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ATR激酶通过防止复制资源耗尽来支持早期S期的正常增殖

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发表时间：2023-06-28 11:00作者：武汉新启迪Xinqidibio

摘要

ATR激酶协调细胞对DNA复制应激的反应，对于正常无应激细胞的增殖也是必不可少的。尽管ATR在复制应激反应中的作用已被很好地确定，但ATR支持正常细胞增殖的机制仍不清楚。在这里，我们表明ATR对于G0停滞的幼稚B细胞的生存能力是可有可无的。然而，在细胞因子诱导的增殖中，Atr缺陷型B细胞有效地启动了DNA复制，但是到了S中期，它们表现出dNTP耗竭、分叉停滞和复制失败。尽管如此，Atr缺陷细胞中生产性DNA复制和dNTP水平可以通过抑制起点放电来恢复，如部分抑制CDC7和CDK1激酶活性。总的来说，这些发现表明ATR通过在S期早期调节起点放电的速度来支持正常无应激细胞的增殖，以避免dNTPs和重要的其他复制因子的耗竭。

介绍

共济失调毛细血管扩张症和Rad3相关(ATR)激酶是PI3K相关蛋白激酶(PI3KK)家族的一员，该家族还包括共济失调毛细血管扩张症突变(ATM)和DNA依赖蛋白激酶(DNA-PK)1。这三种PI3KKs通过磷酸化多种介导适当细胞结果的底物，如DNA修复、细胞周期停滞和/或细胞死亡，共同协调哺乳动物DNA损伤反应(DDR)。当ATM和DNA-PK被DNA双链断裂(DSB)酶促激活时，ATR主要被产生单链DNA (ssDNA)结构的复制应激所诱导。因为肿瘤细胞通常表现出高水平的复制应激2ATR的药物抑制剂目前正被开发为潜在的癌症治疗药物。有趣的是，在这三种PI3KKs中，只有ATR是动物发育和非应激细胞正常增殖所必需的，这意味着ATR除了在DDR中的关键作用外，还具有重要的功能3,4,5。然而，尽管在阐明其DDR功能方面取得了广泛的进展，我们仍然不明白ATR如何在没有遗传毒性应激的情况下支持复制，以及它是否通过与其DDR活性相关的机制来支持复制。随着最近关于ATR抑制剂临床试验中正常组织毒性的报道，这个问题变得更加紧迫，这可能反映了它们对非转化细胞的基本ATR功能的影响6.

在酵母Mec1中，ATR直向同源物南酿酒酵母也是正常细胞增殖和复制应激的DDR所必需的。有趣的是，在无应激的增殖细胞中，Mec1（同antitransmit-receive）反收发当脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)水平变得不足以支持DNA复制时，通过自发产生的复制应激在早期S期短暂激活7。激活的Mec1（同antitransmit-receive）反收发进而诱导涉及Rad53的激酶级联CHK1和促进Sml1降解的Dun1激酶，SML 1是核糖核苷酸还原酶(RNR)的负性调节因子，允许dNTPs的从头产生和持续的DNA复制8,9。事实上，Mec1缺陷型酵母的生长可以通过删除Sml1来挽救，建立Sml1调节作为一个必要的Mec1（同antitransmit-receive）反收发正常DNA复制的功能10。值得注意的是，ATR也与RNR对复制应激反应的转录上调有关11。然而，在哺乳动物中尚未发现Sml1和Dun1的功能性直向同源物，使得ATR在哺乳动物细胞正常复制中的重要作用仍未解决。

在复制应激时，ATR激酶和它的必需伴侣ATR相互作用蛋白(ATRIP)被DSB末端切除或干扰DNA复制的各种过程(如R环形成、脆性位点表达)产生的RPA包被的ssDNA丝募集并激活11,12,13,14,15,16。ATR激酶的完全激活也需要它与TOPBP1或ETAA1蛋白结合17,18,19,20。应激激活的ATR磷酸化许多底物，包括其效应激酶CHK1，进而引发适当的细胞反应，包括抑制休眠复制起点的启动21诱导细胞周期停滞在S/G2期22和G2/M转换23,24稳定停滞的复制分叉25,26，以及DNA复制的最终重启3。然而，我们不知道这些应激诱导的途径是否也介导ATR在非应激细胞增殖中的基本功能。

ATR基本功能的研究在技术上具有挑战性，特别是考虑到ATR蛋白的长半衰期(> 24小时)27。然而，长期处于细胞周期G0期的体细胞，如外周淋巴细胞，应该提供一个合适的遗传平台来检测ATR生物学的这些方面。在这里，我们使用淋巴细胞的发育和活化作为模型系统来研究ATR在正常复制中的重要生理作用。发育中的B淋巴细胞在成功装配Ig重链之后和装配其Ig轻链基因之前经历几轮增殖，之后淋巴细胞迁移到次级淋巴器官(例如脾和淋巴结)，在那里它们保持静止数月或数年。不同于组织培养细胞，其经历连续生长而没有明显的G0期，外周淋巴细胞驻留在G0期。在抗原暴露和细胞因子刺激下，淋巴细胞需要大约24小时进入第一轮DNA复制，然后在接下来的2-3天内复制4-8次28，提供同步的和明确定义的G0-G1-S相变，在没有外部复制应力的情况下研究ATR功能。使用发育阶段特异性Cre和条件性ATR等位基因，我们发现虽然ATR对于DNA复制的启动和维持是不可或缺的，但它需要防止复制因子的耗竭，包括早期S期的核苷酸。与Mec1的效果不同（同antitransmit-receive）反收发酵母中的缺失，ATR缺陷淋巴细胞中的核苷酸短缺是由细胞dNTP库的过度使用而不是有限的dNTP产生引起的。根据这些结果，ATR缺陷B细胞的dNTP水平、细胞周期进程和复制叉相关的表型可以通过部分抑制新的起点触发的治疗来挽救，例如抑制CDC7和CDK1激酶活性。总之，这些数据表明ATR通过平衡DNA复制的速度和复制资源的可用性来促进正常增殖，提供了ATR激酶抑制剂正常组织毒性的潜在机制。

结果

ATR对于早期B细胞的发育是必不可少的，对于幼稚B细胞是不可缺少的

为了分析ATR在正常原代细胞中的作用，我们灭活了（同antitransmit-receive）反收发基因使用Mb1贷方（即credit） (CD79a)，其在克隆扩增和轻链基因重排之前在前B细胞中表达Cre重组酶29，或者CD21-Cre，其在成功的轻链基因重排和表面IgM表达后在幼稚B细胞中表达Cre重组酶30(补充图1a).Cre阳性（同antitransmit-receive）反收发+/C包括小鼠作为对照，以确保观察到的表型确实是由Atr失活引起的，而不是由Cre介导的切除引起的Cre重组酶表达或DNA损伤。当控制Mb1+/Cre （同antitransmit-receive）反收发+/C小鼠经历正常的B细胞发育，骨髓和脾脏中的幼稚B细胞(B220+IgM +)的百分比显著降低Mb1+/Cre（同antitransmit-receive）反收发由…转交和Mb1+/Cre（同antitransmit-receive）反收发C/KD老鼠。假定在B细胞中Atr的限制性缺失，而在T细胞或其他造血细胞中没有Mb1+/Cre小鼠，这些结果表明ATR在B细胞发育中的重要作用，可能是Ig轻链重排前的增殖和克隆扩增(图。1a、b)4。相反，当成功的免疫球蛋白轻链装配后，Atr DNA和蛋白质的丢失仅限于幼稚B细胞，如CD21-Cre+（同antitransmit-receive）反收发由…转交和CD21-Cre+（同antitransmit-receive）反收发C/KD小鼠(补充图。1b)，B220 + B细胞的频率和计数在所有随后的发育阶段保持正常，表明ATR蛋白及其激酶活性对于静止的幼稚B细胞的生存是不可或缺的(图。1a–c)4.

抗原暴露后，幼稚B细胞退出G0，快速增殖，并经历高类别转换重组(CSR)以产生具有不同效应子功能的抗体31。这一过程可以用细胞因子混合物在纯化的脾B细胞中模拟，提供了一个系统来研究ATR在原代细胞正常增殖中的重要作用。具体来说，IL-4和抗CD40激活幼稚B细胞，并启动针对IgG1(第4天约30% IgG1+)和IgE的强CSR。然而，Atr缺陷的B细胞CD21-Cre+（同antitransmit-receive）反收发由…转交和CD21-Cre+（同antitransmit-receive）反收发C/KD小鼠对IgG1的CSR下降了约50%(图。1d，e)以及在第2天后，由于膜联蛋白-V或PI染色阳性所指示的同时发生的细胞凋亡而导致的生存力的大量丧失(补充图。1c–f).CSR降低可能是由DNA末端连接缺陷、不良增殖或两者共同造成的。为了确定ATR是否在CSR的末端连接阶段起作用，我们使用高通量全基因组易位测序(HTGTS)分析了CSR连接32。而从非同源末端连接(NHEJ)缺陷型B细胞中回收的连接(例如DNA-PKcs-/-，Xrcc4-/-)显示广泛切除和优先使用微同源性33,34,35，交叉点自CD21-Cre+（同antitransmit-receive）反收发由…转交和CD21-Cre+（同antitransmit-receive）反收发C/KDb细胞与从对照中回收的细胞没有区别CD21-Cre+（同antitransmit-receive）反收发+/Cb细胞(补充图。1g–I)36。尽管如此，激活的细胞增殖CD21-Cre+（同antitransmit-receive）反收发由…转交和CD21-Cre+（同antitransmit-receive）反收发C/KDb细胞严重受损(图。1d)，暗示着（同antitransmit-receive）反收发通过确保有效增殖来支持B细胞CSR。为了确定Atr在B细胞活化中的生理影响，我们检测了生发中心的形成，在T细胞的帮助下，B细胞在抗原暴露后扩张并成熟37。因此，生发中心B细胞(CD95+和GL7 + B细胞)代表最活跃的增殖B细胞。与年龄匹配的相比CD21-Cre+（同antitransmit-receive）反收发+/C对照小鼠21-中铁快运+（同antitransmit-receive）反收发由…转交在免疫前后，小鼠具有降低的生发中心B细胞频率(在所有脾B细胞中)和较少的生发中心(Bcl6染色阳性，生发中心标记物)(图。1f，g)，表明体内受损的B细胞克隆扩增。为了了解ATR在G0的初级B细胞中的作用是否在转化的B细胞中也是保守的，我们产生了携带三苯氧胺诱导的v-abl激酶转化的B细胞系罗萨ER-CreT2（同antitransmit-receive）反收发+/C或者罗萨ER-CreT2（同antitransmit-receive）反收发C/KO等位基因。迅速激活他莫昔芬的添加（同antitransmit-receive）反收发删除，并导致一个延迟和更温和的生活力下降罗萨ER-CreT2（同antitransmit-receive）反收发C/KO转化的B细胞(补充图。1j，k)，强调了ATR在G0停滞的原代细胞中启动增殖的一致且潜在更显著的作用。

ATR激酶的活性对于生产性DNA复制至关重要

为了理解Atr如何支持原代B细胞的增殖，我们分析了细胞因子刺激后48小时的细胞周期进程，此时ATR缺乏尚未严重影响细胞的生存能力(补充图。1c–f).在用BrdU脉冲标记(30分钟)后，中期-S期(通过PI染色测定)对照< 5%CD21-Cre+（同antitransmit-receive）反收发+/Cb细胞为BrdU阴性(BrdU-)。相比之下，大约一半的中期阶段CD21-Cre+（同antitransmit-receive）反收发由…转交和CD21-Cre+（同antitransmit-receive）反收发C/KD细胞是BrdU-(图。2a)并在刺激后72和96小时保持不变(补充图。2a，b).在他莫昔芬诱导ATR缺失后4天，在转化的B细胞中观察到类似的表型，但程度较低(补充图。1j).我们推断，与从G0进入细胞周期的原代B细胞相比，继续培养的B细胞系可能具有更多的核苷酸储备和复制因子。BrdU整合入基因组的显著缺失与大规模分叉停滞一致。事实上，DNA纤维分析揭示了在复制中IdU轨道长度的严重减少CD21-Cre+（同antitransmit-receive）反收发由…转交和CD21-Cre+（同antitransmit-receive）反收发C/KD细胞(图2b和补充图。2c).此外，CD21-Cre+（同antitransmit-receive）反收发由…转交细胞显示不对称分叉显著增加(补充图。2d)，这与以前报道的CHK1抑制剂处理的细胞中复制阻断或屏障的存在一致38。通过流式细胞仪测量，这些细胞也显示大量的γH2AX信号(图。2c)和碱性彗星试验中DNA断裂的增加(图。2d)，与fork塌陷一致，以及以KAP1和RPA的超磷酸化为特征的强有力的DNA损伤反应(图。2e).用端粒探针进行FISH分析，有助于识别小鼠短染色体中的染色体断裂39揭示了断裂和脆弱端粒的适度增加CD21-Cre+（同antitransmit-receive）反收发由…转交或者CD21-Cre+（同antitransmit-receive）反收发C/KDCSR D3处的b细胞(补充图。2f).然而，由于分析是在中期制备物上进行的，并且存在明显的S期进展缺陷Atr缺陷型b细胞(图。2a)，我们推断染色体断裂和端粒不稳定性在CD21-Cre+（同antitransmit-receive）反收发由…转交或者CD21-Cre+（同antitransmit-receive）反收发C/KDb细胞。最后，与对照组不同的是CD21-Cre+（同antitransmit-receive）反收发+/Cb细胞，CD21-Cre+（同antitransmit-receive）反收发由…转交或者CD21-Cre+（同antitransmit-receive）反收发C/KDb细胞缺乏磷酸化的CHK1，与ATR激酶活性的缺乏一致。假设小鼠细胞的DNA-PKcs蛋白水平比人类细胞低50倍40这可能解释了为什么我们没有看到任何DNA-PK介导的CHK1的补偿性磷酸化11如在用ATR抑制剂处理的人类癌细胞中所报道的。总的来说，表型CD21-Cre+（同antitransmit-receive）反收发由…转交和CD21-Cre+（同antitransmit-receive）反收发C/KD细胞无法区分，表明ATR的激酶活性是增殖所必需的。

ATR激酶活性在S期早期是必需的，以支持生产性复制

为了确定B细胞增殖的哪个阶段需要Atr激酶活性，我们在细胞因子刺激后的不同时间点用ATR激酶抑制剂(ATRi) VE-821处理ATR熟练的B细胞，然后在中期-S期(刺激后48小时)测量BrdU掺入。虽然在刺激开始时(时间零点)的ATRi处理(5微米)消除了BrdU掺入，但是在刺激后46小时的ATRi处理(在BrdU标记之前和期间仅2小时)，甚至在更高的浓度(10 M)下，对BrdU掺入没有影响(图。2f).该数据表明，进行中的S期细胞不需要ATR激酶活性来进行生产性复制。相反，ATR是S中期之前无应激细胞正常增殖所必需的，无论是在G1/S转变期还是在早期S期。这与ATR在复制应激反应中的作用形成鲜明对比，在复制应激反应中，在DNA损伤后需要ATR活性(例如。、HU或顺铂)14。此外，这种BrdU阴性表型是由ATR抑制特异性引发的(图。2f)，因为在用充分表征的商业抑制剂抑制ATM (KU55933)或DNA-PKcs (NU7441)或暴露于低剂量羟基脲(HU，20 M)时未观察到这种现象，已知羟基脲可诱导强ATR激活，但仍允许S期进入(补充图。2g).高剂量的HU (2 mM)完全消除了B细胞复制和S期41(补充图2h).与这些发现一致的是，缺乏ATM的B细胞42,43,44或DNA-PKcs34,45,46没有显示出明显的扩散缺陷。最后，v-abl激酶转化了罗萨ER-CreT2（同antitransmit-receive）反收发C/KOb细胞也积累了BrdU阴性的S期细胞，表明这种表型在转化细胞中是一致的(补充图。1j).

为了排除在缺乏ATR的情况下第一轮复制产生的DNA损伤作为刺激后48小时BrdU阴性表型的原因，我们在B细胞进入其第一个S期的24小时进行了实验(补充图。3a).集中在第一个24小时也避免了激活诱导的脱氨酶(AID)的表达，这可能会引入额外的基因组不稳定性47,48。Atr缺陷的BrdU阳性细胞的百分比与Atr熟练的B细胞相似(图。3a，b)，表明Atr对于复制起始是可有可无的(补充图3a，b).但是，虽然约60%的BrdU+对照细胞具有中期和晚期S期和G2 DNA含量(通过PI染色测量)，但超过70%的BrdU+（同antitransmit-receive）反收发-缺陷淋巴细胞只有G1 DNA含量(图。3a，c)，表明缺乏生产性DNA复制。像在48小时，接近24小时S期的一半（同antitransmit-receive）反收发-缺陷淋巴细胞是BrdU阴性的(图。三维（three dimension的缩写）).此外，用ATRi处理的细胞以前s期发作，t= 0 h，并且t= 10小时时间点显示类似的早期S期停滞CD21-Cre+（同antitransmit-receive）反收发由…转交b细胞。相比之下，在第一个S期中期(激活后22小时，BrdU标记前2小时)用ATRi处理的细胞没有显示任何复制阻断或显著的BrdU阴性分数(补充图。3c)，表明正在进行的分叉不需要ATR激酶活性来立即支持。在24小时用BrdU进行脉冲追踪标记显示BrdU阳性CD21-Cre+（同antitransmit-receive）反收发+/C细胞通过G2和下一个G1。相比之下，BrdU+CD21-Cre+（同antitransmit-receive）反收发由…转交b细胞停滞不前，不能完成复制，至少24小时内不能返回G1，这种表型由激活时补充的心房肌复制(心房肌24小时后BrdU脉冲标记，然后用心房肌再追踪24小时，总心房肌0-48小时，蓝色箭头)。然而，当在S期后期加入ATRi(在激活后24小时短暂暴露于ATRi 30分钟后进行BrdU脉冲标记，然后在激活后24-48小时内用ATRi再追踪24小时，激活后24-48小时的总ATRi，红色箭头)或1小时后冲洗掉(在激活后24小时用ATR脉冲标记30分钟后追踪24小时而没有ATRi，绿色箭头)时，细胞作为对照细胞继续进行细胞周期(图。3e并在补充图中量化。三维（three dimension的缩写）).这一发现还表明，ATR激酶在进行中的S期是可分配的，并且似乎在生产性DNA复制开始之前更为关键——例如对于进入第一次复制的G0细胞。此外，早期S阶段CD21-Cre+（同antitransmit-receive）反收发由…转交和CD21-Cre+（同antitransmit-receive）反收发C/KD细胞对有丝分裂标记组蛋白H3 Ser10磷酸化呈阳性，表明CDK1过早激活(图。3f和补充图。3e).为了理解ATR缺陷细胞在S期早期非生产性DNA复制的原因，我们将细胞因子的加入时间定义为G0，因为纯化的B细胞是静止的。选择10小时时间点代表没有显著BrdU掺入的G1细胞(图。3g).在G1期，细胞已经启动氨基酸合成和核糖体生物发生，为增殖做准备(见下文，补充图。4一个和5a、b).奇怪的是，在静止期(记为G0，0 h)和G1 (10 h)中，通过碱性彗星试验检测到明显更多的DNA链断裂CD21-Cre+（同antitransmit-receive）反收发由…转交和（同antitransmit-receive）反收发C/KD单元格与CD21-Cre+（同antitransmit-receive）反收发+/C控制(图3h。刺激后10小时的中性彗星试验显示，至少一部分断裂是DSB(补充图。3f).在这方面，ATR与核苷切除修复有关，在某些特殊情况下可能被转录过程中产生的ssDNA激活1,27。同时，CHK1激酶在G0中检测不到，在G1中非常低(10小时)，并在24小时和48小时的S期积累和磷酸化(补充图。3g).此外，KAP1和RPA(ATM激活的两个标志)的过度磷酸化仅在Atr缺陷细胞激活24小时后才出现(补充图。3h).这些数据表明ATR在S期早期或之前保持基因组完整性以支持有效的DNA复制中的重要功能。

ATR激酶的缺失不影响S期转录程序

因为人类的复制表型CD21-Cre+（同antitransmit-receive）反收发由…转交和（同antitransmit-receive）反收发C/KD细胞是不可区分的，我们专注于CD21-Cre+（同antitransmit-receive）反收发由…转交细胞。首先，我们对刺激后0、10和24小时收集的样品进行了RNA-seq分析。基因本体论(GO)分析显示，ATR丰富细胞和ATR缺乏细胞的基因表达程序是相似的。从G0 (0小时)到G1 (10小时)，几个RNA相关的通路独立于Atr状态上调(补充图。4a).从G1期(10小时)到S期(24小时)，CD21-Cre+（同antitransmit-receive）反收发+/C和CD21-Cre+（同antitransmit-receive）反收发由…转交细胞上调参与DNA复制和染色体分离的基因(图。4a).重要的是，Atr-缺陷B细胞上调原始加载因子(例如。or C2–5)和S期的复制因子(例如，Mcm、Cdc、复制型聚合酶)的水平与对照相当CD21-Cre+（同antitransmit-receive）反收发+/C细胞(图4b).基因组富集分析(GSEA)也进一步证实CD21-Cre+（同antitransmit-receive）反收发由…转交细胞有效地启动与DNA复制相关的转录程序，表明ATR对于启动DNA复制是不可或缺的(补充图。4b).

代谢组分析和直接dNTP测量揭示Atr缺陷B细胞中选择性核苷和脱氧核糖核苷酸缺陷

在酵母中，ATR直向同源基因Mec1通过RNR的翻译后修饰在调节脱氧核糖核苷酸合成中起着关键作用8,9,49。为了了解哺乳动物ATR是否也调节核苷酸代谢以支持DNA复制，我们通过质谱分析了G0 (0小时)、G1 (10小时)和S (24小时)B期细胞中的极性代谢物50(图。5a).主成分分析(PCA)显示，在所有分析的样品中，G0、G1或S期B细胞可以清楚地区分(补充图。5a).途径影响分析显示，非必需氨基酸的积累、三羧酸(TCA)循环代谢物、糖酵解和糖异生是G0期细胞G1中最显著的变化(图。5b).同时，嘌呤和嘧啶代谢是G0和S之间增加最多的途径之一(图。5c).正如先前对T细胞的记载51，活化的B细胞先生成氨基酸，再生成核苷酸。TCA循环代谢物和氨基酸从G0到G1期的增加不受ATR状态的影响(补充图。5b).相比之下，在24小时(S期)ATR缺陷细胞中，多核苷酸前体和中间体(例如，核糖-磷酸、单磷酸核苷-IMP、AMP、GMP、UMP、CMP、二磷酸核苷IDP、ADP、GDP、UDP、CDP及其脱氧形式)明显低于对照组(图。5d)，表明核苷酸的选择性缺乏。然而，三磷酸核苷酸(如ATP、GTP和CTP)的丰度在Atr缺陷型细胞中略高，可能反映了使用缺陷或NMP和NDP过度转化为NTP形式。值得注意的是，由于核糖核苷酸水平比脱氧核糖核苷酸高数百倍，大量代谢组主要反映了核糖核苷酸的变化。为了了解DNA复制所需的dNTPs水平是否受到ATR缺陷的损害，我们使用先前描述的酶方法在体内测量了dNTPs52(图。5a).正如所料，dNTP水平在S期(24小时)对照细胞中急剧上升(补充图。5c).Atr缺陷显著降低了G1和S期细胞中所有四种dNTP水平(图。5e，f).此外，用ATRi处理的对照细胞也显示出显著的dNTP缺陷，其水平相当于CD21-Cre+ （同antitransmit-receive）反收发由…转交细胞(图5f).此外，与G1期和S期相比，静止期细胞中的dNTP水平非常低，并且在对照组和ATR缺陷型细胞之间相似(补充图。5d).最后，RNA-seq分析证实了核苷酸代谢基因表达的强有力的和可比较的激活。ATR缺陷型细胞(补充图。5e).与最近用ATR抑制剂处理T细胞的报道一致53，我们注意到在S期ATR缺陷型B细胞中RNR亚单位(Rrm1和Rrm2)的诱导有中度但无统计学意义的减少(补充图。5e，从~1.5倍到~1.3倍)。这种减少的意义将在后面进行测试和讨论。

图5:代谢组分析和直接dNTP测量揭示了选择性核苷和脱氧核糖核苷酸缺陷*（同antitransmit-receive）反收发*-缺乏B细胞。

脱氧核糖核苷不能挽救复制叉停滞，但能减轻ATR缺陷细胞的DNA损伤反应

淋巴细胞表达高水平的脱氧胞苷激酶(dCK ),可将脱氧核苷(dN)转化为脱氧核苷酸(dNTP ),从而绕过RNR。dCK的缺失特异性地阻断了B和T细胞的发育，而在其他器官中没有明显的表型54。利用这一点，我们试图通过向细胞补充脱氧核糖核苷(脱氧鸟苷、脱氧腺苷、脱氧胞苷和胸苷)来挽救B细胞中ATR缺陷的表型。dNTPs细胞内水平的直接测量证实了细胞的成功摄取和磷酸化(图。6a和补充图。6a)，使得dNTPs的水平现在在CD21-Cre+（同antitransmit-receive）反收发+/C和（同antitransmit-receive）反收发由…转交b细胞。然而，他们未能挽救ATR缺陷细胞的生存能力和CSR缺陷(补充图。6b).通过BrdU掺入测量DNA复制进程CD21-Cre+（同antitransmit-receive）反收发由…转交单独使用脱氧核糖核苷或补充额外的核糖核苷也没有改善b细胞(图。6b和补充图。6c).我们注意到平衡的核苷和脱氧核苷补充物不影响正常细胞的S期进程55，表明拯救B细胞复制的失败不能仅由核苷酸不平衡来解释53。总之，这些数据表明ATR在超过dNTPs和NTPs的水平上调节B淋巴细胞中的生产性DNA复制。在这种情况下，以前的研究也试图使用核苷(核糖形式)来挽救CHK1抑制剂治疗的人癌细胞的增殖，但失败了38。其他研究表明，在HU诱导的复制应激下，ATR抑制剂导致RPA耗竭14，提出了ATR缺陷细胞的一个额外的限速因子。

图6:在v-abl病毒转化的B细胞中补充脱氧核糖核苷和CRISPR-Cas9筛选的效果。

有趣的是，在刺激后10小时补充脱氧核糖核苷，尽管不能恢复复制叉，但减轻了ATR缺陷细胞的DNA损伤反应。事实上，在补充脱氧核糖核苷的情况下，KAP1、RPA和γH2AX的过度磷酸化都大大降低了CD21-Cre+（同antitransmit-receive）反收发由…转交细胞(图6c)，以及彗星试验检测到的DNA损伤累积(图。6d).拯救的程度与提供给培养物的脱氧核糖核苷的量正相关，支持了一个模型，其中核苷酸是ATR缺陷细胞中生产性DNA复制的许多限速因素之一。因此，核苷酸补充似乎是必要的，但不足以完全恢复生产性DNA复制。

在ATRi处理小鼠转化的B细胞中进行CRISPR-Cas9筛选

为了确定ATR介导其在正常细胞增殖中的基本功能的机制，我们研究了允许细胞在ATR抑制下存活的途径。因此，我们在暴露于高剂量(IC90)ATR抑制剂(VE-821用于两个独立筛选，AZD6738)的鼠B细胞中进行了慢病毒gRNA文库(18，424个小鼠基因)的无偏CRISPR-Cas9筛选。此外，由于ATR底物CHK1对正常细胞增殖同样重要23,56我们还使用CHK1抑制剂(LY2603618)进行了筛选(图。6e).与先前在低剂量心房颤动条件下进行的筛选(IC20)相反57,58，我们选择IC90 (90%杀伤)来模拟ATR的完全基因缺失，从而确定支持正常增殖中基本Atr功能的途径。使用FDR < 0.2作为截止值，随机命中出现在一个以上屏幕中的机会低于5%。以前的DNA损伤反应筛选，包括使用ATR抑制剂的筛选，在比较来自多个独立筛选的共同靶标时，也使用0.2的截止值57,58,59,60。用这个标准，57个gRNA靶向基因在ATRi或CHK1i处理的组中富集(与DMSO处理的对照组相比)。GO分析显示，大多数富集的基因涉及两种功能过程中的任何一种(图。6f，g和补充图。6d和补充数据1).一组由促进S/G2/M细胞周期转换和有丝分裂检查点的基因组成，如Cdc25a和Cdc25b。值得注意的是，这一组以前也在低剂量(IC20)抗ATRi筛选中观察到，该筛选旨在识别由ATR抑制诱导的新的遗传易感性。虽然这些筛选的预期结果是在心房肌治疗后被耗尽的gRNAs，但发现类似的一系列细胞周期转换和检查点基因被富集。有趣的是，第二组大得多的gRNAs代表了与复制起点启动的各个方面相关的基因，并且在我们的高剂量ATRi/CHKi筛选中独特地富集。这包括核心起点启动复合物中的基因(如Cdc45、Cdc7、Dbf4和Gins3)、参与晚期起点启动的染色质调节剂(Asf1b和Baz1a)和许可起点启动的转录因子(E2f2、Ccne2、Ccna2)。这些发现表明，Atr通过其抑制起点放电的能力支持正常的DNA复制，并且早期S期的过度起点放电是ATR缺陷B细胞表型的原因，包括核苷酸和其他复制因子的耗竭。

CDC7和CDK1的同时抑制拯救了ATR缺陷B细胞的DNA合成和核苷酸供应

如果Atr在S期早期的主要功能是防止过度的起点放电，那么通过部分抑制起点放电，有可能挽救Atr缺陷的原代B细胞中的DNA复制。事实上，以前在人类永生化或癌细胞中的几项研究表明，ATR和CHK1通过抵消CDC7或CDK1活性，在控制复制起始和起点启动中起作用38,61,62。考虑到origin firing的相关因子出现在我们的CRISPR存活筛选中，我们开始测试抑制origin firing是否可以在彻底删除ATR的原代细胞中恢复生产性复制。为此，我们研究了抑制CDC7(一种通过磷酸化MCM解旋酶促进起点放电的激酶)是否能挽救上述表型。因此，用CDC7激酶抑制剂(XL413)单独或与CDK1抑制剂RO-3306一起处理细胞。包括CDK1抑制剂是因为细胞周期蛋白A-CDK1复合物的过早激活促进了迟发性放电63，我们在Atr缺陷细胞中观察到CDK1下游的过早有丝分裂(图。3f和补充图。三维（three dimension的缩写）).虽然CDC7i单独治疗增强了BrdU标记强度（同antitransmit-receive）反收发-缺陷细胞，它不足以恢复生产性DNA复制，如通过增加的DNA含量所测量的(补充图。7a)，除非结合CDK1抑制(图。7a).值得注意的是，CDK1和CDC7抑制剂需要在DNA复制前添加——在G1 (10小时)以降低S期BrdU阴性频率CD21-Cre+Atr由…转交细胞和部分，但显着恢复有效的DNA复制中期和后期的S期(图。7a–c和补充图。7b，c).相应地，CDK1和CDC7双重抑制也降低了CD21-Cre+Atr由…转交细胞，包括磷酸化KAP1、磷酸化RPA和γH2AX(图。7d).此外，治疗减少了DNA链断裂(图。7e)和部分恢复的叉速(图。7f)在Atr缺陷型细胞。值得注意的是，CDK1和CDC7抑制剂也增加了叉子的速度精通Atr对照细胞，表明即使在ATR存在的情况下，单个复制叉的速度也受到同时启动的复制叉数量的限制。与过度消费作为核苷酸耗竭的原因相一致，dntp(dATP，dGTP，dTTP)CD21-Cre+Atr由…转交伴随CDC7i和CDK1i抑制，细胞也部分恢复(图。7g和补充图。7d).RNA-seq分析也揭示了DNA损伤反应和p53信号的显著减弱。CD21-Cre+Atr由…转交CDK1和CDC7抑制后的细胞(补充图。7e).因此，我们的数据表明，ATR通过隔离复制起点来防止复制蛋白和核苷酸的耗尽，从而促进活化淋巴细胞中的生产性DNA复制。因此，在具有有限残余起源的中期或晚期S期细胞中，ATR抑制不会阻止强有力的复制。

图7: CDC7和CDK1的同时抑制拯救了Atr缺陷B细胞中的生产性DNA合成和核苷酸供应。

讨论

关于ATR如何协调细胞对DNA复制应激的反应，现在已经知道很多，所述DNA复制应激是由人类癌细胞系中的各种基因毒素和活化的癌基因诱导的3。然而，在哺乳动物细胞未受干扰的DNA复制过程中，其基本作用的机制仍不清楚，部分原因是在培养中维持ATR缺陷型细胞的挑战。大多数哺乳动物的体细胞，包括外周淋巴细胞，处于静止的G0状态。在这里，我们表明，ATR的丢失在外周幼稚B细胞中耐受性良好，为研究ATR在正常复制中的基本功能提供了一个遗传模型。在细胞因子刺激下，脾幼稚B细胞有效退出G0，进行G1-S转换，并在S期早期开始DNA复制。使用这个系统，我们发现Atr-null或Atr-KD(激酶死亡)B细胞启动DNA复制并表达正常的S期转录组。然而，生产性DNA复制(由增加的总DNA含量定义)被中止，使得大约50%的中期-S期细胞在30分钟的标记期间不能掺入BrdU。这些Atr缺陷型细胞也显示出DNA损伤反应的标记，表明DNA复制叉的停滞和崩溃加剧。此外，由于无效和激酶死亡的ATR突变产生相似的复制缺陷，我们的结果表明Atr的激酶活性是生产性DNA复制所必需的。这一观点与我们以前的观察一致，即激酶失活的ATR能以显性负向方式抑制ssDNA上野生型ATR和RPA的动态交换，导致困难和晚期复制区域、核糖体DNA和端粒的复制应激64。重要的是，ATR缺陷细胞的复制缺陷可以通过在G1期间用药物ATR抑制剂治疗而在正常的Atr熟练B细胞中重现，但在S期中期/晚期不能重现，这表明Atr激酶活性对于正在进行的复制是不可或缺的，并且在G0阻止原代细胞进入细胞周期后的第一个早期S期是最重要的。在使用ATR激酶抑制剂或处于复制压力下的人类癌细胞中也报道了类似的表型。这种表型不是由其他损伤诱导型PI3KKs(即ATM或DNA-PK)的抑制剂产生的，突出了ATR在正常复制中的独特功能。总之，我们的发现表明，Atr激酶活性在正常哺乳动物细胞中生产性DNA复制的早期S期是特别需要的。这一要求似乎在从G0期进入细胞周期的初级细胞中最为突出，并且当资源有限时，对于第一个细胞周期尤为重要。

ATR在早期S期如何支持非应激哺乳动物细胞的DNA复制和增殖？有趣的是，对芽殖酵母的研究表明，G1细胞的稳态dNTP水平不足以支持G1/S转换后进行性DNA合成。然而，随着DNA复制的开始，酵母Mec1（同antitransmit-receive）反收发激酶被早期S期出现的ssDNA结构瞬时激活7。激活后，Mec1（同antitransmit-receive）反收发和它的下游效应激酶Rad53CHK1和Dun1，通过增加核糖核苷酸还原酶(RNR)的活性，主要通过降解RNR抑制剂Sml1，促进从头dNTP合成8,10。然而，由于在哺乳动物中尚未发现Sml1或Dun1的直向同源物，该途径不能解释Atr在哺乳动物细胞正常增殖中的基本功能。在这里，我们表明细胞因子诱导的Atr熟练B细胞的dNTP水平在G1/S转换时显著增加。在ATR缺陷细胞中，dNTP水平在G1/S转换时也增加，但在G1和S期都明显低于对照细胞。然而，尽管dNTP水平相对较低，ATR缺陷型B细胞仍能稳健地启动DNA复制，这可以通过早期S期BrdU掺入的强度和频率来衡量(图。3a和补充图。3a).然而，到中期阶段，这些细胞中大约有一半经历了复制叉的广泛停滞和崩溃。不像芽殖酵母7我们不能通过补充细胞dNTP水平来恢复Atr缺陷B细胞中的DNA复制。像其他人一样，我们也注意到RNR在Atr缺陷型细胞53。利用dCK的活动54在淋巴细胞中，我们用绕过RNR的dNs补充细胞，成功地增加了细胞中dNTP的浓度。补充dN未能恢复DNA复制，但显著减弱了DNA损伤反应。dN补充物的浓度不影响对照细胞中的复制，表明复制拯救的缺乏不能用来自补充物的核苷酸不平衡来解释。这些细胞的RNA-seq分析进一步证实，复制相关的转录程序被强烈诱导，并且核苷酸生物发生途径被正常表达。

我们无法通过有效增加细胞dNTP来挽救Atr缺陷B细胞中的DNA复制，这意味着这些细胞中额外的复制因子也是有限的。因此，为了确定克服这些缺陷的机制，我们使用近致死剂量的ATR和CHK1抑制剂进行了CRISPR-Cas9筛选。我们推断，这些因素，以及介导Atr的基本功能的潜在途径，在经历了严重的ATR/CHK1抑制的细胞中会得到增强。在这些筛选中，我们观察到两类不同基因的富集，一类由传统上与G2/M和纺锤体检查点相关的因子(如Cdc25a、Cdc25b)组成，另一类由涉及复制起始各方面的蛋白质组成，如下所述。值得注意的是，以前使用低剂量ATRi (IC20)进行CRISPR-Cas9筛选，以确定代表ATR抑制的遗传脆弱性的gRNA靶，因此可能作为基于ATRi的治疗的有价值的协同靶57,65。有趣的是，这些低剂量ATRi筛选也发现G2/M和纺锤体检查点因子的grna富集，但复制起始因子的grna不富集。在这种情况下，Cdc25a的缺失被认为可以防止过早的有丝分裂和随后由ATR和CHK1抑制引起的有丝分裂灾难。如下所述，Cdc25磷酸酶的gRNAs可能在我们的高剂量ATR抑制剂筛选中富集，因为Cdc25能够激活细胞周期蛋白A-CDK1，从而促进晚期复制起点的启动63.

在我们的高剂量ATRi筛选中回收的最大类别的gRNAs由已知促进起源点火的各个方面的因子组成，包括核心起源发射因子(例如。Cdc45、Cdc7、Dbf4、Gins3)、复制起点的染色质重塑(例如，Asf1b、Baz1a)和复制起始的转录因子(例如，E2f2、Ccne2、Ccna2)。复制起始因子gRNAs的独特富集表明，ATR介导的起点触发抑制是正常DNA复制中ATR基本功能的一个重要方面。为了验证这一假设，我们试图联合使用CDC7和CDK1抑制剂来部分抑制Atr缺陷细胞的起源放电。磷酸化MCM解旋酶复合物的CDC7激酶通常是起点放电所必需的66，而先前发现细胞周期蛋白A-CDK1的过度激活在缺乏ATR或CHK1的情况下促进晚期起源放电63。此外，最近的一项研究表明，CDK1在G1/S转换时也被激活，它与CDC7协同或冗余地通过磷酸化MCM解旋酶复合物来驱动起点放电67。我们观察到两种激酶的共同抑制拯救了Atr缺陷细胞中的生产性DNA复制，这表明抑制起点放电是Atr基本功能的一个关键方面。此外，CDC7和CDK1共抑制也恢复了这些细胞中的dNTP水平，这与Atr缺陷型S期细胞中dNTP水平降低的概念相一致，这是由于过度的起源放电和随之而来的dNTP池的过度使用。CDC7单独抑制部分抑制了DNA损伤反应，但不足以恢复生产性复制。因此，除了抑制起点放电之外，CDK1抑制还可以防止过早有丝分裂和结构特异性核酸酶的激活，这些核酸酶可以瓦解停滞的复制叉68和关机RNR的表情69。根据这些结果，我们提出ATR通过防止过度的起点放电和dNTPs及其他复制蛋白的耗竭来确保DNA复制和正常细胞增殖。在任何给定的时间，关键复制因子的可用性，包括蛋白质和dNTPs，应该反映其生产和消费之间的平衡。鉴于哺乳动物细胞的基因组很大，在S期早期将单个起源的启动间隔开可能更有效，以允许一些复制因子的再利用和调节对dNTPs的需求。因此，在早期S期，细胞可能对ATR抑制更敏感，此时晚期复制的起点必须被抑制，而在中期或晚期S期，只有很少的起点存在。类似的机制可能是ATR在感知脱氧核苷不平衡中的关键作用的基础55。与该模型一致，与连续培养或后期细胞周期中的细胞系相比，从G0(最初24小时)进入细胞周期的原代细胞对ATR抑制/缺失最敏感，这可能受益于先前细胞分裂留下的显著水平的复制因子。这是否表明原代和干细胞可能比癌细胞对ATR抑制更敏感还需要进一步研究。在这种情况下，癌细胞经常遭受致癌复制应激，这增强了它们对ATR抑制的敏感性。

大量的工作已经确定了至少四种明确的机制，ATR通过这些机制促进细胞对复制应激的反应:抑制起点放电、激活细胞周期检查点、稳定停滞的分叉和诱导分叉重新启动3。这些机制中的一种或多种也可能介导ATR在非应激细胞增殖中的基本功能。识别ATR在肿瘤细胞和正常细胞中的共同和独特作用将为识别肿瘤特异性易损性和最小化ATR抑制的毒性提供第一步。我们的数据表明，早期S期ATR介导的起源放电抑制是支持从G0转变的正常淋巴细胞中生产性DNA复制所必需的。在芽殖酵母中，我们发现ATRMec1对于细胞因子诱导的B细胞中DNA复制的启动不是必需的。此外，在S期中期或晚期开始的ATR抑制不能消除正在进行的复制。因此，尽管ATR及其激酶活性通过防止有限复制因子的过度使用而促进DNA复制，但它们似乎对fork起始和进展的实际机制是不可或缺的。事实上，最近重建的快速有效的人类DNA复制70不包括ATR激酶。因此，ATR在正常复制中的重要作用在S期早期最为突出，此时细胞维持大量的休眠起源，如果启动不当，将很容易耗尽可用的复制因子库。相比之下，在S期中期或后期的短暂ATR抑制不会阻断生产性复制，这可能是因为这些细胞拥有相对较少的休眠起源储备或已经积累了显著的复制因子。ATR对生产性DNA复制的这种阶段特异性作用可能提供了一种在癌症治疗期间给药ATR抑制剂以最小化正常组织毒性的方法。

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