主要的

胞外域磷酸酶/磷酸二酯酶-1 (ENPP1)是一种胞外酶,在癌症进展和转移的背景下促进免疫逃避。ENPP1是一种免疫检查点,通过水解细胞外环磷酸鸟苷腺苷单磷酸(cGAMP)和三磷酸腺苷(ATP)来调节先天和适应性免疫途径1,2,3,4。cGAMP由环状GMP-AMP合酶产生,以响应病毒感染后出现的胞质溶胶中的核酸检测,也存在于肿瘤细胞中。细胞输出和输入cGAMP,触发1型干扰素的细胞间激活,协调多效性免疫反应和免疫细胞的募集1,3,4,5,6,7。同时,cGAMP通过抑制肿瘤细胞中的上皮-间质转化途径和促进免疫细胞中的抗肿瘤反应,作为转移的负调节因子4,5,6,8,9。肿瘤微环境(TME)可以具有高浓度的细胞外cGAMP,并且ENPP1经常在肿瘤细胞上被上调以逃避反式cGAMP信号,增强免疫逃避和转移1,3,4,5,6,7,8.

因此,对抑制ENPP1以克服将淋巴细胞排除在TME(免疫“冷”肿瘤)之外的癌症的治疗挑战有很大的兴趣1,2,3,6,10,11,12,13,14。免疫疗法,如针对细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4 (CTLA-4)或PD-1/PD-L1的检查点抑制剂和电离辐射需要肿瘤浸润淋巴细胞,对免疫“冷”肿瘤的效果较差15,16,17,18,19,20。ENPP1的小分子抑制剂为阻断TME中内源性cGAMP的水解从而使肿瘤细胞对免疫疗法和放射疗法敏感开创了治疗先例1,2,3,6,10,11,12,13,14。干扰素基因刺激剂和toll样受体激活剂同样旨在通过1型干扰素信号传导来刺激“冷”肿瘤,但需要直接肿瘤内给药以防止健康组织中细胞因子介导的毒性21,22,23,24,25,26。通过ENPP1抑制延长内源性cGAMP的半衰期是一种替代策略。然而,当ENPP1被系统靶向时,仍然有过度活跃的免疫反应的证据,强调需要优化ENPP1抑制剂对肿瘤细胞的选择性3.

ENPP1由正常组织表达和分泌,并控制多种生理途径,引起了对肿瘤外毒性的关注和对肿瘤内药物递送的障碍27,28,29。ENPP1代谢核苷酸底物,是嘌呤能信号和无机磷酸盐水平的中央调节因子29,30。小鼠中ENPP1的基因缺失和全基因组关联研究中发现的ENPP1变体将ENPP1活性与肌肉骨骼矿化和心血管钙化疾病联系起来27,30,31,32,33,34,35。ENPP1水平还与胰岛素抵抗、浆细胞存活、细胞能动性和早衰相关,强调了其多功能生物学27,30,36,37,38,39。此外,健康组织和血浆中的ENPP1螯合全身施用的抑制剂,并干扰药物向肿瘤细胞的递送,影响治疗效力和最小剂量浓度。因此,治疗性ENPP1抑制剂需要对肿瘤细胞的最佳选择性,并且理想情况下不会与TME中的高水平ATP和cGAMP竞争,这些特性可能难以使用小分子方法进行设计。

生物制剂,如抗体,是一类治疗药物,对于重组工程改造成多价形式是理想的,并具有很强的药代动力学特征。与小分子相比,基于抗体的ENPP1抑制剂可以通过重组为识别第二种肿瘤特异性抗原的多价构建体来优化肿瘤细胞选择性。值得注意的是,当被格式化为T细胞接合物时,这种抗体是效应细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)反应和T细胞定向杀伤的免疫柄。因此,基于抗体的ENPP1抑制剂可以协同cGAMP激活和靶向免疫治疗以增强疗效。

在这里,我们描述了首次报道的抗体运动,以产生针对ENPP1酶活性的生物制剂。我们分离了ENPP1的高亲和力结合物,包括一个可变重(VH)结构域,该结构域变构抑制cGAMP和ATP水解。我们将抑制剂改造成具有强大细胞活性的双极性和双特异性分子。最后,我们解析了VH抑制剂与ENPP1复合物的3.2分辨率冷冻电子显微镜(cryo-EM)结构,阐明了抑制的变构机制,并为下一代治疗药物的结构导向设计提供了见解。

结果

VH-噬菌体展示产生对ENPP1的高亲和力结合物

ENPP1是一种2型膜蛋白,具有一个核酸酶样结构域、磷酸二酯酶结构域和两个朝向胞外空间的生长激素B样结构域(SMB1和SMB2 )(图。1a)40,41,42,43。ENPP1在细胞膜上形成同型二聚体,但也作为酶活性单体分泌43。为了表达用于噬菌体展示的抗原,通过截短SMB1和SMB2结构域(SMB)并将催化苏氨酸突变为丙氨酸(T256A)来修饰人ENPP1的胞外域。对于基于珠子的噬菌体展示选择,ENPP1抗原的C-末端通过含有烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶位点的接头与具有C-末端AviTag的Fc结构域(enp P1–Fc)融合(图。1a).生物素化的抗原被固定在链霉亲和素珠上用于噬菌体展示的反复循环。

图1:噬菌体展示产生的高亲和力VH结构域识别PDX来源的骨肉瘤细胞上的天然ENPP1,并且VH27–Fc抑制ATP和cGAMP水解。
figure 1

a,ENPP1胞外结构域的结构和用于噬菌体展示的重组enp P1 C-末端Fc-融合抗原(enp P1–Fc)。b,代表生物层干涉测量信号,适合每种VH–Fc结合enpp 1–Fc抗原或Fc-生物素对照。c,目录KD值(平均值n= 2).d,VH–Fc与用ENPP1 KO或SG工程化的PDX衍生OS384细胞系的结合。柱状图报告了中值荧光强度的倍数变化(SG/KO)的平均值和±s . e . m .(n= 3或4个独立的重复)。统计数据是使用单尾学生的t测试。英、法米氏动力学是使用ATP(e)或cGAMP(f)底物(平均值和标准差n= 3个独立的重复)。g通过VH27-Fc抑制离体人血浆中分泌的ENPP1活性。用1 mM cGAMP补充血浆,并在90分钟和24小时的时间过程中分析水解。Fc同型处理和没有添加cGAMP的条件(没有cGAMP)被包括作为对照(n=供体1的3)。

源数据

我们使用基于稳定的曲妥珠单抗支架的合成单结构域VH文库44。VH结构域具有三个互补决定区(cdr ),并且通常比具有六个cdr的fab具有更弱的亲和力。然而,较小尺寸的VH结构域(15 kDa)可能比Fab (60 kDa)具有结合隐蔽或空间挑战性位点的实质性优势。此外,VH结合物可以亲和力成熟或以单链形式连接成多价形式,以显著提高它们的亲和力44.

我们使用两种洗脱策略进行了平行的VH噬菌体选择,以产生与ENPP1和抑制性表位特异性结合的结合物。在第一个标准选择中,使用TEV蛋白酶处理释放结合的VH噬菌体,以捕获所有与ENPP1胞外域结合的VH(扩展数据图。1a).在第二次底物特异性选择中,使用过量ATP洗脱结合的VH-噬菌体,以分离可能竞争底物结合或捕获无活性构象的克隆(扩展数据图。1b).如所示,通过增加阳性和阴性选择严格性进行四轮选择(扩展数据图。1a、b).

TEV和ATP洗脱策略分离出不重叠的VH克隆组,根据亲和力和细胞染色(TEV洗脱,VH24和VH38ATP洗脱,VH27和VH31CDR序列,扩展数据图。1c).首先,我们通过将VH结构域的C末端直接融合到Fc铰链来表达二价VH–Fc构建体。使用生物层干涉测量法(BLI;图。1b,c).使用患者来源的异种移植物(PDX)来源的具有高ENPP1表达(OS384)的骨肉瘤(OS)细胞系测定细胞上的结合(参考文献。45,46).为了进行成对的等基因比较,OS384细胞用ENPP1的CRISPR敲除(KO)或safe-guide (SG)对照进行工程改造。包含VH24、27、31和38的VH–Fc构建体都识别OS384细胞上天然二聚体形式的ENPP1上的表位。VH31–Fc和VH38–Fc是强的细胞上结合物,SG染色比ENPP1 KO细胞系高7.5倍和2.5倍。VH24–Fc和VH27–Fc的SG与ENPP1 KO染色比率较低,分别为1.3和1.5,尽管所有结合剂具有相似的亲和力和解离动力学(图。1d和扩展数据图。1d).与修饰的ENPP1–Fc抗原相比,当天然enpp 1在细胞膜上二聚化时,VH24–Fc和VH27–Fc识别的表位可能更难接近。几个因素是SMB结构域的存在、作为N-末端二聚体的膜ENPP1的取向(相对于作为C-末端二聚体的enpp 1–Fc)或来自膜上蛋白质相互作用物如胰岛素受体的阻碍36,37.

接下来,我们表达了具有催化活性的(T256)ENPP1–Fc,并进行基于荧光素酶的功能性分析,监测ATP或cGAMP水解,以确定该组中可能抑制enpp 1的VH候选物。VH27–Fc是唯一一种被发现能与米氏蛋白一起功能性抑制enpp 1–Fc的分子KiATP和cGAMP的值为220 nM (95%置信区间(CI95):160–300纳米)和130纳米(CI95:97–160纳米)(图。1e,f).有趣的是,V应用在有VH27的情况下–Fc没有到达V最大这表明VH27–Fc不与底物竞争,并通过变构机制抑制ENPP1。这是有趣的,因为VH27是通过用过量ATP洗脱而分离的,但既不直接也不与底物构象竞争;因此,它的发现可能是偶然的。

为了证实VH27–Fc也能抑制天然可溶性ENPP1,我们在供体人血浆中测试了该抑制剂。VH27–Fc抑制IC水解cGAMP50在90分钟和24小时内的值分别约为3.8米和3.9米(图。第一代).其他人报道了具有较高IC的小分子ENPP1抑制剂50使用血浆或平板细胞与重组酶进行测试时的值2,12。效力的变化反映了在更复杂的生物样品中的非特异性蛋白结合。抗原亲和力和表位可及性的差异是影响VH27–Fc效力的额外变量。

酵母展示产生了具有改进特性的VH27变体

单链VH结构域非常适合亲和力成熟,以进化出更强的结合物。已经证实VH27是一种ENPP1抑制剂,我们的目的是使用自主超突变酵母表面展示(AHEAD)来改善其结合动力学和稳定性47。如前所述,AHEAD酵母菌株使用正交易错聚合酶,该聚合酶专门复制和诱变编码选定基因的正交质粒,而不影响基因组DNA (OrthoRep系统)47,48。AHEAD平台实现了cellulo中的软随机化,与容易出错的PCR文库制备相比,这简化了克隆,并允许在出现选择瓶颈时进行再多样化。我们合并了VH27用血凝素(h a)标签将基因导入质粒以定量表达。在反复的几轮选择中,用荧光标记的抗原和抗-HA抗体对持续多样化VH27序列的酵母细胞进行染色,并通过荧光激活细胞分选(FACS图。2a和扩展数据图。2a).

图VH27的亲和力成熟提高了亲和力、抑制能力和稳定性。
figure 2

a前酵母展示选择轮的模式。b下一代测序(NGS)读取T75I和A89V突变体的频率和等级。c,VH27–Fc、VH27/T75I–Fc、VH27/A89V–Fc和VH27/T75I/A89V–Fc与enpp 1–Fc抗原结合的结合和解离速率和亲和常数通过生物层干涉测量法测定(平均值和标准差n= 2个独立的重复)。d,e,Michaelis–Menten使用ATP的VH27/T75I/A89V–Fc酶动力学(d)和cGAMP(e)底物(平均值和标准差n= 3个独立的重复)。f。VH27/T75I/A89V-Fc (1 mM cGAMP,90分钟)抑制离体人血浆中分泌的ENPP1活性。Fc同型处理和没有添加cGAMP的条件(没有cGAMP)被包括作为对照(n=每个供体3)。g,用差示扫描荧光法测定TmVH27和VH27/T75I/A89V在非还原和还原(6.25% BME)条件下作为单域VHs。条形图报告以下项目的平均值和标准误差n= 4或5个独立重复,使用双尾Student’s计算统计数据t测试。h,VH27–Fc和VH27/T75I/A89V–Fc进行SEC分析,并分析“聚集峰”和“Fc峰”之间的峰面积比。条形图报告了的平均值n= 2或3个独立的重复。

源数据

经过五轮AHEAD过程后,出现了几个VH27变异体,并检测到下一代测序读数丰度超过1%。T75I和A89V是位于VH框架中的顶级突变(图。2b).残基T75I位于邻近富含酪氨酸的CDR H1的支架环中;对异亮氨酸的这种偏好可能表明与芳香CDR H1残基的疏水相互作用。T75I取代降低了解离速率,支持了这一假设,即它可能将效应扩展到CDR构型(图。2c).残基A89V在空间上接近VH结构域的C末端,可能影响压缩和稳定性。A89V变异体增强了结合率,这可能与增加折叠蛋白有效浓度的稳定性增益有关(图。2c).

我们构建了一个共有变异体(VH27/T75I/A89V–Fc ),它提高了联合和解离率,并降低了纳摩尔浓度KD价值(图2c和扩展数据图。2b–d).这些收益对应于较低的KiATP和cGAMP水解值,120 nM (CI95:83–160纳米)和43纳米(CI95:30–57纳米)(图。2d,e).VH27/T75I/A89V–Fc也是IC患者血浆中cGAMP降解的三倍强抑制剂50三个供体的值在1.2米和1.4米之间(图。2f).我们测试了该抑制剂与小鼠ENPP1 (mENPP1)的交叉反应性,该抑制剂与人ENPP1 (hENPP1)具有约80%的同源性42。在离体C57BL/6J小鼠血浆中,VH27/T75I/A89V–Fc抑制重组mENPP1单体水解ATP和cGAMP,并阻断天然mENPP1降解cGAMP(扩展数据图。2e–g).

与我们的假设一致,即这些支架的变化可能会影响结构域的稳定性,双突变体显示出增强的生物物理特性。T75I/A89V突变的掺入显著增加了热解链温度(Tm)从48°C到63°C(图。2g).当用β-巯基乙醇(BME)还原VH二硫化物时,双突变体仍然比VH27稳定得多Tm分别为50℃和45 ℃(图。2g).最后,当以VH–Fc格式表达时,T75I/A89V突变降低了通过尺寸排阻色谱法(SEC)观察到的聚集水平(图。2h).虽然聚集的VH27–Fc产生了一些非特异性细胞粘着,但VH27/T75I/A89V–Fc在OS384 ENPP1 KO细胞上显示出明显更少的背景染色(扩展数据图。1d3c).我们在其余的实验中使用VH27/T75I/A89V,为简便起见,将其称为VH27.2。

多价构建体增加了细胞抑制

我们测试了VH抑制剂是否可以改造成多价形式以增强效力和肿瘤特异性。例如,我们构建了双极性和双特异性四价Fc构建体,通过15个氨基酸的甘氨酸-丝氨酸接头将第二个识别臂附加到Fc的C-末端(图。3a).这些Fc形式是对称的,不需要专门的“旋钮-孔”装配管道,可以在哺乳动物细胞培养中高产率生产,并且是生物物理稳定的(扩展数据图)。3a,b).

图3: VH27.2被格式化为双极性和双特异性构建体。
figure 3

a双极性和双特异性四价Fc抑制剂的结构。b,c当VH27–Fc预加载在传感器上时,生物层干涉测量法绘制VH组的表位相对于VH27表位的图(b),以及传感器上预装了VH24–Fc、VH31–Fc或VH38–Fc(c). d,代表性生物层干涉测量信号,适合双极性VH27.2/VH31抑制剂结合enpp 1–Fc抗原或Fc-生物素对照(平均值和标准差n= 2个独立的重复)。e通过双极性分子(1 mM cGAMP,90分钟)抑制离体人血浆中分泌的ENPP1活性。Fc同型处理和没有添加cGAMP的条件(没有cGAMP)被包括作为对照(n=每个供体2个独立的重复)。fVH 27.2–Fc和双极性分子与OS384 SG和ENPP1 KO细胞的结合。柱状图报告了中值荧光强度的倍数变化(SG/KO)的平均值和±s . e . m .(n= 5或6个独立的重复)。统计数据是使用单尾学生的t测试。g,h,代表性生物层干涉测量信号和双特异性抑制剂结合enpp 1–Fc抗原的拟合(g),PD-L1–Fc抗原(h)和Fc-生物素质控品(平均值和标准差n= 2个独立的重复)。i。通过双特异性分子(1 mM cGAMP,90分钟)抑制离体人血浆中分泌的ENPP1活性。Fc同型处理和没有添加cGAMP的条件(没有cGAMP)被包括作为对照(n=每个供体2个独立的重复)。

源数据

为了产生双极性抑制剂,我们对VH–Fc组进行了表位宁滨,发现在VH27–Fc存在的情况下,每个表位都可以同时与ENPP1结合,这表明这些表位不重叠,并且适合与VH27–Fc结合(图。3b,c).我们使用VH31创造了VH27.2双极性抑制剂,因为它显示OS384的最佳细胞染色;我们假设VH31部分会增加膜上ENPP1抑制剂的局部浓度(图。1d).BLI在体外证实了双极性分子与enpp 1–Fc的结合常数低于纳摩尔,其ic50在人体血浆中,三个供体的测量值介于0.96 M和1.2 M之间(图。3d,e).我们对OS384 SG和ENPP1 KO细胞进行染色,并证明VH31的效价增加了69%的特异性结合,对于VH27.2-Fc和双极性抑制剂,SG与ENPP1 KO的比值分别为1.6和2.7(图。3f和扩展数据图。3c).

接下来,我们使用临床批准的PD-L1检查点抑制纳米抗体Envafolimab产生了双特异性ENPP1抑制剂(图。3a)49,50。几份报告显示,小分子ENPP1抑制剂与免疫检查点阻断共同治疗显著增强了肿瘤消退11,13,14。双特异性生物制剂将这两种协同疗法结合到一个分子中。此外,在各种癌症中过表达的PD-L1应该增加肿瘤细胞膜上VH27.2的局部浓度,以增强效力和肿瘤选择性。我们构建了双特异性VH27.2/Envafolimab抑制剂,并证实了其与enpp 1–Fc和PD-L1–Fc抗原的结合(图。3g,h).双特异性分子在人血浆中保留了其抑制功能(图。3i).

ENPP1和PD-L1在MDA-MB-231细胞上高表达;因此,我们使用该细胞系来测量与VH 27.2–Fc和VH31–Fc相比的双特异性分子的细胞上结合,以及与VH 27.2–Fc和Fc–Envafolimab(Envafolimab通过15个氨基酸的甘氨酸–丝氨酸接头融合到Fc的C末端)相关的双特异性分子的细胞上结合。欧共体50VH27.2–Fc和VH31–Fc的值估计分别大于10 M和0.65 M,双极性分子的EC降低50相对于VH 27.2-Fc的配合(图。4a).虽然VH 27.2–Fc是一种弱的细胞结合剂,但Fc–Envafolimab用EC对细胞进行了强有力的染色50值约为1纳米。双特异性分子具有一个EC50值约为4 nM,显示出与Fc–Envafolimab几乎相当的细胞结合,表明我们可以有效地利用PD-L1双重识别来提高细胞膜上的抑制剂浓度(图。4a).

图4:双极性和双特异性构建体改善了在肿瘤细胞上的定位并增加了对细胞膜上ENPP1的抑制。
figure 4

a,MDA-MB-231细胞用VH 27.2–Fc、VH31–Fc、双极性分子、双特异性分子或Fc–Envafolimab的滴定进行染色,中值荧光强度值用于拟合EC50曲线(平均值n= 2或3个独立的重复)。b,MDA-MB-231细胞用cGAMP和指定浓度的VH 27.2–Fc、双特异性抑制剂或双特异性抑制剂处理。通过cGAMP ELISA测量培养基中剩余的cGAMP。c,数据被标准化为无细胞处理的培养基和用PBS处理的细胞之间的范围。在3 M处处理的Fc同种型也被包括作为对照。d,用pNP-TMP处理MDA-MB-231细胞,并测量VH 27.2–Fc、双极性抑制剂或双特异性抑制剂和pNP-TMP水解的指示浓度。e数据被标准化为PBS条件。在3 M处处理的Fc同种型也被包括作为对照。数据输入b–e代表平均值和标准误差n= 3–5个生物复制。

源数据

使用MDA-MB-231细胞和ENPP1、cGAMP的两种底物的细胞分析,将双极性和双特异性抑制剂的抑制能力与VH 27.2–Fc的抑制能力进行了比较(图。4b,c)或对硝基苯基胸苷5′-一磷酸(pNP-TMP;图。4d,e).尽管pNP-TMP是一种被其他胞外磷酸二酯酶水解的合成底物,但它提供了一种比cGAMP ELISA更高的通量和更低的噪音的直接比色读数。这些细胞分析证明cGAMP和pNP-TMP底物的趋势相同。VH 27.2–Fc用IC抑制细胞ENPP150值在0.73 M和0.78 M之间,低于IC50血浆中可溶性ENPP1的值(图。4b–e2f).这与同二聚体膜种类比分泌型单体具有更高的亲和力相一致,这将增加特异性靶向膜结合形式的ENPP1的能力。

在ic细胞分析中,双极性抑制剂的效力大约是VH 27.2–Fc的两倍50值在0.30米和0.40米之间(图4b–e).双亲化合价影响细胞ic50价值比它更引人注目地改变了等离子IC50值,支持VH31表位在膜结合的ENPP1上是高度可及的,并且可以有效地拯救细胞结合(图。3e4b–e).有趣的是,在基于细胞的分析中,最高浓度的双极性分子存在钩效应,这在血浆中没有观察到(图。3e4b–e).当VH31表位在ENPP1同源二聚体的两个亚单位上变得饱和时,可能存在空间限制。

相对于VH 27.2–Fc,双特异性抑制剂具有更大数量级的细胞定位,相应地在细胞ic中表现出7到10倍的改善50pNP-TMP和cGAMP底物的值分别为0.11 M和0.07 M(图。4b–e).正如对双极性抑制剂所观察到的,对膜ENPP1的抑制作用有明显的改善,但对血浆中的分泌型enpp 1的抑制作用没有改善(图。3i4b–e).这进一步证实了对第二肿瘤表位或抗原的工程多特异性识别可以改善细胞定位以优化效能。结果,通过驱动肿瘤细胞膜上显著更高的抑制剂浓度,共同靶向PD-L1产生了我们最有效的分子。

VH结构域被设计成免疫疗法和降解支架

ADCC是临床批准的治疗性抗体的基本机制51,52,53。除了抑制ENPP1,含有Fc结构域的构建体与Fc受体如自然杀伤(NK)细胞和巨噬细胞上的CD16结合,激活ADCC54,55。正如所料,二价和四价Fc抑制剂是CD16的高亲和力结合剂,而单结构域VH27.2不结合Fc受体(图。5a).

图5: VH27.2被重组工程化到免疫治疗支架和下一代蛋白质降解器中。
figure 5

a,二价VH27.2–Fc、四价双特异性Fc和单结构域VH 27.2(无Fc)结合CD16–Fc抗原或Fc-生物素对照的代表性生物层干涉测量信号(n= 2).b,结合VH27.2和识别CD3的臂(OKT3 scFv)的双特异性T细胞接合器(BiTE)的结构。c,表达NFAT-GFP报道基因的Jurkat细胞与用Fc-enpp 1包被的珠子或无珠子对照孵育,并用10 nM BiTE或PBS对照处理。通过流式细胞术测量由NFAT激活驱动的GFP表达。数据被标准化为无珠粒/无咬合条件。条形图报告以下项目的平均值和标准误差n= 3个独立的重复。使用双尾学生模型计算统计数据t测试。d,结合抗ENPP1 VH和rnf 43-募集IgG臂的“钮入孔”双特异性AbTAC降解物的结构。e,f,MDA-MB-231细胞用PBS或滴定的VH27.2 AbTAC处理,通过免疫印迹测量ENPP1水平。细胞另外用500nM VH 27.2-Fc和Fc同型对照处理。将ENPP1密度标准化为肌动蛋白加载对照。计算相对于PBS处理剩余的ENPP1的百分比。e,图表总结了的平均值和标准误差n= 3–5个独立的重复。使用双尾学生模型计算统计数据t测试。f,一个实验的代表性免疫印迹。gMDA-MB-231细胞用VH27.2 AbTAC,指示对照分子或PBS预处理24小时。除去分子并洗涤细胞后,测量pNP-TMP水解。数据标准化为PBS条件,该图表示平均值和±标准差n= 3个独立重复,1个或2个技术重复。使用双尾学生模型计算统计数据t测试。

源数据

VH结构域可以被工程化为掺入CD3识别臂的双特异性T细胞接合子(BiTEs)。我们通过将(15个氨基酸甘氨酸-丝氨酸接头)VH27.2与OKT3(一种公认的抗CD3 scFv)连接产生了一个BiTE(图。5b)56,57。Jurkat T细胞通过激活的T细胞(NFAT)反应元件(NFAT-GFP报告基因)的核因子控制GFP的表达,在与10 nM BiTE和固定在链霉亲和素磁珠上的enpp 1-Fc孵育20小时后,变得活跃。当在没有BiTE或没有ENPP1偶联珠的情况下培养Jurkat细胞时,没有NFAT反应,证明了VH27.2 BiTE激活T细胞的高特异性(图。5c和扩展数据图。三维(three dimension的缩写)).

生物制剂和免疫疗法的治疗空间继续扩大,我们小组的VH域可以直接移植到新的格式中。例如,蛋白质降解物是一类新的具有降解诱导臂的双特异性分子58,59,60。AbTACs整合了一个IgG臂,该臂招募膜结合E3连接酶RNF43来泛素化靶蛋白胞质结构域上的赖氨酸残基,并将其指定用于溶酶体降解58。虽然在我们的小组中只有一个VH结构域识别ENPP1上的功能表位,但是任何VH结构域都可以构建到AbTAC中,以阻断降解途径并使ENPP1失活。

在ENPP1的胞质结构域中有三个赖氨酸残基,表明它可能是RNF43泛素化的可行靶标。我们为VH24、VH27.2、VH31和VH38构建了“旋钮入孔”双特异性VH–IgG抗体。5d).VH结构域缺少轻链;因此,不需要复杂的轻链配对步骤。“旋钮”和“孔”片段在单个哺乳动物转染中共表达,并使用导入“旋钮”臂的His标签纯化,以排除污染的“孔-孔”同源二聚体。

通过形成E3连接酶、双特异性降解物和靶蛋白的三级复合物的降解是表位依赖性的59,61。MDA-MB-231细胞表达RNF43,以前用于RNF43介导的靶蛋白降解,用AbTACs处理,我们发现VH27.2 AbTAC是最有效的ENPP1降解剂58,61。在与500 nM VH27.2 AbTAC孵育24小时后,总共有44%的ENPP1被降解。用500nM VH 27.2–Fc处理没有降低ENPP1水平,证实AbTAC诱导蛋白质降解,而不是内化(图。5e,f和扩展数据图。3e).AbTACs通常表现出这种程度的最大降解(D最大)因为它是合成和降解速率的合成58,59,61.

最后,我们用1 M VH27.2 AbTAC、VH 27.2–Fc和同型对照或PBS预处理MDA-MB-231细胞24小时。去除含有AbTAC或对照分子的溶液,洗涤细胞,然后用pNP-TMP底物孵育5小时。用VH27.2 AbTAC预处理的细胞显示出相对于PBS条件少约36%的pNP-TMP水解,但用VH 27.2–Fc和同型对照预处理的细胞与PBS没有统计学差异5g).这些结果验证了ENPP1的降解可以有效地抑制其水解活性。

冷冻电镜结构阐明了变构结合的位置

为了揭示变构抑制的表位和机制,我们解析了VH27.2与T256A enpp 1–Fc复合物的3.2″全局分辨率cryo-EM结构(图。6a和扩展数据图。4a–h5a、b;蛋白质数据库(PDB)代码:8HGR和EMD-40047).由于柔性铰链和接头,没有观察到Fc结构域的密度。cryo-EM结构显示了预期的2:1 VH:ENPP1同型二聚体化学计量,VH结构域结合到头对头二聚体中配置的每个ENPP1胞外域(图。6a和扩展数据图。5c,d).VH–ENPP1结构与包括SMB结构域在内的全长enpp 1胞外域的晶体结构对齐(PDB代码:6wfj),全球RMSD为0.972(扩展数据图)5e)42。覆盖这些结构,很明显VH27.2 CDR H3与SMB结构域结合紧密,但没有冲突。值得注意的是,没有足够的空间容纳轻链,这表明我们使用小VH结构域来靶向隐蔽表位的最初动机是必要的。VH–enpp 1结构也与mENPP1晶体结构(PDB代码:4gtw);hENPP1和mENPP1催化结构域共享接近90%的同源性40,42。关键的VH-ENPP1界面相互作用得以保留,解释了物种交叉反应性(扩展数据图。5f).

图6: Cryo-EM揭示了接近催化位点的VH结构域结合ENPP1。
figure 6

a结合到ENPP1胞外域的VH27.2的Cryo-EM 3D重建。b,查看CDR H1表位。c,查看CDR H2表位。d,查看CDR H3表位。e,总结VH和ENPP1残基之间相互作用的表格。f比较VH 27.2–Fc丙氨酸变异体结合动力学的生物层干涉测量法。痕迹代表n= 2个独立实验。g,VH 27.2–Fc丙氨酸变体相对于WT VH 27.2–Fc在500 nM下对ATP、pNP-TMP和cGAMP底物的抑制能力。条形图报告了的平均值n= 2个独立的重复。h,生物层干涉测量法,比较VH 27.2–Fc与WT、K528A、F346A和H380A enpp 1–Fc的亲和力。痕迹代表n= 2个独立实验。i,生物层干涉测量法比较VH 27.2–Fc苯丙氨酸变异体的结合动力学。痕迹代表n= 2个独立实验。j,VH 27.2–Fc苯丙氨酸变异体相对于WT VH 27.2–Fc在500 nM下对ATP、pNP-TMP和cGAMP底物的抑制能力。条形图报告意味着n= 2个独立的重复。k,ATP/cGAMPKiWT、Y102A和W104F VH 27.2–Fc的倍数变化值。l,线性回归和R2值关联KDKiWT、Y102A和W104F VH 27.2–Fc变体的ATP和cGAMP底物值。

源数据

所有三个VH CDRs都以令人印象深刻的形状互补性与ENPP1结合,结合靠近活性位点的区域,但不封闭该位点或与核苷酸结合口袋中的残基相互作用(图。6b–d)40,41。在活性位点观察到类似于核苷酸单磷酸(我们建模为AMP)的密度(可能是纯化留下的,因为没有外源提供配体),证明VH27.2和诸如AMP的核苷酸可以同时结合。ATP和cGAMP等底物与催化产物AMP结合在同一个核苷酸袋中。这表明这些底物也能够与enpp 1–VH复合物结合,与观察到的非竞争性抑制一致。VH结构域偏向鸟苷邻近位点,覆盖了VH–enpp 1结构和与3′-5′-连接的pApG复合的mENPP1晶体结构(cGAMP水解线性中间体;PDB电码:6aek)表明VH结构域会与鸟苷碱基发生冲突(扩展数据图。5g)41。然而,以前的报道发现鸟苷碱基在口袋中具有一定程度的移动性,因此这些鸟苷相邻残基的突变不会完全破坏cGAMP结合和水解3。基于这种位置灵活性,与这些残基重叠的VH结构域不一定会阻止cGAMP结合,这得到了我们的Michaelis–Menten表征的支持。

我们通过丙氨酸扫描形成VH27.2和ENPP1之间特异性相互作用的残基进行了表位分析(图。6e–g).这些结构-功能特征确定了VH27.2上有助于ENPP1结合和变构抑制的以下两个热点:(1) CDR H1 Y30/Y31和(2) CDR H3 Y102/W104/Y105。

VH27.2 CDR H1环通过Y31和Y30的pi堆积在内部构建,这两个位点都在与ENPP1 K528的阳离子-pi相互作用的范围内。此外,VH27.2 Y31 pi与ENPP1 H380堆叠(图。6b,e).当Y31或Y30突变为丙氨酸时,VH 27.2–Fc与ENPP1的结合消失(图。6f).野生型(WT)VH 27.2–Fc不与ENPP1 H380A结合,但是保留了对ENPP1 K528A的亲和力,表明H380是必要的接触点,其与VH Y31的芳香相互作用在能量上是不可或缺的(图。6小时).ENPP1 H380、VH27.2 Y31、VH27.2 Y30和ENPP1 K528一起连接了广泛的芳香阳离子网络,极大地促进了VH亲和力。

VH27.2 Y31和ENPP1 H380之间的π堆积,ENPP1催化核中的残基与Zn配位2+,可能有助于变构抑制和对cGAMP抑制的三倍选择性(图。6b,e).因为ENPP1的水解活性高度依赖于Zn2+底物的协调,我们假设VH 27.2 Y31 pi-堆积与H380可以发挥抑制作用。尽管VH 27.2–Fc Y31A和ENPP1之间缺乏结合阻止了酶抑制试验,我们注意到以前发现对应于hENPP1 H380的mENPP1 H362对cGAMP而不是ATP降解是必需的,并且mENPP1 H362A不能与Zn配位2+对于生产性cGAMP水解3。有锌2+VH–enpp 1复合体的密度;因此,涉及H380的π堆积网络可以降低组氨酸残基的pKa,而不会完全降低其对Zn的亲和力2+如在更极端的组氨酸到丙氨酸突变中观察到的62。另一种可能性是,在催化过程中,VH27.2在该位点的结合可能扰乱反应几何或构象轨迹。

结构导向诱变揭示了第二个热点,CDR H3,它对结合亲和力和抑制ATP水解特别重要。VH27.2 CDR H3残基Y102、W104和Y105 pi-堆叠形成疏水口袋,与ENPP1残基多次接触VH27.2 Y102和ENPP1 S377侧链之间的弱极性相互作用;VH27.2 W104和ENPP1 G342主链之间的氢键;VH27.2 W104和ENPP1 F346之间的π堆积以及VH27.2 Y105和ENPP1 R395之间的阳离子π相互作用,要求R395侧链断开其与ENPP1 E347的盐桥,并相对于其在非VH结合的ENPP1中的寄存器旋转(PDB代码:6wjf)以防止与Y105碰撞(图。6d,e).丙氨酸扫描证实了这三个芳香残基结合的主要能量贡献。VH 27.2–Fc W104A不与ENPP1结合,VH 27.2–Fc Y102A和Y105A对ENPP1的亲和力减弱了两个数量级(图。6f和扩展数据图。5h).

值得注意的是,500nM VH 27.2–Fc Y102A未能抑制ENPP1水解ATP,但仍能抑制cGAMP和pNP-TMP水解(图。6g).将VH 27.2–Fc Y102A与WT进行比较,米氏–MentenKi对于cGAMP,增加了约五倍,达到220 nM (CI95:170–290纳米)。然而KiATP大于4.5米(置信区间95:2.8–11M),表明Y102A变异体赋予了非凡的底物选择性(扩展数据图。5i,j).VH 27.2–Fc Y102A变异体的这种ATP特异性效应可能暗示与ENPP1 S377的弱极性相互作用,或者酪氨酸残基支持VH27.2 W104和Y105疏水口袋的结构完整性。为了消除这些影响,我们产生了Y102的苯丙氨酸变体,挽救了亲和力和ATP水解的抑制(图。6i,j).这些结果表明,极性接触是可有可无的,但疏水相互作用对CDR构象是至关重要的。类似地,与相应的丙氨酸变体相比,VH 27.2–Fc Y105F和W104F变体恢复了亲和力,证实了ENPP1界面疏水填充的重要性(图。6i).

有趣的是,VH 27.2–Fc W104F变体概括了Y102A变体的底物偏向性,其中VH 27.2–Fc W104F对ATP水解的抑制作用比cGAMP或pNP-TMP水解弱得多(图。6j).这KicGAMP的值为270纳米(CI95:240–300纳米),但KiATP值为2.3 M(置信区间95:1.2–10米;扩展数据图。5l,m).WT VH 27.2–Fc抑制cGAMP水解的选择性是ATP水解的2.7倍,而VH–Fc Y102A和W104F的选择性分别约为20.6倍和8.5倍(图。6k).尽管WT、Y102A和W104F VH 27.2–Fc具有显著不同的结合亲和力(KD= 0.7、111和14.2纳米),没有相关性(R2= 0.17)KicGAMP的值。相比之下,有很强的相关性(R2= 0.85)进行比较KiATP值,表明CDR H3的不稳定不成比例地失调了ATP的效力(图。6l和扩展数据图。5h–m).从机理上讲,W104F变体破坏了与ENPP1 G342骨架羰基的氢键。苯丙氨酸也不能填充色氨酸的疏水孔,并可能削弱与ENPP1 F346的芳香相互作用。WT VH 27.2–Fc对ENPP1 F346A变体的亲和力降低,证明ENPP1 F346和VH27.2 W104之间的pi堆积是一个重要的能量成分(图。6小时).

总之,这些诱变结果表明VH27.2 W104对于ATP抑制机制是必需的,Y102的疏水填充支持W104的正确构象。此外,VH 27.2–Fc Y102A和W104F变异体最低程度地影响Ki对于cGAMP,这意味着CDR H1与ENPP1 H380的结合在cGAMP的抑制机制中起主导作用。因此,结构-活性分析显示,VH CDRs与ENPP1上不同的位点结合,分别调节cGAMP或ATP的水解。这些发现可能会启发设计新的小分子和生物抑制剂,这些小分子和生物抑制剂可以询问与我们的VH结构域相同的变构表位。

讨论

随着ENPP1的有效小分子抑制剂开始显示出令人兴奋的翻译结果,生物制剂提供了不同强度的互补抑制模式2。首先,药物定位于肿瘤细胞对于最小化潜在的肿瘤外毒性和减轻可溶性ENPP1的药物隔离是重要的。小分子通常在全身分布,对它们进行设计以获得更高的肿瘤特异性是一项挑战。相反,我们将VH抑制剂重组表达为双特异性分子,双靶向高PD-L1和ENPP1表达,显著改善细胞ic50不改变IC的值50血浆中的值。可以设计靶向其他肿瘤生物标志物的双特异性分子来治疗各种癌症类型。

第二,研究表明,将ENPP1抑制剂与检查点抑制剂组合增加了它们对免疫“冷”肿瘤的治疗指数11,13,14。很难构建类似药物的双功能大分子。相反,简单的蛋白质工程方法允许构建具有VH27.2和Envafolimab的双特异性。ENPP1也是一种抗转移靶标,可以与其他治疗剂一起以双功能形式使用4,5,6,8,9。例如,当癌症发展到转移时,OS变得致命63。由于HER2和ENPP1在OS中过表达,结合ENPP1抑制剂和第二种临床抗体如曲妥珠单抗的双特异性分子可能是治疗这种侵袭性癌症的机会。

第三,基于抗体的ENPP1抑制剂也可用作抗原导向的免疫疗法。NK细胞和巨噬细胞将靶向与ADCC的Fc效应子活性形式结合的肿瘤细胞,并且以BiTE形式的ENPP1抑制剂强烈激活T细胞。此外,VH结构域是有用的,因为它们作为嵌合抗原受体-T细胞(CAR-Ts)稳定表达。我们假设,与只有单一作用机制的小分子相比,cGAMP激活与抗原定向杀伤的分层作用可以增强生物抑制剂的治疗效果。由于VH抑制剂与mENPP1具有交叉反应性,这些免疫治疗协同作用将在未来的研究中使用免疫活性小鼠进行评估。一个重要的考虑是ENPP1也在一些正常组织中表达;因此,需要研究抗ENPP1免疫疗法的潜在肿瘤外毒性。共同靶向第二种肿瘤抗原的双特异性CAR或BiTE模式可以增强对肿瘤细胞而非健康细胞的定位。

通过靶向降解的抑制是由抗ENPP1 VH结构域组实现的另一种治疗方法。VH27.2 AbTAC仍然保留其作为抑制剂的功能,因此我们认为降解将是附加的。我们的重点是抑制ENPP1的生化活性;然而,已知ENPP1通过与胰岛素受体直接结合来负调节胰岛素信号36,37,40。降解ENPP1以消除这种相互作用可能对胰岛素抵抗和二型糖尿病具有治疗相关性。

最后,VH结合物对底物选择性抑制的模块性是优于当前小分子ENPP1抑制剂的关键优势。使用结构导向诱变,我们确定CDR H3在阻断ATP而非cGAMP水解中具有重要作用,我们怀疑CDR H1与H380的相互作用对于抑制cGAMP降解的机制是重要的,这与以前的报道一致3。我们证明了VH CDRs可以被调节以产生cGAMP选择性抑制剂,随着进一步的亲和力成熟和优化,这些将成为研究疾病中cGAMP信号传导和潜在疗法的有价值的试剂。此外,这些分离ATP和cGAMP水解机制的独立变构袋的发现可以帮助未来设计具有更大效力和专门活性的小分子和生物抑制剂。总之,我们的研究证明,对不同大小形式的蛋白质结合物进行无偏见的筛选,结合详细的生物化学和结构表征,可以揭示新的机制见解,并为生物和小分子发现提供分子机会。