介绍

在各种共刺激和共抑制受体中,后一种特异性表达于T细胞上的受体被称为免疫检查点分子,包括细胞毒性T淋巴细胞抗原-4 (CTLA-4)、程序性细胞死亡-1 (PD-1)、淋巴细胞激活基因3 (LAG-3)、具有免疫球蛋白和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、T细胞免疫球蛋白粘蛋白3 (Tim-3)等1。免疫检查点抑制剂(ICI)疗法正在成为各种类型恶性肿瘤的标准疗法。ICIs通常阻断这些检查点分子与其配体的结合,并且正在被积极研究以阐明它们的流行病学以及它们通过拯救肿瘤中T细胞的衰竭状态来抑制肿瘤生长的分子机制2,3,4,5,6.

PD-1仅在T细胞受体(TCR)刺激初始T细胞后2-6小时表达,并在效应细胞上保持一周以上,在从启动到效应细胞和记忆分化的所有阶段都有助于T细胞抑制7。PD-1有两个配体,PD-1-配体1 (PD-L1)和PD-L2;前者无处不在并持续表达,特别是在血管内皮和上皮细胞以及淋巴细胞上,以维持足够的免疫反应8,9,10后者优先在免疫细胞如专职抗原呈递细胞(APC)上表达8,11,12。最近的临床报告描述了高表达人(h) PD-L2或双重表达hPD-L1和hPD-L2作为hPD-1配体的恶性肿瘤13。在我们以前的报告中,我们证实了在体外干扰素γ (IFNγ)培养之前或之后,不同的人肺癌细胞系内源性表达hPD-L1和hPD-L2,并发现了依赖于每种细胞系的不同的hPD-1配体表达模式14。在世界范围内,许多类型的ICIs已经被开发并被批准用于治疗这些类型的癌症15,16,17。每家公司都为每种药物添加了自己的特性,并根据每种药物单独进行的临床试验结果确定了适应症和剂量。关于ICIs之间的头对头功能比较以及每个患者体重和年龄的最佳有效剂量,我们的信息很少18,19,20。ICIs与其他ICIs或常规癌症治疗的几种组合疗法最近已经被引入,并显示出一些疗效3,21。因此,ICIs的适应症正在日益扩大。通过减少确定适当的ICI剂量和联合治疗所需的资源,这可以使患者受益并节省医疗费用。

最近的成像技术揭示了T细胞和APC之间粘附界面上通过TCRs的抗原识别和信号通路的独特结构,我们称之为免疫突触22,23,并进一步被认为是最小的信号单位,称为TCR微团簇信号体24,25,26。在我们以前的报告中,使用表达MHC分子的支持脂质双层(SLB)和鼠(m) PD-L1,我们描述了在PD-1-PD-L1结合后,TCR微团簇被PD-1共定位。PD-1可以在TCR微簇上募集磷酸酶SHP2,并通过形成PD-1介导的抑制性微簇来减弱TCR/CD3复合物CD28和TCR下游几乎所有信号分子的去磷酸化状态14,27。我们还证明了由PD-1-PD-L2结合引发的PD-1微团簇形成的诱导,PD-L2的主要结合能力将PD-L1与PD-L2对PD-1的更高亲和力相比较,以及PD-L1和PD-L2在PD-1结合中的物理竞争。

受体和配体之间的大多数亲和力通常通过基本策略,表面等离子体共振(SPR)光谱法来测量,该方法检测膜附着受体和可溶性配体之间1:1的分子相互作用。然而,我们有时在SPR光谱的理论数据中观察到明显的差异,这通常忽略了膜-膜相互作用和受体或配体的横向或顺式结合。SLB是一种创新的方法,可以在允许细胞膜上表达的受体和配体横向迁移的优选条件下评估亲和力。

在这里,我们构建了一个新的超分辨率成像系统,以可视化hPD-1与hPD-L1和/或hPD-L2的结合,并观察hPD-1形成的微团簇。由于整个系统完全适应人类材料,我们可以评估临床实践中使用的抗PD-1、PD-L1或PD-L2药物(如nivolumab、pembrolizumab、atezolizumab或durvalumab)的疗效。我们发现hPD-1通过hPD-L1或hPD-L2在T细胞APC或-SLB界面的结合形成簇,产生抑制性微簇,通过募集磷酸酶SHP2使TCR/CD3复合物及其下游信号分子去磷酸化,与mPD-1类似。此外,每种抗体需要其自身的浓度来阻断PD-1–PD-L1或–PD-L2结合,并通过针对不同靶分子而非同一靶分子的其他抗体的组合在这些阻断中获得更有效的功能。我们相信,我们新建立的hPD-1分子成像系统将允许我们通过检查这些生物反应和清晰可见的微团簇形成之间的相关性,以数字方式评估T细胞活化和每个ICI的实际功能。由于正在研究各种新的ICIs,这项研究可能具有广泛的应用,以估计阻断效应,计算有效ICIs所需的实际浓度,并选择这些ICIs和不同治疗方法的组合,如其他ICIs和常规癌症疗法。

结果

hPD-L1诱导hPD-1在TCR微团簇上聚集

我们试图应用我们以前的报告,通过使用由高分辨率全内反射荧光(TIRF)显微镜和由糖基磷脂酰肌醇锚定的鼠主要组织相容性复合体II类(MHC-II)分子组成的SLBs构建的新成像系统,更准确地分析hPD-1的定位k,(即k-GPI)和mICAM-1作为基本组分,hPD-L1可以作为hPD-1的配体加入其中。为了确定适于成像hPD-1微团簇的SLB上的hPD-L1密度,我们检测了hPD-1在不同hPD-L1密度下的聚集。我们证实了那些介于37.5和150分子/米2并且在几个人癌细胞系中hPD-L1的细胞表面密度在该范围内(补充图。1a–c).基于这些实验和几个先前的可视化PD-1微团簇的报告14,27SLB上的hPD-L1分子的数量被确定为150个分子/微米2,这可能在生理范围内。脾脏CD4+t细胞从和-TCR制备,其对母细胞色素c 88–103(MCC88–103)在I-E上k转基因Rag2-(Rag2−/−)和PD-1缺陷型(Pdcd1−/−3)小鼠,用增强型绿色荧光蛋白标记的hPD-1 (hPD-1-EGFP)刺激和逆转录病毒转导(补充图。1d).在上述条件下将这些T细胞铺在SLB上,并通过共聚焦或TIRF显微镜成像。在SLB上存在hPD-L1的情况下,hPD-1在新生T细胞-双层接触区域形成簇,并且hPD-1微簇向免疫突触的中心迁移,形成中央-超分子激活簇(c-SMAC)(图。1a、b和补充电影1).为了检测hPD-1和TCR在微团簇中的共定位,这些和-Tg CD4+表达hPD-1-EGFP的t细胞用DyLight 650标记的抗TCRβ (H57) Fab预染色,并在同一SLB上成像,如图。1a。在hPD-L1存在的情况下,hPD-1最初与TCR(hPD-1-TCR微簇)一起聚集在同一簇中28,29)(图。1c,左,和1d),然后这些hPD-1簇最终向c-SMAC移位(图。1c,对)。此外,通过CRISPR-Cas9重组到mPD-1缺陷的表达-TCR的T细胞杂交瘤(2D12)中的hPD-1-EGFP在原代T细胞中表现出与hPD-1相似的行为(补充图。1e–g).为了检测hPD-1和hPD-L1在T细胞APC界面的共定位,我们将表达hPD-1-EGFP的T细胞与I-E结合k+APC细胞系,DC-1细胞,导入了用HaloTag标记的hPD-L1(补充图。1h),并证实只有当hPD-L1表达时,hPD-1和hPD-L1才会在T细胞APC界面聚集(图。1e).这些数据清楚地表明,hPD-1与TCR在同一区域形成簇,这依赖于与它的配体hPD-L1的结合,与mPD-1显示的方式相同。

图1: hPD-1与TCR聚集,以配体结合的方式在T细胞-双层界面形成微团簇。
figure 1

a和-TCR-Tg CD4+将表达hPD-1-EGFP(绿色)的t细胞铺在MCC上88-103-含有碘的预脉冲SLBk–、mICAM-1–和不带(上图)或带hPD-L1–GPI(下图)并通过TIRF显微镜实时成像(时间在图像上方;辅助电影1). bhPD-1在黄线上的聚集和向心运动a在云图中显示为水平元素。c中的单元格a用DyLight 650标记的抗TCRβ (H57) Fab(红色)预染色,铺在SLB上a,并在接触后2分钟(左)或20分钟(右)通过共焦显微镜实时成像。直方图显示了DIC图像中对角黄线上TCRβ(品红色)和hPD-1(绿色)的折叠荧光强度。d该图显示了在T细胞中接触后2分钟,与hPD-1共定位的TCR微团的百分比c(n = 10)。e和-TCR T细胞杂交瘤,2D12细胞,表达hPD-1–EGFP(绿色),用DyLight 650标记的H57 Fab(红色)预染色,与MCC缀合88-103预脉冲(1微米)即k-表达APC系,DC-1细胞,不表达(顶部)或表达(底部)hPD-L1-卤标记(青色),并在T细胞-APC接触后2分钟通过共聚焦显微镜实时成像。所有数据代表两个独立的实验。条,5 μm。数据以平均值±SD表示。统计分析由不成对的双侧进行t-测试。****p < 0.0001. Source data for cd作为源数据文件提供。

SHP2在hPD-1-hPD-L1结合触发的hPD-1微团簇上瞬时移位,抑制T细胞活化

我们接下来检测了hPD-1是否向TCR微团募集磷酸酶SHP2,以与mPD-1相同的方式形成抑制性信号体。和-TCR T细胞共表达hPD-1-HaloTag和EGFP-SHP1或-SHP2定居在具有hPD-L1的SLB上,证明hPD-1微团簇与SHP2共定位,但不与SHP1共定位(图。2a).这些结果通过细胞-细胞接合试验得到了证实,该试验显示SHP2在免疫突触处的积聚与hPD-1-hPD-L1结合相关(补充图。2a).当表达hPD-1-EGFP的T细胞被MCC刺激时,也检测到了SHP2与hPD-1的物理联系88-103表达hPD-L1的肽预脉冲DC-1细胞(图。2b).

图2:hPD-1–hPD-L1结合诱导SHP2募集到hPD-1微团簇,通过受体及其下游信号分子的去磷酸化来抑制T细胞信号。
figure 2

a将表达hPD-1–HaloTag(红色)和EGFP–shp 1(左,绿色)或–shp 2(右,绿色)的2D12细胞铺在没有(顶部)或有hPD-L1–GPI(底部)的SLB上。直方图显示了在DIC图像中对角黄线上hPD-1(品红色)和SHP1(绿色)或SHP2(绿色)的折叠荧光强度。b表达hPD-1–EGFP的2D12细胞与MCC结合88–103-不表达(左)或表达hPD-L1(右)的预脉冲DC-1细胞。裂解细胞,通过抗GFP免疫沉淀hPD-1,并印迹SHP1、SHP2或hPD-1。为SHP1、SHP2或GFP印迹wcl。c表达hPD-1–EGFP(绿色)的2D12细胞用DyLight 549标记的H57 Fab(青色)预染色,铺在没有(顶部)或有hPD-L1–GPI(底部)的SLB上,接触后2分钟固定,用抗磷酸(p) CD3ζ(红色)染色。直方图显示了DIC图像中对角黄线上TCRβ(青色)、hPD-1(绿色)和pCD3ζ(品红色)的折叠荧光强度。d散点图汇总了(c).通过在2 0个细胞上随机绘制的20个分布图,在不存在hPD-L1–GPI(左,0.6232±0.05)或存在hPD-–GPI(右,0.1198±0.05)的情况下,计算PCC在pCD3ζ/TCRβ之间的值。e中的单元格b用MCC刺激88-103-不表达(左)或表达hPD-L1(右)的预脉冲DC-1细胞。为pPLCγ1、PLCγ1、pAkt、Akt、pErk1/2或Erk1/2印迹wcl。f图表显示了pPLCγ/PLCγ(左)、pAkt/Akt(中)或pErk/Erk(右)的强度比(e). g中的单元格b与DC-1细胞(黑色)或表达hPD-L1的细胞(灰色)以及指示浓度的MCC共同培养88-103。ELISA法测定IL-2的浓度。未检测到。所有数据都来自两个独立的实验。条,5 μm。数据以平均值±SD表示。通过不成对的双侧进行统计分析t-测试和单向方差分析。****p < 0.0001. Source data for ag作为源数据文件提供。

我们检测了TCR下游激活信号分子的磷酸化状态,激活信号分子募集到hPD-1-SHP2抑制性微团簇。尽管在T细胞-SLB附着开始时,TCR微团簇被抗磷酸(p) CD3或含抗pSH2结构域的76 kDa白细胞蛋白(SLP-76)高度染色,但如果hPD-1与hPD-L1结合,这些磷酸化蛋白减少(图。2c和补充图。2b).pCD3与TCR的比率(pCD3ζ/TCR)或pSLP-76与TCR的比率(pSLP-76/TCR)在统计学上降低(图。2d和补充图。2c).正如预期的那样,蛋白质印迹分析证实了TCR/CD3复合物、磷脂酶Cγ (PLCγ)和激酶Akt和Erk的下游分子的磷酸化状态的降低(图。2e,f).为了证实这些生化结果是否与T细胞反应相关,我们分析了hPD-1的反应+MCC脉冲hPD-L1刺激的TCR T细胞+DC-1细胞通过IL-2产生,通过ELISA测定,发现在hPD-1-hPD-L1结合的存在下,T细胞产生较少的IL-2,表明hPD-L1介导的对T细胞生物反应的抑制(图。2g).

hPD-1-hPD-L1结合的封闭抗体抑制hPD-1微团簇的形成,并在每种抗体的足够浓度下恢复T细胞抑制

已经证实了hPD-1的微团簇形成和PD-1介导的T细胞抑制之间的相关性,我们接下来研究了我们的SLB成像系统是否适用于评估实验室中使用的抗hPD-1或抗hPD-L1对临床实践中使用的抗hPD-1或抗hPD-的抑制作用,如pembrolizumab、nivolumab、durvalumab和atezolizumab。所有抗体的亲和力和最佳剂量通过流式细胞术分析进行检测,用足够浓度的每种抗体对表达hPD-1或hPD-L1的细胞进行染色。浓度至少为2 μg/ml时,所有抗体都足以与几乎所有目标结合(补充图。3a,b).半最大有效浓度(EC50)是通过使用4参数逻辑函数从这些流式细胞术数据的平均荧光强度(MFI)计算的30EC值无显著差异50对于单个抗体(补充图。3c和补充表格1).通过加入足够浓度(10 μg/ml)的抗hPD-1/hPD-L1抗体,在T细胞和表达hPD-L1的SLB之间的界面上形成的hPD-1微团被破坏(图。3a,b,补充图。4a、b).在细胞-细胞接合试验中,如图。1e这些抗体的加入干扰了hPD-1和hPD-L1在T细胞APC界面的积聚(图。3c).这些T细胞分泌的IL-2的量见图。3c或补充图。4a通过添加抗hPD-1/hPD-L1抗体得以恢复(图。三维(three dimension的缩写)和补充图。4c).我们准备了脾脏CD8+来自OT-I TCR Tg的t细胞(特异性针对卵清蛋白257-264 [OVA257–264]装在H-2K上b)Rag2缺陷型(Rag2−/−)PD-1缺陷型(Pdcd1−/−)小鼠,由hPD-1重建(补充图。4d),并通过与H-2K共培养来检测这些表达hPD-1的T细胞的细胞毒性b肿瘤细胞系,EL-4细胞,无或有hPD-L1表达(补充图。4e).OT-I TgRag2−/− Pdcd1−/−CD8+如果这些细胞与表达hPD-L1的EL-4细胞共培养,表达hPD-1的t细胞表现出较低的细胞毒性,但加入抗hPD-1或抗hPD-L1后,由hPD-1-hPD-L1结合介导的抑制作用得到恢复(图。3e).我们使用表达hPD-1-EGFP的OT-I Tg T细胞和hPD-L1重建的SLB,通过我们的成像系统进一步评估了这些抗体对PD-1-PD-L1相互作用的阻断作用。在细胞毒性试验中,加入抗hPD-1或抗hPD-L1抗体抑制了hPD-1的微簇形成(补充图。4f,g).

图3:如果加入足够浓度的hPD-1或hPD-L1的封闭抗体,hPD-1微团簇形成的抑制与T细胞反应的恢复相关。
figure 3

a表达hPD-1-EGFP(绿色)的2D12细胞用DyLight 650标记的H57 Fab(红色)预染色,并铺在具有hPD-L1-GPI的SLB上,如图所示。1a。在浓度为10 μg/ml的pembrolizumab(抗hPD-1,第2行)、nivolumab(抗hPD-1,第3行)、durvalumab(抗hPD-L1,第4行)、atezolizumab(抗hPD-L1,第5行)、MIH1(抗hPD-L1,第6行)或29E.2A3(抗hPD-L1,底部)不存在或存在的情况下,接触后2分钟,通过共聚焦显微镜对细胞成像。b该图显示了形成hPD-1微簇的T细胞的百分比a (n= 30).c中的单元格a与MCC结合88-103T细胞APC接触后2分钟,在指定抗体存在或不存在的情况下,表达hPD-L1-卤标记(青色)的预脉冲(1微米)DC-1细胞和共聚焦显微镜图像。d中的单元格a与1个微米MCC共培养16小时88-103以及在指定抗体存在或不存在的情况下不表达或表达hPD-L1的DC-1细胞,并通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)一式三份测定每份上清液中IL-2的浓度。e Pdcd1−/−将由hPD-1重建的OT-I TCR-Tg T细胞与1 nM OVA共培养257-264-在没有或有浓度为10 μg/ml的抗hPD-1或抗hPD-L1的情况下,不表达或以所示E/T比率表达hPD-L1的脉冲靶EL-4细胞达16小时。在有和没有每种抗体的情况下,在计算的特异性裂解百分比之间进行统计。所有数据代表两个独立的实验。ns不重要。条,5 μm。误差条,SD。用单因素方差分析进行统计分析。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. Source data for b, de作为源数据文件提供。

我们还评估了hPD-1-GFP对IFNγ的产生+通过用表达H-2K的HCC827细胞刺激OT-1 Tg T细胞b并上调hPD-L1,如补充图所示。1c。通过添加抗hPD-1/hPD-L1抗体,来自这些T细胞的IFNγ的量趋于恢复(补充图。4h).在使用这些细胞的细胞-细胞接合实验中,hPD-1积聚在T细胞-HCC827细胞界面,并且通过添加抗体将其破坏(补充图。4i,j).

这些结果清楚地表明,通过加入抗hPD-1或抗hPD-L1,PD-1微团簇形成的抑制与T细胞反应抑制的反向效应(如IL-2产生和细胞毒性功能的降低)之间存在正相关。

每种抗体都需要自己的最佳浓度来从T细胞抑制中恢复

我们接下来检查了如上所述的针对hPD-1-hPD-L1结合的各种封闭抗体的最小浓度。浓度为10 μg/ml时,所有四个抗体克隆均可阻断hPD-1微团簇的形成,但每个克隆都具有抑制hPD-1微团簇形成所需的最低浓度(图。4a).分析这些成像数据,通过将hPD-1微团簇的总面积除以总细胞面积来计算T细胞内微团簇总面积的比率(%面积),并确认每种抗体所需的浓度(图。4b,补充图。5a、b).为了比较阻断hPD-1聚集的每种抗体的最小剂量与抑制T细胞生物反应的最小剂量,我们测量了进一步用相同的阻断抗体处理的表达hPD-1的T细胞产生的IL-2的浓度。三维(three dimension的缩写)(图。4c).然后,我们进行了线性回归分析,证实了图中hPD-1微团簇的总面积之间的强负相关。4b和IL-2的产量。4c,表明成像分析可能适用于评估生物功能(图。4d).通过计算百分比效应浓度(表1)从剂量反应曲线(图。4e和补充图。5c)30我们验证了计算的百分比效应浓度是否与上述成像数据相关,并得出了在EC时阻断hPD-1微团簇形成的速率25,欧共体50和欧共体75对于每个克隆体。我们注意到欧共体50所有四个克隆的比率足以阻断大多数T细胞中hPD-1微团的形成(图。4f).从生物学检查中获得了相似的结果,即需要什么浓度的抗体来恢复细胞毒性Pdcd1−/−OT-I TCR-Tg CD8+表达hPD-1的初级T细胞(图。第四代移动通信技术,补充图。5d,e和补充表格2).为了通过鼠体内实验评估这些体外发现,我们应用了一种荷瘤小鼠模型,其中我们进一步将hPD-L1导入OVA转染的淋巴瘤细胞系EL-4,E.G7(补充图。5f),并将E.G7-hPD-L1移植到Rag2−/−白化C57BL/6小鼠Pdcd1−/−OT-I TCR-Tg CD8+hPD-1重组的原代T细胞。给这些荷瘤小鼠接种指定浓度的每种ICI,然后测量每只小鼠的肿瘤大小,以在各组之间进行比较,从而判断对肿瘤缩小的效果(图。4h,我和补充图。5g).在接受高浓度(0.1mg/kg)nivolumab或durvalumab的组中,两种ICIs对移植的E.G7-hPD-L1的生长显示出相似的抑制作用(图。4i,对)。然而,在接受低浓度(0.001mg/kg)ICI的每个组中,durvalumab(而不是nivolumab)具有足够的能力来降低肿瘤生长(图。4i,左)。

图4: ICIs需要其自身的最佳浓度来阻断hPD-1–hPD-L1结合。
figure 4

a将表达hPD-1-EGFP(绿色)的2D12细胞铺在具有hPD-L1-GPI的SLB上。在与所示浓度的每种抗体接触后2分钟,对细胞进行成像。小节,5 μmb微团簇的总面积与单个T细胞中T细胞-SLB界面面积的比率(面积%)a).从方框上方所示的细胞总数中分析数据。框中心表示中间值、框边缘第25和第75百分位,以及胡须最小和最大百分位。c中的单元格a与MCC共培养88-103和不表达或表达hPD-L1的DC-1细胞,并通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测定IL-2的浓度。dPCC,R的平方,p值和线性回归方程之间的结果(b)和(c). e中的数据c在四种抗hPD-1和抗hPD-L1中被标准化。t细胞反应曲线用4参数逻辑函数描述。结果代表来自六个独立实验的汇总数据。每个图是这些实验的平均值。f在每种抗体存在下,在指定的有效百分比浓度下,形成hPD-1微团簇的T细胞的百分比(n= 30).g效应细胞的细胞毒性,Pdcd1−/−由hPD-1重建的OT-I TCR-Tg T细胞,针对靶细胞OVA257–264-在每种抗体存在下,E/T比为1的预脉冲EL-4细胞。h荷瘤小鼠体内实验的时间进程。i该图显示了表达hPD-L1的E.G7细胞的生长曲线Rag2−/−小鼠进一步注射Pdcd1−/−OT-I TCR-Tg CD8+t细胞加上浓度为0.001毫克/千克(左)或0.1毫克/千克(右)的nivolumab或durvalumab,如所示h。ns,不显著。小节,平均值SEM。所有数据代表两个独立的实验。误差线,SD,除了(i).用单因素方差分析进行统计分析。*p < 0.05. Source data for bgi作为源数据文件提供。

表1百分比效应的浓度,EC20,欧共体25,欧共体50,欧共体75,欧共体90和欧共体98从PD-1介导的对T细胞产生IL-2的抑制中恢复所需的pembrolizumab、nivolumab、durvalumab或atezolizumab

此外,我们评估了每种抗体在SLB上不同hPD-L1密度下对hPD-1微簇形成的抑制作用。发现甚至密度低于150分子/微米2例如75个分子/微米2和37.5分子/微米2,可以证实每种抗体阻断能力的差异(补充图。6a、b).

这些结果表明,每种ICI都具有通过阻断体外和体内hPD-1-hPD-L1结合来恢复T细胞功能的最佳浓度,并且确定每种ICI的最佳浓度以将hPD-1微团簇成像为通过hPD-1的T细胞衰竭的指标是有用的。

hPD-L2具有与hPD-L1相同的抑制功能,并可用于确定ICIs的实际效果

由于我们的成像系统可以用来评估ICIs对表达hPD-L1的某些癌症类型的作用,我们接下来建立了一个实验系统,使用由hPD-L2重组的SLB来检测表达hPD-L2的肿瘤。hPD-L2也可以在hPD-L2-GPI加载的SLB上的TCR微团簇上引入hPD-1的积累,其动力学与hPD-L1相同(图。5a、b).通过添加浓度为10 μg/ml的抗hPD-1或抗hPD-L2抗体24 F.10C12,抑制了由hPD-1-hPD-L2结合触发的hPD-1微团簇的形成(图。5c,d和补充图。7a).在细胞-细胞接合实验中,只有当DC-1细胞表达hPD-L2时,hPD-1和hPD-L2才在T细胞-DC-1细胞界面聚集(补充图。7b,c),hPD-1和hPD-L2的积累被抗hPD-1或抗hPD-L2的加入所破坏(图。5e).我们通过用hPD-L2刺激来测量表达hPD-1的T细胞产生的IL-2+图1所示的装甲运兵车。5e评价在hPD-1-hPD-L2结合控制下的生物反应。火奴鲁鲁警局-L2+DC-1细胞明显减少hPD-1产生的IL-2+加入抗hPD-1或抗hPD-L2,这种hPD-L2介导的抑制作用被取消(图。5f).基于由每种抗体的浓度和这些T细胞产生的IL-2之间的生态效率描绘的剂量-反应曲线(图。5g,补充图。7d,e),计算百分比效应浓度(补充表3).正如我们在hPD-L1的情况下注意到的,抑制hPD-1-hPD-L2产生所需的封闭抗体的浓度对于每种抗体是不同的。

图5: hPD-L2形成hPD-1微团簇,以与hPD-L1相似的方式抑制T细胞反应。
figure 5

a表达hPD-1-EGFP(绿色)的2D12细胞成像如图。1c在MCC上88-103-含有碘的预脉冲SLBk–和mICAM-1–GPI不带(上图)或带hPD-L2–GPI(下图)。TCRβ,红色。直方图显示了DIC图像中对角黄线上TCRβ(品红色)和hPD-1(绿色)的折叠荧光强度。b该图显示了接触后2分钟与hPD-1共定位的TCR微团簇的百分比a (n= 30).c中的单元格a在不存在(上图)或存在浓度为10 μg/ml的pembrolizumab(抗hPD-1,第2行)、nivolumab(抗hPD-1,第3行)或24 F.10C12(抗hPD-L2,下图)的情况下成像。d该图显示了形成hPD-1微簇的T细胞的百分比c (n= 30).e中的单元格a与MCC结合88-103在不存在或存在浓度为10 μg/ml的指定抗体的情况下,表达hPD-L2-卤标记(青色)的预脉冲(1微米)DC-1细胞,并在接触后2分钟成像。f中的单元格a与1个微米MCC共培养16小时88-103以及在不存在或存在浓度为10 μg/ml的每种抗体的情况下不表达或表达hPD-L2的DC-1细胞。用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定每份上清液中IL-2的浓度。g数据输入f在三种抗体中被标准化,T细胞反应曲线由4参数逻辑函数描述,如图。4e。结果是来自三个独立实验的汇总数据。每个图是这些实验的平均值。所有数据代表两个独立的实验。条,5 μm。数据以平均值±SD表示。统计分析由未配对的学生进行t-测试和单向方差分析。**p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. Source data for a, b, d, fg作为源数据文件提供。

为了模拟同时表达PD-L1和PD-L2的肿瘤的临床情况,临床医生不能决定哪种ICI是合适的,我们在SLB上重建了h PD-L1和hPD-L2-GPI蛋白,并成像了hPD-1在表达和TCR的T细胞上的行为。在表达hPD-L1和hPD-L2的SLB上,T细胞形成坚硬的hPD-1微团簇,加入抗hPD-1或抗hPD-L1加抗hPD-L2可破坏该微团簇(图。6a、b).即使仅将抗hPD-L1或抗hPD-L2加入到表达hPD-1的T细胞中,这些hPD-1微团簇也是稳定的。单独施用抗hPD-1或联合施用抗hPD-L1和抗hPD-L2,而不是单独使用抗hPD-L1或抗hPD-L2,干扰了hPD-1、hPD-L1和hPD-L2在hPD-1之间的界面上的积聚+t细胞和DC-1细胞在细胞-细胞接合试验中同时表达hPD-L1和hPD-L2(图。6c)并同时恢复相同实验组中这种T细胞的IL-2产量(图。6d).

图6:抗hPD-1单独阻断,但是抗hPD-L1和抗hPD-L2协同阻断hPD-1和hPD-1配体之间的结合。
figure 6

a细胞成像如图2所示。1c接触MCC后2分钟88-103-含有碘的预脉冲SLBk–、mICAM-1–、hPD-L1–和hPD-L2–GPI,在10 μg/ml的浓度下,不存在(上图)或存在pembrolizumab(抗hPD-1,第2行)、nivolumab(抗hPD-1,第3行)、29E.2A3(抗hPD-L1,第4行)、24 F.10C12(抗hPD-L2,第5行)或29E.2A3和24 F.10C12(下图)hPD-1-EGFP,绿色;TCR,红色。b该图显示了形成hPD-1微簇的T细胞的百分比a (n= 30).c中的单元格a与MCC结合88-103-预脉冲(1微米)DC-1细胞表达hPD-L1-SNAP-tag(红色)和hPD-L2-HaloTag(青色)加抗体,如a和接触后2分钟的图像。d中的单元格a与1个微米MCC共培养16小时88–103以及不表达或同时表达hPD-L1和hPD-L2加抗体的DC-1细胞(a).用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定每个上清液中的IL-2。ns不重要。所有数据代表三个独立的实验。条,5 μm。数据以平均值±SD表示。用单因素方差分析进行统计分析。***p < 0.001, ****p < 0.0001. Source data for bd作为源数据文件提供。

联合使用抗hPD-1和抗hPD-1配体可能会更有效地消除PD-1介导的T细胞抑制

为了确定四种ICIs之间更有效的组合以及它们在这些应用中的最佳剂量,我们检测了表达hPD-1的T细胞在MCC刺激下的反应88-103-在ICIs的各种组合和剂量存在下,表达hPD-L1的预脉冲DC-1细胞。如表中所示1,与欧共体相比90和欧共体98,欧共体50对于每种抗体来说,恢复这些T细胞产生IL-2所需的时间都非常低。然而,在每个EC中联合使用抗hPD-1和抗hPD-L150显示出比单独使用每种抗体在其自身EC时更大的IL-2产生增强90(图。7a,b).抗hPD-1或抗hPD-L1的不同克隆的组合在恢复IL-2产生方面不如抗hPD-1和抗hPD-L1的那些有效。此外,在T细胞抑制中同时使用抗PD-1和抗PD-L1的这种组合效果通过成像hPD-1微团簇的形成是否被抑制来评估。当抗hPD-1或抗hPD-L1以低浓度EC单独加入时20或者当加入两种不同的抗hPD-1或抗hPD-L1克隆时,hPD-1微团簇保留下来,但是如果T细胞用低浓度的每种EC的抗hPD-1和抗hPD-L1组合处理20,hPD-1微团簇的形成被明确抑制(图。7c,d).如图所示。4b当联合添加抗hPD-1和抗hPD-L1时,hPD-1微团簇的总面积减少(图。7e).

图7:抗hPD-1和抗hPD-1配体的组合使用更有效地消除了hPD-1介导的T细胞抑制。
figure 7

a表达hPD-1-EGFP的2D12细胞与MCC共培养88-103和在所示抗体组合存在下以从EC计算的个体浓度表达hPD-L1的DC-1细胞50。用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定IL-2的浓度。p,pembrolizumabn,nivolumabd、durvalumab答:阿替唑单抗。bIL-2增加的比率在(a). c中的单元格a在接触MCC后2分钟成像88-103-含有碘的预脉冲SLBk–、mICAM-1–和hPD-L1–GPI,在不存在或存在指定抗体组合的情况下,根据EC计算个体浓度20. d形成hPD-1微团的T细胞百分比c (n= 30).e该图显示了在(c).从方框上方所示的细胞总数中分析数据。框中心表示中间值、框边缘第25和第75百分位,以及胡须最小和最大百分位。f同样的文化a使用表达hPD-L1和hPD-L2的DC-1细胞,在不存在或存在指定浓度的抗体的情况下进行。g中的单元格a与MCC结合88-103-在不存在或存在浓度为0.1 μg/ml的彭布罗利珠单抗和/或29E.2A3和/或24 F.10C12的情况下,表达hPD-L1-SNAP-tag(红色)和hPD-L2-卤代tag(青色)的预脉冲DC-1细胞。接触后2分钟获取图像。h该图显示了在T细胞-DC-1细胞界面(n= 30).所有数据代表两个独立的实验。ns不重要。条,5 μm。误差条,标准偏差(SD)。用单因素方差分析进行统计分析。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. Source data for a, b, dfh作为源数据文件提供。

最后,用三种抗体(抗hPD-1、hPD-L1和hPD-L2)进行联合治疗的效果通过与图1所示相同的生物学试验进行评估。7a,b,其中将抗体的每个组合加入到hPD-1的聚集培养物中+和-具有MCC的TCR T细胞88-103-共表达hPD-L1和hPD-L2的预脉冲DC-1细胞。当单独加入抗hPD-L1或抗hPD-L2时,在所有抗体浓度下观察到T细胞IL-2产生的恢复较少,但低于10 μg/ml。然而,当联合使用抗hPD-1或两种或多种抗体时,观察到IL-2产生的恢复依赖于抗体的浓度。如果联合使用三种抗体,即抗hPD-1、抗hPD-L1和抗hPD-L2,每种抗体在非常低的浓度(0.1 μg/ml)下就足以恢复IL-2的产生(图。7f).三重抗体存在时,在T细胞-DC-1细胞界面上的hPD-1、hPD-L1和hPD-L2的转运被完全阻断,每种抗体的浓度都很低,而如果抗体以单一或双重组合使用,至少有一种hPD-1、hPD-L1和hPD-L2保留在界面上(图。7g高).基于这些结果,我们认为,与高剂量下单独使用抗体相比,针对多个靶标的抗体的组合使用在低剂量下会更有效。

讨论

在这篇报告中,我们建立了一个单分子成像系统,以可视化人类免疫检查点受体hPD-1的精确行为,并重新发现了一个信号体hPD-1微簇,它是由hPD-1与其配体hPD-L1和hPD-L2结合形成的。我们进一步详细证实了磷酸酶SHP2在PD-1微簇上的募集,通过TCR下游信号分子的去磷酸化来减弱TCR信号,并通过各种生物化学和生理学方法完全确定了hPD-1微簇是一种抑制性信号体。我们评估了临床使用的抗PD-1、抗PD-L1或抗PD-L2的每个克隆的阻断作用,并证实我们的分子成像策略与生物学功能的常规分析相关。

在临床实践中,相同量的ICIs或体重调整剂量的ICIs被均匀地施用给具有不同体重和一般健康状况的患者,因此很难判断每个患者的血液浓度是否是最佳的。我们证实,加入足够浓度的抗hPD-1、抗hPD-L1或抗hPD-L2均可抑制hPD-1-hPD-L1或-hPD-L2结合,但每种抗体都有其自身的最低浓度,这是物理抑制结构结合和从生理衰竭状态中恢复T细胞所必需的。从小鼠体内荷瘤小鼠模型中获得了类似的结果,其中移植了表达OVA的淋巴瘤细胞系E.G7细胞,并通过CD8引入了抗肿瘤反应+来自OT-I TCR-Tg小鼠的t细胞。欧共体的差异50前一份报告中的值30可能受hPD-1或hPD-1配体的表达水平影响。此外,在这项研究中,使用了来自小鼠的细胞,但为了评估治疗性抗体的阻断能力,最好接近人类系统,这是我们下一步的研究任务。

我们还发现联合使用抗PD-1和抗PD-L1比使用两种靶标相同的克隆抗体PD-1或PD-L1更有效地恢复了hPD-1介导的T细胞抑制。此外,我们使用包含抗PD-1、抗PD-L1和抗PD-L2的三重抗体评估了抗体鸡尾酒对T细胞恢复的作用,并且我们发现了针对不同靶标使用多个克隆的微小但可靠的优势。作为有效使用多种抗体的一个例子,邱等人报道了一种由三种不同的针对埃博拉糖蛋白的单克隆抗体组成的鸡尾酒疗法,这种鸡尾酒疗法是从以前的抗体鸡尾酒疗法中优化出来的,是治疗由埃博拉病毒引起的感染的一种成功疗法31。在我们的实验中,我们发现联合使用针对同一靶标的抗体几乎没有效果,但是如果我们使用表位不同的其他抗体,我们可能会获得更大的效果。我们认为,选择最佳的抗体组合对于有效治疗某些疾病非常重要。

先前的报道显示PD-1在T细胞和B细胞中强烈地募集SHP2,而不是SHP114,27,32。另一方面,一些报道讨论了PD-1在T细胞中募集SHP1和SHP233。虽然在我们的实验中我们不能证实mSHP1募集到hPD-1,但我们不能否认mSHP1也可能以与mSHP2相似的方式起作用的可能性。此外,我们已经表明,在mPD-1被mPD-L1或mPD-L2交联后,SHP2向PD-1微团簇的募集短暂而迅速地发生。SHP2的聚集只需要几十秒钟14,27。相比之下,其他报告已经从生物化学方面证明了人SHP2立即被募集到hPD-1的胞质尾部,而hSHP2在hPD-1的共定位往往比mPD-1与mSHP2的共定位时间更长34。在本报告中,我们还证实了SHP2与hPD-1的长期相关性,在抗原刺激后维持30秒至5分钟。鼠和人PD-1之间PD-1-SHP2结合持续时间的差异可以用结构差异来解释,特别是在ITIM和/或ITISM中或其周围的氨基酸序列32,33,所以需要进一步的检查来证明这种考虑。

近年来,世界各地已经开发了许多ici。每个公司都在强调其产品与其他公司产品的区别特征,如抗体的同种型,包括抗体依赖的细胞介导的细胞毒性的存在与否,人源化抗体在人和其他动物之间的嵌合性,以及基于蛋白质科学、结晶学、分子工程等分析的特征的结构稳定性。然而,如上所述,每个ICI指示哪个患者,哪个对该患者是最好的,目前简单地基于I期试验的第一个设计。由于每个患者的ICI的每个适应症是由他们的年龄和任何先前治疗的病史决定的,所以目前没有适应症的科学依据。我们首先证实,加入足够浓度的抗体的抗hPD-1、抗hPD-L1或抗hPD-L2同样可以消除T细胞的抑制状态。我们接下来发现,这些抗体需要自己的最佳浓度才能从T细胞抑制中恢复。显然,每种ICI都应该以适当的剂量给患者服用,要考虑到患者的情况和临床试验中的实验环境之间的差异。如果疗效相似,通常建议使用最小剂量的抗体。因此,我们认为ICIs的剂量应该减少到适当的量作为一个合理的目标。当然,抗体结合位点的面积通常与这些抗体的亲和力不相关,但是如果这些面积与这些抗体结合的位点明显重叠,这些抗体将在受体-配体对的阻断中提供更多的优势35,36,37,38。这里,我们认为从PD-1介导的T细胞抑制中恢复所需的抗体剂量的差异可能是由于这些抗体结合的表位的差异。由于hPD-L1在不同组织学分类或肿瘤微环境中的肿瘤细胞上以不同水平表达,不能精确设定SLB上的hPD-L1分子的数量与肿瘤上表达的数量相同可能导致差异,其中大多数hPD-1微簇的形成被EC浓度的每种ICI的加入所抑制50。我们希望,如果我们模拟SLBs的实验条件,更接近于肿瘤患者引流淋巴结或肿瘤微环境中树突状细胞的设置,我们可以更准确地评估ICIs对肿瘤抑制的作用。

值得注意的是,如果SLB上hPD-L1的密度偏离一定范围,就不能观察到hPD-1微团簇的形成。如补充图所示。1a和补充图。7a,b当hPD-L1的密度在37.5分子/微米之间时,可以观察到hPD-1微团簇的形成及其通过添加抗体的抑制2和150个分子/微米2,但是当密度低于18.75分子/微米时,很难将它们可视化2或高于300分子/微米2。开发具有更宽范围的hPD-L1分子密度的成像系统来评估封闭抗体的能力是未来的挑战。我们的初步实验表明,当MHCⅱ类和共刺激配体CD80以非常高的密度重组为SLB时,特别是在生理范围之外,TCRs和CD28分别在T细胞-SLB界面上同源移位。因此,在一些配体高水平表达的情况下,受体均匀聚集在免疫突触以引入它们的信号传导可能是一种生理现象。

我们在本文中证明,如果hPD-L1仅在肿瘤上表达,在最低抗体浓度下,抗hPD-L1比抗hPD-1能更有效地阻断hPD-1-hPD-L1结合。相反,当hPD-L2仅在肿瘤上表达时,抗hPD-1仅用于治疗,因为目前没有抗hPD-L2被批准用于治疗。如果将来开发出对hPD-1-hPD-L2阻断具有高效力的任何抗hPD-L2,如24 F.10C12,并批准用于治疗用途,那么与抗hPD-1相比,我们可以用更小剂量的抗hPD-L2获得足够的效力。当hPD-L1和hPD-L2都在肿瘤上表达时,我们必须选择抗hPD-1,因为目前没有商业抗hPD-L2。在这些情况下,对于分别表达hPD-L1和hPD-L2的肿瘤,与抗hPD-L1和抗hPD-L2相比,治疗可能需要更高剂量的抗hPD-1。因此,我们的评估策略(包括高分辨率成像)的优势在于,它可以识别可用ICIs的特征,以便为每个患者选择合适的ICIs,并且还可以用于比较新药与药物开发过程中使用的其他药物的功效。

近年来,多种抗体联合疗法已被证明对各种疾病或癌症类型具有疗效39,40,41,42。这一证据是基于这样一种想法,即将几种针对不同靶的抗体组合起来可以产生协同效应,或者即使一种抗体由于突变而丧失了与靶分子的结合能力,另一种抗体的抑制效应也将确保一定的抗肿瘤效应。与ICIs相似,最近的新冠肺炎·疫情不约而同地证明了一些具有不同表位的抗体混合物的优势41,42。最流行的ICIs组合可能是nivolumab和抗hCTLA-4,ipilimumab的联合,据报道其具有效率和可接受的副作用39,40。有趣的是,pembrolizumab(抗hPD-1)和ipilimumab(抗hCTLA-4)的组合效果较差,而nivolumab(抗PD-1)和ipilimumab(抗hCTLA-4)的组合效果较好,如果患者接种的ICIs组合剂量相似43。这两种联合治疗的临床结果的不一致可以用抗hPD-1结合的表位的差异来解释,但是精确的机制仍然难以捉摸。我们的实验证明,在相对较低的浓度下,pembrolizumab可以抑制hPD-1-hPD-L1结合,而nivolumab在超过10倍的抗体浓度下显示出类似的效果。当仅给予小剂量的nivolumab时,它可能不能完全抑制PD-1-PD-L1结合;因此,ipilimumab的加入可能导致与nivolumab协同的补偿抗肿瘤作用。

在本报告中,我们比较了通过极低剂量的抗-hPD-1和抗-hPD-L1的组合使用对PD-1-PD-L1结合的阻断作用与相对较高剂量的每种抗体的单独使用的阻断作用,并表明这种组合使用将比足够剂量的单独使用更有效。当hPD-L1和hPD-L2都表达时,在低浓度下联合使用具有不同靶标的多种类型的抗体可能是有用的。在通过hPD-L1和hPD-L2检测到肿瘤的情况下,选择针对不同靶标的多个克隆并以低浓度使用它们来阻断hPD-1-hPD-L1和-hPD-L2结合将是有用的。如果以比目前使用量更少的量组合使用各种ici,可以预期对肿瘤免疫治疗具有更大的效果,这也将导致医疗资源和成本的节约。由于肿瘤不断诱导基因突变,我们偶尔会在hPD-1中发现意想不到的突变。多种克隆的多次使用将最小化由这些突变引入的ICIs的抗肿瘤效果的不期望的降低。

在本文中,我们通过生物化学、生理学和分子成像技术评估了各种抗hPD-1、抗hPD-L1或抗hPD-L2对hPD-1-hPD-1配体结合的阻断效率以及它们的组合。为了选择个体癌症患者的最佳治疗方案,PD-1的基础实验,包括本文中的分子成像,将变得越来越重要,并且这些类型的研究将在未来应用于临床实践。