介绍

肝癌的化学疗法没有取得令人满意的结果,并且由于严重的副作用会导致肝损伤,使患者遭受痛苦1,2。因此,迫切需要确定使肝癌细胞对化疗敏感的靶点,并探索减轻副作用和耐药性的联合策略。

赖氨酰氧化酶(LOX)家族包括LOX和四种LOX样蛋白,主要在细胞外基质(ECM)重塑和胶原与弹性纤维的交联中起作用3,4,5。异常的LOX家族成员表达和活性导致了广泛的疾病,包括恶性肿瘤。然而,针对LOX家族成员产生了意想不到的结果6,表明LOX家族可能不参与细胞外基质重塑。例如,LOXL2部分位于细胞核中,并显示组蛋白去甲基化酶活性7和组蛋白氧化活性8在H3赖氨酸4。我们之前报道过9在OSM刺激下,LOXL3移位到细胞核中,并去除了STAT3在K685的赖氨酸乙酰化。鉴于LOX家族在亚细胞中扮演着不同的角色,我们想知道哪些成员在细胞内参与了肝癌的化疗耐药。

铁下垂,一种最近发现的以铁依赖性脂质过氧化积累为特征的调节性细胞死亡模式10与包括癌症在内的疾病进展密切相关。睑下垂症在机制和形态学上不同于其他形式的细胞死亡,如凋亡;因此,它在癌症治疗方面有很大的潜力。由对凋亡的适应性耐受引起的肿瘤细胞化学抗性可以通过诱导铁下垂来治疗11。因此,确定用于肝癌化疗的药物,如奥沙利铂,是否能诱导肝癌细胞的铁下垂是令人感兴趣的。已经发现了几种抑制铁下垂的途径,包括GPX4介导的磷脂氢过氧化物(PLOOHs)减少、铁下垂抑制蛋白1(fs P1)-泛醌系统和角鲨烯介导的脂质过氧化抑制10,12。我们想知道LOX家族,包括细胞外基质酶,是否参与调节肿瘤细胞的铁下垂。

虽然其他LOX家族成员在肝癌中的功能已经阐明,但LOXL3在肝癌中的功能需要进一步的全面研究。例如,LOX过表达诱导上皮间质转化13。LOXL2在肝癌中作为癌蛋白发挥作用,驱动肝癌细胞增殖、迁移、侵袭和细胞存活14,15,16。LOXL4通过激活受损的野生型p53促进肝癌细胞死亡17。LOX家族成员既作为ECM酶又作为参与信号转导或表观遗传调控的细胞内蛋白发挥作用8,9。我们观察到,在其成员中,只有LOXL3部分位于线粒体中,依赖于外膜(TOM)复合体的转位酶。TOM复合物位于线粒体外膜,主要作为线粒体蛋白的常规入口18。包括受体TOM20、TOM22和TOM70以及通道形成蛋白TOM40。定位于线粒体外膜的TOM20通过前序列实现最初的前体识别,促进蛋白质通过线粒体外膜输入19.

在这项研究中,LOXL3被TOM20转运到线粒体中,并被代谢物激酶AK2磷酸化。然后,它发挥更强的赖氨酰氧化酶活性,防止DHODH-K344泛素化,反过来赋予对线粒体铁下垂的抗性,因为线粒体DHODH积累是防止低GPX4表达细胞铁下垂所必需的20。为了增强奥沙利铂的疗效并降低高剂量治疗的毒性和副作用,我们应用了一种晚期肝癌小鼠模型来探索一种联合策略,即低剂量奥沙利铂联合来氟米特,以有效地缓解肝癌的进展,同时降低药物毒性。

结果

LOXL3线粒体定位和酶活性赋予肝癌细胞对化疗诱导的睑下垂的耐受性

为了研究LOX家族和肝癌化疗耐药性之间的关系,我们首先敲除了肝细胞癌(HCC)细胞中的LOX家族成员(补充图。1a),这并不影响存活率(补充图。1b).接下来,当我们用奥沙利铂和5-Fu处理基因操作细胞时,LOXL3的缺失大大提高了肝癌细胞对这些药物的敏感性,而LOX家族其他成员的缺失对化疗耐药性没有显著影响(图。1a,补充图。1c).与此一致的是,LOXL3缺陷型细胞表现出较高的细胞死亡和较低的IC50值,这代表了在药物治疗下癌细胞较低的化学抗性状态(补充图。1d,e).同时,我们通过使用两种靶向LOXL3的shRNAs来避免脱靶效应,进一步证实了LOXL3对化疗耐药性的作用(补充图。1f–h).此外,我们也排除了LOXL3缺失影响其他LOX成员表达的可能性(补充图。1f).用酶死(ED)-LOXL3拯救的LOXL3缺陷型细胞显示出对化疗反应的细胞活力降低,证明LOXL3赖氨酰氧化酶活性与化疗抗性有关(图。1b,补充图。1i–k).

图1: LOXL3线粒体定位和酶活性赋予肝癌细胞对化疗诱导的铁下垂的耐受性。
figure 1

a稳定表达shNT、shLOX、shL1、shL2、shL3或shL4的Huh7或Hep3B细胞在指定时间点用Oxa-H处理后的细胞存活力。bd在指定的时间点用Oxa-H处理稳定表达shL3并恢复EV、WT-或ED-L3表达的Huh7或Hep3B细胞,并评估细胞活力(b).通过荧光强度评估Huh7细胞的胞质ROS水平Ex/Em=495/529纳米(c)和脂质过氧化水平通过使用BODIPY C11(d). eg用Oxa-H或Oxa-L处理稳定表达shL3并恢复EV、WT-或ED-L3表达的Huh7或Hep3B细胞6小时(e)或24小时(f)或指示的时间点(g).用Oxa-H处理的上述Huh7细胞进行包埋后染色,并通过透射电子显微镜使用金标记蛋白方法成像,以获得超微结构证据(e).使用指定的抗体(f).评估细胞活力。(g).比例尺:1 μmh-i用Oxa或5-Fu处理Huh7细胞半小时,然后收集线粒体、胞质和核部分用于WB(h)使用指定的抗体或如果(i)使用FLAG抗体和MitoTracker。比例尺:20 μmjl用Oxa-H/L处理指示的细胞并收集用于脂质过氧化水平检测,使用BODIPY C11(j, k),或细胞生存力测量(l).为方便起见,LOXL蛋白家族命名为L,如L1、L2、L3或L4。Oxa-H,高剂量奥沙利铂,5 g ml−1;Oxa-L,低剂量奥沙利铂,1 g ml−1。ED,酶死,H607/609Q。EV,空向量。对于(ad, g, k, l),数据表示来自三个独立实验的SEM(n= 3).通过用于多重比较的双向ANOVA计算统计分析(a, b, g, l)或采用Tukey诚实显著性差异(HSD)事后检验的单向ANOVA(c, d, k).源数据作为源数据文件提供。参见补充图。1.

在癌细胞中,大多数化疗药物产生大量的活性氧(ROS ), ROS在调节细胞死亡和耐药性中起重要作用21。在这里,奥沙利铂治疗诱导肝癌细胞产生大量活性氧。而LOXL3缺乏仅轻微改变胞质ROS水平(图。1c,补充图。1j),在奥沙利铂治疗下,LOXL3缺陷细胞的脂质过氧化水平显著升高(图。1d,补充图。1k).由于铁下垂被认为是一种新的细胞死亡形式,其特征是依赖于ROS生成的严重铁依赖性脂质过氧化,我们进一步评估了LOXL3缺陷细胞调节的铁下垂是否响应奥沙利铂治疗。通过透射电子显微镜,观察到了铁下垂的特征,如线粒体结构致密,线粒体嵴明显减少,线粒体体积较小(图。1e).此外,为了进一步确定构象,我们加入了铁下垂抑制剂ferrostatin-1,它阻断了奥沙利铂诱导的LOXL3缺失细胞的铁下垂(补充图。1l,m).值得注意的是,经典的睑下垂诱导剂Erastin复制了奥沙利铂诱导的睑下垂(补充图。1n,o).

为了增加化疗敏感性和减少化疗药物引起的毒性,我们将低剂量治疗引入我们的研究,以研究LOXL3缺乏是否仍然通过诱导铁下垂使HCC细胞对低剂量奥沙利铂治疗敏感,这通过测量脂质过氧化得到证实(补充图。1p).接下来,为了验证化疗引发的睑下垂是由哪一种途径诱导的,我们检测了五种重要的睑下垂相关标记物和一种凋亡标记物,caspase 3及其切割形式。只有DHODH蛋白在LOXL3缺陷或ED-LOXL3细胞中表现出降低的水平(图。1f).与此一致,LOXL3缺陷或ED-LOXL3细胞比野生型(WT) -LOXL3表达细胞对正常或低剂量奥沙利铂更敏感(图。第一代,补充图。1q).

接下来,细胞质、细胞核和线粒体的分级显示LOXL3部分分布在线粒体中,其线粒体定位通过化疗得到加强(图。1h,我),而LOX和LOXL2在细胞核内,与以前的报道一致22,23。我们构建了LOXL3缺陷型细胞,这些细胞被重新引入了WT或ED-LOXL3与线粒体信号肽的表达(下文中分别称为M-WT-L3和M-ED-L3)(补充图。1r).分级分析证实了这些细胞的线粒体定位(补充图。1s).在奥沙利铂治疗下,表达WT-L3或M-WT-L3的细胞有效地抑制了LOXL3缺陷细胞中脂质过氧化的强烈增加,但在ED-形式中则没有(图。1j,k),这暗示了线粒体中LOXL3酶活性的依赖性。相应地,测量细胞存活力和细胞死亡(图。1l,补充图。1t).为了确定LOXL3的相对线粒体赖氨酰氧化酶活性,我们迫使FLAG标记的WT-LOXL3在HCC细胞中表达,并富集线粒体或胞质LOXL3蛋白以测量LOXL3活性。观察到线粒体LOXL3表现出比胞质LOXL3更高的活性,而LOXL3活性被奥沙利铂上调(补充图。1u).此外,我们接下来强制FLAG标记的WT-LOXL3和M-WT-L3表达(补充图。1v).M-LOXL3仅显示出比总LOXL3稍强的活性(补充图。1w),表明线粒体中LOXL3对奥沙利铂反应的较高活性受上游信号和线粒体中LOXL3强度的协同控制。

总之,LOXL3部分位于线粒体中,在药物治疗下,表现出进入线粒体和酶活性的增加。这可能有助于癌细胞抵抗化疗诱导的脂质过氧化和铁下垂,可能是通过LOXL3/DHODH轴。重要的是,LOXL3缺乏使肝癌细胞对低剂量奥沙利铂治疗敏感,具有降低的毒性和增加的肿瘤杀伤功效。

EGF-EGFR信号介导LOXL3-Tom 20轴,阻断化疗诱导的睑下垂,并在S704上调lox L3磷酸化

我们进行了细胞因子筛选,以阐明参与介导LOXL3转运至线粒体的信号:EGF处理促进LOXL3进入线粒体;TNFα治疗诱导了细胞溶质LOXL3的显著减少,但没有增加线粒体LOXL3(图。2a).IF染色显示EGF驱动LOXL3进入线粒体(图。2b).

图2: EGF/EGFR信号介导的LOXL3/TOM20轴阻断了化学诱导的铁下垂并上调了S704的LOXL3磷酸化。
figure 2

aHuh7细胞饥饿超过12小时,然后用细胞因子处理半小时。然后,收集线粒体和细胞溶质部分用于WB。b, cHuh7细胞饥饿超过12小时,用EGF处理半小时,然后固定并染色IF(b)或提取线粒体蛋白,用针对TOM20的抗体(c).比例尺:20 μmdAlphaFold 2预测了LOXL3的结构构象。箭头表示LOXL3的N-末端(氨基酸1-40)的Ser39,其包含一个螺旋。e, f稳定表达WT-或1-40个氨基酸缺失的LOXL3-FLAG的Huh7细胞(e),或者K35/36A-突变型LOXL3-FLAG(f)饥饿超过12小时,然后用EGF处理半小时。然后,为Co-IP收集细胞。g收集稳定表达WT-或K35/36A-突变型LOXL3-FLAG的Huh7细胞,提取总蛋白,用于分离线粒体和胞质溶胶。hj收集用EV表达shNT或用EV、WT-或K35/36A-突变型LOXL3表达shL3的Huh7细胞用于脂质过氧化测量(h).使用BODIPY C11(i).收集相同批次的细胞,并使用指定的抗体进行WB(j).比例尺:50 μmk收集表达WT-或K35/36A-突变体LOXL3的Huh7细胞,通过翻译后修饰的LC/MS分析鉴定LOXL3的富集。使用两批数据将翻译后修饰水平不同的位点组织成热图。l表达野生型或突变型LOXL3-FLAG的Huh7或Hep3B细胞富含LOXL3赖氨酰氧化酶活性。m收集表达WT-或S704A-突变体LOXL3-FLAG的Huh7细胞,以分离线粒体和胞质溶胶。对于(i, l)数据表示来自三个独立实验的SEM(n= 3 ),并通过单向ANOVA和Tukey的HSD事后检验(i, l).源数据作为源数据文件提供。参见补充图。2.

为了探索EGFR信号在化疗诱导的对睑下垂的耐药性中的作用,我们联合了低剂量奥沙利铂和EGFR单克隆抗体西妥昔单抗来治疗癌细胞。相对于单独使用奥沙利铂或西妥昔单抗,该组合显著增加了WT-LOXL3表达细胞的脂质过氧化和细胞死亡,但没有增加LOXL3缺陷细胞的脂质过氧化和细胞死亡(补充图。2a,b).在LOXL3缺陷细胞中,奥沙利铂联合来伐替尼比联合西妥昔单抗更有效。相对于奥沙利铂和来伐替尼的联合用药,联合使用所有三种药物(奥沙利铂、西妥昔单抗和来伐替尼)增加了WT-LOXL3表达细胞的脂质过氧化,但没有增加LOXL3缺陷细胞的脂质过氧化(补充图。2a,b).这些结果表明,EGFR信号介导的脂质过氧化抑制依赖于LOXL3此外,Lenvatinib改善了化疗诱导的睑下垂中EGFR抑制或LOXL3耗竭的效率。

因为TOM20通常作为一般的线粒体输入受体24免疫共沉淀(Co-IP)分析证实在TOM复合物中观察到LOXL3,由EGF处理介导,这意味着EGF信号可能介导LOXL3–TOM 20轴和lox L3的线粒体定位(补充图。2c,图。2c).α折叠2在LOXL3的N-末端显示了氨基酸1-40的前序列,形成富含正电荷氨基酸的短螺旋。因此,我们怀疑LOXL3的突出序列可以充当招募TOM20的钩子(图。2d).为了验证这一点,我们删除了这一序列,并观察到LOXL3和TOM20之间的关联显著下降(图。2e).将K35/36突变为A35/36削弱了LOXL3和TOM20之间的相互作用,正如预期的那样(图。2f).因此,K35/36A-LOXL3的线粒体定位比WT-LOXL3弱得多(图。2g,补充图。2d,e).相应地,具有恢复的K35/36A-LOXL3表达的LOXL3敲除细胞比那些具有恢复的WT-LOXL3表达的细胞表现出更多的脂质过氧化(图。2h,我,补充图。2f).此外,K35/36A-LOXL3表达恢复的LOXL3敲除细胞显示DHODH表达减少(图。2j).同时,为了测试LOXL3的规范功能是否存在于HCC的化学抗性调节中,我们在LOXL3缺陷细胞中恢复了K35/36A-LOXL3或WT-LOXL3的表达。因为LOXL3-K35/K36A在分泌培养基中具有LOXL3的主要典型活性(补充图。2g,h),但缺乏进入线粒体的能力(图。2f,g,补充图。2d,e),因此,LOXL3-K35/K36A在LOXL3敲除细胞中的恢复表达可以确定LOXL3是否通过规范功能在HCC化学抗性调节中的作用。我们观察到LOXL3-WT,而不是LOXL3-K35/K36A突变体,可以挽救脂质过氧化水平(图。2h,我)、细胞死亡水平、药物反应状态(补充图。2i,j)和DHODH蛋白水平(图。2j)在奥沙利铂的治疗下,最终排除了LOXL3在肝癌化疗耐药中的典范作用。

为了找到线粒体上游如何调节LOXL3,我们通过质谱比较了LOXL3缺陷细胞中LOXL3的翻译后修饰与恢复的K35/36A-LOXL3或WT-LOXL3表达。根据热图,线粒体LOXL3-S704磷酸化显著上调,而S39和S563磷酸化在细胞质和线粒体LOXL3之间略有不同(图。2k,补充图。2k).在赖氨酰氧化酶活性测试中,我们通过将S704突变为A704来模拟去磷酸化:LOXL3活性降低>约65%,而S39和S563的去磷酸化模拟没有显著影响LOXL3活性(图。2l).然后制备抗LOXL3-S704磷酸化的特异性抗体(补充图。2l,m)并显示S704磷酸化仅发生在线粒体LOXL3中(图。2m).值得注意的是,西妥昔单抗阻断EGFR信号会减少奥沙利铂诱导的LOXL3-S704磷酸化上调(补充图。S2n),进一步证明了化疗诱导的EGFR激活是线粒体LOXL3-S704磷酸化介导的抗铁下垂所必需的。

总之,这些发现揭示了EGF-EGFR信号介导LOXL3和TOM20之间的相互作用,导致线粒体LOXL3-S704磷酸化。这反过来增加LOXL3的活性,减少化疗诱导的脂质过氧化和睑下垂。

LOXL3磷酸化阻止DHODH-K344泛素化并促进DHODH稳定性以抵抗化疗诱导的铁下垂

我们以前报道过,当LOXL3形成同型二聚体时,其活性增加9。我们测试了S704A-LOXL3突变体(模拟去磷酸化)是否减少同型二聚化。Co-IP和反向高效液相色谱(HPLC)显示S704A突变体几乎完全消除了LOXL3同型二聚化(补充图。3a,图。3a).在LOXL3敲除细胞中,DHODH蛋白水平下调,但其mRNA水平没有下调。恢复WT-LOXL3的表达,而不是S704A-LOXL3的表达,拯救了DHODH蛋白水平,这意味着DHODH蛋白稳定性需要LOXL3的S704磷酸化(图。3b,c,补充图。3b,c).通过Co-IP证实了LOXL3-S704磷酸化介导LOXL3和DHODH之间的联系(图。三维(three dimension的缩写)).在表达LOXL3-S704A突变体的细胞中,LOXL3和DHODH的共定位被破坏(补充图。三维(three dimension的缩写)).

图3: LOXL3-S704磷酸化阻止DHODH-K344泛素化,促进DHODH稳定性以抵抗化疗诱导的铁下垂。
figure 3

a富集稳定表达WT-或S704A-、S704D-突变LOXL3-FLAG的Huh7细胞用于R-FPLC分析。b, c用Oxa-L处理WT-或S704A-突变体LOXL3表达恢复的Huh7细胞进行WB (b)或qRT-PCR(c)。d用MG132处理表达WT-、S704A-或S704D-突变型LOXL3-FLAG的Huh7细胞12小时,并收集Co-IP。e将表达WT-或S704A-突变型LOXL3的Huh7 shL3细胞用CHX (2微米)处理指定的时间点,并收集WB(e,左)。分析蛋白质衰变(e,对)。CHX:环己酰亚胺。f, g用DHODH-FLAG或DHODH-myc转染表达WT或S704A突变体LOXL3的Huh7 shL3细胞,包括WT和上述赖氨酸(K)位点突变为精氨酸(R)的突变体。然后,在用MG132处理细胞12小时(f).WT和KR突变体DHODH-myc蛋白水平通过WB(g). h用DHODH-myc和HA-泛素转染表达WT-或S704D-LOXL3的Huh7细胞36小时,用MG132处理12小时。使用所示抗体进行IP测定和WB。i收集表达WT-或S704A-、S704D-突变型LOXL3-FLAG的Huh7或Hep3B细胞以富集LOXL3-FLAG,将其与肽“ALEK”一起孵育344IRAGAS”作为LOXL3底物。j用WT-或K344R-突变DHODH-FLAG转染表达WT-或S704A-突变LOXL3的Huh7或Hep3B shL3细胞48小时,然后评估脂质过氧化水平和WB。k在指定的时间点,用Oxa-L处理表达带有WT或K344R-突变体DHODH的恢复的WT-或S704A-突变体LOXL3的Huh7或Hep3B shL3细胞,并评估细胞活力。L3,LOXL3DH,DHODH。对于(c, e, i, k),数据表示来自三个独立实验的SEM(n= 3 ),并通过单向ANOVA和Tukey的HSD事后检验(c, i, j)或用于多重比较的双向ANOVA(e, k).源数据作为源数据文件提供。参见补充图。3.

为了进一步证实LOXL3-S704磷酸化调节DHODH蛋白的稳定性,我们用环己酰亚胺(CHX)处理细胞,观察到在LOXL3敲除细胞和恢复的S704A-LOXL3突变细胞中DHODH蛋白的降解速率显著加快(图。3e,补充图。3e).在表达恢复的WT或S704A突变的LOXL3的两个细胞系中最泛素化的DHODH位点被比较并总结在热图中(图。3f).这些赖氨酸位点被逐一突变为精氨酸,以测试这是否会拯救DHODH蛋白水平(图。3g).将K344突变为R344后,DHODH泛素化显著降低(图。3h),与DHODH-K344泛素化信号中最显著的变化一致(图。3f).相对于WT-LOXL3过表达细胞中的水平,DHODH-K344氧化在过表达S704A-LOXL3的细胞中较低,但在那些表达S704D-LOXL3的细胞中较高(图。3i),说明LOXL3-S704磷酸化增加了LOXL3赖氨酰氧化酶活性,促进了DHODH-K344氧化。结合我们先前的观察,LOXL3与DHODH相互作用并调节其蛋白稳定性,我们可以得出结论,LOXL3通过其赖氨酰氧化酶活性催化DHODH-K344氧化,并与DHODH-K344泛素化竞争以防止降解;线粒体中LOXL3-S704磷酸化增强了其竞争力。

在化疗(奥沙利铂)治疗下,去磷酸化且稳定的DHODH (K344R)降低了由非磷酸化LOXL3 (S704A)引发的脂质过氧化的上调水平(图。3j),验证了DHODH在化疗下作为LOXL3的下游效应子。与此一致,K344R-DHODH挽救了细胞活力(图。3k)并抑制S704A-LOXL3表达细胞的细胞死亡,甚至在低剂量奥沙利铂治疗下也是如此(补充图。3f,g).值得注意的是,IF染色显示低GPX4表达与最小线粒体定位相关(补充图。3h),说明Huh7和Hep3B细胞的线粒体铁下垂是由线粒体DHODH的积累决定的。

DHODH催化嘧啶生物合成途径中二氢乳清酸(DHO)转化为乳清酸(OA)。在催化过程中,DHODH通过辅酶q将两个电子从DHO转移到线粒体呼吸复合体,导致辅酶q还原为辅酶QH2这导致DHODH对线粒体呼吸链的作用与铁下垂调节的紧密结合20,25。首先,我们研究了DHODH的线粒体氧化还原功能或其嘧啶合成能力是否有助于对抗奥沙利铂诱导的睑下垂。DHODH代谢产物尿苷在LOXL3-S704A细胞中显著下调。然而,补充尿苷并没有增强LOXL3-S704A细胞对奥沙利铂的耐药性,这表明DHODH合成嘧啶并没有参与LOXL3介导的对铁下垂的耐药性(补充图。3i–k).为了证实DHODH通过将CoQ还原为CoQH来介导LOXL3对睑下垂症的作用的观点2,我们补充了线粒体靶向的辅酶q和辅酶q的类似物2在奥沙利铂治疗下的LOXL3-S704A突变细胞。结果表明,CoQH2在奥沙利铂治疗下,可以保护LOXL3-S704A突变细胞中由DHODH缺乏诱导的脂质过氧化和细胞死亡(补充图。3l,m).当电子传递链(ETC)复合物III转化CoQH时2回到CoQ,我们用复合物III抑制剂抗霉素A(抗A)处理细胞以降低CoQ/CoQH2比率。类似于mitoQH2补充,抗霉素A保护细胞对抗奥沙利铂治疗诱导的细胞下垂和细胞死亡(补充图。3n,o).尽管以前的报告显示,在DHODH缺陷细胞和DHODH敲除细胞中,OXPHOS内不超过10%的常规耗氧量和ATP产量具有OXPHOS衍生的ATP和生物能学的正常水平26,我们测量了DHODH表达下调的LOXL3-S704突变细胞的总耗氧率和ATP生成水平。结果确实证实略有下降(补充图。3p,q),这可以解释为CoQ作为DHODH和肝癌细胞中特异性的其他上游ETC复合物的电子受体,导致线粒体呼吸链的总体平衡。

这些发现表明LOXL3-S704磷酸化靶向并阻止DHODH-K344泛素化,反过来通过将CoQ还原为CoQH促进DHODH稳定性以抵抗铁下垂2并上调奥沙利铂治疗后的细胞存活率,导致化疗耐药性增加。

线粒体腺苷酸激酶2磷酸化LOXL3-S704并赋予对化疗诱导的睑下垂的抗性

我们筛选了参与线粒体定位的激酶,并通过斑点印迹筛选鉴定了负责LOXL3-S704磷酸化的激酶(图。4a).AK2出现在右上角,表明它是调节LOXL3-S704磷酸化的最重要的激酶(图。4b).蛋白质印迹和斑点印迹分析显示AK2敲低大大降低了LOXL3-S704磷酸化(图。4c,补充图。4a).AK2的缺失大大削弱了LOXL4-S704的磷酸化,甚至在EGF刺激下也是如此(图。4d).Co-IP证实LOXL3和AK2可能形成独立于AK2活性的轴(图。4e,补充图。4b).AK2抑制剂导致的AK2缺失或失活导致脂质过氧化的强烈上调,这与表达活性缺陷型LOXL3的细胞的结果一致(图。4f,补充图。4c).AK2酶活性与LOXL3-S704磷酸化正相关,通过WT-或ED-AK2的强制表达揭示(图。4g,h).

图4:线粒体腺苷酸激酶2在S704磷酸化LOXL3,并赋予对化疗诱导的睑下垂症的抗性。
figure 4

a线粒体中LOXL3-S704磷酸化的激酶筛选工作流程。b使用特异性抗plox 13-S704的抗体从斑点印迹收集灰度值。siNC与siMK的灰度值之比,分析为火山爆发。红点表示AK2。MK,线粒体激酶。c使用所示抗体用靶向人AK2的siRNAs转染的Huh7或Hep3B细胞的WB。dHuh7的WB用靶向人AK2的siRNAs转染,并在饥饿后通过去除血清12小时用EGF刺激e收集表达LOXL3-FLAG的Huh7或Hep3B细胞用于Co-IP和WB。fOxa-L处理12小时后,用靶向人AK2的siRNAs转染的Huh7或Hep3B细胞的脂质过氧化测定g用靶向人AK2的siRNA转染的Huh7细胞恢复表达逐渐增加的小鼠AK2达48小时,并收集WB。h从Huh7细胞中富集和纯化LOXL3-FLAG,然后用λPP (1微米)处理半小时以减少S704-磷酸化,然后在激酶反应缓冲液中与His-AK2 (WT或ed)一起孵育。ED,酶死,L199A/Q214A。i, j用靶向人AK2的siRNAs转染的Huh7或Hep3B细胞用小鼠WT或K14G/R17G突变体AK2恢复表达48小时,并收集用于WB确认(i).同时,还进行了各自的脂质过氧化测定(j). k用靶向人AK2的siRNA转染的Huh7或Hep3B细胞恢复WT-或S704A-LOXL3的表达,并用Oxa-L处理指定的时间点,然后评估细胞存活力。对于(f, j, k),数据表示来自三个独立实验的SEM(n= 3 ),并通过单向ANOVA和Tukey的HSD事后检验(f, j)或用于多重比较的双向ANOVA(k).源数据作为源数据文件提供。参见补充图。4.

接下来,为了进一步研究AK2如何参与调节LOXL3,我们构建了内源性AK2敲除细胞,并恢复了WT-AK2或线粒体信号肽突变体-AK2 (K14G/R17G)的表达(图。4i).IF染色证实该突变体AK2没有进入线粒体(补充图。4d).在表达突变AK2的细胞中,脂质过氧化水平和对奥沙利铂的敏感性显著升高(图。4J),LOXL3-S704磷酸化减少(补充图。4e),可能是因为细胞溶质AK2不能有效地与LOXL3形成轴,或者是因为它在细胞溶质中的激酶活性较低(补充图。4f).AK2缺陷细胞中S704D-LOXL3的恢复表达有效地挽救了肿瘤细胞对化疗的耐药性,进一步证实了LOXL3在AK2的下游起作用(图。4k).

这些发现表明LOXL3-S704磷酸化发生在线粒体中,并由线粒体激酶AK2介导。虽然AK2是一个众所周知的线粒体激酶,我们证明LOXL3是AK2的蛋白底物。

S704D-Loxl3睡美人转座子诱导的肝癌患者对奥沙利铂治疗产生耐药性

为了确定具有高LOXL3活性和更多化疗抗性的HCC患者的临床治疗的意义,我们构建了S704D-Loxl3小鼠,并通过测序证实其构建(图。5a、b,补充图。5a).我们应用睡美人(SB)转座子介导的活化β-连环蛋白和c-Met的表达迅速诱导晚期小鼠HCC,然后给予奥沙利铂治疗(图。5c).与WT小鼠相比,在SB诱导后,肝脏重量有中度差异(补充图。5b).接受奥沙利铂治疗后S704D-Loxl3小鼠仍然表现出腹胀,肝脏解剖显示肝脏体积和重量增加(图。5d).H&E染色显示肿瘤组织在大鼠肝脏中明显积聚S704D-Loxl3老鼠(图。5e).S704D-小鼠肝脏中ALT和AST上调,提供了肝功能异常的初步指示(图。5f,补充图。5c).奥沙利铂治疗后,肝脏S704D-Loxl3小鼠表现出DHODH水平和活性的同步上调(图。5g,补充图。5d),脂质过氧化LOXL3显著下调至野生型小鼠肝脏的约20%(图。5h).这表明奥沙利铂诱导的睑下垂很少S704D-Loxl3小鼠,导致对用于SB诱导的晚期肝癌的奥沙利铂治疗的显著抗性,表现为肝重量比和每个肝脏中肿瘤的平均数量,以及减少的存活时间(图。5i–k).这些发现表明S704D-Loxl3小鼠表现出铁下垂的阻断和脂质过氧化的减少,从而促进了化疗耐药性。

图5:lox L3-S704D突变体在睡美人转座子诱导的肝癌中赋予对奥沙利铂治疗的抗性。
figure 5

a, bLoxl3-S704D将突变小鼠代、CRISPR–cas 9 mRNA、sgRNA和突变供体ssDNA混合物注射到受精卵的细胞质中,受精卵在0.5 dpc时转移到假孕雌性小鼠的输卵管中,用于突变小鼠的出生。c6周龄雄性体重或Loxl3-S704D突变小鼠注射了睡美人(SB)转座子,其尾部携带致癌的dnβ-连环蛋白和c-Met。小鼠接受低剂量奥沙利铂(1毫克千克−1体重)腹膜内治疗,每周3次,共14天。n=每组4个。dj在6周的诱导和随后的治疗后,WT和Loxl3-S704D展示突变小鼠,并测量肝脏重量(d).进行HE染色以确定肿瘤发生(e).肝脏进一步用于测定ALT活性(f),WB使用指定的抗体(g)和脂质过氧化水平(h).肿瘤与肝脏质量的比率(i)和平均肿瘤数量(j)进行了分析和计算。n=每组4个。k另一批小鼠接受腹膜内低剂量奥沙利铂(1毫克千克−1体重)处理通过Kaplan-Meier绘图仪计算存活时间。n=每组10个。对于(d, f, hk),数据代表单个小鼠组的平均值SEM(n= 4或10),统计分析由两个有尾学生计算t测试(d, i, j),采用Tukey的HSD事后检验的单向ANOVA(f, h)或对数秩检验(k).源数据作为源数据文件提供。参见补充图。5.

低剂量奥沙利铂联合lox L3–dho DH轴抑制有效促进晚期肝癌的治疗

为了探索利用低剂量奥沙利铂抑制lox L3–dho DH轴的治疗策略,我们首先进行了表达S704A突变体的肿瘤细胞或对照肿瘤细胞的皮下移植:在实体瘤形成方面没有显著差异(图。6a).在低剂量奥沙利铂治疗下,S704A-LOXL3细胞形成的实体瘤逐渐缩小,而WT-LOXL3细胞通过从最初的增殖抑制中恢复而快速生长(图。6b).Ki67染色证实WT和S704A肿瘤细胞的增殖速率相对相似(图。6c),不考虑使用的化疗策略。然而,TUNEL染色显示,在奥沙利铂治疗下,S704A细胞形成的实体瘤中的TUNEL阳性细胞比对照细胞中的多(图。6d).这可能是因为S704A细胞对奥沙利铂诱导的睑下垂敏感,如脂质过氧化增加所示(图。6e).

图6:奥沙利铂与来氟米特的组合策略有效地促进了晚期肝癌的治疗。
figure 6

ae异种移植研究。将用WT-或S704A-LOXL3恢复的Huh7 LOXL3耗尽的细胞异种接种到裸鼠的左腹股沟(n=每组6个)。当肿瘤大小达到50毫米时2(接种后约3周),低剂量奥沙利铂(1 mg kg−1体重)腹膜内给药,每周3次,共14天。显示了用指定的处理或对照由Huh7细胞形成的实体瘤(a).肿瘤生长速度(b)进行了记录和分析。收集并固定肿瘤,然后用抗Ki67的抗体染色(c)或TUNEL(d)或脂质过氧化测定和计算(e).比例尺:1毫米(c),200微米(d). f用于治疗验证的SB驱动肝癌发生的实验设计。野生型C57小鼠在8周内初步获得SB诱导的肝肿瘤。DHODH抑制剂来氟米特(0.2毫克千克−1体重)或低剂量奥沙利铂(1毫克千克−1体重)腹腔预给药12天,每4天一次作为实验组,而模拟组用作对照组。预给药后,奥沙利铂(1毫克千克−1体重)或DHODH抑制剂来氟米特(0.2毫克千克−1体重)腹膜内治疗12周,每周3次。gk解剖肝脏(g).使用这些代表性肝脏进行HE染色(h).检测肝肿瘤中DHODH活性(i).肿瘤与肝脏质量的比率(j)和平均肿瘤数量(k)进行了分析和计算。每组n = 4。l另一批接受指定治疗的小鼠或对照小鼠用于通过Kaplan-Meier绘图仪计算存活时间。n=每组10个。对于(be, il),数据代表单个小鼠组的平均值SEM(n= 4、6或10),并且通过用于多重比较的双向ANOVA计算统计分析(b),采用Tukey的HSD事后检验的单向ANOVA(c, d, ik)或对数秩检验(l).源数据作为源数据文件提供。参见补充图。6.

为了进一步探索治疗策略,我们解剖了接受联合策略的实验小鼠的肝脏(图。6f),显示联合治疗后肝脏体积和重量降低(图。6g,补充图。6a).H&E染色显示,联合策略损害了肝癌的进展(图。6小时).来氟米特降低了肝脏中的DHODH活性,但低剂量奥沙利铂治疗增加了DHODH活性(图。6i).

Loxl3-S704D具有较高LOXL3活性的突变小鼠,对奥沙利铂治疗具有潜在抗性。重量和Loxl3-S704D突变小鼠用奥沙利铂联合或不联合来氟米特(一种DHODH抑制剂)治疗。总的来说,结果显示联合来氟米特和奥沙利铂,而不是单独的奥沙利铂,有效地抑制或阻断了小鼠肝脏肿瘤的生长Loxl3-S704D突变(补充图。6b–f).此外,使用来氟米特和低剂量奥沙利铂的联合治疗抑制了肿瘤的质量和数量(图。6j,k),实现更健康的肝脏和延长的存活时间(图。6l).这些发现揭示了低剂量奥沙利铂和来氟米特联合治疗晚期小鼠肝癌的疗效。

AK2–lox L3–dho DH轴预测预后,为晚期肝癌提供联合治疗策略

为了进一步研究AK2介导的LOXL3和DHODH蛋白磷酸化在肝癌中的临床相关性,我们首先挖掘了TCGA-LIHC队列,发现LOXL3 mRNA在肿瘤组织中上调(补充图。7a).然后,我们收集了60名接受FOLFOX化疗的患者的样本,包括奥沙利铂加氟尿嘧啶。其中,25名患者有配对的透明癌旁或正常组织。我们首先检测了这50名HCC患者的癌症和邻近组织中LOXL3-S704磷酸化以及AK2和DHODH蛋白水平,使用了指示的抗体,首先验证了它们的特异性(补充图。7b):LOXL3-S704磷酸化在人类HCC组织中显著上调(图。7a).

图7:AK2/lox L3/dho DH轴预测肝癌患者的预后,并提供用于晚期肝癌的组合策略。
figure 7

a人类HCC临床样本的免疫组化(n= 50)使用抗pLOXL3-S704或LOXL3的抗体进行。显示了代表性的图像。获得plox 13-S704 IHC评分用于分析和计算。比例尺:200 μmb, c使用抗plox 13-S704的抗体对人HCC临床样品进行IHC,DHODH IHC如图所示。S7b-c,分别为。代表性图像显示在(b).计算人HCC样本中AK2和plox 13-S704、plox 13-S704和DHODH之间的相关IHC信号(c).比例尺:200 μmdKaplan-Meier生存图基于人类HCC AK2、plox 13-S704和DHODH表达。人类HCC临床样本的ihc如(b–d)所示。根据AK2、plox 13-S704和DHODH IHC评分,通过卡普兰-迈耶图分析人类HCC患者的总生存率。e低剂量奥沙利铂(1毫克/千克−1体重)治疗试验,使用患者来源的异种移植物(PDX)模型。根据组织学表达:plox 13-S704和DHODH的高表达(n= 3名患者),或低(n= 3名患者)。组织准备的体积为5-10毫米3,然后按照标准程序皮下植入6周龄雌性NSG小鼠的左侧。小鼠接受低剂量奥沙利铂腹腔注射治疗,每周3次,持续1个月。如前所述测量肿瘤大小。fAK2/LOXL3/DHODH轴介导的对化疗药物诱导的睑下垂的抗性的示意图。对于(a, e),数据代表单个人HCC样本组的平均值SEM(a)或PDX集团(e).双尾Mann–Whitney使用了统计分析U测试(a),双尾学生的t皮尔逊相关系数测试(c),对数秩检验(d)或用于多重比较的双向ANOVA(e).源数据作为源数据文件提供。参见补充图。7.

在对来自这60名患者的人类HCC样本进行病理学分级后,我们将肝内转移水平分级为低或高:LOXL3-S704磷酸化在高级别组织中显著上调(补充图。7c).通过IHC揭示的DHODH蛋白水平与LOXL3-S704磷酸化一致(补充图。7d).

为了精确计算AK2、LOXL3-S704磷酸化和DHODH之间的相关性,我们使用抗AK2的抗体对60名HCC患者的肿瘤组织进行染色,同时预先测量pLOXL3-S704和DHODH(补充图。7c,d).染色强度揭示了AK2和pLOXL3-S704之间以及pLOXL3-S704和DHODH之间的正相关性(图。7b,c).根据其AK2、pLOXL3-S704和DHODH染色分数,将60个样品分为高和低染色强度组。总存活曲线显示AK2、plox 13-S704和DHODH染色水平越高,预后越差(图。7d).此外,队列中接受化疗患者的无进展生存期(PFS)分析显示,AK2–lox L3–dho DH轴应赋予HCC患者对化疗的耐药性(补充图。7e).LOXL3在肝癌中的致癌作用得到了TCGA-LIHC队列的进一步支持(补充图。7f).

在使用患者来源的异种移植物(PDX)模型的低剂量奥沙利铂治疗试验中,plox 13-S704和DHODH水平较低的组显示出对奥沙利铂的显著敏感性(图。7e),表明选择奥沙利铂治疗需要人类HCC患者的适当背景。与该表型一致,在表达较低水平plox 13-S704和DHODH的PDX肿瘤中,观察到在奥沙利铂治疗下DHODH的较低积累和较高的脂质过氧化(补充图。7g高).总之,我们应用来氟米特(一种DHODH抑制剂)阻断AK2–lox L3–dho DH轴转导,并通过增加铁下垂来增强肝癌细胞对奥沙利铂治疗的敏感性(图。7f).这提供了一个潜在的有希望的策略来阻断高活性LOXL3的晚期HCC。

讨论

肿瘤细胞,尤其是肝癌细胞,以使其能够存活、生长和增殖的方式对诸如奥沙利铂的化疗药物产生反应。由对凋亡的适应性耐受引起的肿瘤细胞化学抗性可以通过诱导铁下垂来治疗11。因此,有必要探索一种新的细胞死亡方式,为克服耐药性和降低毒副作用提供有效的策略。在这项研究中,我们发现LOXL3通过激活线粒体中的AK2–lox L3–dho DH轴参与化疗诱导的睑下垂。此外,我们探索了一种联合策略来提高奥沙利铂在晚期肝癌中的疗效。虽然这项研究证明了线粒体LOXL3的分子机制和临床意义,但包括研究局限性在内的几个因素仍有待讨论。

为了探索LOX家族和化疗之间的联系,我们在这两种细胞系中分别去除LOX家族成员,并观察LOXL3去除使肝癌细胞对化疗药物敏感。以LOX家族为靶点是开发预防癌症进展和转移的新药的令人兴奋的前景。临床前研究已经检测了小的不可逆竞争性抑制剂对LOX或LOXL2的靶向作用,以及使用特异性功能阻断抗体来预防转移6,27。然而,LOXL3在癌症中的作用尚未完全阐明;因此,还没有开发出特异性靶向LOXL3的抑制剂或单克隆抗体。

出乎意料的是,我们观察到,在用奥沙利铂刺激肝癌细胞后,LOXL3的缺失显著上调了线粒体脂质过氧化,而不是总的胞质ROS。化疗药物通常通过触发肿瘤细胞中的ROS失衡来杀死肿瘤28,29。细胞质和线粒体的分级显示LOXL3部分位于线粒体中,并且在奥沙利铂治疗后,LOXL3的线粒体定位增强。所有这些数据应该将化疗与线粒体LOXL3介导的睑下垂联系在一起。

我们证实了LOXL3的N-末端肽有助于其线粒体定位。LOX家族的N-末端分泌肽序列包含富含亮氨酸的氨基酸序列,其可以嵌入磷脂双层并分泌到ECM或进入内质网30。因此,我们推测如果LOXL3调节线粒体铁下垂,它可以进入线粒体并与线粒体铁下垂相关蛋白相互作用。缺乏线粒体信号肽的蛋白质可以通过线粒体蛋白质转运到线粒体中。例如,GRIM-19作为线粒体呼吸链复合物I的组成成分发挥作用;STAT3通过与GRIM-19相互作用被导入线粒体31,32,33。使用AlphaFold 2预测的LOXL3构象结构揭示了在其N-末端LOXL3中的氨基酸1-40包含一个螺旋,该螺旋将该N-末端肽弯曲成钩,暴露于LOXL3结构的外部,为募集其他蛋白质提供了条件。线粒体外膜转位酶(TOM)是核编码的线粒体蛋白进入线粒体的主要入口34。在激活的EGFR信号下,TOM20的功能是引导LOXL3进入线粒体。在探索lox L3–Tom 20轴形成的机制时存在局限性。我们怀疑EGFR直接磷酸化LOXL3或间接调节其构象变化LOXL3以将其结合区域暴露于TOM20。

探索有助于LOXL3线粒体定位的上游信号有利于开发与奥沙利铂联合治疗肝癌的策略。在这项研究中,EGF激活的EGFR信号被证实驱动LOXL3与TOM复合体的关联。用EGFR单克隆抗体西妥昔单抗阻断EGFR信号使肿瘤细胞对奥沙利铂敏感,表明这种联合策略应该在晚期肝癌中重新评估。根据以前的报告35西妥昔单抗和Lenvatinib与奥沙利铂的组合阻断了EGFR和多种上游酪氨酸激酶受体,提高了肿瘤细胞杀伤活性。这进一步证实了诱导铁下垂将改善肿瘤治疗。

根据肿瘤细胞亚细胞定位(细胞质和线粒体GPX4,细胞膜上的FSP1和线粒体上的DHODH)的差异,至少有三种类型的铁死亡防御系统20,36,37。在这项研究中,虽然GPX4存在于线粒体中,但它主要位于细胞质中,而DHODH主要位于线粒体中。因此,我们研究了DHODH的调节,揭示了DHODH-K344是一个关键的赖氨酸,可以同时被泛素或氧化修饰。在K344的竞争性修饰过程中,DHODH蛋白水平受到严格调控。我们的研究进一步加强了DHODH在化疗诱导的线粒体铁下垂中的保护作用。

二聚化或多聚化是蛋白激酶和其他酶活化的一种充分证明的机制38,39,40。LOXL3通过形成同型二聚体发挥酶活性9。这里,LOXL3-S704磷酸化上调赖氨酰氧化酶活性,这阻止了DHODH-K344泛素化。因此,我们推测S704的LOXL3磷酸化也可能调节LOXL3的二聚化。正如预期的那样,S704磷酸化显著上调LOXL3二聚化。有趣的是,LOXL3-S704磷酸化不仅增强赖氨酰氧化酶活性,而且增强其与DHODH的结合,并诱导其在DHODH-K344上的赖氨酰氧化酶活性。因此,我们认为S704磷酸化诱导线粒体LOXL3的构象变化,使其表现出细胞质或细胞外基质中没有的功能。

与胞质溶胶相比,线粒体中的激酶更少。大多数线粒体激酶是代谢物激酶,如腺苷酸激酶和肌酸激酶家族中的那些41。这些线粒体激酶中最著名的是PTEN诱导激酶(PINK) 142。为了检查LOXL3-S704磷酸化如何在线粒体中发生,我们首先通过文献搜索安排了一个含有37种激酶的筛选池,使用关键词“线粒体和激酶”,包括19种代谢物激酶和18种蛋白激酶,它们可能存在于线粒体中或被报道磷酸化线粒体蛋白。基于具有磷酸化修饰蛋白(如PKM2和PGK1)的代谢物激酶的当前情况43,44,19种代谢物激酶被包括在筛选LOXL3-S704磷酸化的激酶池中。这表明AK2磷酸化两种代谢物以及蛋白质,如LOXL3。AK2利用ATP作为磷酸供体,通过磷酸化AMP和dAMP来催化核苷磷酸的相互转化,但当利用GTP作为磷酸供体时,仅磷酸化AMP。与其他腺苷酸激酶相比,AK2表现出相对较低的广谱核苷二磷酸激酶活性,表明AK2在底物选择上表现出灵活性45,46,47。然而,仍然不知道AK2是否利用蛋白质作为底物,尽管其他代谢物激酶如PKM2和PGK1直接磷酸化指定的蛋白质43,44。我们的发现揭示了LOXL3的S704位于β-折叠或β-螺旋的核心,处于卷曲-卷曲状态,为AK2在S704上发挥激酶活性提供了可能足够的空间。

细胞质AK2可能不会显著增加细胞质中LOXL3的磷酸化。在AK2缺失的细胞中恢复AK2的表达后,我们观察到胞质AK2不能有效地上调LOXL3-S704磷酸化。与线粒体AK2相比,细胞质AK2对LOXL3或其代谢物底物AMP的激酶活性显著降低,这表明细胞质AK2可能缺乏活性构象。细胞溶质AK2的低激酶活性可能是由于线粒体为AK2提供的微环境的丧失而表现出相对高的活性(就pH和氧化还原稳态而言),或者甚至是由于线粒体中的翻译后修饰。另一个可能的原因是AK2和LOXL3不能有效地在胞质溶胶中形成轴,可能是由于一些支架蛋白的丢失,特别是那些存在于线粒体中并促进AK2和LOXL3相互作用的蛋白。

应该指出的是,在这项研究中,化疗药物如奥沙利铂或FOLFOX的5-Fu不是HCC的全球策略,而是用于选择的患者。化疗增敏能有效抑制肿瘤细胞逃逸,避免严重的副作用。为此,我们使用低剂量奥沙利铂联合来氟米特(一种DHODH抑制剂)来阻断肝癌中的AK2–lox L3–dho DH轴。较好的联合策略可能是低剂量奥沙利铂加LOXL3抑制剂;然而,如上所述,靶向LOXL3的抑制剂尚未得到有效开发。因此,我们选择了低剂量的奥沙利铂,以及用于治疗类风湿性关节炎的来氟米特。两者都有S704D-Loxl3发现敲入小鼠和具有S704A-LOXL3的移植肿瘤模型,LOXL3是低剂量奥沙利铂治疗肝癌的重要对应物。

总之,这些发现揭示了LOX家族成员LOXL3通过其被AK2上调的高线粒体活性水平参与抗线粒体铁下垂。LOXL3的高活性竞争占据DHODH-K344并减弱DHODH在K344的泛素,反过来诱导线粒体DHODH的积累。这进一步赋予了对化疗药物如奥沙利铂诱导的线粒体铁下垂的抗性。最后,低剂量奥沙利铂联合DHODH抑制剂来氟米特有效地抑制了肝癌的进展,延长了小鼠的存活时间。