介绍

在癌症中,来自脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTPs)的DNA合成和修复被增强;然而,细胞dNTP水平很低,仅支持几分钟的DNA复制1,2,3。因此,dNTP库是通过冗余和强烈调节的生物合成途径“按需”产生的4,5,6。有两种类型的脱氧核糖核苷酸途径:(I)从头途径(DNP),其中核苷酸由更简单的化合物组装而成,和(ii)补救途径(SP),其中降解的RNA和DNA再循环成新的核苷酸。DNP以葡萄糖和氨基酸为碳源和氮源,产生核糖核苷酸二磷酸,通过关键酶核糖核苷酸还原酶(RNR)转化为脱氧核糖核苷酸二磷酸7。近几十年来,已经开发出阻断这一途径的疗法,如RNR抑制剂8,9;然而,肿瘤耐药性可以通过替代SP的上调而产生。SP通过代谢激酶和磷酸核糖转移酶的联合作用,将RNA和DNA降解形成的核苷片段回收成核苷酸。核碱基被磷酸核糖转移酶回收:腺嘌呤磷酸核糖转移酶(APRT),它从腺嘌呤形成AMP,次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT),它从次黄嘌呤形成IMP(肌苷一磷酸)和从鸟嘌呤形成GMP(鸟苷一磷酸)。相反,核苷被核苷激酶回收。胞质SP中的第一个酶促步骤由胸苷激酶1 (TK1)催化,其磷酸化胸苷(dT)。此外,脱氧胞苷激酶(dCK)催化生理嘧啶和嘌呤的5′-磷酸化,包括2′-脱氧胞苷(dC)、2′-脱氧腺苷(dA)和2′-脱氧鸟苷(dG)。由于其广泛的底物特异性,dCK是限速酶和SP的关键成员10。许多抗癌和抗病毒核苷类似物,如吉西他滨、阿糖胞苷和拉米夫定的第一次磷酸化也需要dCK11。然后,脱氧核苷单磷酸(dNMPs)在另外两个步骤中进一步磷酸化成脱氧核苷三磷酸(dNTPs),这两个步骤由核苷单磷酸激酶(NMPK)和核苷二磷酸激酶(NDPK)执行。

癌细胞利用主要DNP的生物合成能力不足,这是因为增殖增强和不受控制导致dNTPs消耗增加。为了满足细胞生长的代谢要求,癌细胞必须同时参与DNP和SP,以达到足够的核苷酸库来支持其核酸合成速率。虽然对DNP和SP如何协同工作知之甚少,但已经确定这些途径的相互关系能够上调SP对DNP的抑制,这增加了特定癌细胞对SP产生核苷酸的依赖性12。在癌症中,淋巴样白血病和淋巴瘤已被证明对抑制核苷酸合成的化疗方案高度敏感。事实上,如癌细胞系百科全书中大量人类癌症模型的RNASeq和定量蛋白质组学数据所揭示的,这些疾病相对于正常组织表现出增加的dCK表达13和人类蛋白质图谱14。因为dCK是SP的限速酶,所以它是SP必需或上调的癌症的抗增殖治疗的选择目标。在这种情况下,dCK最近被证实是肿瘤学中的一个相关靶点。在一项关于急性淋巴细胞白血病(ALL)的研究中,Nathanson等人发现了一种缺乏治疗选择的癌症。12证实了癌细胞将它们的dNTP合成从DNP切换到SP的能力。共同靶向dCTP生物合成的两种途径在小鼠中耐受性良好,并且在T细胞和B细胞ALL (T-ALL和B-ALL)模型中有效,证实了DNP和SP的联合靶向是对这些癌细胞的有效治疗。另一项研究提出,白血病细胞中核苷酸生物合成的可塑性由共济失调毛细血管扩张和Rad3相关蛋白(ATR)信号和核苷酸代谢适应机制介导15。作者假设并证实了dCK是白血病中ATR抑制的重要抵抗机制,因为dCK活性可以补偿ATRi诱导的RNR下调。因此,dCK是采用合成致死方法的双重DNP/SP治疗策略的有效靶点。

在之前的研究中16,我们采用反向蛋白质组学方法(药物重新定位),将dCK确定为选择性酪氨酸激酶抑制剂(TKi) masitinib的非靶标。Masitinib正在接受多种病理学的III期临床试验评估,如肥大细胞增多症和肌萎缩侧索硬化,但当与吉西他滨(一种用于化疗的脱氧胞苷类似物)联合使用时,它也可以使吉西他滨耐药的癌细胞系增敏17,18。这种致敏作用的目标是dCK,我们揭示了masitinib以及其他一些用于治疗癌症的TKis(如伊马替尼)如何与dCK相互作用。我们发现了这种以前未知的分子相互作用,导致了dCK的激活。这种激活导致这种核苷酸激酶的生理(例如dC)和前药(例如吉西他滨)底物的磷酸化增加。dCK与马西替尼和伊马替尼复合物的晶体结构得到了解决,我们能够描述dCK是如何被构象依赖机制激活的,该机制涉及与底物结合位点部分重叠的动态功能口袋。由于masitinib被证明是dCK酶活性的优秀调节剂,并且晶体结构的解析提供了关于结合模式的关键信息,我们决定启动一项药物设计计划,以开发新的masitinib衍生物,即dCK抑制剂。

新药的发现和开发是一个非常昂贵和缓慢的过程,并且重新定位旧药物以治疗其他疾病正日益成为一个有吸引力的提议,因为它涉及使用具有潜在较低总开发成本和较短开发时间的化合物19。在这种情况下,在药物设计和药物重新定位之间的界面上,我们决定应用一种综合的多学科药物设计方法来重新调整现有药物在新靶点上的用途,并开发新的衍生物,以加速经典药物发现、命中识别和从命中到先导优化的过程。

我们假设与dCK相互作用水平的增加可以触发从激活到抑制的转换;因此,在这项工作中,我们合理地设计了新的马西替尼衍生物,以增加它们的结合位点互补性和dCK亲和力,从而诱导酶抑制。随后,人们认为新设计的dCK抑制剂与RNR抑制剂的组合可以有效地对抗癌细胞并防止逃逸机制,因为两种途径(DNP和SP)将被同时抑制。我们将我们的hit-to-lead整合方法——多样性导向的目标导向合成法(DOTS)应用于马西替尼。DOTS依赖于高度自动化的电子化学库设计和基于片段的药物设计以及实验评估过程20。在目前的研究中,我们设计了一个masitinib衍生物的原始文库,并逐步实施关键的化学修饰以增加蛋白质-配体相互作用和活性。探索这些探针的作用模式:我们研究dCK对新化合物的亲和力,解析与dCK复合的最佳衍生物的3D晶体结构,并评估对dCK酶活性的影响。此外,我们在T-ALL细胞模型中评估了这些新的dCK抑制剂与RNR抑制剂联合应用的体外抗增殖活性。最后,主要的dCK抑制剂OR0642与生理抑制剂RNR联合进行了体内研究。联合治疗使人类白血病小鼠模型以及患者来源的异种移植物模型中的中位生存期加倍,这显示了T-ALL治疗的治疗潜力(至少)。目前的工作证明了这种药物设计方法的概念验证,其中药物(masitinib,一种TKi靶向c-KIT)在新靶点(dCK)上的再利用可以用作设计和加速优化更好的抗癌药物的自动化过程的起点。

结果

从激活到抑制:概念的证明

这项工作的起点是利用观察到的dCK和masitinib之间的晶体结构相互作用,该相互作用位于只能以开放形式进入的酶活性口袋的延伸部分16。令人惊讶的是,这种复合物主要由疏水接触驱动,并激发了旨在改善配体/dCK互补性的结构-活性关系(SAR)计划,以开发有效的dCK抑制剂。作为概念的证明,我们首先合理设计合成了两个masitinib衍生物,命名为“dCKi1”和“dCKi2”(图。1a),在吡啶环(环A)上有微小的修饰。该环与底物结合位点部分重叠,我们决定模拟与周围残基的接触,如生理底物脱氧胞苷(dC)的4-氨基嘧啶-2-酮结合在底物腔中时所见(补充图。1).这两种类似物与dCK的结合使用热位移分析(TSA)进行评估(图。1b)和等温滴定量热法(ITC)(图。1c和补充图。2).正如所料,dCKi1和dCKi2对dCK的结合亲和力增加。这些新化合物产生的dCK热稳定性分别从masitinib的7.4°C大幅提高至dCKi1和dCKi2的14.3°C和17.3°C。1.4微米离解常数(KD)观察到的马西替尼,由ITC测定16,在这两个小的化学修饰后提高了10倍以上;我们测量了KDdCKi1的值为128纳米,dCKi2的值为37纳米。dCK与dcki 1/尿苷二磷酸(UDP)或dCKi2/UDP复合物的晶体结构证实了与马西替尼相似的结合模式。dCKi1和dCKi2从底物结合位点延伸至占据变构动态功能袋的溶剂,该变构动态功能袋已在先前的dCK抑制剂中描述过21,22,23远离UDP占据的磷酸供体位点(见图。1d,补充图。1和结晶方法)。该结构还揭示了dCK和新化合物之间的额外氢键接触(图。1d),解释了美国运输安全管理局和美国国际贸易中心之前观察到的亲和力增加。参与这些相互作用的关键残基是GLU-53、GLN-97和ASP-133,这三种氨基酸位于底物结合位点。此外,还进行了生化分析,以研究在UTP和dCKis存在的情况下,dCK对dC的酶促磷酸化(图。1e)(有关磷酸盐供体的更多信息,请参见酶分析方法)。这些实验揭示了dCK酶活性的变化。虽然马西替尼是仅增加dCK酶活性的调节剂,但其衍生物在高浓度下也诱导dCK酶活性降低;因此,dCKi1和dCKi2从激活剂转变为抑制剂(微摩尔范围)。此外,在表达人c-KIT受体(masitinib靶向的主要酪氨酸激酶)的细胞中进行了测定,并证实了在这两个较小的化学修饰后对该靶标的抑制作用降低(图。1f).最后,我们开发了一种差异代谢细胞测定法来研究DNP和SP的抑制剂,并验证了dCK抑制剂和RNR抑制剂联合应用对这些途径的协同抑制是否能导致细胞增殖的抑制。我们使用生理性RNR抑制剂胸苷(dT ),因为外源添加的dT通过胸苷激酶产生的dTTP通过R1亚单位的变构调节作为嘧啶还原的RNR抑制剂24。dC的加入完全阻止了dT诱导的S期细胞周期停滞,并通过dCK恢复了SP的增殖。DNP和SP之间的协同关系以及外源添加的dT、dC和dCKi对细胞周期停滞的影响总结于补充图。3。对人白血病(T-ALL)细胞系CCRF-CEM的研究结果显示,虽然马替尼不能与dT联合抑制癌细胞增殖(图。第一代),dCKi1和dCKi2在低微摩尔浓度(IC50分别为6.9米和8.9米)(图2d).

图1:两个最初的马西替尼衍生物显示出对dCK的亲和力和酶抑制作用增加。
figure 1

a显示环和接头的Masitinib、dCKi1和dCKi2结构。b通过TSA测量的masitinib、dCKi1和dCKi2的dCK热稳定性(n= 3).cdCK与马西替尼结合16、由ITC确定的dCKi1和dCKi2(n= 3).ddCK(灰带)的晶体结构与UDP(黄色)和dCKi1(橙色)(PDB)的叠加7ZI1)或dCKi2(绿色)(PDB7ZI2). e显示在UTP存在下,masitinib、dCKi1和dCKi2对dCK底物磷酸化的影响的代表性实验(n= 3).f显示在不存在IL3和存在细胞干细胞因子(SCF)的情况下,masitinib、dCKi1和dCKi2对IL3依赖性Ba/F3细胞系(表达WT人c-KIT)的细胞增殖的作用的代表性实验(增殖依赖于c-KIT) (48小时) (n= 3).g在不存在或存在dT (111 M)和dC (1 M)的情况下,masitinib、dCKi1和dCKi2 (10 M)对白血病细胞系CCRF-CEM (T-ALL)的细胞增殖的影响(72小时)。NS表示马西替尼和马西替尼+dT + dC之间无统计学意义。统计显著性是**P= 0.0011和***PdCKi1和dCKi2分别= 0.0001(dCKi+dT+dC与单独dCKi相比,双尾不成对t检验)。所有数据都表示为平均值±标准差(n= 3).

图2:具有改善的亲和力、酶抑制和细胞活性的dCK抑制剂的优化。
figure 2

a74种合成化合物对dCK热稳定性(由TSA测定)和dCK细胞增殖试验(CCRF-CEM细胞系)的影响。数据显示为平均值。b通过TSA测量选定化合物的dCK热稳定性。数据表示为平均值±标准差(n= 3).c两个独立实验之一的代表性曲线,显示了在ATP存在下所选化合物对dCK底物磷酸化的影响。数据表示为三次技术复制的平均值±SD。d显示在dT (200 M)和dC (1 M)数据存在下所选化合物对CCRF-CEM细胞系细胞增殖的影响的代表性实验以平均SD(n= 3).eOR0642的化学结构。f与OR0642(品红色)和UDP(黄色)(PDB)复合的dCK(灰色带)的结构7ZI3)显示了到dCK的氢键网络(黑色虚线)。OR0642 CF之间的VdW相互作用3群组和dCK ILE-200和PRO-201在缩放插入中显示为绿色虚线。g化合物周围的网格显示了配体周围轮廓为2.0σ的| 2Fo | | Fc |电子密度图(蓝色)和轮廓为1.0σ的| Fo | | Fc |电子密度图(橙色),后者是在优化前省略模型化合物后生成的(省略图)。

集成(迭代)方法,用于命中至销售线索优化

由这些化学修饰诱导的从激活剂到抑制剂的成功转变,推动了以dCKi1/dCKi2为起点的“从击中到领先”优化策略的发展。我们之前开发了一种高度自动化的迭代和多学科的基于片段的药物设计(FBDD)方法,依赖于通过DOTS结合实验评估的计算设计20。这种方法被设计来处理在FBDD环境中常用的增长和连接策略。简而言之,DOTS的计算机阶段最初依赖于两个主要步骤:(I)通过使用相容的药物化学反应将初始hit的激活形式与可用构件的集合相结合来设计多样性导向的化学库,以及(ii)使用基于模板的对接方法对该库进行虚拟筛选,以对最佳相互作用化合物进行优先排序。DOTS之前已经被我们的团队在其他药物化学项目中验证过,并在较短的时间内成功生成了潜在的先导化合物20.

我们的目标是广泛探索dCKi1和dCKi2化合物的化学空间,优化系列,同时最大限度地减少合成和筛选的化合物数量:25,26一个“综合性多学科药物设计”加速项目。然而,与以前基于生长的碎片到铅项目不同,该化合物的多种化学元素被同时研究。因此,通过插入常用有机修饰(官能团、具有不同间隔基的环)的字典,对每个部分进行系统的探索比依赖于原始的DOTS工作流程更有效。

最后,使用基于模板的对接模式,在SeeSAR软件中直接评估设计的化合物,以快速识别最有希望的化学修饰。此外,其他设计,如不同系列之间的嵌合化合物,也在SeeSAR中进行人工评估。最后,结合模式的视觉分析、缺乏构象警告和共同的物理化学性质(例如,logP或MW)被用于对要合成的化合物进行优先排序。

在合成每个新的类似物系列后,实施实验多学科管道,使用生物物理学、生物化学、结构生物学和细胞生物学的方法评估每个化合物。新合成化合物的dCK亲和力由TSA测定,而dCK的酶活性在UTP和ATP存在下进行评估,必要时测定化合物的调节作用(激活剂对抑制剂)。晶体结构被解决,并且模型细胞系(CCRF-CEM)被用于研究细胞增殖的抑制。在这个迭代的工作流程中,在一个步骤中获得的知识直接用于新系列化合物的优化。

通过TSA、酶分析、X射线晶体学和细胞分析进行化合物优化研究

5个马西替尼环(A、B、C、D和E)和4个接头中的3个(图。1a)以及亚结构融合在DOTS/药物化学运动中被相继探索。通过几个周期的优化,超过1000个模拟化合物被设计并在目标的3D结构中进行评估。选择每个循环中排名最高的化合物进行合成和评价,最终得到总共74种化合物。这74种化合物通过TSA和细胞分析获得的实验评价总结在补充表中1和图。2a。由这些化合物的结合产生的dCK热稳定性在+4.1至+22.4℃的范围内(δTm).使用dCK细胞分析(补充图。3),我们研究了dT与新的dCK抑制剂的组合对DNP和SP的抑制是否会导致细胞增殖的抑制。对人类白血病(T-ALL)细胞系CCRF-CEM的研究结果表明,新化合物能够与dT联合抑制癌细胞增殖。获得的集成电路50细胞增殖值在37 μm和2 nM之间。从所有这些合成的衍生物中,9种化合物可以说明最终先导化合物的整个优化过程。这些化合物表现出关键的修饰,通过增加生物化学性质、亲和力和体外活性来推动先导化合物的优化(图。2b–d).药物化学运动总结在图。3,其中SAR研究的这9个关键化合物以及dCKi1和dCKi2被作为优化的里程碑放置在决策树中,从而产生了我们的先导化合物。

图3:命中引导决策树。
figure 3

点击销售线索优化活动的决策树,显示了推动SAR优化从masitinib(蓝色)、dCKi1(橙色)和dCKi2(绿色)到ORO0642(洋红色)的9个关键里程碑化合物。对于每种化合物,TSA(δTm,C)和dCK蜂窝(IC50nM)的测量值。在每个步骤中,分子的修饰部分用彩色圆盘突出显示,关于马西替尼的全部修饰用红色突出显示。

在第一次修饰dCKi1中的A环后,研究了接头C–D,因为预计酰胺基团在dCK中是次优的,并且也被认为是TKi药效基因的关键元件。对不同的置换接头(例如,不同长度的反向酰胺、醚、烷烃/烯烃/炔烃链和附加环)进行了计算机评估,抑制酰胺部分以获得线性联苯核心(OR0274)被优先考虑为最有利的修饰,增加了亲和力(δTm+16.7°C)和体外细胞活性(IC502096 nM)。接头D–E延长了一个碳(OR0325 ),以补偿酰胺基团的损失,并在结合位点内更好地容纳E环。结果,亲和力和体外细胞活性都增加了(δTm+ 17.8癈和IC501676 nM)。还预测在连接体B-C的氮原子上添加疏水链可以通过使强范德华(vdW)与几个紧密的疏水残基接触而对亲和力产生有利的影响。为了优化这个接头,我们合成了一系列的类似物N-丙基衍生物(OR0345)显示出非常有趣的特征,dCK酶促活化完全丧失(补充图。4),亲和力增加,细胞IC降低3倍50Tm+ 18.4癈和IC50505纳米)。X射线结构证实了我们的假设,在丙基部分和几个疏水残基(ILE-30和ILE-200)之间有最佳的vdW接触(补充图。5).

后来,通过将稍微改进的dCKi2与dCKi1优化结论合并,合成了由几个成功修饰组成的融合类似物(OR0600)。正如所料,这种衍生物的亲和力增加,dCK稳定性达到+20°C(δTm).此外,这种化合物仅表现出酶抑制作用(在低浓度下没有激活作用),因为存在N-丙基部分(补充图。4)和提高的体外细胞活性(IC50341纳米)。然后从这种有效的化合物中探索环D,该系列中最令人感兴趣的化合物由取代OR0602中的苯环的吡啶组成,其亲和力得以保持,同时溶解度和酶抑制作用得到增强,达到了酶分析的技术极限(ic5077 nM)。此外,细胞活性提高了约2.4倍(IC50130 nM)而不增加非特异性细胞毒性。与此同时,接头D–E也被广泛研究,通过引入砜部分优化了距离和角度,产生了磺酰胺(OR0624)。虽然dCK热稳定性相似,但细胞体外活性比观察到的IC提高了7倍以上5046纳米。由于这些有希望的结果,我们决定合并OR0602和OR0624的结构修饰以获得杂交化合物OR0634。这种化合物增加了分子与dCK的接触,如X射线晶体学所确定的(补充图。6),保持良好的细胞活性(IC5054 nM)并显示出更好的体内耐受性(OR0634甚至在80mg/kg/天的剂量下也能被小鼠很好地耐受,而OR0602在20mg/kg/天的剂量下表现出不可接受的副作用(补充表2)).最后,对C、D和E环进行了一系列的修饰,以提高活性和体内稳定性。在环D中具有取代的类似物(OR0635具有OMe,OR0642具有CF3)提供了最佳结果。对于OR0635和OR0642,dCK稳定性提高至+20.4°C和+22.2°CδTm细胞体外活性增强至IC50值分别为15和2.2纳米。化合物的体外和体内稳定性大大提高,半衰期分别长于5小时和7小时(补充表2).OR0642在小鼠模型中的耐受性良好,剂量为80 mg/kg,每天两次。在整个优化过程中,我们的结构数据(补充图。56)证实了配体的预期结合模式。OR0642的X射线结构(图。2f,g和补充图。7)显示在优化我们的先导化合物后,与dCK的接触得到改善;(I)与A环的活性位点结合的氢键网络,(ii)由CF产生的vdW相互作用3和(iii)磺酰胺/环E部分与氨基酸ASN-140和SER-144之间增加的接触。此外,为了研究dCK对c-KIT(masitinib靶向的主要酪氨酸激酶)的选择性,我们在表达人c-KIT受体的细胞中进行了测定。我们证实了c-KIT中抑制作用的降低,显示了IC50在SAR研究中,所有9种关键化合物的IL3/SCF比率(非特异性/c-KIT)低于1,而ic50马西替尼的比值大于100,dCKi1和dCKi2的比值分别为7.6和2.7(补充图。8).此外,对OR0642进行了全基因组分析,97种受试激酶均未被抑制(补充表3),这通过在细胞增殖试验中不存在非特异性毒性得到了证实(补充图。9).最后,我们建立了dCK缺陷的CCRF-CEM CRISPR-Cas9细胞系,并进行实验以研究对dT、dC和OR0642的敏感性(补充图。10).在对照细胞系中,dC通过dCK活性挽救了dT效应后的细胞增殖,而OR0642能够逆转这种效应,诱导细胞增殖的减少。相反,在dCK中由于缺乏dCK,dC细胞系不能挽救细胞增殖,并且添加OR0642不影响细胞增殖。因此,OR0642的无毒作用及其活性(仅在dCK存在下观察到)证明OR0642的生物活性是由dCK介导的,而不是由非靶介导的。

总之,用于SAR优化的DOTS多学科策略是有效的。与母体化合物masitinib相比,优化化合物OR0642的dCK热稳定性提高了+15°C,与我们药物化学活动的起点(dCKi1)相比,提高了+7.9°C。我们的先导化合物OR0642是dCK选择性的,并且还表现出良好的物理化学性质,这突出表现在它能够穿过细胞膜,并且在细胞增殖试验中,与第一个dCK抑制剂hit (dCKi1)相比,其效力增加了1000倍以上。

最后,我们合成了与OR0642密切相关的阴性对照化合物(补充图。11).OR0659化合物呈现与OR0642相同的结构,但是二氨基嘧啶(环A)被吡啶(如在母体化合物masitinib中)和CF取代3环D上的取代基被除去。正如预期的那样,该化合物显示出对dCK的较低结合亲和力(+6.3℃),较低的酶抑制(ic50> 100 M),并且在dT + dC存在下不能抑制细胞增殖,表明在这两个关键修饰后对dCK的作用丧失。

核苷酸不足会促进DNA损伤和细胞死亡

为了探索联合治疗的作用模式,我们在RNR抑制剂dT和生理性核苷dC存在或不存在的情况下,使用流式细胞术研究了暴露于or 0642 24小时的CCFR-CEM细胞的细胞周期进程(补充图。12).正如所料,在dC存在的情况下,dT和OR0642都呈现出与DMSO对照相似的细胞周期曲线。然而,联合治疗(dT+OR0642)在DNP和SP抑制后由于核苷酸不足而出现S期阻滞。此外,以前报道的两种dCK抑制剂(DI-39和DI-87)也在相同的组合条件下进行了研究,结果显示了与OR0642相似的细胞周期特征。

我们还进行了研究核苷酸库的实验,以验证维持DNA合成的核苷酸不足是否是联合治疗生物效应的来源(补充图。13).如前所述,dT由TK、NMPK和NDPK通过SP转化为dTTP。dTTP与RRM1上的变构特异性位点结合,有利于嘌呤还原而不是嘧啶CDP还原,从而导致dCTP不足。正如所料,添加dT增加了dTTP池(补充图。13a)和dTTP的RNR抑制增加了CDP库的大小(补充图。13b)和减少dCDP池(补充图。13c),因为RNR无法将CDP减少到dCDP。这种作用通过添加dC来模拟生理条件而逆转,CDP和d CDP池与对照组相似(补充图。13b,c).在这种情况下(dT+dC), dCK能够磷酸化dC,dCTP池通过SP被dCK恢复(补充图。13d),即使dT通过RNR抑制作用阻断了DNP产生dCTP。正如预测的那样,单独添加OR0642和随后的dCK抑制没有影响核苷酸库(补充图。13a–d),因为在基础条件下,DNA合成主要依赖于DNP产生的dCTP27。相反,在dC存在的情况下,组合治疗dT+or 0642(dT+dC+or 0642)能够减少dCTP池(补充图。13d),因为这两种途径都被抑制(dT抑制DNP,OR0642抑制SP),即使存在生理浓度的dC。这些结果证实了我们的假设,并与以前的报道完全一致,在以前的报道中,RNR抑制触发了补救途径的补偿性上调,增加了补救dCTP的生物合成,这可以被dCK抑制剂阻断12,15.

进一步的研究确定,在dC存在的情况下,单独的dT或OR0642都不诱导细胞中的DNA损伤或凋亡(补充图。1415).相反,联合治疗dT+OR0642触发了DNA损伤的诱导,组蛋白变体H2A的存在就是证据。x在其丝氨酸139上磷酸化(γH2A。x)通过流式细胞仪测定(补充图。14a、b)和免疫荧光显微术(补充图。14c).此外,dT+OR0642也诱导细胞凋亡,如流式细胞仪膜联蛋白V染色所测量的(补充图。15).将所有这些结果与之前描述的其他dCK抑制剂(DI-39和DI-87)诱导的效果进行比较。联合治疗(dT + dCK抑制剂)的数据与三种化合物(OR0642、DI-39和DI-87)相似,显示了之前发表的相同细胞死亡机制,其中持续的核苷酸不足触发复制应激,促进致命的DNA双链断裂。

在T-ALL小鼠模型中成功的合成致死率

为了研究在体外观察到的功效是否也可以在体内观察到,我们在SAR优化后获得的先导化合物OR0642被用于体内系统性白血病小鼠模型。我们研究了在NOD-SCID-IL2Rγc无效(NSG)小鼠模型中,共靶向替代核苷酸生物合成DNP和SP的体内有效性和耐受性,该小鼠模型静脉接种了表达荧光素酶的人CCRF-CEM T-ALL细胞系。DNP被RNR的生理抑制剂dT抑制,SP被新开发的dCK抑制剂OR0642抑制。

在移植后的第3天开始治疗,并维持19天,以5天(BID,两次/天)和2天(QD,一次/天)为周期(图。4a).我们通过与给予载体(对照)和分别给予两种成分中的每一种相比较来评估联合治疗的功效。每周一次通过生物发光成像监测白血病进展(图。4b).在第21天,组合治疗(dT + OR0642)中的小鼠具有比对照小鼠或单独用任一化合物治疗的小鼠低100倍以上的生物发光信号,这表明全身性白血病负担显著降低并且有希望的治疗效果(图。4c,d).此外,hCD45+在第21天,通过流式细胞术测量血样中的群体,联合治疗显著降低了疾病进展(图。4e).正如所料,根据合成致死率概念,这两种成分分开给药时在体内效果不佳;OR0642没有显示任何抗增殖作用,dT几乎没有减少白血病进展(图。4b).结果,所有对照组和单次治疗组小鼠在25-30天后死亡(图。4f).重要的是,只有联合治疗(dT + OR0642)显著降低了疾病进展(图。4b)和延长的小鼠存活时间(平均存活48天),甚至在第21天停止治疗后(图。4f),表明这两种治疗剂之间的强协同作用和显著的生存优势。因此,由于新的dCK抑制剂OR0642,对从头和补救生物合成途径的药理学共同靶向,对体内T-ALL白血病细胞具有良好的耐受性和高度的有效性。

图4: OR0642联合dT在体内具有强的抗白血病作用。
figure 4

a赋形剂和药物管理小鼠组(赋形剂(n= 8),dT 1.5克/千克(n= 7),或0642 40毫克/千克(n= 9)和dT 1.5克/千克+ OR0642 40毫克/千克(n= 9))(一次/天(QD)和两次/天(BID))抗CCRF-CEM白血病小鼠。b治疗对CCRF-CEM白血病荷瘤小鼠全身辐射定量的影响(生物发光)。黄色箭头突出显示治疗结束。数据以平均值SEM表示,并使用双向ANOVA检验和Turkey多重比较检验(vehicle(n= 8),dT(n= 7),或0642(n= 9)和dT + OR0642(n= 9)).NS表示无统计学意义,*表示P < 0.05, and **P= 0.001.c第21天小鼠的代表性生物发光图像(NI =未注射小鼠;没有嫁接) (n= 3).d处理对第21天全身辐射量化的影响。(NI =未注射的小鼠;没有嫁接)。数据以平均值SEM表示。使用单向ANOVA Kruskal–Wallis检验和Dunn多重比较检验(载体(n= 8),dT(n= 7),或0642(n= 9)和dT + OR0642(n= 9)).NS表示无统计学意义,***P= 0.0002.e处理对hCD45的影响+在第21天通过流式细胞术确定的群体。数据以平均值SEM表示。hCD45的比较+使用单向ANOVA Kruskal–Wallis检验和Dunn多重比较检验(载体(n= 8),dT(n= 7),或0642(n= 9)和dT + OR0642(n= 9)).NS表示无统计学意义,***P= 0.0005.f载体和药物治疗CCRF-CEM白血病荷瘤小鼠的生存分析。黄色箭头突出显示治疗结束。使用Log-Rank(Mantel–Cox)检验比较中位生存期。NS表示无统计学意义,并且****P < 0.0001.

使用T-ALL患者来源的异种移植物模型预测敏感性

为了在更相关的人类T-ALL模型中测试联合治疗,我们使用了来自原始T-ALL样本的已建立的患者来源异种移植物(pdx)28,29。我们体外评估了8个PDX样本对dCK抑制剂OR0642和dT浓度范围的敏感性。或者,我们在dC存在的情况下测试dT + OR0642关联,因为这种情况允许触发SP(补充图。3).因此,我们研究了联合治疗(dT + OR0642)与单独dT治疗相比是否有益处。如图所示。5a,对单独dT的反应是不同的;发现3个pdx是应答者,4个是部分应答者,1个是耐药者。dC的加入部分逆转了dT的作用并增加了应答PDX细胞的生存力,而dT + OR0642的联合治疗(在dC存在或不存在的情况下)能够诱导细胞生存力的显著降低。因此,3例pdx被归类为联合治疗的缓解者(UPNT525、UPNT775和UPNT885),5例被归类为部分缓解者(UPNTAGG、UPNT380、UPNT486、UPNT489和UPNT615)。我们假设PDX的内在体外增殖行为可能是化合物OR0642疗效的关键。为了测试这一点,我们检查了组合反应(对于100 M固定浓度的dT)和PDXs增殖指数(在对照培养条件下通过CellTrace测量)之间的相关性(图。5b).正如所料,分裂分数最高的pdx对dT治疗和与OR0642 (UPNT525、UPNT775和UPNT885)的联合治疗反应最好。为了证明这一点,我们研究了耐药PDX upnt 730的敏感性(图。5c),并在单层OP9-DL1基质细胞上培养以促使其增殖。虽然测试的PDX对常规条件有抗性,但发现它在增殖条件下对dT和联合治疗(dT + OR0642)敏感,这证实了我们的假设。此外,我们比较了联合治疗(dT + OR0642)对两个有反应的pdx与标准护理化疗(长春新碱+)的疗效L-门冬酰胺酶+地塞米松)(补充图。16).结果显示,新的组合至少与传统疗法一样有效(UPNT525)或更有效(UPNT775)。最后,我们使用应答者UPNT525在T-ALL PDX小鼠模型中评估了体内联合治疗的功效(图。5d).在第19天,基于动物血流中循环的hCD45+细胞的比例,通过流式细胞术确定白血病负荷。单独使用dT治疗可显著降低疾病进展,但联合治疗(dT + OR0642)大大改善了这一结果,将白血病负担降低了1000倍以上。如预期的那样,与对照组(26天)相比,治疗组的中位生存期增加了。单独用dT治疗的组表现出38天的中位生存期,而用组合疗法(dT + OR0642)治疗的组令人印象深刻地将中位生存期增加到64天,这显示了该疗法在源自患者肿瘤的小鼠模型中的高效性。

图5:联合治疗对PDX模型的影响。
figure 5

a在不存在或存在dC (1 M)和/或OR0642 (0.25 M)的情况下,dT浓度范围(10至3000 M)对PDX样品的影响。数据表示为平均值±标准差(n= 3).bdT 100 M处的响应与分割分数之间的相关性。在验证数据集的正态分布(P= 0.0012).c在不存在和存在增殖条件(OP9-DL1单层)dC (1 M)和/或OR0642 (0.25和0.5 M)的情况下,联合治疗对PDX样品UPNT730的影响。数据表示为平均值±标准差(n= 3).d对PDX小鼠模型UPNT525的治疗。赋形剂和药物管理小鼠组(赋形剂(n= 6),dT 1.5克/千克(n= 6),而dT 1.5克/千克+ OR0642 40毫克/千克(n= 7))(两次/天(BID))对带有UPNT525的小鼠。e处理对hCD45的影响+在第19天通过流式细胞术确定的群体。数据以平均值SEM表示。hCD45的比较+使用单向ANOVA Kruskal–Wallis检验和Dunn多重比较检验(载体(n= 6),dT(n= 6),而dT + OR0642(n= 7)).NS表示无统计学意义,***P= 0.0002.f用载体和药物处理的带有UPNT525的小鼠的存活分析。黄色箭头突出显示治疗结束。使用Log-Rank(Mantel–Cox)检验比较中位生存期。NS表示无统计学意义,*表示P= 0.02,并且***P < 0.0003.

讨论

在目前的工作中,我们展示了这种药物设计方法的概念验证,其中利用“脱靶”的识别对药物进行重新定位已被用作起点,以加速经典药物发现(命中识别和命中引导优化)进入针对这种新靶点设计和优化新药的自动化过程。该策略已在人类T-ALL PDX小鼠模型中进行了体内验证,该模型是一种对耐药和复发患者明显缺乏治疗选择的白血病亚群。

大约30%新批准的用于特定治疗的药物已经从另一种治疗中重新定位,并且这种重新定位策略可能在癌症药物发现中变得更加普遍30。药物重新定位有两种主要策略:靶向和非靶向。在靶向药物重新定位中,药物的已知药理学机制被应用于新的治疗目的。在这种策略中,药物的生物靶点是相同的,但疾病是不同的,药物产生两种不同的治疗效果。另一方面,在脱靶药物重新定位中,药物作用于新的靶点,超出了原来的范围,用于新的治疗适应症。因此,目标和指标都是新的。

我们以前成功的非靶药物重新定位策略揭示了dCK如何保持开放构象,以增强核苷类似物在与马西替尼结合时的活性16。masitinib在dCK延伸腔中的弱互补性导致我们实施了一个SAR优化程序,该程序使用masitinib的吡啶部分(环A)作为起始锚点。我们假设与dCK相互作用水平的增加可以触发masitinib衍生物从激活剂到抑制剂的转换。这种有效的SP抑制剂与RNR抑制剂联合使用,通过同时抑制DNP和SP,可以有效地对抗癌细胞并防止逃逸机制。嘧啶SP和DNP在维持癌细胞增殖的能力方面可以相互补偿,并且通过它们的同时抑制可以实现合成的致死表型12.

DOTS方法成功地应用于从dCKi1配体开始设计更有效的dCK抑制剂。这一策略在很大程度上依赖于通过药物化学、生物物理学、生物化学、结构生物学、细胞生物学和动物模型等方法获得的实验结果所强化的计算设计。从早期的优化步骤中,我们很快证实了我们对最早合成的抑制剂dCKi1和dCKi2的假设,dcki 1和dcki 2带有一个嘧啶环,环A上带有额外的胺部分(dC模拟物)。总体而言,使用DOTS对masitinib的5个环(A、B、C、D、E)和4个接头中的3个(B–C、C–D、D–E)进行了顺序优化,以实现更好的亲和力、酶和细胞活性以及物理化学性质。

促进先导化合物优化的关键改进是用4,6-二氨基嘧啶取代A环吡啶,随后在C-D环引入联苯和/或苯基吡啶NB-C接头上的-丙基,D–E接头上的磺酰胺,以及D环上的各种取代。OR0642是我们的最终先导药物,是一种选择性强的dCK结合剂,对dCK酶和细胞活性具有纳摩尔级的抑制作用。在小鼠中耐受性良好,OR0642使接受DNP/SP联合治疗(dT + OR0642)的小鼠的中位存活率增加了一倍,证明了这种策略对T-ALL治疗的潜力。用于监测肿瘤进展的生物发光成像显示,用联合疗法治疗的小鼠的信号比用对照或单独疗法治疗的小鼠低100倍,表明全身性白血病负担显著降低。这证实了一种表型合成致死作用机制。这两种单独的治疗对肿瘤进展表现出轻微或无影响,但联合治疗(dT + OR0642)证实了有希望的治疗效果,即使在早期治疗停止(21天)后,联合治疗也显著降低了疾病进展并延长了小鼠生存期(48天对26天)。

在20世纪80年代,研究了胸腺嘧啶核苷在血液恶性肿瘤和实体瘤患者中的临床、细胞动力学和生化作用31。长时间的dT输注显示了白血病和淋巴瘤患者的深度反应;然而,这些患者对dT的治疗反应通常是有限的和短暂的32。癌细胞将它们的dNTP合成从DNP转换到SP的能力解释了为什么dT作为单一药物在临床试验中显示有限的功效。因此,我们将dT与dCK抑制剂OR0642联合使用,共同靶向SP产生的dNTP,这比单独使用任何一种治疗方法都更能有效地杀死肿瘤细胞,对这些白血病患者来说是一种更好的治疗方法。尽管急性淋巴细胞白血病的治疗取得了进展,但尽管进行了强化治疗,成人患者的预后和临床结果仍然不佳。高度侵袭性的T-ALL更令人担忧,因为治疗方案仍然有限33。由于儿科启发的强化化疗的引入,T-ALL成人的长期存活率接近50%34以及基于微小残留病监测的更好的风险分层;然而,T-ALL也与早期侵袭性复发和治疗耐药性有关35,36。儿童病例的复发率接近20–25%,成人病例的复发率接近40%,复发患者的5年总生存率低于25 %,因此T-ALL仍然是一个关键的临床挑战。在患者复发后,B-ALL和T-ALL之间的差异变得更加重要。由于CD19 × CD3双特异性T细胞结合物blinatumomab的发展,B-ALL患者在复发后有多种选择37,抗CD22抗体-药物缀合物伊珠单抗奥加米星38或嵌合抗原受体(CAR)-T细胞疗法39。其他选择,如蛋白酶体抑制剂硼替佐米40和BCL2抑制剂venetoclax41,也有报道;然而,它们的使用目前非常有限。相比之下,复发后的T-ALL患者的治疗选择有限,仅限于挽救性化疗方案或化疗药物奈拉滨,奈拉滨是专门批准用于复发后T-ALL的化疗药物。由于缺乏治疗选择,有几项临床试验正在研究已经用于T-ALL患者其他癌症的药物,但其疗效尚未得到证明42.

因此,需要创新、有效和耐受性良好的治疗方法,尤其是当同种异体移植不可行时,因为复发和难治性T-ALL患者的中位生存期仅为8个月43。之前的其他研究表明,DNP和SP的药理学共靶向对小鼠的所有模型都有效12,但这些结果大多是在皮下异种移植肿瘤模型中进行的,没有研究患者来源的样本。在此,我们评估了PDX样本对这种同时针对DNP和SP的治疗策略的敏感性,结果显示分裂分数较高的pdx对OR0642和dT治疗的反应最好。此外,联合治疗在T-ALL PDX小鼠模型中是有效的,使中位存活率加倍。从我们令人信服的体外和动物模型结果来看,使用这种合成致死方法的T-ALL靶向治疗代表了一种有希望的治疗选择,我们目前正在进一步研究。当细胞中的dNTP库仅足以进行几分钟的DNA复制时,将OR0642(一种SP抑制剂)与dT(一种DNP抑制剂)组合可以限制癌细胞的两种核苷酸来源。此外,这种合成致死策略应该对所有表现出对SP高度依赖的细胞高效,并且可以应用于表现出对dCK和SP强烈依赖的其他特定癌细胞。至关重要的是,T-ALL的攻击性本质赋予了对抗增殖药物的敏感性,T-ALL在几天内就显示出来自侵入具有数百亿原始细胞的患者骨髓和血液的离散肿瘤细胞的克隆性扩增的爆发。T-ALL的这一主要特性在临床上通过糖皮质激素在诱导过程中的强烈和快速的减瘤作用得到了证明。我们推测,对T-ALL母细胞增殖的致癌性成瘾传达了对dCK抑制剂的脆弱性,并将OR0642定位为治疗急性白血病的有希望的候选药物。这些问题将在以后的研究中解决。