介绍

精确肿瘤学中的功能方法需要将肿瘤细胞暴露于治疗干预,以识别候选药物,并快速评估药物对个体患者和治疗选择的潜在疗效1,2,3,4,5,6,7,8。虽然已知少量可操作的突变,但大多数新诊断的肿瘤缺乏任何目前可操作的基因组改变9。通过直接测量药物对组织或细胞的作用,功能精确医学方法可以告知肿瘤的治疗抗性和敏感性情况,而不需要事先完全了解潜在的分子脆弱性2,3,4,10,11,12,13,14,15,16,17.

广泛采用的用于筛选分析的模型系统都有局限性。二维(2D)细胞系培养起来相对简单和便宜,但是不能代表天然组织的结构、行为和药物反应18,19,20,21。小鼠模型具有额外的复杂性,但具有固有的物种特异性变异,这限制了它们在人类患者中的应用22,23。患者来源的异种移植物(PDX)模型旨在更好地再现人类癌症,但仍然受到与其使用相关的大量成本和时间的限制,这意味着进行大规模药物筛选是不切实际的1,24,25。三维(3D)肿瘤类器官是精确医学的有前途的模型,其可以从多种细胞系中快速有效地建立26,27和组织来源28,29,并准确模拟患者对治疗的反应3,4,8,12,13,14,15,28,29,30,31,32。它们是生理相关的、个性化的癌症模型,非常适合药物开发和临床应用8,28,29,31。我们之前开发了一种筛选平台,该平台利用以迷你环形式接种的患者来源的肿瘤类器官来自动化高通量药物测试,结果可在手术后一周内获得3,16,33。广泛采用基于类器官的筛选的主要突出限制仍然是细胞接种步骤的时间密集性和操作者对操作者的敏感性,以及后续类器官分析所需的破坏性的群体水平方法34,35.

为了克服这些限制,我们开发了一种有机类筛选方法,该方法通过生物打印将自动细胞接种与高速活细胞干涉测量术(HSLCI)相结合,用于无创、无标记、时间分辨成像。生物打印是一种将生物链中的细胞精确、可重复地沉积到固体支持物上的技术,在癌症生物学领域正迅速获得牵引力36,37,38,39,40。在沉积的生物链接中,嵌入的细胞可以与生理微环境成分相互作用34。然后我们使用HSLCI,一种定量相位成像(QPI)41,42,43,44,45,快速监测单一类有机物的干生物量和生物量分布随时间的变化。HSLCI测量透过样品的光的相移,用于计算每种类有机物的质量密度46,47。生物量是类器官适合度的重要度量,因为其动力学是细胞内生物合成和降解过程的直接结果46,47。HSLCI使用波前传感相机来重建光通过细胞并与物质相互作用时的相移43,46,47。这是由于溶液中生物分子的质量密度和折射率之间的确定的线性关系,该线性关系相对于细胞内容物的变化是不变的48,49,50,51,52测得的相移可以在图像的整个区域上积分,并乘以转换因子,以获得成像细胞的干生物量密度46,47。该转换因子是比折光率增量的倒数,比折光率增量定义为溶液的折光率和质量浓度之间关系的斜率46,47,50。生物量变化的QPI测量允许在治疗的几个小时内分辨2D细胞培养模型中的抗药性和药物敏感性细胞41,42,45,53,54,55,56,57。HSLCI测量的反应曲线与PDX小鼠乳腺癌模型的药物敏感性相匹配42。然而,到目前为止,HSLCI仅用于筛选在2D生长的癌细胞系或切除的PDX肿瘤的单细胞悬液41,42,44,45.

在这里,我们介绍了一个综合的管道,它结合了生物打印、HSLCI和基于机器学习的类器官跟踪和分类。使用细胞系作为3D肿瘤细胞生长的模型,我们证明了沉积在均匀、平坦的细胞外基质层中的生物打印细胞允许在单一类器官分辨率下对生长模式和药物反应进行无标记、时间分辨、非破坏性的量化。

结果

生物打印能够将细胞以合适的几何形状接种到基质胶中,用于定量成像应用

为了解决当前的限制3,16,33并且便于通过HSLCI对3D类器官进行非侵入性、无标记成像,我们使用挤压生物打印机创建了自动化细胞打印协议。作为基础,我们使用了类有机化合物筛选平台,其中类有机化合物从接种在96孔板边缘周围的基质凝胶小环中的细胞生长,空的中心允许使用自动液体处理器,便于培养基交换和加入扰动剂3,16,32,33。我们保留了空的中心结构,但改变了几何形状,以在Matrigel中生物打印细胞的迷你正方形(图。1a).将正方形的边定位在HSLCI成像路径中允许对更大的区域进行采样,并限制由井边缘的不均匀照明引起的成像伪影43(图。1a).我们的生物打印方案需要将细胞悬浮在由3:4比例的培养基和基质凝胶组成的生物链接中。然后,我们将这种材料转移到打印盒中,在17°C下培养30分钟,并在7到15 kPa的压力下生物打印到每个孔中,在标准玻璃底板上产生< 200 m的打印结果(图。1b).

图1:生物打印能够接种为高效HSLCI而优化的基质胶包封的细胞。
figure 1

a带有相对于HSLCI成像路径(蓝色箭头)的小环(顶部)和小方(底部)的孔示意图。俯视图(左)表明,从环形过渡到方形增加了HSLCI成像路径中的材料面积。侧视图(右)显示正方形几何形状中的类有机物比环状的类有机物更好地对准单个焦平面。b印刷前孔板的等离子体处理优化了水凝胶结构的几何形状。将Matrigel生物打印到未经处理的玻璃上(左)会产生厚的(~ 200 m)结构,通过增加焦平面外的簇数量来降低类器官追踪的效率。全井等离子体处理(中间)增加了所有井表面的亲水性,使基质凝胶在表面上铺展得很薄(约50m);然而,增加的亲水性也会将生物吸上井壁。用阱掩模进行等离子体处理有助于对阱的期望区域进行选择性处理(右图)。这导致在成像路径上具有大约75 μm的均匀厚度的最佳构造。c单个的类器官可以随着时间的推移在成像模式中被追踪。五个代表性的HSLCI图像被追踪到穿过明场图像的成像路径。d铺板后1小时,在基于Matrigel的bioink中,印刷的与手动接种的MCF-7细胞的细胞存活力。数据以平均值±SD表示。进行单向方差分析(n= 4,p= 0.0605)与事后Bonferroni多重比较测试进行比较,将所有生物打印条件与手动接种的对照进行比较。调整过的p-对于10、15、20、25 kPa的印刷压力,数值分别为0.0253、0.6087、> 0.9999、0.1499。eH&E染色显示多细胞类器官的发育与接种方法无关。随着培养时间的延长,多细胞结构的数量和大小都在增加。Ki-67/Caspase-3染色显示,大多数细胞在整个培养过程中保持增殖状态。虽然在培养72小时的类器官中观察到一些凋亡细胞,但大多数细胞显示出强烈的Ki-67阳性。Ki-67被染成棕色,Caspase-3被染成粉红色。比例尺为60米。源数据以源数据文件的形式提供。

接下来,我们将生长在3D集群中的生物打印细胞系耦合到HSLCI平台。HSLCI使用波前传感摄像机和动态聚焦稳定系统对生物样品进行连续、高通量、无标记的QPI,跟踪其生物量随时间的变化41,42。然而,使用HSLCI的3D类有机化合物的高效高通量QPI受到几何考虑的阻碍;当感兴趣的物体失焦时,不能假定测量的相移与质量密度保持直接关系43。因此,我们试图生成更薄的基质凝胶层,以产生相对更多数量的聚焦类有机物,这些有机物可以在任何给定时间进行定量评估。为了产生更薄的(< 100 m)构建物,以进行有效的无标记HSLCI成像,我们通过氧等离子体处理增加了96孔玻璃底板表面的亲水性58。我们开发了由BioMed琥珀树脂(FormLabs)组成的3D掩模,以选择性地功能化感兴趣的区域(补充图。1A–C).等离子体处理后的生物打印产生了均匀的小正方形,其类有机物在约70 m厚的单个焦平面上紧密排列(图。1b).印刷结构是一致的(补充图。1D)并服从于HSLCI的大规模并行QPI,因为我们将生物打印的迷你正方形构造的腿与HSLCI成像路径对齐(图。1c).

最后,我们通过直接比较根据我们建立的方案人工接种的MCF-7细胞,验证了所用的印刷参数不会改变细胞存活力3,16,33通过25号针(260 μm内径)使用10-25 kPa的挤出压力印刷细胞。我们没有观察到通过ATP释放试验测量的细胞活力的任何降低(图。1d).这些结果与现有文献一致,因为细胞活力的降低通常与更高的印刷压力(50-300 kPa)有关59,60。总之,这描述了一种用于生物打印层的方法,该方法适用于HSLCI成像而不影响细胞活力,同时支持高通量应用的自动化液体处理3,16,33,61,62.

生物打印的肿瘤细胞保持了人工接种的3D培养物的组织学特征

为了验证生物打印不会干扰肿瘤生物学,我们直接比较了来自两种乳腺癌细胞系BT-474和MCF-7的生物打印和手工接种细胞的组织学和免疫组织化学特征。选择这些细胞系是因为它们不同的分子特征,例如它们的人类表皮生长因子受体2 (HER2)和雌激素受体(ER)状态63,64。我们从接种在大环(1 × 10)上的细胞中培养出类器官5细胞/环)以获得足够的材料用于下游表征。将细胞人工接种到24孔板中3,16,33或者在15 kPa的挤出压力下生物打印成8孔板。在细胞接种后1、24和72小时拍摄的明视野图像和苏木精-伊红(H&E)染色切片中,生物打印的细胞和细胞团在形态学上与人工接种的细胞和细胞团无法区分(图。1e).生物打印和人工接种的细胞群的大小都随时间增长,并且生物打印没有改变它们的增殖速率(Ki-67染色)或凋亡(裂解的胱天蛋白酶-3;图。1e).两种细胞类型的激素受体状态与文献报道一致64,65,66,67并且在生物打印和人工接种的细胞之间没有改变,如HER2和ER的免疫组织化学(IHC)所示(补充图。2).伴侣蛋白表达也与手工打印的细胞保持一致(补充图。3).因此,生物打印不会影响被测细胞类型的组织学。

生物打印和人工接种的细胞在分子上是无法区分的

虽然生物打印的细胞在组织学上与人工接种的细胞无法区分,但这并不排除打印过程引起的分子变化。因此,我们对人工接种和生物打印的细胞在接种后1、24和72小时的转录组进行了详细的分析。通过汇集两个独立实验的RNA测序(RNAseq)数据,我们评估了30,544个RNA转录物的分布,发现接种方法之间没有显著差异(图。2a).人工接种和生物打印细胞的总转录组高度相关(图。2b),任一细胞系中没有个体转录物的丰度显著不同(FDR < 0.05,t-测试;图。2c).

图2:生物打印不会显著改变转录组。
figure 2

a在人工接种(左)和生物打印(右)的细胞之间,检测到的RNA总数(上图)和以每百万转录本(TPM)测量的RNA丰度(下图)的分布是相似的。n=通过两个独立的实验评估了30,544个转录本。箱线图的中心代表每个中位数,方框的边缘代表第25和第75个四分位数,触须代表数据的范围,单独绘制的点是大于中位数四分位数间距1.5倍的异常值。b在三个时间点(接种后t = 1、24和72小时),人工接种和生物打印细胞系3D模型的RNA丰度的Spearman等级相关性。我们发现两种细胞系的人工接种细胞和生物打印细胞中的RNA丰度之间有很强的相关性。p-值来自成对样本之间相关性的双尾检验。c成对的双尾t检验结果的火山图,比较人工播种和生物打印的MCF-7和BT-474与未调整的RNA丰度p-调整了值(左)和错误发现率(FDR)p-值(右)。基于任一细胞系的接种方法,没有转录物优先表达(n= 30,544个基因中的0个,FDR < 0.05,t检验)。d拼接(PSI)外显子的百分比分布类似地分布在BT-474(顶部)和MCF-7(底部)中。PSI在人工接种(左)和生物打印(右)细胞之间的分布是相似的。PSI为1表示该外显子被排除在外,而PSI为0表示该外显子被排除在外。源数据作为源数据文件提供。

我们接下来研究了前mRNA选择性剪接事件,因为这些事件即使在mRNA水平没有变化的情况下也能诱导功能变化68,69,70。我们发现外显子包含和外显子跳跃亚型的密度没有变化(图。2d).类似地,我们发现接种方法和融合转录物的数量(p= 0.0519,Mann-Whitney U-test),尽管一部分样品具有大量的RNA融合,反映了无限增殖化细胞系的广泛分布的反式剪接和基因组不稳定性71(补充图4A).最后,在印刷和人工接种的样品之间,RNA编辑位点的数量或性质没有显著差异(p= 0.977,曼-惠特尼U检验;补充图4B).这些发现表明,生物打印方案不会显著影响通过批量RNA测序测量的肿瘤细胞的分子特征。

基于机器学习的图像分割和分类支持单器官分析

我们的完整管道包括细胞生物打印(第0天)、类器官建立(第0-3天)和完全培养基替换(第3天,图。3a)然后转移到HSLCI培养箱中。在更换培养基的6小时内,我们开始在后处理的72小时内对板进行连续成像。在成像期结束时,我们进行了终点ATP释放试验来评估细胞活力(图。3a).对于下游数据处理,我们首先使用SID4软件开发套件(GPU版本,v741)将HSLCI收集的干涉图转换为相移图43。然后,我们使用两种类型的机器学习算法进行图像分割和单器官水平分析(图。3a).

图3:生物打印可通过高速活细胞干涉测量法进行单一器官追踪。
figure 3

a管道总示意图。基于挤压的生物打印用于将单层Matrigel构建物沉积到96孔板中(第0天)。类器官模型的建立和生长(第0-3天)可以通过明视野成像进行监控。处理后(第3天),将孔板转移到高速活细胞干涉仪进行相位成像(第3-6天)。相干光照射生物打印的构造,并获得相位图像。使用HSLCI跟踪类器官长达三天,并测量类器官质量的变化,以观察对治疗的反应。b在四个时间点(治疗后t = 6、24、48和72小时),每个细胞系的细胞集落的径迹总数(左)和每个孔的径迹平均数SD(右)。对于MCF-7来说,用载体(1% DMSO)处理的重复孔中的径迹总数为921个(n= 12个孔)和438个用于BT-474(n= 12口井)c四个时间点(治疗后t = 6、24、48和72小时)的质量分布。黑条代表平均值,误差条代表标准偏差。平均值和标准偏差的计算基于n= 804,855,859,803对于MCF-7和n在t = 6、24、48和72小时,BT-474细胞群分别为= 421、420、423、402。d在1% DMSO中培养的追踪的MCF-7(左)和BT-474(右)的每小时生长率(每小时的质量变化百分比)。数据以每小时的平均值SEM表示,根据以下数据的增长率计算得出n= 921 MCF-7和n= 438个BT-474跟踪集群。e在四个时间点(治疗后t = 6、24、48和72小时)采集的代表性HSLCI相位图像。左侧显示的是治疗前拍摄的明视野图像。f随着时间的推移,每种代表性类有机物的计算质量。源数据作为源数据文件提供。

尽管存在背景噪声、碎片和失焦类器官,为了可靠地识别每个成像帧中的独特细胞群,我们使用U-Net架构进行图像分割72使用ResNet-3416,73作为主心骨。U-Net是一种卷积神经网络(CNN),由一个从输入图像中提取丰富特征图的编码器和一个将特征图的分辨率扩展回图像原始大小的解码器组成。编码器和解码器之间的长跳跃连接将像素级上下文信息传播到分段的有机类遮罩中。即使在提供小的训练数据集时,得到的分割图像也非常详细。我们使用了由100个随机选择的成像帧中的人工标记的类器官组成的训练数据集。该模型创建了二进制掩模,指示图像的每个像素属于有机类还是背景,在95%的置信水平下,平均Jaccard指数为0.897±0.109。CNN可靠地创建了掩模,省略了由异常背景或失焦类有机物导致的相位伪影(补充图。5).

接下来,我们通过对有机类区域上的相移进行积分并乘以实验确定的特定折射率增量,来确定分段掩模中每个簇的质量48,50,51,54,74。我们使用TrackMate将离散的分段细胞团和类器官的数据组合成时间一致的轨迹75,76并且使用XGBoost分类器过滤每个被跟踪对象的质量对时间数据77经过训练,可排除移进和移出焦点、经常与相邻簇重叠和/或分离、或掺入碎片的类有机物(补充表格1).我们通过对样本人群进行3重采样的交叉验证来验证该模型。分类器的3重重采样交叉验证分数为93.1±1.3%,AUC为0.966±0.020(补充表2).我们还观察了用于对每个轨迹进行分类的特征的趋势,被排除的轨迹通常具有更多的缺失帧、更小的四分位间距和更小的初始质量(补充图6).

质量累积的趋势可以通过具有单一类器官分辨率的HSLCI进行量化

基于HSLCI的成像允许连续跟踪n= 12个重复孔中的921个MCF-7细胞系衍生的类器官(中位数:78.5/孔)和n= 12个重复孔中的438个BT-474(中位数:36/孔,图。3b).由于细胞移入和移出视野(FOV),每个时间点跟踪的对象数量略有不同。总的来说,我们在整个成像过程中的任何给定时间跟踪了平均821±28个MCF-7和412±9个BT-474细胞群(图。3b).

与化学终点分析或其他实时成像模式不同,基于HSLCI的成像有助于对单个细胞和类器官进行平行质量测量。成像开始时的初始平均测量质量(相当于培养物中大约78小时的总质量)对于MCF-7(1.36±0.84 ng)大于BT-474(1.12±0.61 ng,图。3c).考虑到单个细胞质量为200-300皮克55,培养3天后,根据HSLCI测量,簇包含约4-7个细胞,与观察到的组织病理学一致(图。1e).MCF-7和BT-474之间的尺寸差异在整个成像期间一直存在(补充表格3).BT-474以每小时0.80±6.07%的速率生长,而MCF-7表现出较慢的平均每小时生长速率(每小时0.33±4.94%,图。三维(three dimension的缩写)).BT-474在3D中的生长速率比在2D培养物中6小时后观察到的BT-474细胞稍慢(~ 1.3%),而MCF-7在3D中显示出比先前报道的2D培养物低得多的生长速率(~ 1.7%)55。我们还观察到源自两个品系的类器官的初始质量和生长速率之间的正相关性;然而,这些因素之间的联系对MCF-7细胞更强(补充图。7).提供的数据提供了细胞系特异性3D生长特征可以通过HSLCI量化的证据。

3D培养物中的药物反应可以通过HSCLI定量

然后,我们测试了我们的平台在高通量3D类器官筛选中检测药物反应的效用(图。3a).作为原理证明,我们测试了星形孢菌素,一种具有广泛细胞毒性的非选择性蛋白激酶抑制剂78奈拉替尼,一种针对EGFR和HER2的不可逆酪氨酸激酶抑制剂79和拉帕替尼,一种可逆的酪氨酸激酶抑制剂,也针对EGFR和HER280。我们在0.1、1和10 M测试了星孢菌素,而在0.1、1、10和50 M筛选了奈拉替尼和拉帕替尼(图。4和S8)。测试的浓度范围包括并超出了两种拉帕替尼(4.2微米)的最大血浆浓度81奈拉替尼(0.15米)82。我们从图像分析中排除了用50 M neratinib处理的孔,因为该浓度的药物沉淀会导致不透光。沉淀物和其他不透明材料会产生无法解释的相位图像,从而限制数据采集。

图4: HSLCI实现了癌症3D模型的高通量、纵向药物反应分析。
figure 4

a代表性的HSLCI采集的MCF-7和BT-474的三维生长的相位图像,并用10 M星形孢菌素、10 M奈拉替尼和10 M拉帕替尼处理。b每个柱代表处理后6小时、24小时、48小时和72小时的质量分布(从左到右)。黑色水平条代表中位数,误差条代表分布的四分位数范围。样本大小、汇总统计和精确p-每个条件的值可在补充表中找到3。使用Kruskal-Wallis检验评估统计显著性。对于含有以下物质的样品p-值低于0.05,我们在各个时间点对车辆对照进行了双尾Mann-Whitney U-检验。p < 0.05 is denoted by *, p < 0.01 is denoted by **, and p < 0.001 is denoted by ***. c比较了用10 M星形孢菌素和赋形剂、10 M奈拉替尼和赋形剂以及10 M拉帕替尼和赋形剂处理的类有机化合物之间的小时生长率,以每小时质量变化百分比计算。数据以平均增长率SEM表示。增长率数据来源于n= 921、592、249和292个MCF-7细胞群和n=分别用载体、10 M星形孢菌素、10 M奈拉替尼和10 M拉帕替尼处理的438、299、110和127个BT-474簇。源数据作为源数据文件提供。

代表性的HSLCI图像显示了对治疗的一系列反应(图。4a).处理后6小时,我们检测到用10 M奈拉替尼处理的BT-474簇的平均质量相对于对照组显著降低。在所有其他条件下,成像窗开始时(治疗后6小时)的平均质量与载体对照无显著差异(图。4b,补充表3).24小时、48小时和72小时后,我们观察到许多处理过的样品存在显著差异(补充表3).24小时后,对照MCF-7细胞团平均为1.56±1.05 ng,而用1个微米和10个微米星形孢菌素处理的细胞团显示平均质量显著降低至1.18±0.77 ng(p= 1.93 × 10−9,曼-惠特尼U检验)和1.11±0.69纳克(p= 1.49 × 10−13,曼-惠特尼U检验)。BT-474在24小时后显示出类似的模式,对照类有机化合物的平均质量为1.27±0.69 ng,而星形孢菌素处理的簇的平均质量为0.76±0.39 ng(1微米,p= 2.27 × 10−32曼-惠特尼U检验)和0.79±0.44纳克(10微米,p= 1.59 × 10−28,曼恩–惠特尼U检验)。MCF-7和BT-474对1微米星形孢菌素的治疗都有快速反应,如标绘的标准化生长曲线所示(补充图。9)和平均增长率的下降(图。4c).

对拉帕替尼和奈拉替尼的反应反映了与HER2表达一致的细胞系特异性趋势(补充图。2).BT-474很快表现出对奈拉替尼和拉帕替尼的敏感性,而MCF-7仅表现出对10 M拉帕替尼和奈拉替尼的敏感性(图。4b,补充表3).24小时后,用0.1 M奈拉替尼处理的BT-474团簇的平均质量从1.27±0.69 ng(p= 4.86 × 10−6,Mann-Whitney U-检验)和用1 M拉帕替尼治疗的那些降低至1.00±0.49(p= 3.37 × 10−5,曼恩–惠特尼U检验)。比较EC时50在2D培养、人工接种和生物打印的3D培养中,我们没有发现显著的变化,尽管我们观察到了EC降低的趋势50对于用奈拉替尼治疗的生物打印MCF-7(补充图。10,补充表4).独立实验的结果一致(补充图。11).

药物反应的样本内异质性

我们将HSLCI与基于机器学习的工具相结合,提供了对单个细胞团和类器官的质量跟踪,从而允许对样品内的异质性进行定量(图。4b,补充电影12).我们评估了对照和处理样品在12、24、48和72小时内增加、减少和保持质量的成像3D簇的比率(图。5a,补充表5).在没有药物治疗的情况下,在72小时内,11.9%的BT-474 3D簇损失了超过其初始质量的10%,80.9%获得了超过其初始质量的10%。相比之下,MCF 7号只有50.8%增加了质量,32.6%减少了质量。这种群体的异质性随着时间的推移而增加,23.2%的MCF-7在12小时内增加了超过10%的质量。这一比例在24小时后几乎翻倍至44.8%,但在48小时和72小时后分别保持在48.6%和50.8%。这种模式不同于BT-474,因为在48至72小时之间达到平台期之前的前48小时内,增重的类有机物数量持续增加。质量增加> 10%的BT-474从12小时后的30.1%增加到24小时后的62.4%,以及72小时后的80.9%。

图5: HSLCI能够识别抗性和敏感性3D簇亚群,并比终点分析更早地辨别对治疗的反应。
figure 5

a显示在处理后12、24、48、72小时,在每种条件下增加(绿色)或损失(黑色)超过其初始质量10%的被追踪簇的百分比的图。b生物打印的MCF-7和BT-474的HSLCI成像板中处理孔的相对生存力,通过终点ATP释放试验确定。条形图代表平均值,误差条形图代表标准偏差。每个点代表来自独立重复的标准化发光信号。n= 12且n=分别用MCF-7和BT-474的载体对照处理11个孔。对于两个实验中的处理井,N=对每个浓度的星形孢菌素筛选8个重复,并且N=对每个浓度的拉帕替尼和奈拉替尼筛选3个重复的孔。使用带有韦尔奇校正的双尾、不成对t检验评估统计显著性。p < 0.05 is denoted by *, p < 0.01 is denoted by **, and p < 0.001 is denoted by ***. Exact p-数值在补充表中报告6。源数据作为源数据文件提供。

处理后,我们观察到样本间(MCF-7对BT-474)和样本内的异质性。在HER2靶向拉帕替尼(10 m)的存在下,37.7%的MCF-7继续生长,另外10.0%在治疗72小时后保持其质量(图。5a,补充表5).当用10 M奈拉替尼处理时,只有4.5%的MCF-7簇增加了质量,而18.1%保持稳定。相比之下,BT-474对这两种药物表现出更高的敏感性,10 M拉帕替尼治疗组有11.4%的细胞团生长,73.7%的细胞团失重(对照组为11.9%),暴露于10 M奈拉替尼72小时后没有细胞团生长(图。5a,补充表5).BT-474细胞的一个子集显示出对0.1 M的拉帕替尼和奈拉替尼的高敏感性。作为对拉帕替尼的反应,12.8%的BT-474团簇失去了质量,而17.9%保持了稳定的质量。用奈拉替尼治疗时,49.1%的患者体重减轻,22.4%的患者体重保持稳定。这两种反应与用赋形剂处理的类器官形成对比,其中11.9%失去质量,7.2%保持质量。鉴于在这些细胞中发现HER2的较高表达,预计BT-474细胞对拉帕替尼和奈拉替尼的敏感性增加63(补充图3).

所有处理细胞组合中的一部分细胞对测试的药物没有反应(图。5a,补充图。9,补充表5).这些细胞的生长速率与赋形剂处理的细胞相似,根据细胞系和药物的不同,占所有类器官的7.8%至87.1%。例如,用10 M拉帕替尼处理的37.7%的MCF-7细胞群在72小时后生长,而另外10%保持稳定的质量(补充表5).类似地,当用10 M奈拉替尼处理72小时时,近8%的BT-474保持其质量,当暴露于10 M拉帕替尼72小时时,该比例增加到超过25%(补充表5).我们的发现表明了一个可以通过HSLCI成像快速识别的类器官耐药群体。这些持久性可能为理解新生和获得性治疗耐药提供了一个独特的模型。

最后,为了验证HSLCI测量的反应,我们在用于HSLCI成像的相同板上进行了终点ATP释放测定,并评估了72小时治疗结束时的存活率(图。5b).ATP分析证实,两种细胞系都对星形孢菌素高度敏感,在1和10 M浓度下的存活率接近于零。此外,当用0.1 M拉帕替尼和0.1 M奈拉替尼处理72小时时,BT-474显示生存力显著降低(补充表6).总的来说,72小时后的细胞活力测定结果证实了HSLCI在短至6小时内观察到的趋势,但未能捕捉到样品内的变异性。

讨论

癌症治疗越来越趋向于针对每个患者独特和异质性疾病的治疗83,84。分子精确医学需要了解分子特征和药物反应之间的联系;1,85然而,其中许多关系尚未建立86。功能性精确医疗不需要事先了解这些关联,一些研究已经将体外反应与患者结果相关联4,12,13,32。广泛采用功能精确医学的关键限制是生理培养模型的创建、高通量系统的开发以及测量类器官异质性的困难7,31,34,35,87。我们的管道通过整合强大的3D类器官生物打印协议和成像方法来克服这些障碍,这有助于对治疗反应的单个类器官分析。

我们引入了生物打印来提高我们之前发表的类器官筛选方法的通量和一致性3,16,33。我们选择打印基于Matrigel的生物链接,因为它能够在体外保存肿瘤特征3,21。Matrigel在其6–8°c的胶凝温度下,在较窄的温度范围内表现为液体。在这些温度值以上,当其热交联时,其粘度显示出时间和温度依赖性的变化88,89。如果不严格控制温度和生物打印准备程序,bioink的粘度可能会有所不同。因此,每次印刷都需要调整挤压压力。尽管这些物理特性使其生物打印的适用性变得复杂,但我们表明,通过严格的温度调节,生物打印简单的单层基质凝胶结构是可以实现的。我们通过用氧等离子体处理选择性地修饰印刷基材,进一步提高了基质凝胶沉积的质量。3D等离子体掩模介绍(补充图1)促进了每个井中正方形区域的选择性处理。暴露区域中基底亲水性的增加引导了材料的铺展,以最大化沉积体积和构造厚度的一致性,同时防止孔中心的堵塞。生物打印使我们能够精细地控制沉积凝胶构建体的大小和形状,便于使用HSLCI进行下游分析(图。1).

我们已经优化了一种基于低压、温控挤压的生物打印方案,以避免改变肿瘤细胞。虽然一部分细胞可能会受到生物打印过程的影响,但我们的大量RNAseq分析表明,这将局限于非常小的亚群。总的来说,我们正交研究结果的总和支持我们的结论,即我们测试的细胞在很大程度上不受我们研究中使用的温和生物打印条件的影响。这适用于这项工作中包括的生物打印参数和细胞模型的特定组合。在未来的研究中,继续评估生物打印的生物效应将是重要的,这些研究要么使用替代打印协议,要么侧重于不同的患者样本。

先前的研究已经使用干涉测量法来量化在2D基底上培养的单个细胞的质量,以研究细胞分裂90,细胞骨架重塑91,机械性能92和对治疗的反应41,42,54。断层QPI也已经用于获得3D物体的高分辨率图像,例如大脑器官93和癌症类器官94。将高通量定量成像技术应用于癌症的类器官模型的持久挑战是3D集群的有效可视化35,95。HSLCI成像在相对于平板表面的单个焦平面上记录由培养的细胞或类器官引起的入射光相移的2D投影41。2D相移图仅提供聚焦物体的精确生物量测量43,96。当使用HSLCI测量生物量时,在成像期间,类有机物垂直于焦平面移动会降低效率。我们通过使用生物打印来生成均匀、薄的构造,最大限度地增加可以并行跟踪的有机类的数量,并结合基于机器学习的有机类分类器,从分析中排除失焦对象,从而缓解了这一挑战。或者,能够捕获板的多个z平面的成像系统可以解决这个问题。然而,这种方法会降低类器官成像的频率,并增加所得数据集的大小,这对及时有效的数据分析提出了不同的挑战。

通过引入区域特定的参考图像和基于机器学习的图像分割和轨迹过滤方法,我们已经能够将跟踪的类有机化合物的数量增加到初始分析的大约15倍,在初始分析中,使用标准方法分析的类有机化合物只有大约1%被保留(补充图。11).进一步的改进将包括缩短药物治疗和成像开始之间的6小时延迟,这将允许我们在该时间范围内捕捉正在经历细胞死亡的高度敏感的类器官。最后,由于使用HSLCI生成了大量数据(约250 GB板/天),数据分析仍然是一个时间限制因素。

我们的工作将生物打印与时间分辨HSLCI相结合,用于癌症3D模型的高通量、无标记生物量分析。而其他小组之前已经生物打印了类器官模型97,98,99,100评估药物治疗98,99,100与其他筛选方法一样,这些系统中的大多数使用终点化学敏感性分析,在单个时间点返回孔水平的平均测量值95。这些终点分析在揭示生长和药物敏感性表型的瞬时反应和异质性方面能力有限95。相比之下,HSLCI返回的时间分辨的类器官水平信息能够表征罕见的耐药细胞亚群,提供了基于群体的分析无法解决的额外见解。肿瘤的基因组特征表明,这些恶性肿瘤是进化相关亚克隆的集合,而不是同质群体101,102,103,104。这种遗传多样性是导致治疗反应不同的几个因素之一。终点检测,如活-死染色或ATP释放定量,表征了对治疗的平均反应。虽然它们可以用于鉴定大多数细胞群中的药物敏感性,但是它们不能解释可能也存在的抗性克隆的反应。在临床环境中,未能治疗耐药人群可能会在初始反应后导致复发和长期疾病进展105,106,107。尽管开发了具有不同程度的复杂性和可扩展性的3D癌症模型,但是功能性筛选试验由于不能考虑肿瘤反应的异质性而受到阻碍。HSLCI允许随着时间的推移对生物打印类器官的各种特征进行无创、无标记的跟踪,包括单个类器官分辨率下的大小、运动性和质量密度。由于能够定量测量响应于治疗的时间分辨的个体质量变化,因此有可能识别和分离响应性和抗性细胞亚群,这可以在选择治疗方法时导致更明智的临床决策45。通量、时间分辨率和采样的类有机物数量的组合94,108,109再加上我们从播种到药物敏感性结果的实验时间很短3,16,33,110,使得我们基于HSLCI的方法对于筛选用于研究的肿瘤器官样模型以及将来可能的临床应用是有价值的。