单细胞转录组学和表观组学揭示单核细胞在神经母细胞瘤骨髓转移中的作用

成神经细胞瘤(NB)占儿童癌症相关死亡的15%,其中> 90%的转移期(M期)NB肿瘤扩散到骨髓(BM ),骨髓是疾病复发和进展的场所1,2,3,4。遗传性NB肿瘤异质性和可塑性被认为有助于分化或转移和复发，充当内在致癌驱动因素5,6,7,8。疾病发生和发展中涉及的主要遗传因素包括MYCN(MNA)，突变TP53的扩增或突变ALK和其他Ras/MAPK途径基因和端粒维持失调TERT或端粒的选择性延长(ALT)，这通常与突变或截短有关ATRX (ATRX傻瓜)9,10,11,12,13,14。然而，最近的全基因组测序研究已经确定了复发性体细胞改变的稀缺性15但是表明转移性NB的亚组是由大片段染色体畸变定义的16(此处称为散发)。

近年来的大量研究17,18,19,20,21,22,23致力于确定发育中的肾上腺髓质的细胞类型和谱系轨迹，旨在揭示NB中的起源细胞，其来源于交感神经系统胚胎发育过程中不同阶段的神经嵴(NC)衍生的交感-肾上腺祖细胞24。尽管原发性NB中的大多数肿瘤细胞类似于健康的交感神经母细胞，特别是在未治疗的和低风险的肿瘤中19,21预处理和高风险病例中的一些肿瘤细胞显示出嗜铬细胞及其祖细胞(即，许旺细胞前体(SCP ))以及间充质细胞和NC样细胞的富集特征，表明它们的丰度和分化状态与预后相关21。肿瘤微环境中的免疫细胞已被证明具有肿瘤促进或抑制活性。对原发性NB肿瘤的研究发现，在低风险NB的肿瘤微环境中，T-、NK和树突状细胞水平增加25,26,27与高风险NB相比28,29。以前的研究应用组织成像和批量转录组学将骨髓细胞与炎症信号联系起来30,31,32,33,34,35。免疫微环境和肿瘤细胞在转移部位的相互作用的全面表征仍然难以捉摸。

最近，单细胞技术的使用已经成为全面表征健康和患病组织内细胞状态的有力工具36。这些方法已经被用于表征原发性NB肿瘤的肿瘤异质性以及肿瘤微环境19,20,21,37，并且已经研究了正常和疾病环境中成人BM的组成，例如，在白血病和前列腺癌的骨转移中38,39,40,41,42。然而，这样的方法还没有在不同的NB子群，即MNA，ATRX傻瓜，并在NB的转移小生境BM处散发。在这里，我们应用单细胞ATAC测序法(scATAC-seq)和单细胞RNA测序法(scRNA-seq ),在一致的NB亚组中，与蛋白质组学和功能分析相结合，以:(I)研究转移性和原发性肿瘤中NB亚型之间细胞可塑性的差异，(ii)研究肿瘤细胞和BM微环境之间的相互作用，以及(iii)阐明转移诱导的BM改变。

我们发现NB亚群决定细胞类型组成，并且肿瘤表型在转移时是保守的。NB细胞主要与髓样细胞相互作用，髓样细胞具有M1和M2特征，表现为异常的促炎和抗炎核心TF调节环、促分化、细胞周期基因减少以及肿瘤促进因子的表达。总的来说，这些数据提供了对所有亚组中NB的分子和细胞结构的见解，并有可能为旨在改善患者预后的未来研究提供信息。

神经母细胞瘤骨髓转移单细胞图谱

我们在来源于良性肿瘤(n= 5)没有BM转移(神经节细胞瘤和神经节细胞瘤)，在此定义为对照，和11个跨越转移NB亚型的样品:MNA，ATRX傻瓜和零星的(缺乏任何改变)(图。1a).对每个肿瘤样品进行分子和细胞遗传学表征(补充表1)，充实亚型分类。scRNA-seq总共产生80，789个单细胞，中位数为1278个基因/细胞(图。1b和补充数据1).在对scRNA-seq数据进行整合和聚类后(补充图。1a)，使用五个参考数据集对细胞进行分类(图。1c).这产生了七种主要的细胞类型，包括各种类型的免疫细胞:T细胞、NK细胞、B细胞、髓样细胞和浆细胞样树突状细胞，随后是红系细胞和干细胞，它们由规范标记基因的表达支持(图。1d)43,44,45,46,47。此外，我们鉴定了一群NB细胞，它们(I)被归类为神经元，(ii)表达关键的NB标记48,49和(iii)在对照样品中不存在(图。1b–d).由22个细胞组成的未指明的细胞群被定义为“其他”，并从进一步分析中排除(图。1b).为了进一步证实微环境和肿瘤细胞之间的界限，我们使用了两种互补的策略。首先，我们通过流式细胞术基于肿瘤标记物GD2和L1CAM的评估计算肿瘤浸润率(参见门控策略补充图。1b)，这与scRNA-seq数据分配一致(补充图。1c和补充表格1).第二，我们根据存在于NB细胞中的scRNA-seq数据推断出拷贝数变异(CNVs )(补充图。1d)并且在非NB细胞中不存在(补充图。1e).基于scRNA-seq的CNV调用通过SNP-阵列使用大量肿瘤图谱进行验证(图。1e，补充数据2)，进一步证实了我们的肿瘤细胞分配。

a我们的实验和分析方法概述。DTC播散性肿瘤细胞，微环境b整个scRNA-seq数据集的UMAP(n= 80，789个细胞)。数字表示簇，而颜色区分细胞类型。c每个聚类中推断细胞类型的相对丰度。右侧的注释表示分配给每个聚类的最终像元类型分类。d标准细胞类型标记基因在簇中的表达显示于b. e从scRNA-seq数据(底部行)预测的拷贝数变异区域(有色区域)与从SNP阵列数据(顶部行)中的log R比率(黑线)推断的区域的比较。显示了来自每个相应NB亚型的一名患者。源数据作为源数据文件提供。

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骨髓转移小生境中神经母细胞瘤细胞的细胞景观

先前对原发性肿瘤的研究描述了NB细胞的两种转录模式，即定向(去甲)肾上腺素能和未分化间充质/神经嵴样(NCC样)细胞类型48,49。我们的数据显示，转移性NB细胞主要由去甲肾上腺素能信号定义，在一定程度上也由肾上腺素能信号定义，尽管这些标记物的表达在不同患者之间存在差异(图。2a，补充图。2a).然而，在我们的样本集中，在这项研究的分辨率下，我们没有检测到具有明显间充质或NCC样信号的NB细胞，因为具有最高间充质或NCC样信号得分的前5%的细胞缺乏NB典型标记基因，并且存在于非NB细胞群中(补充图。2a–c).此外，转移性NB细胞与肾上腺髓质的比较显示MNA肿瘤主要由类似神经母细胞、循环神经母细胞和桥细胞的细胞组成。相比之下，非MNA肿瘤的特征是晚期成神经细胞和嗜铬细胞的存在(图。2b).利用已发表的原发性肿瘤的scRNA-seq数据20我们发现BM转移瘤显示出与原发灶相当的肿瘤细胞表型，这在21(图。2b，补充图。2d).原发性和转移性NB基因表达的相关性分析表明，MNA肿瘤聚集在一起，与肿瘤部位无关。ATRX傻瓜和散发亚型，与MNA肿瘤相比形成了一个独立的簇，进一步证实了它们不同的生物学特性。此外，它们以原发性和转移性肿瘤之间的转录差异为标志(图。2c，补充图。2e).总之，我们的数据显示表型可塑性在转移时是保守的，并且在MNA患者中不同于ATRX傻瓜和散发性NB亚型，后两种在转移小生境中显示出比原发部位更明显的转录变化。

a患者NB细胞(左)和其他细胞类型(右)中NB标记基因的表达。b原发性和转移性肿瘤细胞中分配给每种肾上腺髓质细胞类型的NB细胞的比例。NB亚型分为MNA和非MNA (A + S)肿瘤。c假大块基因表达的相关性分析将M肿瘤与A和S肿瘤区分开来。源数据作为源数据文件提供。

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神经母细胞瘤细胞与骨髓微环境的相互作用

为了阐明NB和BM细胞群之间的串扰和通讯途径，我们接下来根据注释的受体-配体对的基因表达来推断细胞对之间的相互作用50。这表明NB细胞表达配体，该配体被髓样细胞识别，并在较小程度上被NK细胞和浆细胞样树突状细胞识别，这表明从NB细胞到BM细胞的直接通讯，而从微环境到NB细胞的通讯是边缘性的(图。3a).接下来，我们使用配体-受体对的精选注释，确定了主要的通讯途径，即中期因子(MK)、巨噬细胞移动抑制因子(MIF)和多效蛋白(PTN)，并定义了介导NB细胞与微环境相互作用的分子(图。3b，c，补充数据3).在MIF途径中，NB和干细胞是MIF的主要来源，主要通过该途径与干细胞、髓样细胞、B细胞和浆细胞样树突状细胞交流，在较小程度上与NK和T细胞交流(图。三维（three dimension的缩写）).类似地，在MK途径中，NB细胞主要驱动与红系细胞、干细胞和NK细胞的交流，其次是浆细胞样树突状细胞和髓样细胞，以及在较小程度上与B细胞和T细胞的交流(图。3e).此外，我们的数据显示，虽然肿瘤衍生的MIF主要以旁分泌方式作用于BM微环境，但MK也以自分泌方式作用于NB细胞(图。3d，e，补充图。3a，b).我们观察到NB和髓样细胞之间的主要串扰，其中MIF信号主要由CXCR4、CD44和CD74介导(图。3b，cf)，而MK信号主要通过MDK-NCL和MDK-LRP1对介导(图。3b，c，g)。与对照组相比，MIF和MK在NB肿瘤和细胞系中的蛋白水平也上调，并且受体在静息和活化的单核细胞上表达较高(图。3h，我).为了在实验上测试NB与骨髓细胞的相互作用，我们测量了NB细胞系、外周血单核细胞(PBMC)以及NB细胞与PBMC共培养物的上清液中MIF和MK蛋白的分泌水平，无论是直接接触还是通过跨膜。NB细胞系和PBMC对照之间的MIF水平相当，然而，直接共培养导致MIF蛋白分泌水平升高，这是细胞-细胞接触依赖性的(图。3j).与单独的PBMC培养物相比，NB共培养物中的MK水平更高(图。3j).细胞表面受体CD44、CD74、CXCR4、LRP1和NCL的表达通过流式细胞术在CD14+ CD16+和CD14-CD16+骨髓细胞以及GD2+ NB细胞中测定。所有受体在CD14+ CD16+ PBMC群体中都很高，并且在对照组(PBMCs)和共培养环境(直接和跨孔)之间有显著差异(图。3k).在CD14 CD16+人群中，这些受体的表达很低或不存在，并且在共培养中没有表现出显著差异(图。3k).与所有其他人群相比，CXCR4和NCL的表达仅在NB细胞(CD45 GD2+)中最高，这与以前的报道一致51,52。此外，与对照细胞相比，共培养细胞中CD44和LRP1的表达更高(图。3k).总之，我们的数据表明NB细胞主要通过旁分泌MK和MIF与BM龛中的CD14+ CD16+髓样细胞相互作用，这些相互作用分别由CD44、CD74、CXCR4和LRP1、NCL受体介导。

a转移性NB细胞与BM微环境的配体-受体相互作用的数量。b每个配体-受体对整个通讯网络的相对贡献。c配体-受体对及其在每种细胞类型相互作用中的相对通讯分数。d, e基于分别计算的MIF和MK信号网络的四个网络中心性测量，每个细胞类型的相对重要性。f, g个体患者中分别参与MIF和MK途径的配体和受体的RNA表达水平。h–i神经节细胞瘤中MIF和MK的无标记蛋白定量(GNM，n= 6个生物学上独立的样本)、原发性NB肿瘤(NB-TU，n= 3个生物学上独立的样本)、人类间充质干细胞(hMSC，n= 3个独立实验)，以及NB细胞系(n= 3个生物学上独立的样本)，以及用LPS刺激的原代单核细胞中的CD44、CD74、LRP1和NCL(n= 3个独立实验)和相应的对照(n= 3个独立实验)。数据服从双尾不成对学生的t测试MIF (GNM对NB-TU，p= 0.46，hMSC对NB-CL，p= 0.0025)和MK (GNM对NB-TU，p= 0.0005，hMSC对NB-CL，p= 0.0022)或双尾配对学生的t测试(CD44、p= 0.022;CD74，p= 0.027;LRP1，p= 0.017;NCL，p= 0.23).j通过ELISA测定的CLB-马的细胞培养上清液中MIF和MK的分泌水平(nPBMCs的4个独立实验，n=所有其他条件下的5次独立实验)和CHLA90(nPBMCs的2个独立实验，n=所有其他条件下的3次独立实验)。k细胞表面蛋白CD44、CD74、CXCR4、LRP1和细胞内受体NCL的平均荧光强度(MFI ),通过流式细胞术在NB细胞中测定，直接与PBMCs或通过trans-well共培养3天。针对GD2+ CD45、CD14+ CD16+和CD14-CD16+群体对细胞进行门控(n= 3个独立实验)。数据(j–k)进行单向方差分析，并使用Dunnett的事后检验进行多重比较。星号表示与对照组(PBMC或CLB-马)相比的静态显著变化p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. Data are presented as mean ± standard error of the mean (h–k).源数据作为源数据文件提供。

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骨髓转移性神经母细胞瘤患者的免疫细胞动力学

为了评估NB肿瘤浸润对BM微环境的影响，我们接下来研究了MNA中BM微环境的组成，ATRX傻瓜和偶发性NB。首先，我们评估了细胞类型丰度的变化，结果显示与对照组相比，NB转移中T细胞和NK细胞富集，B细胞和髓样细胞减少。其他细胞类型在NB患者和对照组之间表现出微小差异(图。4a，补充图。4a).第二，基因表达分析显示，与对照组相比，转移性NB的基因表达总体下调，这在除髓细胞外的所有细胞类型中都很明显(补充图。4b，补充数据4).相关性分析表明，在整个不同的BM微环境中细胞群落发生类似的变化ATRX傻瓜而MNA亚型中的微环境细胞是不同的(图。4b)，这种模式让人想起在转移性NB细胞中观察到的相关性(图。2c).基因集合富集分析揭示了几种炎症相关途径的富集，包括TNFα和INFγ信号传导，以及相关基因的上调，例如，NFKB1, IL1B, SOD2, 人类白细胞抗原，以及HLA-DR在所有亚组中(图。4c，d).这些变化主要发生在B细胞和髓细胞，代表典型的M1样特征。相反，调节细胞周期和增殖的E2F和MYC靶，以及它们的相关基因，PCNA, MKI67，以及CDK4被耗尽/下调。此外，髓样细胞的特征是缺氧和上皮细胞向间质细胞的转变(图。4c，d，补充图。4c，补充数据5)，表明M2样表型53，其传达早期肿瘤进展、侵袭性和对化疗的抗性54。通过亚聚类成CD14+经典和CD16+非经典单核细胞、髓样树突状细胞和其他髓样细胞，对髓样亚群的进一步研究揭示了上述途径在髓样亚型中表现出相似的趋势(补充图。5a–c，补充数据6).对照组和NB之间的差异，以及NB亚型之间的差异，在CD14+ CD16单核细胞中最为显著，以典型M1(CXCL2)和M2(CD163, TIMP1，以及EREG)标记，然而，缺乏关键巨噬细胞标记的表达(补充图。5b–f，补充数据7).来自显示M1和M2表型的原代单核细胞和细胞系的蛋白质组数据证实，骨髓转移相关单核细胞显示M1(nfk B1、IL1B、SOD2水平升高)和M2(PCNA、MCM5水平低)特征(图。4e，补充图。5f).与对照骨髓相比，使用多重成像对患者骨髓转移的进一步表征显示CD14 (TLR4结合LPS)和β1整合素CD29的水平更高，介导单核细胞的侵袭(图。4f).有趣的是，我们注意到当NB细胞存在时，MHC类和II类成员(HLA-A和HLA-DR)的蛋白水平较低(图。第四代移动通信技术).NB细胞与PBMCs的培养实验表明，在CD45+群体中，与NB细胞直接共培养的单核细胞显著分泌炎性M1细胞因子、INFγ、TNFα、IL-1β和M2细胞因子、IL-10和TGFβ以及CD163+CD86dim表型，与M2样培养物(用IL-4和IL-10刺激)一致。这与M1样培养(用IFNγ和LPS刺激)形成鲜明对比，后者主要表现出CD 163 dim CD 86高表型。此外，通过trans-well与NB细胞共培养的单核细胞表现出CD14+ CD16+群体比例的增加，然而，再次表现出以CD163更高表达为标志的M2样表型(图。4h–j).最后，MHC类和II类标记物的表达水平显示，与NB细胞共培养的总体PBMCs显示出与M2样条件下相似的水平(图。4j).这些数据强调了一种BM转移相关单核细胞，它由NB分泌因子诱导，在较小程度上由细胞间接触诱导，促进肿瘤炎症、促有丝分裂和侵袭信号。

aNB亚型中的细胞类型丰度(n= 4名、2名和5名患者MYCN放大了，ATRX傻瓜和偶发性)，与对照相比(n= 5名患者)。bNB患者与对照组NB亚型BM微环境细胞类型基因表达变化的相关性分析。c使用MSigDB Hallmark 2020数据库进行基因集合富集分析，根据基因相对于对照组表达的对数倍数变化对基因进行分类。p-数值基于在R包fgsea中实施的自适应多级分割蒙特卡罗方案。d在我们的患者队列中，针对在中确定的前两个富集/耗尽途径的示例性基因的表达c. e中确定的目标的无标记蛋白质定量d在U937细胞中(n= 3个独立实验)。f, g单核细胞和巨噬细胞中的蛋白质表达来源于无no的神经母细胞瘤BM样品的多重图像(对照，C，n= 3名患者)和高(> 200个细胞，n= 5名患者)NB细胞浸润。比例尺，45 m，Wilcoxon–Mann–Whitney，带FDR校正p-值:ns不重要，**p≤ 0.01, ***p≤ 0.001.h与PBMCs共培养的NB细胞中M1和M2标记物的分泌水平(n= 2个独立实验)。i在共培养的NB细胞和PBMC中的NB细胞和CD45+群体的代表性FACS图，对照，以及在第3天被诱导获得M1或M2表型的PBMC。jCD45+、CD14+ CD16+和CD14dim CD16dim群体中表达M1标记、CD86或M2标记、CD163的细胞百分比(%)，以及MHC类和II类标记的百分比和MFI(n= 3个独立实验)。圆点表示原始数据(a, g)和方框显示中间值和25%和75%四分位数；胡须延伸到1.5倍四分位范围内的最大值。数据服从双尾配对学生的t测试(e)或单向方差分析(j与对照组(PBMC或马萨诸塞州CLB)相比)，并使用Dunnett的事后检验进行多重比较。星号表示静态显著变化，*号p < 0.05, **p < 0.01, ***p  <  0.001. Data are presented as mean ± standard error of the mean (j).源数据作为源数据文件提供。

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神经母细胞瘤骨髓转移小生境中的染色质景观和异质性

为了研究与BM转移中表现出的细胞类型特异性基因表达相关的潜在染色质调节，我们在相同的匹配患者样本集中进行了scATAC-seq(n= 16).scATAC-seq数据中指定的细胞类型(图5a)与scRNA-seq数据中鉴定的细胞类型一致(图。1b和补充图。6a).为了证实scATAC-seq数据的细胞类型分配，我们研究了每种细胞类型中细胞类型特异性标记集和谱系特异性转录因子(TF)基序的可及性(补充图。6b).与对照组相比，NB患者骨髓细胞中受影响途径相关基因的scATAC-和scRNA-seq数据的整合(图。4c)揭示了MYC和E2F靶基因表达的缺失主要与闭合染色质相关。有趣的是，TNFα和IFNγ途径相关基因表达的增加并不总是等同于开放染色质(图。5b，补充图。7a)，这可能部分归因于峰定位。NFKB1 (TNFα途径)和KDM2B (E2F靶点)的基因组浏览器追踪突出了NB患者和对照组在骨髓腔室中染色质可及性的差异(图。5c).我们通过模体富集分析来推断TF的活性，以进一步分层近端和远端区域可及染色质的组织如何与这些染色质结合蛋白协同作用。这表明介导TNFα刺激作用的NFκB-p65位于远端启动子区，而不是近端启动子区(图。5d)，在一定程度上解释了TNFα途径中scRNA-seq和scATAC-seq数据之间缺乏相关性(图。5b).此外，我们观察到STAT3激活，作用于M2细胞因子IL-10的下游，后者在BM转移中以上调为标志(补充图。7b，c).类似地，与单独的NB细胞或PBMCs相比，NB细胞与PBMCs的共培养导致在直接和跨孔条件下分泌的IL-10水平更高(补充图。7d).高IL-10可能拮抗M1细胞因子IFNγ/STAT1信号55并解释了BM转移相关单核细胞中M1和M2特征的共现。此外，无论NB亚型如何，髓样细胞在启动子和远端区域都表现出对属于Fos (Fos，Fosl2，Fra1/2)和Jun (JunB)家族的AP-1基序及其二聚体的可及性，而NFκB和Bach1基序仅在远端区域可及。AP-1是驱动早期髓系分化的核心因子，据报道在许多恶性肿瘤中其表达失控56。参与骨髓细胞生成和分化调节的其他关键TF的基序，如PU.1和干扰素应答因子，如IRF156在近端和远端区域都以抑制性染色质为标志(图。5d).TF足迹分析也证实，与对照骨髓相比，NB转移的骨髓细胞中这些TF占据的区域富集(图。5e)，表明骨髓单核细胞通过髓系定向和单核细胞活化的关键TF模块重新编程。此外，网络分析将这些关键的TF模块与M2极化、肿瘤生长和转移相关的基因中的开放染色质区域联系起来，包括白介素-10, TIMP1，以及EREG(补充图8–10).因此，scATAC-seq与scRNA-seq的整合将表观遗传学调节的骨髓-单核细胞谱系定型和极化与由肿瘤细胞提供的外部信号引起的转录变化联系起来。

aNB和BM细胞类型的scATAC-seq图谱的UMAP投影。点表示单个细胞，而颜色表示细胞类型的同一性。bTNFα途径和E2F靶基因的scRNA-seq和scATAC-seq对数倍数变化散点图。c与对照组相比，NFKB1和KDM2B基因座的代表性测序轨迹显示NB亚型中不同的假大量ATAC-序列峰。ATAC序列数据已经用Signac标准化60并且选择y轴上的刻度以最佳显示每个样品的峰。d描绘比值比和调整的点图p-NB亚型之间的启动子和远端区域中基序富集的值(用HOMER中实施的超几何统计测试计算(n= 4名、2名和5名患者MYCN放大了，ATRX傻瓜和零星的)与对照样品(n= 5名患者)。e足迹分析推断的NB亚型之间个体TF活性结合的差异，其中置信区间代表该组患者之间的差异。源数据作为源数据文件提供。

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我们展示了NB中人类骨髓转移的单细胞转录组和成对染色质可及性图谱。我们发现，尽管突变状态在所有NB亚型中区分健康细胞和癌细胞，但基因表达区分原发性肿瘤和转移性肿瘤ATRX傻瓜和散发性NB亚型，而这种差异在MNA肿瘤中是微不足道的。此外，转移性肿瘤与骨髓中免疫成分的扭曲有关，特别是骨髓细胞。NB细胞通过MK和MIF途径向髓系细胞发出信号，并促进炎症环境，传递肿瘤相关的单核细胞表型，这归因于髓系定向和单核细胞极化的关键信号/转录因子模块的重新布线(图。6).总的来说，这些数据提供了对所有亚组中NB的分子和细胞结构的见解，并为针对肿瘤-髓细胞相互作用的治疗方法提供了基础。

该图描述了骨髓腔室中NB和髓样细胞之间的相互作用，其通过MIF(巨噬细胞移动抑制因子)和MK(中期因子)途径介导。m，MYCN放大了；一，ATRX傻瓜；s，零星。

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对原发性NB细胞起源的研究表明，在低风险NB中，肿瘤细胞类似于正常的交感神经母细胞，而高风险NB的标志是嗜铬样细胞及其祖细胞(施万细胞前体)的存在，以及具有间充质特征的细胞的存在19,20,21,23。我们对肾上腺髓质、原发性NB肿瘤和BM转移瘤的分析确定了神经母细胞、循环神经母细胞和桥细胞是MNA肿瘤中的细胞相关细胞，而非MNA肿瘤的定义是晚期神经母细胞和嗜铬样细胞的存在。这表明NB细胞在转移时保持其表型特征，并且细胞类型组成主要由NB亚型决定。在转录和表观遗传学上，NB细胞被定义为未分化的间充质细胞和定向肾上腺素能细胞48,49。在体外治疗中观察到从肾上腺素能到更未分化和耐药的间充质或NCC样表型的可塑性，此外，后者在预处理和复发的原发性肿瘤中富集48,49。我们的数据主要显示了去甲肾上腺素能和肾上腺素能谱，除了嗜铬细胞样和SCP基因标记，我们没有在转移性NB细胞中检测到明显的间充质或NCC样基因标记，尽管这些在其他细胞类型中也存在。最近的研究报道了具有间充质样基因标记的细胞在外周神经母细胞瘤和患者来源的异种移植小鼠模型中的存在57,58。未来的研究将显示这些细胞转变是否依赖于细胞内在或其他外在因素，并研究它们的临床相关性。

髓样细胞浸润已在各种肿瘤中报道，并与不良临床结果相关59但是NB中关于它们在患者预后中的作用的报道是不一致的。先前对NB的研究表明，巨噬细胞浸润的增加与不良临床结果呈负相关30,31,32,33,34。然而，最近一项采用scRNA-seq研究原发性NB中骨髓细胞群异质性的研究表明，各种骨髓细胞群与促炎细胞状态呈正相关，并提高了患者存活率37。我们对原发性NB中肿瘤微环境理解的这些最新进展为抗GD2免疫疗法的发展铺平了道路，该疗法目前与高危NB中的常规治疗一起施用60,61,62。在这里，我们报道了转移小生境中髓样细胞的减少，这与NB亚群无关。肿瘤细胞与BM微环境的相互作用包括通过MIF/CD44/CD74/CXCR4和MK/LRP1/NCL轴与骨髓细胞的优先通讯。单核细胞呈现M1和M2特征，表现为异常的促炎和抗炎核心TF调节环、促分化、细胞周期基因减少以及肿瘤和转移促进因子如TIMP1和EREG的表达63,64(图。6).已经描述了MK在生理条件下的作用，如发育和生殖，以及在病理条件下如黑色素瘤，其中MK的过表达通过促进免疫抑制性骨髓细胞分化以及将骨髓细胞募集到肿瘤部位而导致免疫治疗抗性65。类似地，MIF与肿瘤相关巨噬细胞的炎症和肿瘤促进功能有关。此外，MIF表达在低分化NB中更高，这导致这些肿瘤中MYCN表达增加66,67。近年来，这项研究中鉴定的受体作为各种肿瘤的新兴治疗靶点受到了广泛的研究。事实上，抗MIF的小分子抑制剂和抗体以及抗CD74抗体-药物-缀合物目前正处于自身免疫性疾病和白血病的I期试验中68.

总之，我们的工作提供了一个跨越所有亚组的NB细胞图谱，它定义了每个NB亚组的细胞状态，解开了肿瘤内和肿瘤间异质性的决定因素。重要的是，我们研究中鉴定的配体/受体对在正常和疾病环境中发挥多效性作用，并通过破坏肿瘤-微环境通讯或骨髓转移小生境中单核细胞极化提供治疗机会的分子靶点。