定向自然进化确定了M1病毒的强化毒株 为了通过定向进化增强M1病毒的溶瘤效力，我们在难治性结肠直肠癌细胞系HCT-116中进行了连续传代。为了实时观察和定量病毒复制，我们使用了一种在病毒复制过程中表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组M1病毒，称为M1-GFP 20 。用M1-GFP(称为P0)以10的感染复数感染HCT-116细胞。感染后72小时，收集培养上清液用于下一次传代(图。 1a ).在第3代(P3)，GFP阳性细胞的比例明显增加，表明M1病毒在HCT-116细胞中的感染、复制或传播增强，这可能是由于HCT-116细胞适应的M1病毒变体的产生。随着连续传代，这些M1变异体增强的传染性和杀伤能力得以保持(图。 1b ).接下来，我们通过MTT试验比较了适应的变体与亲代病毒的溶瘤效力。剂量-反应曲线显示M1变体的溶瘤功效显著增强(图。 1c ).使用非线性回归确定半最大有效浓度(EC50)。与M1-GFP相比，M1变体的EC50值降低了6470-6970倍(图。 1c
图1: M1病毒在难治的HCT-116细胞系中连续传代以产生更有效的OVs。 a 在HCT-116细胞系中连续传代和通过定点突变产生突变病毒的示意图。 b 显示了P3、P8和P10的相差和GFP荧光图像。比例尺，50 μm。代表性图像 n = 3. c 在用M1-GFP、P3、P8和P10的系列稀释液感染细胞后，通过MTT试验评估细胞生存力。通过非线性回归计算EC50偏移，并通过相对于M1-GFP的单向ANOVA和Tukey多重比较检验将EC50值用于统计分析，并进行调整 P 显示值。 d M1-绿色荧光蛋白基因组RNA示意图。分离病毒基因组RNA用于遗传分析。核苷酸替换用红框突出显示。 e 以0.1的MOI感染HCT-116细胞，并在感染后72小时用相差显微镜和荧光显微镜成像。的代表图像 n = 3.比例尺，50 μm f 用M1-GFP和M1-N3E2M (MOI = 1)感染HCT-116细胞48小时，通过流式细胞术测定感染率。 P < 0.0001 was calculated with Two-tailed unpaired t-test. g 在用M1-GFP和M1-N3E2M以0.1的MOI感染HCT-116细胞后，通过CCID50方法测试病毒滴度。 P = 0.0060由相对于M1-GFP的双向方差分析确定。 h 在用M1-GFP和M1-N3E2M的系列稀释液感染细胞后，评估细胞存活力。通过非线性回归计算EC50位移。相对于M1-GFP，使用双向ANOVA和Bonferroni多重比较检验计算统计显著性。调整过的 P 值为:MOI(模拟)， P > 0.9999;MOI(3)， P = 0.0003;MOI(2比1)，P < 0.0001。n.s ::无意义，** P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001. Data are shown as mean ± SD, for n = 3次生物复制。源数据作为源数据文件提供。
在P3、P8和P10检测到的变异体的基因组分析鉴定了M1变异体中的两个错义突变，即非结构蛋白3 (nsP3)的核苷酸序列中的A1072C和包膜蛋白E2的核苷酸序列中的A12C，这导致nsP3中358位的甲硫氨酸(M)到亮氨酸(L)的取代和E2中4位的赖氨酸(K)到天冬酰胺(N)的取代(图。 1d ).通过定点突变将两种突变引入M1-GFP主链，产生M1-N3E2M(图。 1a )，其在HCT-116细胞中大量复制并诱导显著的细胞病变效应(CPE)(图。 1e ).M1-N3E2M在HCT-116细胞中的最大感染率为92%，远高于M1-GFP的感染率(图 1f ，S 1 ).与这一发现一致，M1-N3E2M的病毒产量大于10 3 -折叠更高(图。 第一代 ).病毒复制的增加导致溶瘤功效的增强，EC50降低了6690倍，这与在连续传代试验中获得的M1变体相似(图。 1h ).总之，我们通过定向自然进化开发了M1-N3E2M，具有令人鼓舞的复制能力和溶瘤功效。
M1-N3E2M具有更广的体外抗肿瘤谱 我们接下来试图确定NGOVM的溶瘤作用是在HCT-116细胞中特异性增强还是在其他类型的肿瘤细胞中广泛增强。在57种人类肿瘤细胞系中测试了M1-N3E2M的溶瘤功效，包括结肠直肠癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌和膀胱癌细胞系。在大多数受试细胞系中，M1-N3E2M在MOI为10时表现出增强的溶瘤作用(图。 2a )，其中大多数是消化系统和乳腺癌细胞系，只有少数膀胱癌或前列腺癌细胞系(图。 2b ).为了证实消化系统肿瘤中溶瘤作用的增强，我们进一步评估了M1-N3E2M在另一种结肠直肠癌细胞系HCT-8和肝细胞癌细胞系Huh 7中的溶瘤作用。在HCT-8细胞中观察到M1-N3E2M的广泛复制和明显的CPE(图。 2c )，同时EC50降低了2760倍，表明杀伤能力增强(图。 2d ).在Huh 7细胞中获得了类似的结果，EC50降低了158倍(图。 2e，f
图2:M1-N3E2M的溶瘤效果在多种肿瘤细胞中得到改善，并且在正常细胞系中不引起CPE。 a 在感染后72小时，通过MTT试验评估57个人细胞系的生存力。肝癌以黄色显示，结肠癌以绿色显示，前列腺癌以橙色显示，胰腺癌以紫色显示，膀胱癌以蓝色显示，乳腺癌以浅蓝色显示。 b M1-GFP和M1-N3E2M的溶瘤效果通过双尾配对t检验和 P 显示值。数据显示为小提琴图，在最小值和最大值处具有方框界限，在中间值处具有中心线。(结肠癌， n = 8;肝癌， n = 2;乳腺癌， n = 15;胰腺癌， n = 11;前列腺癌， n = 6;膀胱癌， n = 15). c , e HCT-8和Huh-7细胞被M1病毒感染，感染复数为0.1。的代表图像 n = 3.比例尺，50 μm d , f 通过MTT试验评估HCT-8和Huh-7细胞的生存力。通过非线性回归计算EC50位移。相对于M1-GFP，使用双向ANOVA和Sidak多重比较检验计算统计显著性。调整过的 P 值为: d MOI(模拟)， P > 0.9999;MOI(3)， P = 0.9991;MOI(2)， P = 0.0008;MOI(1比1)，P < 0.0001 f MOI(模拟)， P > 0.9999;MOI(3)， P = 0.0528;MOI(2)， P = 0.0028;MOI(1和0)， P < 0.0001; MOI (1), P = 0.0489. g CCD-18Co细胞用M1-GFP和M1-N3E2M感染，感染复数为10。的代表图像 n = 3.比例尺，50 μm h 通过MTT试验评估CCD-18Co细胞的存活力。通过非线性回归计算EC50位移。新标准:无意义* P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001. Data points represent mean % viability relative to vehicle ± SD, for n = 3次生物复制。源数据作为源数据文件提供。
更重要的是，尽管在肿瘤细胞中复制和杀伤效果显著增强，但M1-GFP和M1-N3E2M都不能在正常人结肠成纤维细胞系CCD-18Co中良好复制(图。 2g ).因此，在正常细胞系CCD-18Co中，M1-GFP和M1-N3E2M均未表现出细胞毒性(图。 2h ).我们进一步发现，测试的正常细胞系在暴露于100 MOI的任一病毒后没有表现出显著的细胞毒性，这比癌细胞中使用的最高MOI高10倍(图5 2 ).这些发现表明M1-N3E2M在广泛的人类癌细胞中具有有效的肿瘤选择性溶瘤作用。
M1-N3E2M具有更强的体内外抑制肿瘤生长的能力 M1-N3E2M在体外的有效溶瘤作用促使我们进一步研究其在体内的治疗潜力。给裸鼠皮下接种HCT-116细胞，并在随机化后静脉注射载体对照、M1-GFP或M1-N3E2M(图。 3a ).与体外结果一致，M1-N3E2M显著延迟皮下异种移植肿瘤的生长，而M1-GFP几乎不抑制肿瘤生长(图。 3b ).在整个观察期间，小鼠没有表现出明显的异常，并且它们的体重没有显著差异(图5 3a ).末次治疗后24 h，用免疫组织化学(IHC)染色检测M1病毒的复制和肿瘤细胞的增殖与凋亡。与M1-GFP组相比，M1-N3E2M组中GFP和裂解的caspase3的IHC染色强度更高，Ki-67信号更低，这表明M1-N3E2M在肿瘤组织中复制更强，从而抑制肿瘤细胞的增殖并促进其凋亡(图。 3c ).在正常小鼠组织中，没有检测到病毒复制，也没有观察到组织形态学的明显变化(图。 三维（three dimension的缩写）
图3:M1-N3E2M的溶瘤作用在体内和体外得到加强。 a , b 用载体、M1-GFP或M1-N3E2M静脉内处理HCT-116异种移植物连续6天。 n =每组7只小鼠。 c 通过免疫组织化学分析肿瘤组织中的GFP、裂解的caspase-3和Ki-67。的代表图像 n = 3.标尺，20 μm。GFP的定量，裂解的caspase-3和Ki-67， n = 3次生物复制。相对于M1-GFP，使用单向ANOVA和Sidak多重比较检验计算统计显著性。调整过的 P 值为:GFP P < 0.0001, Cl-casps-3 P = 0.0002，Ki-67 P = 0.0376. d 来自脑、结肠、肝、肺、心脏(比例尺，20微米)和关节(比例尺，500微米)的正常组织。通过免疫组织化学分析GFP。的代表图像 n = 3. e –h 连续21天静脉内处理HCT-116和SW620异种移植物。在HCT-116异种移植模型中， n =每组7只小鼠；在SW620异种移植模型中， n =每组10只小鼠。 我–我 对BALB/c小鼠中的CT26异种移植物和C57BL/6小鼠中的HEPA1-6异种移植物进行连续6天的静脉内处理。在CT26异种移植模型中， n =每组5只小鼠；在HEPA1-6异种移植模型中:对照 n = 7只小鼠，M1-GFP n = 9只小鼠，M1-N3E2M n = 8只老鼠。 m 用M1-GFP或M1-N3E2M (1×10 7 PFUs)72小时，并评估细胞存活力。一个柱状图代表一个肿瘤样品相对于载体的平均细胞毒性%。肿瘤体积的统计学显著性用双向方差分析和Tukey多重比较检验来计算。调整过的 P 值为: b M1-GFP对对照， P = 0.4464;M1-N3E2M对M1-GFP， P = 0.0005; f M1-GFP对对照， P < 0.0001; M1-N3E2M vs. M1-GFP, P < 0.0001; h M1-GFP对对照， P < 0.0001; M1-N3E2M vs. M1-GFP, P = 0.0006; j M1-GFP对对照， P = 0.0673;M1-N3E2M对M1-GFP， P = 0.0127; l M1-GFP对对照， P = 0.6654;M1-N3E2M对M1-GFP， P = 0.0176.新标准:无意义* P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001. Data are shown as mean ± SD. Source data are provided as a Source Data file.
为了探索延长和更高剂量的给药是否能更有效地抑制体内肿瘤的生长，我们用HCT-116细胞系建立了皮下结肠直肠肿瘤模型，并连续21天静脉内给予载体对照、M1-GFP或M1-N3E2M(图。 3e ).M1-GFP对肿瘤生长有中度抑制作用，但M1-N3E2M在降低肿瘤负荷方面明显更有效(图。 3f ).类似地，小鼠保持无症状，并且在整个过程中没有显示出明显的体重差异(图5) 3b ).在更宽松的模型中，SW620皮下结肠直肠肿瘤模型，M1-N3E2M有效抑制肿瘤生长，而其亲代病毒M1-GFP抑制肿瘤生长的程度较低(图。 3g，h ).三组之间的体重没有显著差异(图5 3c ).实验结束时，处死小鼠，切除肿瘤。M1-N3E2M组中肿瘤的大小明显小于对照组和M1-GFP组中肿瘤的大小，且肿瘤重量较低(图5 4 ).我们使用具有皮下肿瘤的免疫活性小鼠进一步研究了抗肿瘤活性，所述皮下肿瘤来源于CT26和Hepa1-6，这两种小鼠模型分别广泛用于结肠直肠癌和肝癌。结果显示，M1-N3E2M显著抑制肿瘤生长，而M1-GFP没有(图。 3i–l ).重要的是，所有小鼠保持无症状，并且在观察期内没有观察到体重的显著差异(图5 3d，e ).这些结果表明，M1-N3E2M在抑制肿瘤生长而不损害正常组织方面具有比M1-GFP更强的治疗潜力。
为了提供更多的临床相关证据，我们用结直肠癌患者的手术肿瘤样本建立了离体模型。将分离自六名结肠直肠癌患者的肿瘤组织分成小块，在暴露于M1-GFP、M1-N3E2M或载体72小时后分析其生存力。肿瘤组织对M1病毒的敏感性差异很大，可能是由于肿瘤的异质性。在对M1-GFP高度敏感(细胞毒性> 10%)的肿瘤组织中，两种病毒的溶瘤作用相似。然而，在对M1-GFP难治的肿瘤组织中(细胞毒性< 10%)，M1-N3E2M的溶瘤作用增强(图。3m )，表明其治疗结肠直肠癌的潜力。
E2和nsP3的突变协同促进了M1病毒的溶瘤 为了确定这两种突变对M1-N3E2M溶瘤效力提高的贡献，我们产生了M1-E2M和M1-NS3M，它们分别含有E2的K4N突变和nsP3的M358L突变。我们通过MTT法检测了M1病毒在HCT-116细胞中的溶瘤作用，发现具有个体突变的M1病毒的溶瘤作用强于M1-GFP，但弱于M1-N3E2M，这表明两种突变都部分促进了M1病毒的溶瘤作用，并且它们协同起作用(图。4a 4a 4b ).第二，病毒结构蛋白E1丰度的定量分析证实了我们通过荧光显微镜观察到的结果(图5 5 ).最后但同样重要的是，我们比较了HCT-116细胞中M1变异体的病毒生产能力，发现所有M1变异体产生的子代病毒都比亲代病毒多。观察到M1-E2M的病毒产量略有增加，而M1-NS3M的产量大幅增加，这两种突变都是病毒复制完全增强所必需的(图。 4c
图M358L和K4N突变协同增强了M1-N3E2M的溶瘤作用。 a 通过MTT试验评估细胞活力。通过非线性回归计算EC50位移，EC50值用于不成对的统计分析 t- 用韦尔奇修正法测试，M1-NS3M vs M1-GFP， P = 0.0467;M1-E2M对M1-GFP， P = 0.0481;M1-N3E2M vs M1-NS3M， P = 0.0345;M1-N3E2M对M1-E2M， P = 0.0237.数据点代表相对于车辆SD的平均%生存力，对于 n = 3次生物复制。 b 用M1病毒以0.1的MOI感染HCT-116细胞，并在感染后48小时成像。的代表图像 n = 3.比例尺，50 μm c 通过TCID50试验确定病毒滴度。我们使用未配对进行了最终病毒产量的统计分析 t- 用韦尔奇修正法测试，M1-NS3M vs M1-GFP， P = 0.0240;M1-E2M对M1-GFP， P = 0.0327;M1-N3E2M vs M1-NS3M， P = 0.0451;M1-N3E2M对M1-E2M， P = 0.0284.数据点代表平均病毒滴度标准差，对于 n = 3次生物复制。 d 单层HCT-116细胞以0.1的MOI感染M1病毒。感染后1小时，用半固体培养基替换培养基。的代表图像 n = 3.比例尺，500 μm。放大图像中的比例尺代表100 μm。 e 斑块面积的量化( d ).使用不成对的来计算统计显著性 t- 用韦尔奇氏校正和 P 显示值。数据显示为小提琴图，在最小值和最大值处具有方框界限，在中间值处具有中心线(M1-GFP n = 21，M1-E2M n = 30，M1-NS3M n = 17，M1-N3E2M n = 32). f 的牌匾( d )都算了。使用单因素方差分析和Tukey多重比较检验计算统计显著性 P 显示值。对于n = 3个生物重复，图条代表每个孔的平均噬菌斑数目SD。新标准:无意义* P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001. Source data are provided as a Source Data file.
为了进一步分析这两种突变在增强病毒复制中的特殊作用，我们进行了一项空斑形成实验。感染后1小时，用PBS洗涤HCT-116细胞以除去未结合的病毒颗粒，然后进入细胞的病毒颗粒可以复制形成噬斑 21 。病毒进入的速度决定了斑块形成的数量，而局部病毒复制的数量影响斑块的大小。与M1-GFP相比，M1-E2M感染导致明显更多的斑块，M1-NS3M感染导致更大的斑块。当两种突变都存在时，斑块的数量和大小随之增加(图。 4d-f ).这些发现表明E2的K4N突变可能加速M1病毒的进入，而nsP3的M358L突变可能促进病毒复制。总之，这些结果表明这两种突变通过互补机制协同增强了M1病毒的溶瘤作用。
E2基因的K4N突变加速了M1病毒的入侵 此前，我们获得了M1病毒和M1受体复合物的冷冻电镜结构，表明包膜蛋白E2位于病毒颗粒表面，并在受体结合中起关键作用 22 。为了描述E2内K4N突变加速M1病毒进入的机制，我们首先进行了基于空斑形成的进入动力学分析，发现M1-E2M病毒在感染后5分钟就形成了明显更多的空斑，证实了它确实能比亲代病毒更快地进入肿瘤细胞(图。 5a、b ).与这一发现一致，M1-E2M细胞对肿瘤细胞的附着能力增强(图。 5c
图5:E2的K4N突变提高了M1病毒的附着和进入。 a 进行改良的蚀斑形成试验，并在感染后48小时用荧光显微镜对细胞成像(MOI = 0.5)。比例尺，500 μm。放大图像中的比例尺代表100 μm。 b 感染后48小时用荧光显微镜计数噬菌斑。数据点代表每个孔的平均斑块数SD，对于 n = 3次生物复制。 P < 0.0001 was determined by Two-way ANOVA relative to M1-GFP. c HCT-116细胞与M1-绿色荧光蛋白和M1-E2M在4℃孵育1小时。通过qRT-PCR对病毒RNA进行定量，并表示为平均值±标准差 n = 3次生物复制。 P < 0.0001 was calculated with Two-tailed unpaired t-test. d M1-GFP和M1-E2M与MXRA8-His结合His-Tag小鼠单克隆抗体琼脂糖珠温育的蛋白质印迹分析。使用抗E1单克隆抗体检测沉淀的病毒颗粒(左)。显示了E1表达的定量(右)。图条代表E1的平均密度测定，标准化为MXRA8 SD的密度测定，用于 n = 3次生物复制。 P = 0.0060是用双尾不成对t检验计算的。 e 通过BLI确定的M1病毒颗粒和MXRA8蛋白之间结合的时间过程。 f , g 用M1-绿色荧光蛋白或M1-E2M处理HeLa、HeLa-Mxra8、Hs 578 T和Hs 578T-δmxra 8细胞。感染后48小时用流式细胞仪测定感染率。柱状图代表平均感染率% SD，对于 n = 3次生物复制。相对于M1-GFP，使用双向ANOVA和Sidak多重比较检验计算统计显著性。调整过的 P 值为: f 矢量 P = 0.6199;Mxra8 P = 0.0002; g 向量， P = 0.0010;Mxra8 P = 0.2713.n.s ::无意义，** P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001. Source data are provided as a Source Data file.
鉴于Mxra8已被确定为M1病毒的受体 22 我们试图确定E2基因有K4N突变的M1病毒是否对Mxra8有更高的亲和力。利用下拉试验来评估M1病毒和MXRA8蛋白胞外结构域之间的结合能力。病毒颗粒首先与MXRA8-His蛋白一起孵育，然后用抗His琼脂糖珠进行免疫沉淀。在M1-E2M组中观察到更大量的病毒，以包膜蛋白E1为代表，这表明M1-E2M和MXRA8受体蛋白之间的相互作用更强(图。 5d ).生物层干涉测量法(BLI)进一步证实，M1-E2M病毒颗粒以显著更高的亲和力结合MXRA8受体(图。 5e ).我们接下来试图弄清楚更高的受体结合亲和力是否有助于M1-E2M更快地进入。在HeLa细胞中，MXRA8表达极低的细胞模型 23 我们观察到M1-GFP和M1-E2M的低感染率。MXRA8在HeLa细胞中的异位表达导致M1-E2M病毒的感染率比亲代病毒高得多(图。 5f ).相反，在Hs 578 T细胞中敲除MXRA8，一种高水平MXRA8表达的细胞模型，减少了M1-GFP和M1-E2M之间感染率的差异(图。 5g ).综上所述，这些发现表明E2区K4N突变赋予了M1病毒对受体MXRA8更高的结合亲和力，并加速了M1病毒的附着和进入。
nsP3中的M358L突变促进M1病毒的复制 接下来，我们试图揭示nsP3中M358L突变促进病毒复制的潜在机制。首先，流式细胞仪分析显示M1-NS3M感染后不仅感染率增加(图。 6a )而且感染细胞中GFP表达水平升高(图。 6b )，表明M1-NS3M具有优越的复制能力。第二，进入动力学分析显示，M1-NS3M形成的噬菌斑数量与M1-GFP相似(图。 6c )，这表明nsP3中的M358L突变可能不影响病毒的进入。
图nsP3中的M358L突变抑制了PKR和STAT1的激活，进一步抑制了IFN介导的抗病毒反应。 a 用M1-GFP和M1-NS3M (MOI = 10)感染HCT-116细胞，用流式细胞仪测定感染率。 b GFP在感染细胞中的表达( a )被检测到。平均荧光强度。 c 进行改良的蚀斑形成试验，并在感染后48小时用荧光显微镜计数蚀斑。 d 识别与nsP3 WT和nsP3 M358L相互作用的流程示意图。 e 该文氏图显示了与nsP3 WT和nsP3 M358L相互作用的宿主蛋白。 f , g 59个nsP3 WT相互作用子和22个nsP3 M358L相互作用子的丰富术语条形图，用p值着色。显示了前10种富集途径。另请参见表 S1 和 S2 h 在用抗nsP3和抗PKR抗体进行免疫印迹分析之前，用抗Flag抗体或同型对照IgG进行共免疫沉淀。的代表图像 n = 3. i , j 用对照、M1-GFP或M1-NS3M处理HCT-116细胞4和24小时(MOI = 10)，通过蛋白质印迹检测细胞裂解物中的蛋白质水平(左)。p-PKR和p-STAT1的定量(右)。 k 定量PKR和STAT1在( 我，j ). l 在用对照、M1-GFP或M1-NS3M (MOI = 1)感染24小时后，通过qRT PCR定量ISGs和病毒RNA的转录水平。（ m-o )qRT-PCR( m )和蛋白质印迹法( n )用于评价PKR的shRNAs敲除效率。用M1-GFP和M1-NS3M (MOI = 1)感染PKR敲除细胞，并通过流式细胞术( o ). p , q 在用M1-GFP或M1-NS3M (MOI = 1)感染后，通过蛋白质印迹在CCD-18Co细胞中检测蛋白质。p-PKR和p-STAT1的定量。使用双向ANOVA和Sidak多重比较检验计算统计显著性( a , b , i , j , o , q )或采用Tukey多重比较检验的单向ANOVA( k–l )，并进行调整 P 显示值。数据显示为三次生物重复的平均值±标准差。源数据作为源数据文件提供。
M358L突变位于nsP3的高变区(HVD ),据报道其与多种宿主蛋白相互作用以促进病毒复制 24 。为了进一步阐明nsP3中M358L突变的分子机制，使用相互作用蛋白质组学方法来鉴定与野生型和突变nsP3蛋白相互作用的宿主蛋白(图。 6d ).一些被充分研究的与其他甲病毒nsP3相互作用的蛋白质，包括Ras GTP酶激活蛋白结合蛋白1 (G3BP-1)、G3BP-2和含SH3结构域的激酶结合蛋白1 (SH3KBP1) 25 ,26 ,27 ,28 ，也在我们的分析中发现，支持这个实验的可靠性。此外，59种蛋白与野生型nsP3特异性相互作用，22种蛋白与nsP3-M358L特异性相互作用(图。 6e ，表格 S1 和 S2 29 。而野生型nsP3特异性相互作用子主要富含mRNA加工途径(图。 6f )，突变的nsP3特异性相互作用子富含病毒相关途径(图。 6g )，表明在M1感染期间，nsP3中M358L突变的重要作用 30 。在突变的nsP3特异性相互作用子中，PKR，一种众所周知的防御RNA病毒的抗病毒蛋白，引起了我们的注意。我们通过免疫共沉淀进一步验证了PKR和突变而非野生型nsP3之间的选择性相互作用(图。 6小时 ).为了揭示这种相互作用对M1病毒复制的生物学影响，我们首先检测了PKR的激活。早在感染后4小时，PKR的磷酸化就被M1-GFP显著上调，而不是M1-NS3M。在感染后24小时，M1-NS3M诱导的PKR磷酸化仍然比M1-GFP诱导的弱得多(图。 6i ).这些结果表明，与nsP3-M358L的相互作用可能抑制PKR的激活。鉴于观察到磷酸化PKR可以介导I型干扰素(IFN)途径中基因的表达，我们进一步检查了STAT1的表达和激活，STAT1是I型IFN途径中不可或缺的转录因子之一。在这两种病毒中，在感染后4小时，STAT1的表达和磷酸化水平都没有改变。然而，在感染后24小时，M1-GFP导致总STAT1和p-STAT1水平显著增加，而M1-NS3M没有(图。 6j ).因此，受STAT1转录调控的多种IFN刺激基因(ISGs)的表达，被M1-NS3M诱导的程度明显低于被M1-GFP诱导的程度(图。 6k，l
为了证明M1-NS3M的增强复制依赖于PKR结合，我们产生了PKR敲除的HCT-116细胞系来比较病毒生长。PKR的抑制将M1-GFP的感染率增加到与M1-N3M相当的水平(图。 6m–o ).这一发现表明nsP3 M358L突变通过抑制PKR抑制了抗病毒反应并改善了病毒复制。即使PKR被敲除，M1-N3E2M的感染仍然高于M1-GFP和M1-N3M，进一步证实了E2 K4N突变在增强受体结合中的作用 6 ).
为了解决安全性问题，我们进一步研究了M1-NS3M是否影响正常细胞中PKR-STAT1通路的激活。使用CCD-18Co正常结肠成纤维细胞，我们发现M1-GFP和M1-NS3M在感染后24小时显著激活PKR和STAT1，导致病毒复制的强烈抑制(图。 6p，q ).上述结果说明nsP3-M358L与PKR相互作用并抑制其激活，从而赋予M1-NS3M通过抑制PKR-STAT1-IFN信号通路的激活并增强肿瘤细胞中病毒复制来逃避抗病毒反应的能力。
M1-N3E2M在非人灵长类动物中是安全的 安全性评价是开发新型口服避孕药的重要步骤之一。在以前的研究中，我们在啮齿动物和非人灵长类动物模型中验证了野生型M1病毒的安全性 10 ,11 。我们的数据还表明，M1-N3E2M保留了亲代M1病毒的肿瘤选择性特性，从而确保了它的高安全性，这得到了我们的小鼠模型结果的支持(图5 3 ).为了进一步确认安全性并考虑到未来的临床转化，我们在中进行了全面的安全性评估 食蟹猴 。给药时间表见图。 7a M1-N3E2M的注射剂量为3.29×10 9 每只动物CCID50。在试验期间，对所有动物进行临床观察，未观察到死亡或濒死动物，也未观察到药物相关毒性。未报告给药部位的不良反应(表 S3 ).没有观察到体重减轻(图。 7b ).动物的生命体征没有显著差异，包括体温、心率和血压(图。 7c ).在实验过程中，所有动物的眼科检查均未发现明显异常(表 第四心音
图7: M1-N3E2M在非人灵长类动物中耐受性良好。 a 给药时间表的时间线。静脉注射。 b 治疗开始后，每周对动物称重。 c 在D-3、D1、D5、D20、D43和D71进行动物体温、心电图和血压测量。MBP，平均血压。 d 在第3、D1、D6、D21、D44和D72天从动物后肢的皮下静脉采集血液，用于分析血清生化参数。谷丙转氨酶。天冬氨酸转氨酶。白蛋白白蛋白。肌酐清除率。 e 在第3、D1、D6、D21、D44和D72天从动物后肢的皮下静脉采集血液，用于血液学参数的分析。白细胞，白血球。 f D-3、D6、D21、D44和D72的凝血功能分析。APTT，激活部分凝血活酶时间。 g 细胞因子和血清C反应蛋白检测。 h 在D-3、D1、D6、D21、D44和D72进行补体检测。另请参见表 S3 S6 。源数据作为源数据文件提供。
除了对照组中个别动物的暂时增加之外，在施用病毒后，肝酶(ALT和AST)和白蛋白的浓度没有显著变化(图。7d ).尿液分析以及血清肌酐和尿素的浓度测量结果显示肾功能未受损(表 表面抗原-5 ，图。 7d
在血液学分析中，白细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和单核细胞的计数显示出轻微的波动，但与给药前相比没有太大差异(图。 7e ).每组动物的凝血功能没有明显异常(图。 7f ).在实验期间，除了对照组中IL-6和HsCRP水平的短暂升高之外，没有可见的全身毒性(图。 7g ).尽管补体C3和C4的水平在M1-N3E2M注射后的第44天下降，但它们最终恢复到基础水平(图。 7h ).施用M1-N3E2M后20天，可检测到低水平的中和IgG抗体(表 S6 ).总的来说，这些结果表明M1-N3E2M病毒在非人灵长类动物中是安全的，提供了支持其临床转化的安全概况的有力证据。
