较短的474 nt的中值长度(补充图。1)，这在以前的研究范围内22,23.

在神经母细胞瘤样本中，我们进一步检测到circRNAs的表达与mRNAs相比变化较小，表明circr nas的表达受到更严格的调控(p < 1e−16; Fig. 第一代).总之，我们的研究结果确定circRNAs是一类在神经母细胞瘤中不依赖于其同源mRNAs的全局稳定表达的转录物。

成神经细胞瘤中circRNA表达与高临床风险相关MYCN扩大

我们研究了不同的circRNA表达模式是否与国际神经母细胞瘤风险组(INRG)定义的不同风险组相关24,25。系统聚类揭示了基于个体圆环丰度的三个主要聚类(图。2a).“聚类2”几乎完全由来自高风险病例的样本组成MYCN扩增，支持这个亚组中独特的circRNA表达谱。研究了临床病理特征的相关性，例如患者风险组与circRNA数量/表达的相关性。缺乏高风险病例MYCN扩增产物具有最高的circRNA丰度和表达，而最低的circRNA丰度和表达发生在含有MYCN放大倍数(图2b，c；补充图2).值得注意的是，c-MYC，是…的旁系MYCN在我们的神经母细胞瘤队列中几乎不表达，独立于风险组(补充图。2).因为据报道circRNAs在增殖组织如癌症样品中较少26中，我们使用已发表的增殖相关表达特征评估了每个患者样本的增殖指数27. MYCN扩增略微增加了样品增殖指数(p= 0.014，图。2b，补充图。2).然而，circRNA下调主要不是由于这些肿瘤中的增殖，因为仅比较增殖最大的高危样本仍显示circRNA表达在有肿瘤的样本中降低。MYCN扩增(p < 1e−16, Supplementary Fig. 2).我们的数据强调了在风险人群中不同的circRNA表达谱，其中circRNA在高危神经母细胞瘤中最不丰富。MYCN扩增。

a通过基于circRNA表达对104个独立的神经母细胞瘤样品进行系统聚类，揭示了不同的表达聚类(样品的颜色代码如图片所示b). b分析了104名独立的神经母细胞瘤患者的主要临床和生物学特征，这些患者被分为不同的风险组，如肿瘤图所示。括号内为患者人数。增殖指数基于转录信号。ST4S阶段4S，LR低风险，IMR中等风险，HR_nMNA高风险非MYCN-放大，MNAMYCN-INSS国际神经母细胞瘤分期系统，OS总生存率，EFS无事件生存率。c在104名独立的神经母细胞瘤患者的每个风险组中鉴定出的独特circRNA亚型的数量。数据显示为小提琴图。小提琴图使用正常的最佳平滑。显示了中位数(白点)、四分位数(方框)和1.5倍四分位数间距(胡须)。源数据作为源数据文件提供。

全尺寸图像

MYCN全面压制circRNA表达

我们探索了MYCN通过比较有或无高危神经母细胞瘤的差异表达基因，更详细地了解扩增和全局circRNA下调MYCN放大。这揭示了4212个上调基因和6616个下调基因(图。3a；补充数据4). MYCN和它相关的邻近基因，MYCNOS和MYCNUT是上调最多的基因之一。被MYCN激活和抑制的已发表的目标被显著地丰富(p < 1e−16) among up- and downregulated genes, respectively (Fig. 3a).包括剪接因子在内的大量RBPs差异表达(82个上调，17个下调；图。3a).在2005年的一次全球循环下调中(408个循环转录本)MYCN-扩增的样本中，25个circRNA上调，包括CDR1-AS，这是癌症中最早研究的circRNA(图。3b，补充数据4).而产生环状RNA的基因的表达在MYCN-放大的肿瘤(p < 1e−16; Supplementary Fig. 4)，circRNA:mRNA比率也显著降低(p < 1e−16), indicating that oncogenic MYCN levels had a stronger negative impact on circRNA biogenesis than general MYCN-dependent transcriptional control.

a差异基因表达分析MYCN-放大(MNA，n= 22个生物学上独立的样本)和非MYCN放大(HR_nMNA，n= 29个生物学上独立的样本)高风险成神经细胞瘤肿瘤。报道了检测到的RNA结合蛋白(黄色)、公布的诱导(蓝色)和抑制(绿色)MYCN靶。重大的限制性商业惯例和MYCN目标用大圆圈标出，不重大的用小圆圈标出。b循环与线性读取计数比的分布a与HR_nMNA肿瘤相比。曼恩-惠特尼U检验，双侧，p < 1e−16. cSK-N-AS神经母细胞瘤细胞含有一个可诱导的MYCN-表达系统诱导120小时，并进行类似的差异表达分析a与对照处理相比(n= 3个生物学上独立的实验)。d循环与线性读取计数比的分布c与对照条件(关)相比，在诱导细胞中(开)。通过蛋白质印迹确认MYCN诱导(n= 3个生物学上独立的实验)。曼恩-惠特尼U检验，双侧，p= 1.3e 7。eMNA与HR_nMNA肿瘤中受影响的circRNA/mRNA比率的分布b和SK-N-AS MYCN诱导的对照细胞d。显示的是数据集的重叠。源数据作为源数据文件提供。

全尺寸图像

为了分析circRNA下调是否归因于高MYCN水平，我们在来源于SK-N-AS细胞系的神经母细胞瘤细胞模型中分析了MYCN诱导对circRNA表达的直接影响28，缺少MYCN放大。四环素治疗将MYCN诱导至致癌水平(图。三维（three dimension的缩写），补充图。3)强烈上调的表达MYCN和相关的目标基因(p= 3e 3，图。3c)和20个RBPs(在1322个基因中)，而它下调了5个RBPs(在1355个基因中)。与来自患者样本的发现一致，诱导MYCN显著降低了circRNA:mRNA比率(p= 1.3e 7，图。三维（three dimension的缩写）)，但并不像文献中描述的那样显著影响增殖29,30(以增殖指数评估，p= 0.5;并在体外实时测量，p= 0.3;补充图3).为了进一步证实MYCN效应，我们采用了一个细胞模型MYCN-扩增的IMR-5/75细胞MYCN拆卸(补充图。3，图。4f).因此，在敲除诱导后，我们检测到circRNAs的整体上调(p < 2e−16).

a神经母细胞瘤肿瘤样本中RNA结合蛋白(RBP)和circRNAs表达的spearman相关性的分级聚类(n= 104个生物学上独立的样本)。b下调的环状RNA重叠MYCN-具有簇1的circRNAs的扩增(MNA)肿瘤。c–eDHX9在高危非MYCN扩增神经母细胞瘤(HR_nMNA)中的表达与生物学独立患者队列中的MNA相比。c本研究队列中DHX9 RNA的表达(HR_nMNAn= 29，MNAn= 22);dDHX9 RNA在张等发表的队列中的表达。34(HR_nMNA，n= 401，MNAn= 92);eHartlieb等人在已发表队列的已发表质谱数据中确定了DHX9蛋白的丰度。35(HR_nMNAn= 22，MNAn= 12).数据输入c–e都呈现为小提琴的情节。小提琴图使用正常的最佳平滑。显示了中位数(白点)、四分位数(方框)和1.5倍四分位数间距(胡须)。f在用诱导型表达系统在SK-N-AS细胞中诱导MYCN后，通过蛋白质印迹测定DHX9的丰度(n= 3个生物学上独立的实验)或用靶向MYCN的可诱导shRNA敲除IMR-5/75神经母细胞瘤细胞中的MYCN(n= 3个生物学上独立的实验)。g用BET溴域抑制剂JQ1处理IMR-5和LS神经母细胞瘤细胞以抑制MYCN，并通过蛋白质印迹观察MYCN和DHX9的蛋白质丰度(n= 3个生物学上独立的实验)。h已发布的分析56,82MYCN芯片测序数据来自3个不同的MYCN-扩增的神经母细胞瘤细胞系(Kelly，SK-N-BE(2)C，NB-1643)和1个非扩增的细胞系(NB-69)。i在IMR-5细胞中，用2种不同的siRNAs敲除DHX9后，通过qRT-PCR测定DHX9连同circRNAs和同源mRNAs的表达，并与混杂对照进行比较(n= 3个生物学上独立的实验，数据表示为平均值±SD，双向ANOVA检验)。j与对照相比，在IMR-5细胞(2种不同的siRNAs)中DHX9敲除后，循环与线性读数比的分布(n= 3个生物学上独立的实验)。敲除通过蛋白质印迹(插入)证实。曼恩-惠特尼U检验，双侧，p < 1e−16. kMNA与HR_nMNA肿瘤中受影响的circRNA/mRNA比率的分布3b和DHX9敲除相对于来自j。显示的是比率的重叠。l已发布的分析38鼠髓母细胞瘤肿瘤球的MYCN芯片测序数据(n= 1).对已发表的39个髓母细胞瘤总RNA测序数据的分析(n= 39个生物学上独立的样品)和对circRNA表达的影响，m，在高与低MYCN-表达样本，n，在高与低DHX9-表达样本。源数据作为源数据文件提供。

全尺寸图像

将SK-N-AS细胞模型的数据与诱导的数据进行比较MYCN表达和MYCN-扩增的肿瘤样本检测到4253个普遍表达的circRNAs。中下调的circRNA(circRNA:mRNA比率降低)MYCN-在放大的肿瘤中，我们发现52%的circRNAs在细胞模型中也被抑制(图。3e).反之亦然，在高危肿瘤中检测到细胞模型中83%的比率降低。细胞模型中下调最多的环RNA在2005年下调最多的500个环RNA中高度富集MYCN-放大的神经母细胞瘤(p < 1e−16), thus showing in total that the MYCN-inducible cell model was able to reproduce the findings in the patient tumors.

因为已知致癌的MYCN水平会放大整体转录31中，我们试图验证观察到的circRNA:mRNA比率的降低不是由于mRNA水平的升高。从我们的RNA测序数据中最下调的circrna中选择的四个circrna的下调通过qRT-PCR从绝对定量的等量诱导的:未诱导的SK-N-AS细胞中得到证实，所述细胞的表达标准化为来自外部RNA控制联盟(补充图4).我们的结果支持MYCN在神经母细胞瘤中全面下调circRNA水平。

MYCN控制DHX9 RNA解旋酶来全面抑制circRNA表达

我们接下来的目标是解释MYCN是如何对circRNA丰度产生全球性的抑制效应的。RBP目前被认为是控制环状生物发生的主要因素32。我们假设MYCN对RBP的异常调节可能导致circRNA的抑制。事实上，在患者样本和我们的细胞模型中，包括剪接因子在内的几个RBPs与致癌MYCN水平存在差异表达，这表明通过一个或几个这些因子对circRNA生物发生的MYCN依赖效应。为了确定RBPs可能调节circRNA生物发生，我们对circRNA相关的RBP表达进行了分级聚类，揭示了两个不同的RBP和circRNA聚类(图。4a).较大的“聚类1”中的大部分circRNAs与“聚类2”的RBP表达弱相关或反相关。circRNA的“簇1”也强烈富含下调的circRNAMYCN-扩增的肿瘤样本(p < 1e−8, Fig. 4b).DExH-box螺旋酶9(DHX9)是与大多数“第1类”圆环仅微弱相关的限制性商业惯例之一(r= 0.2163).最近证明DHX9 RNA解旋酶通过与Alu重复序列结合来抑制HEK293细胞中的circRNA生物发生33。有趣的是，DHX9是2004年上调的限制性商业惯例之一MYCN-我们队列中扩增的高危神经母细胞瘤样本(p= 5e 3，图。4c)和一个独立发表的队列研究34我们重新分析了(92个有，401个没有MYCN扩增，p < 1e−16, Fig. 4d).高危神经母细胞瘤中DHX9蛋白的上调取决于MYCN通过重新分析已发表的质谱数据集来确认扩增35从34个(12个有，22个没有MYCN扩增)独立的神经母细胞瘤样本(p= 0.01，图。4e).因此，在SK-N-AS细胞中，DHX9水平在诱导后升高。MYCN表情又减了减MYCN在IMR-5/75细胞中敲低(图。4f).为了进一步证实，我们治疗了两个MYCN-用BET溴域抑制剂JQ1扩增神经母细胞瘤细胞系IMR-5和LS，以抑制MYCN(图。第四代移动通信技术).因此，这种处理下调了MYCN和DHX9的水平，这进一步表明了MYCN对DHX9的调节。

由于MYCN是一种转录因子，我们分析了三种神经母细胞瘤细胞系公开的MYCN芯片测序数据MYCN扩增和一个没有扩增的细胞系。DHX9启动子处的强信号仅在MYCN扩增的细胞系(图。4h)支持直接DHX9MYCN的规定。DHX9敲除(在RNA和蛋白质水平上验证，图。4i，j)上调几个circrna(选定circrna的qRT-PCR，图。4i)，而相应的同源mRNAs的表达不受影响甚至减少。此外，据报道在HEK293细胞中circRNAs不受DHX9的调节33不受...影响DHX9在IMR-5细胞中敲低(补充图。5).为了研究DHX9与富含Alu重复序列的侧翼内含子的circRNAs的特异性结合，我们在IMR-5细胞中用靶向DHX9的抗体进行了RNA免疫沉淀(补充图。5).靶向侧翼内含子序列的qRT-PCR使得能够检测同一circRNAs的特异性富集DHX9拆卸(补充图。5，图。4i).此外，为了评估修饰的DHX9水平对RNA环化的影响，我们采用了含有无功能分裂的载体作为报道基因分析绿色荧光蛋白，其侧翼是具有互补Alu元件的内含子序列36(补充图5).内含子序列的配对促进了反向剪接并产生功能性GFP，而DHX9与Alu元件的结合抑制了这一过程。用载体转染的SH-EP细胞中的DHX9敲低(通过蛋白质印迹证实)，导致GFP阳性细胞的增加(补充图。5和 6).JQ1对MYCN的抑制作用MYCN-扩增的IMR-5细胞导致MYCN和DHX9水平的下调，如蛋白质印迹所示，以及GFP阳性细胞的增加(补充图。5和6).这意味着DHX9对RNA环化的剂量依赖效应，该效应由MYCN控制。这些结果暗示了DHX9对环状RNA生物发生的抑制作用，这促使我们进行RNA测序来分析DHX9敲除的整体效应。一般来说，circRNA与mRNA的比率明显较高(p < 1e−16) after DHX9 knockdown, with 1047 circRNAs upregulated and only five downregulated (Fig. 4j，补充数据5).我们发现上调的circrna的侧翼内含子包含的Alu重复序列明显多于那些之后没有变化的circrnaDHX9击倒(p= 0.002)，这符合目前的文献33。大约78%的全球下调循环发生在MYCN-在我们的细胞模型中，扩增的高危肿瘤样品通过DHX9敲除上调(图。4k).因此，在高危肿瘤中，DHX9敲除上调的circRNAs有83%下调。MYCN放大。具有最大效应大小的最高上调circrna(基于DHX9敲除后的差异表达分析)在高风险肿瘤样品中最高500个下调circrna中强烈富集(p < 1e−16). Further, clustering our neuroblastoma patients in high and low DHX9表达，类似地揭示了circRNAs在DHX9高表达肿瘤(补充图。5).然后我们研究了MYCN-DHX9轴是否与另一种胚胎性肿瘤髓母细胞瘤中circRNA生物发生的下调有关MYCN在5-10%的病例中被放大37。我们分析了已发表的髓母细胞瘤肿瘤球的MYCN芯片测序数据38并在DHX9启动子处检测到强信号(图。4l)，因此表明MYCN也在髓母细胞瘤中直接调节DHX9。髓母细胞瘤RNA测序数据的再分析39显示circRNAs显著下调(p < 1e−15) in samples with high (top 20 percentile) MYCN表情(149下，7上；n= 39;图。4m).按高或低(最高/最低20个百分点)对样本进行分类DHX9表达式重现了这个结果(200向下，14向上，p < 1e−15; Fig. 4n).因此，致癌MYCN水平全面抑制circRNA表达，至少部分是通过异常上调DHX9 RNA解旋酶，这表明这可能是MYCN驱动的癌症中的一种常见机制。

神经母细胞瘤特异性circARID1A驱动神经母细胞瘤细胞增殖和存活

在…期间MYCN扩增是神经母细胞瘤患者不良临床结果的公认驱动因素，分子特征定义了高危神经母细胞瘤MYCN扩增还没有被清楚地理解。我们假设在后一个神经母细胞瘤亚组中上调的circRNAs可能发挥潜在的促瘤功能。为了验证这一假设，我们将神经母细胞瘤的总RNA测序数据与不同儿童和成人恶性肿瘤以及健康脑组织的公开数据集进行了比较。这种方法产生了25种候选circrna，它们对神经母细胞瘤具有较高的特异性表达，我们称之为“神经母细胞瘤特异性circrna”(图。5a，补充数据6).其中有circARID1A，它是从ARID1A肿瘤抑制基因(cirbase.org标识符40hsa_circ_0008494)，其在缺乏MYCN扩增(p < 1e−3; Supplementary Fig. 7).如同ARID1A在神经母细胞瘤中反复突变并与存活率降低相关41，我们进一步刻画了circARID1A函数。之间的后拼接连接ARID1A外显子4和2(基因座:chr 1:26729651-26732792；图。5b)生成circARID1A，预测长度为783 nt。我们通过RT-PCR和Sanger测序验证了circARID1A中存在一个反向剪接点(图。5b).整个RNA环的PCR扩增显示，在成熟的circARID1A转录物中，外显子3连接外显子2和4(补充图。7)，其也通过来自IMR-5和LS神经母细胞瘤细胞的RNA的northern印迹进行可视化，并证实了预测的长度(补充图。7).在放线菌素D介导的转录抑制后，circARID1A被证明对外切核酸酶处理具有抗性，并且比其同源mRNA更稳定地降解(补充图。1和7).RNA-FISH定位于胞质中(每个细胞1-3个信号),这得到了来自胞质细胞组分的qRT-PCR的支持(图。5c，补充图。7).值得注意的是，RNA鱼ARID1A与circARID1A相比，mRNA显示每个细胞多2-3倍的信号(补充图。7).在一组11个神经母细胞瘤细胞系中的分析表明，大约有1A在整个细胞中表达，但通常表达水平低于。ARID1AmRNA(补充图。7).我们的发现证实了circARID1A的环状特征及其在神经母细胞瘤细胞中的胞质定位。

a神经母细胞瘤样品中circRNA表达的比较(绿色，n= 104个生物学上独立的样本)与公布的正常脑组织样本(蓝色，n= 72个生物学上独立的样本)和儿童和成人癌症样本(“各种肿瘤”，棕色，n= 86个生物学独立的样本)。circARID1A用粗体和星号标记。数据显示为箱线图。箱线图中线、小提琴极限和胡须分别表示中位数、上/下四分位数和1.5倍四分位数间距。b该图显示了ARID1Agene和circARID1A。显示了PCR检测策略和circARID1A的反向剪接点的sanger测序痕迹(引物用箭头标记)。标记参与环化的外显子(Ex)和反向剪接点(BSJ)。c通过RNA-FISH使用对IMR-5细胞(红色)中的后剪接点特异的探针直接检测circARID1A。细胞核用DAPI(蓝色)染色。插页被数字放大了。放大图像50米，插入10米(n= 2个生物学上独立的实验)。d图解说明通过使用靶向BSJ的siRNAs敲除circARID1A的策略。e–i在4种不同的成神经细胞瘤细胞系中，用2种不同的siRNAs与混杂对照相比敲低circARID1A(n= 3个生物学上独立的实验，在e–h数据表示为平均值±SD，双向ANOVA检验)。ecircARID1A和的表达式ARID1A通过qRT-PCR测定的mRNAf细胞总数；g细胞活力；h流式细胞仪测定的膜联蛋白V阳性细胞；i实时检测细胞增殖的测量值(数据以中值范围表示)。源数据作为源数据文件提供。

全尺寸图像

在四种不同的神经母细胞瘤细胞系中敲低circARID1A，两种MYCN-扩增(IMR-5，LS)和两个非MYCN-通过两个独立的siRNA针对反向剪接点扩增(SH-EP，SH-SY5Y)与混杂的对照siRNA相比，大大降低了大约1A的水平，而没有显著的变化ARID1AmRNA水平(图。5d，e).敲除circARID1A减少了细胞数量(图。5f)，生存能力(图。5g)，诱导凋亡(图。5h，补充图。6)，并减少增殖(图。5i)在所有细胞系中，但在SH-SY5Y细胞中不诱导凋亡。一种使用反义寡核苷酸(ASO)靶向circARID1A的独立方法也下调circARID1A，但不影响ARID1AmRNA，并导致IMR-5细胞的细胞活力类似地降低(补充图。8).基于siRNA敲除的特异性通过异位过度表达具有突变的反向剪接连接的circARID1A进一步得到验证，该连接损害了siRNA结合。通过qRT-PCR和northern印迹验证特异性circARID1A过表达(补充图。7和8).与未诱导的对照组相比，过量表达后siRNA定向敲低导致细胞活力的降低更小(补充图。8)，部分抢救效果。我们的数据证实circARID1A是维持神经母细胞瘤细胞活跃增殖的一个因子，在高危神经母细胞瘤中强烈表达。

circARID1A利用KHSRP RNA结合蛋白发挥其功能

我们的数据表明神经母细胞瘤细胞可能依赖circARID1A，因此我们下一步旨在剖析其作用机制。一种确定的circRNA作用方式是通过RBP相互作用8。结合到circARID1A的蛋白质的质谱分析鉴定了16种富集的蛋白质，包括RBPs、KHSRP和ELAVL2-4，其来自使用circARID1A特异性探针的IMR-5细胞的下拉序列(相对于混杂探针对照，图。6a).通过qRT-PCR验证了下拉特异性，检测到显著的大约1A的富集，但没有ARID1AmRNA或对照转录物与混杂探针的比较(补充图。9).通过一种独立的方法将RNA与KHSRP或ELAVL2-4的抗体免疫共沉淀，这种相互作用得到了证实，特异性地富集了circARID1A(图。6b，c).与相同长度的改组对照序列相比，在计算机上探测circARID1A中富集的RBP基序，检测到26个不同RBP的位点，包括KHSRP的三个规范结合位点，但没有ELAVL或其他质谱鉴定的蛋白质的规范结合位点(补充图。9)，表示直接绑定只针对KHSRP。有趣的是，额外的非规范KHSRP位点(与规范基序有90%的相似性)出现在circARID1A反向剪接点，表明通过该位点与circRNA特异性结合。与其他癌症或正常脑组织的公开RNA测序数据集相比，我们的神经母细胞瘤队列的RNA测序数据中KHSRP表达更高(补充图。9). KHSRP和circARID1A表达在我们队列中所有风险组的神经母细胞瘤样本中呈正相关(r= 0.45;图。6d).在IMR-5细胞中敲低大约1A降低了KHSRP蛋白水平，但没有改变KHSRPmRNA表达(图。6e，补充图。9).这在用环己酰亚胺处理细胞阻断蛋白质合成后更为突出(图。6e)，表明circARID1A对KHSRP蛋白的稳定作用。我们还比较了在IMR-5细胞中独立敲除KHSRP或circARID1A后，RNA测序数据中差异表达的基因。受以下因素影响的基因KHSRP敲除约占受敲除影响的差异表达基因的35%p < 1e−16; Fig. 6f，补充数据7和8).携带KHSRP结合基序的RNA在大约11 a敲除后显著富集在上调和下调基因中(p < 1e−16). Gene ontology terms for apoptosis induction were enriched in genes upregulated after KHSRP knockdown, while terms related to various cell cycle processes were diminished (Supplementary Fig. 9).在这一结果的推动下，我们研究了功能注释基因签名的富集(来自分子签名数据库MSigDB42使用C2:策划的基因组)在KHSRP敲除后上调的基因中，并鉴定了与TP53信号传导相关的各种基因组的过度表达(前20个中的6个不同的TP53相关基因组)。类似于circARID1A击倒(图。5e，g，I)，在IMR-5细胞中KHSRP敲低(在RNA和蛋白质水平上验证，补充图。9)细胞活力降低(图。6g)和增殖(图。6小时)，证实了KHSRP在神经母细胞瘤细胞中的功能。我们提供了circARID1A和KHSRP在神经母细胞瘤细胞中影响细胞生长和存活的重要相互作用的证据。

a在IMR-5细胞中，在circARID1A特异性对对照下拉后，进行富集蛋白质的质谱分析(n= 3个生物学上独立的实验)。红圈代表超过4倍富集的蛋白质。实心圆代表高可信度的蛋白质，其中至少检测到3种独立的肽。KHSRP和ELAVL2-4蛋白被标记。学生的t测试，双边，非配对。b在IMR-5细胞(n= 3个生物学上独立的实验，数据表示为平均值±SD，双向ANOVA检验)。抗IgG用作对照抗体。通过qRT-PCR检测到与28S rRNA相比，circARID1A的富集。c免疫印迹证实了b中RIP的特异性。抗IgG抗体用作对照(n= 3个生物学上独立的实验)。d我们神经母细胞瘤肿瘤队列中KHSRP和circARID1A表达Spearman相关性(n= 104个生物学上独立的样本)。风险组的颜色编码如图。2b，c. e用2种不同的siRNAs在有或没有环己酰亚胺(CHX)处理的IMR-5细胞中进行CircARID1A敲除(n= 3个生物学上独立的实验)。通过蛋白质印迹描述KHSRP蛋白水平。f在IMR-5细胞中进行KHSRP敲除(2种不同的siRNAs对对照，n= 3个生物学上独立的实验；蓝色，左图)和在单独的实验中大约1A的敲除(1 siRNA对对照，n= 3个生物学上独立的实验；橙色，右图)并通过RNA测序进行分析。报告了在各个数据集中检测到的差异表达的基因的数量。这两个数据集被整合，重叠部分显示在文氏图中。g–hKHSRP敲除在IMR-5细胞中进行(n= 3个生物学上独立的实验)。g测量细胞生存力(数据表示为平均值±SD，单向ANOVA检验)；h实时分析增殖(单向ANOVA检验，数据以中位数范围表示)。源数据作为源数据文件提供。

全尺寸图像

我们的工作通过综合分析circRNAs在神经母细胞瘤中的复杂表达，为circRNAs在神经母细胞瘤病理学中的重要性提供了证据。我们证明了由DHX9 RNA解旋酶介导的致癌MYCN水平对神经母细胞瘤和第二种儿童胚胎肿瘤髓母细胞瘤circRNA表达的全面抑制作用。一个从ARID1A使用KHSRP RBP促进神经母细胞瘤细胞生长的肿瘤抑制基因被鉴定。

基因突变在癌症生物学中被深入研究，然而，下一代测序最常应用于poly-A RNA，缺少关于调节RNA的重要信息。我们的无偏测序方法在原发性神经母细胞瘤样本中鉴定了5，203个circRNAs，并描述了所有风险组的表达模式。迄今为止，已经描述了T-ALL的全局circRNA表达景观43，AML44套细胞淋巴瘤45，前列腺癌46，胆管癌47，肝细胞癌48，结肠直肠癌49和肺腺癌50。Vo等人通过对来自19个癌症实体的样本应用无偏的、靶向的外显子组捕获测序进行了彻底的研究51，报道了几种circrna的组织特异性表达和发现由通读转录物环化产生的通读circrna。这增加了对全球circRNA表达的理解，特别是在前列腺癌中，大多数调查样本来自前列腺癌。神经母细胞瘤样本也进行了分析，但太少，无法得出全面的结论。已经在神经母细胞瘤细胞系中鉴定出单环RNA，并与分化相关52无氧糖酵解53或者脂肪酸代谢54。在这里，我们将神经母细胞瘤中的全球circRNA表达模式添加到癌症研究的这一新兴领域中。

我们的分析表明，在神经母细胞瘤中，circRNA的表达与mRNA的表达没有很好的相关性。之前有报道称CircRNA的生物发生是细胞类型特异性的，不依赖于同源mRNA的表达55由RBP调节的从标准线性剪接到选择性反向剪接的转换而发生5。我们还发现circRNA表达在神经母细胞瘤样本中被全面抑制。MYCN扩增，神经母细胞瘤的主要致癌驱动力16。的类比MYCN, c-MYC在我们的神经母细胞瘤患者队列中几乎不表达，因此似乎不会显著影响circRNA的表达。已知致癌的MYCN水平驱动转录扩增，这是大多数转录活性基因被进一步上调的过程56。这种效应对传统的基因表达分析提出了挑战，因为它使不受MYCN调控的基因的不变绝对转录水平相对于中值表达下调31。校正这种效应后，我们证实了致癌的MYCN水平通过在诱导型神经母细胞瘤细胞模型中将转录本测量标准化为细胞计数来减少循环RNA的生物发生。MYCN先前暗示通过直接控制几个剪接因子来调节神经母细胞瘤中的选择性剪接57。与此一致，我们在MYCN诱导细胞模型和神经母细胞瘤中发现了几个差异表达的RBPMYCN扩增。circRNA相关的RBP表达的分级聚类鉴定出DHX9 RNA解旋酶是circRNA表达的负调节因子。最近报道DHX9通过分解由反向Alu重复互补性诱导的双链RNA结构，负性调节HEK293细胞中环RNA的生物发生33。据报道，位于表达为环状RNA的外显子两侧的内含子比其他内含子长，并且富含Alu重复序列2，也为我们的数据所证实。Ottesen等人证明了在HEK293和HeLa细胞中敲除DHX9上调了由富含Alu重复序列产生的几种circRNAs。继发性恶性肿瘤(存活运动神经元)基因58因此，强调了DHX9在环状RNA生物发生中的重要性。我们将DHX9对环状RNA生物发生的调节作用扩展到MYCN利用的机制，在致癌活性期间达到非常高的水平。然而，我们知道DHX9可能不是唯一作用于circRNA表达的RBP，因为我们的系统聚类分析也鉴定了其他候选物。然而，我们发现神经母细胞瘤中致癌的MYCN水平通过DHX9全面抑制circRNA的表达，并为相关的胚胎肿瘤髓母细胞瘤中的相同活性提供了证据，证明了该因子的重要性。这一发现增加了另一个调节层，致癌MYCN可以通过它发挥作用，这可能代表了表达致癌MYCN水平的癌症的一般机制。

我们鉴定了25种circrna，我们认为它们是神经母细胞瘤特异性的，因为它们在神经母细胞瘤中的表达高于其他癌症甚至健康脑组织，据报道，健康脑组织是circrna最丰富的组织13。我们证明了circARID1A，一种神经母细胞瘤特异性circRNAs，具有促进癌细胞生长的功能。其来源的宿主基因，ARID1A是SWI/SNF复合物的一个亚单位，在大约20%的人类癌症中发生突变59. ARID1A神经母细胞瘤中的突变与总体存活率显著降低相关41。然而，没有ARID1A在我们的队列中检测到影响circARID1A序列的突变。有趣的是，circARID1A在高危神经母细胞瘤中的表达更高MYCN扩增，一个分子发病机制不太清楚的亚群。最近的报告表明，通过与微小RNA相互作用，circARID1A表达与自闭症谱系障碍和骨骼肌细胞分化相关60,61。我们证明了circARID1A与神经母细胞瘤细胞中的KHSRP RBP结合。KHSRP在前mRNA剪接、RNA穿梭和调节RNA稳定性中发挥作用，特别是通过与决定RNA稳定性的富金元素结合62，在RNA 3'UTRs。最近研究表明KHSRP通过结合侧翼内含子对环状RNA的生物发生很重要63，但是到目前为止还没有描述与circRNAs的直接相互作用。有趣的是，大约1A敲除使KHSRP不稳定，但不影响KHSRPmRNA。因此，KHSRP敲除显著抑制细胞活力和增殖，从而模仿大约敲除1A后的表型变化。这些发现支持circARID1A对神经母细胞瘤细胞是重要的，并且至少部分通过与KHSRP相互作用来发挥其功能。

在这里，我们介绍了神经母细胞瘤中的全球circRNA景观，它是由DHX9 RNA解旋酶介导的致癌MYCN形成的。这项研究扩展了我们关于MYCN功能的知识，并可能适用于其他MYCN失调的癌症，如髓母细胞瘤。我们还发现circARID1A是一种神经母细胞瘤相关的circRNA，至少部分通过与KHSRP的相互作用维持神经母细胞瘤细胞的生存和生长。我们的研究强调了circRNAs对神经母细胞瘤生物学的重要性，为对抗高危疾病的治疗设计提供了新的角度。