介绍

乳腺癌(BC)是一个主要的公共健康问题,全世界每年有超过50万人死亡,主要是由于转移性扩散1。在分子水平上,BC是一种高度异质性的疾病,可以分为不同的亚型,具有不同的肿瘤特征和临床结果2。其中,luminal BC约占BC病例的70%以上,尽管预后相对较好,但长期(> 5年)复发率明显高于其他亚型3,并且在最初诊断为内脏转移后20年内可能复发4,5。另一方面,缺乏针对内分泌抵抗的鲁米诺BC的靶向治疗仍然是一个未解决的临床问题。因此,寻求治疗方法以及能够以准确和精确的方式预见晚期复发的筛查工具是至关重要的。

内源性大麻素系统(ECS)是一种参与控制多种生物过程的细胞通讯系统,其失调已在包括癌症在内的各种疾病中得到确认6,7,8。该系统典型地由G蛋白偶联大麻素受体(CBRs) CB组成1r和CB2r,它们的内源性配体花生四烯酰胺(AEA)和2-花生四烯酰甘油(2-AG),以及产生和代谢这些配体的酶9。在过去的几十年里,大多数关于癌症中内皮细胞的研究都集中在广泛证明的概念上,即癌症小鼠模型中CBRs的药理学激活引起抗肿瘤反应10。然而,很少有研究涉及该系统在癌症进展中的作用。脂肪酸酰胺水解酶(FAAH)是降解AEA的关键酶,因此决定了这种脂质信使的可用性和生物活性11,12。在这里,我们揭示了(i) FAAH在BC中的表达与luminal BC高度相关,其中具有低肿瘤FAAH水平的患者表现出明显更差的总体存活率;(ii)其在BC细胞中的表达促进肿瘤表型向更分化的状态转移;和(iii)它减少了BC细胞和小鼠模型中的肿瘤进展和转移。综上所述,这些发现证实了FAAH在乳腺癌中作为转移抑制因子的作用,并表明它可能构成该疾病的预后生物标志物和潜在的治疗靶点。

结果

FAAH表达与鲁米诺癌相关

为了确定在BC中ECS是否去调节,我们分析了已知调节内源性大麻素合成和降解的最相关基因的表达,这些基因沿着由PAM50信号确定的BC的主要分子亚型13。由bc-GenExMiner网站进行的转录组分析14(其包含来自> 15,000个公元前患者的转录组数据)揭示,在被检测的基因中,FAAH是唯一一个显示不同内在亚型间差异表达的基因。具体来说,显著较高的mRNA水平FAAH与HER2阳性和基底样肿瘤相比(补充图。1a).这些结果是在分析其他患者数据集(包括代谢数据集)后再次发现的15还有TCGA16,其中包括大约3500名患者的数据(图。1a、b和补充图。1b).值得注意的是,最低的FAAH代谢样品中的表达与IC10肿瘤簇高度相关(补充图。1c),一个具有高基因组不稳定性和极有可能在5年内复发或癌症相关死亡的基底样富集亚组15,17.

图1: FAAH在分化的乳腺肿瘤中高表达。
figure 1

亲戚FAAH根据TCGA,沿着BC的四个分子亚型的mRNA表达16 (a)和代谢15 (b)数据集。数据分析采用单因素方差分析和post Tukey多重比较检验。c代表性图像(n> 10个生物重复)显示根据来自TMA #1的样品中染色强度的FAAH表达评分。分数0、1、2和3分别对应于无染色、弱染色、中等染色和高染色。比例尺= 500 μm。dTMA #1中包含的乳腺肿瘤样本的FAAH表达和分子特征之间的关联。皮尔逊卡方检验用于统计分析。源数据以源数据文件。

建立更高层次之间的关联FAAHmRNA水平和管腔肿瘤表型也发生在蛋白质水平,我们分析了包括在几个组织微阵列(在此都称为TMA #1)中的一系列617个人乳腺肿瘤样品中的FAAH蛋白表达。病理学家将FAAH表达评分为0(无IHC染色)、1(弱染色)、2(中度染色)或3(高染色)(图。1c).这里,高FAAH表达与激素依赖性肿瘤,尤其是雌激素受体阳性(ER+)肿瘤密切相关(图。1d).高FAAH表达也与低组织学分级(即高分化肿瘤)显著相关,这与大多数腔内肿瘤显示1级(G1)/G2特征的事实一致(图。1d和补充图。1d).此外,检测到FAAH表达和HER2与三阴性状态呈负相关(图。1d).

有趣的是,在分析了大量的公共DNA微阵列数据集后,在mRNA水平上进一步观察到了FAAH和ER+肿瘤之间的强相关性(补充图。2a,b),这表明FAAH的表达可能与ER信号有关。支持这一观点的是,FAAH的表达被雌二醇上调,被雌激素受体沉默下调18在腔BC细胞系中(补充图。2c,d),这与雌二醇反应性元件的存在是一致的FAAH发起人19。此外,我们发现ESR1成为转录因子,结合到FAAH根据Harmonizome中公布的ChIP-chip和ChIP-seq数据,启动子得分最高,Harmonizome是西奈山Ma'ayan实验室开发的处理数据集集合20,21(补充图2e).

总之,这些观察结果表明高FAAH表达和鲁米诺BC之间有很强的相关性。

乳腺肿瘤中低FAAH表达与患者预后不良相关

为了研究肿瘤FAAH水平和患者结果之间的潜在联系,我们分析了TMA #1中可用的临床数据。这里,肿瘤FAAH表达低的患者(得分0和1)发生远处转移的可能性更高(图。2a)和显著降低的总存活率(图。2b)高于具有高肿瘤FAAH表达的患者(得分2和3)。类似的观察是在分析FAAH几个公共DNA微阵列数据集中的mRNA水平15,22,23(图。2c和补充图。3a–c).有趣的是,低肿瘤FAAH表达与肺癌转移有关,但与骨或脑转移无关24,25,26(补充图3d–f).对于其他主要的内源性大麻素降解酶,单酰基甘油脂肪酶(MAGL ),没有发现预后相关的关联,其mRNA表达通过使用bc-GenExMiner网站进行分析27(补充图4).

图2:乳腺肿瘤中FAAH的低表达与患者预后不良相关。
figure 2

无转移生存的Kaplan-Meier曲线(a)和总体存活率(b, c)在从TMA #1获得的具有高和低FAAH表达的BC样品中(a, b)和代谢数据库15 (c).Kaplan-Meier曲线通过对数秩检验进行统计学比较。d从TMA #2获得的原发性肿瘤和淋巴结(LN)转移的样品中匹配的FAAH表达。数据分析采用双尾学生t检验。e代表性的IHC图像(n> 10个生物学重复)显示与原发肿瘤相比,FAAH在LN转移中的表达降低。比例尺= 250 μm。f代表TMA #2中从原发肿瘤到LN转移的FAAH表达变化的饼图。g根据从原发性肿瘤到LN的FAAH表达的变化,TMA #2中包括的患者的总生存期的Kaplan-Meier曲线。Kaplan-Meier曲线通过对数秩检验进行统计学比较。源数据以源数据文件。

从包括所有固有BC亚型在内的肿瘤数据中推断出的预后相关性可能存在偏差,因为FAAH在BC的腔亚型中占主导地位,而腔亚型是固有生存率最高的亚型。为了排除我们的结论受到这种限制影响的可能性,我们接下来分析了第二个TMA(即TMA #2)中的FAAH蛋白表达,该TMA包含仅腔亚型(n= 276)和匹配的同步淋巴结(LN)转移样品。FAAH表情评分如图。1c并且,由于样本的内腔性质,如预期的那样,在大多数样本中可以清楚地检测到它,其中65%的样本具有中等到高的信号(补充图。5a).此处,原发性肿瘤和淋巴结样本中FAAH的低表达与较低的总生存率相关,表明FAAH的预后价值独立于它们与管腔BC的相关性(补充图。5b,c).此外,当与相应的原发性肿瘤相比时,发现在LN转移的显著比例中,癌细胞FAAH表达总体下降(图。2d,e),表明FAAH下调是luminal BC转移进展过程中的常见事件。具体来说,25%的配对活检显示转移样品中FAAH减少,而只有10%显示增加,其余的没有变化(图。二维,f).此外,在原发性肿瘤和LN转移中均具有高FAAH表达(“FAAH高”)的患者比那些在LN转移中相对于原发性肿瘤总是低表达或表达降低(“FAAH低/降低”)的患者表现出更高的存活率(图。2g).

总之,这些发现表明低肿瘤FAAH表达(内在的或在转移过程中获得的)和BC中高肿瘤侵袭性之间有很强的相关性。为进一步支持这一观点,FAAH免疫染色在侵袭前沿的BC细胞以及从原发性肿瘤分离的细胞中缺失(补充图。5d),它们构成了最具侵袭性(因此也是最具攻击性)的BC细胞亚群。

FAAH基因失活促进小鼠乳腺肿瘤生长和肺转移

为了分析FAAH表达和BC侵袭性降低之间是否存在因果关系,我们在一个成熟的转移性BC动物模型中调节了FAAH的表达:MMTV-纽小鼠模型。这种菌株表达了神经鞘癌基因(大鼠的直系同源物HER2),由小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子驱动,并发展成腔状乳腺肿瘤和肺转移瘤28,29。MMTV大学:FAAH−/−老鼠和它们对应的MMTV大学:FAAH+/+通过将MMTV-纽小鼠与FAAH配种产生对照−/−老鼠30(图。3a).然后在不同的时间点比较两种基因型的肿瘤生成和发展:T0(病变前乳腺)、T1(肿瘤发作)、T2(肿瘤发作后40天)和T3(最大允许大小或肿瘤发作后90天,剔除点)(图。3b).尽管FAAH MMTV大学形成的肿瘤−/−显示肿瘤发作延迟(补充图。6a),与它们的FAAH相比,它们显著增加了它们的肿瘤生长率+/+副本(图3c),这伴随着PCNA表达水平的增加(补充图。6b).由于FAAH基因缺失,AEA水平在来自FAAH MMTV大学的肿瘤中较高−/−比那些来自FAAH的老鼠+/+对照,值得注意的是,两种基因型在肿瘤中显示出比非转化乳腺中更高的AEA水平(补充图。6c).在2-AG水平上没有发现差异(补充图。6c).早期检测到的肿瘤(T1)的组织学分析显示,FAAH MMTV新大学+/+小鼠出现低度腺癌,而FAAH−/−小鼠出现了实性高级别癌(补充图。6d).在肿瘤进展的更晚期阶段(T2和T3),两组都出现了具有坏死区域的实体癌(补充图。6d).在分子水平上,MMTV新大学:FAAH+/+如文献中所述,肿瘤显示均一的管腔模式(细胞角蛋白8阳性)31,而MMTV大学:FAAH-/-肿瘤由不同的成分组成,具有一些管腔,但大多数是基础的(细胞角蛋白14阳性)(图。三维(three dimension的缩写)).此外,FAAH缺陷导致转移率显著增加。因此,尽管FAAH MMTV新大学的转移瘤+/+雌性只在T3时明显,MMTV-纽:FAAH−/−早在T1时,当原发性肿瘤刚刚出现时,动物就显示出转移性侵袭(图。3e).此外,在T3时,FAAH缺陷动物中每只动物的转移数目显著更高(图。3f,g).

图3:在自发乳腺肿瘤形成的小鼠模型中,FAAH基因沉默促进肿瘤进展和肺转移。
figure 3

a, b实验装置。c第一次肿瘤唤醒后50天的肿瘤生长。数据从T2和T3小鼠获得。数据以平均值SEM表示,并通过双尾学生t检验进行分析。d细胞角蛋白8 (CK8,红色)和细胞角蛋白14 (CK14,绿色)的MMTV-纽衍生肿瘤的免疫荧光分析。从T3小鼠获得的数据(n= 3个生物重复)。细胞核被染成蓝色。比例尺= 50 μm。e在图b中确定的时间点具有肺转移的动物的百分比fT3时每只动物的转移数量。数据分析采用双尾学生t检验。gT3时肺转移的代表性H&E图像(n> 10次生物复制)。比例尺= 250 μm。h显示RT数据的火山图2小鼠BC的轮廓PCR阵列。FAAH MMTV新大学上调和下调的基因−/−具有日志的衍生肿瘤2倍数变化≥0.58(即倍数变化≥1.5)分别用黄色和蓝色表示,具有统计学意义的基因在log处的水平线上方10 p值= 1.3(即,p= 0.05).每个点都是平均值的结果n= T3时3只生物复制小鼠。源数据以源数据文件。

为了阐明FAAH作用于BC进展的分子机制,我们分析了一组84个BC相关基因在light新大学的表达+/+−/−使用小鼠乳腺癌商用RT Profiler PCR阵列的小鼠(见方法)。支持我们以前的数据显示FAAH和鲁米诺BC表型之间的联系,两种ER亚型的表达(Esr1Esr2)在FAAH MMTV新大学的肿瘤中下调−/−老鼠与FAAH相比+/+对照,而基础标记细胞角蛋白5(Krt5)被上调(图。3h).此外,已知作为BC预后不良标志的几个基因(Twist1、Snai2、Adam23、Abcb1a、Id1)显示了在FAAH MMTV大学的表达上调趋势−/−肿瘤,与其更具侵略性的行为一致(补充数据1).

总之,这些发现强烈支持FAAH在抑制小鼠乳腺肿瘤进展和肺转移中起重要作用。

FAAH抑制人乳腺癌细胞的原癌基因特征

为了更好地理解FAAH是如何控制肿瘤进展的,我们在人类BC细胞模型中进行了一系列实验。对…的分析FAAH一组BC细胞系中的mRNA表达32揭示了,与我们之前的观察一致,FAAH管腔细胞系的水平高于基底细胞系(补充图。7a).关于FAAH蛋白表达获得了类似的结果(图。4a).基于这些观察,我们旨在下调鲁米诺A(高FAAH表达)细胞系中FAAH的表达,并在基础(低FAAH表达)细胞系中过表达,以分析这些修饰对肿瘤进展相关细胞能力的功能影响。具体来说,我们利用CRISPR-Cas9技术(T-47D FAAH KO细胞系)在T-47D管腔细胞中敲除FAAH,然后用慢病毒载体重新表达(T-47D拯救细胞系);另一方面,我们用慢病毒载体(MDA-MB-231 FAAH细胞系)在MDA-MB-231基底细胞中瞬时过表达FAAH(图。4b).正如所料,内源性或异位表达FAAH的细胞(即亲代/挽救性T-47D细胞和过表达FAAH的MDA-MB-231细胞)中的AEA水平比缺乏该酶的细胞(即T-47D FAAH KO细胞和亲代MDA-MB-231细胞)中的AEA水平低,但2-AG水平不低。4c,d).目测,亲代/挽救T-47D细胞具有立方形外观,并以有序的鹅卵石图案密集堆积,而T-47D FAAH KO细胞具有更梭形的形态,并以无序的图案出现(补充图。7b).与此一致,免疫荧光分析显示,T-47D细胞中的FAAH沉默导致上皮标记物表达减少,间质/进展标记物表达增加(补充图。7c),而FAAH在MDA-MB-231细胞中的过表达导致了相反的表型(补充图。7d).

图4: FAAH在体外和体内调节BC细胞的原癌基因特征。
figure 4

a一组代表主要内在亚型的人类BC细胞系中FAAH的代表性WB分析。针对β-肌动蛋白和对照条件标准化后的光密度值用紫色表示。n= 3次生物复制。bFAAH调节的T-47D和MDA-MB-231细胞系中FAAH的代表性WB分析。n= 3次生物复制。c, dAEA和2-AG的细胞内水平标准化为蛋白质含量。数据以平均值SEM表示n= 3个生物学上独立的样本,并通过具有post-Tukey多重比较检验(T-47D细胞)的单向方差分析和双尾学生T检验(MDA-MB-231)进行分析。e博伊登小室试验中BC细胞通过基质胶的侵袭。10%胎牛血清作为化学引诱剂。数据以平均值SEM表示n= T-47D和MDA-MB-231细胞分别有9个和7个生物重复,并通过单因素方差分析和后Tukey多重比较检验(T-47D细胞)和双尾学生T检验(MDA-MB-231)进行分析。f,g用FAAH调节的T-47D异种移植的无胸腺雌性小鼠中的肿瘤生长(f)和MDA-MB-231(g)细胞系。数据以平均值SEM表示,并采用单因素方差分析和后Tukey多重比较检验(T-47D细胞)以及双尾学生T检验(MDA-MB-231)进行分析。h肺组织学的代表性H&E图像(n显示在无胸腺雌性小鼠的尾静脉中注射FAAH调节的MDA-MB-231细胞后转移外显率(癌细胞侵入的肺实质的百分比)的得分。0 =无转移;1 = <15%;2 = 15–30%;3 = 30–60%.转移结节用星号表示。比例尺= 250 μm。i在h. Pearson的卡方检验中描述的实验中转移外显率的百分比用于统计分析。源数据以源数据文件。

BC细胞中FAAH的缺失,无论是组成型的还是由基因沉默诱导的,都与肿瘤进展密切相关的能力增加有关,如细胞侵袭(图。4e)和乳腺球形成(补充图。7e).有趣的是,与我们以前的观察一致,我们发现低FAAH表达与未分化肿瘤表型相关FAAH来源于亲代T-47D细胞的乳腺球中的mRNA水平高于其粘附的、分化程度更高的对应物(补充图。7f).支持这些发现,FAAH在富含推定的肿瘤起始细胞(CD44)的BC亚群中,mRNA表达下调+/CD24)33(补充图7g).

接下来,我们的目标是在体内环境下验证我们的体外观察。因此,在不存在FAAH的情况下,免疫妥协小鼠中T-47D衍生的异种移植物的生长显著增强,并且通过在拯救细胞系中重新表达该酶来防止这种效果(图。4f).在相同的方向上,当从FAAH过表达的MDA-MB-231细胞产生异种移植物时,与由亲代细胞系产生的相比,肿瘤生长显著降低(图。第四代移动通信技术).值得注意的是,如WB分析所示,发现由FAAH过度表达的MDA-MB-231细胞产生的达到较高体积的肿瘤在一定程度上沉默了FAAH的表达(补充图。7h),因此表明结果(就肿瘤生长而言)依赖于FAAH的表达。

最后,经训练转移至肺的MDA-MB-231细胞(其中FAAH已过表达)在静脉尾注射后产生肺转移的效率远低于亲代细胞(图。4h,我).具体地说,超过40%的注射过表达FAAH的MDA-MB-231细胞的动物无转移(相比之下,只有8%的注射过亲代MDA-MB-231细胞的动物无转移),并且它们中没有一个达到转移外显率3分(相比之下,亲代MDA-MB-231组中的转移外显率为15%)。4i).

总的来说,这些数据表明FAAH阻断了人类BC细胞系中关键的原癌基因特征。

FAAH降低乳腺癌细胞中促转移基因的信号

为了试图阐明FAAH驱动的BC细胞原癌基因抑制的分子机制,我们在三种T-47D衍生的细胞系(SCR、FAAH KO和rescue)中进行了RNA测序(RNA-seq)分析(图。5a).在这项分析中,我们感兴趣的是那些在FAAH KO细胞与亲代细胞中差异表达的基因,当FAAH重新表达时,亲代细胞也恢复了它们的原始水平(拯救的细胞)。我们在FAAH KO细胞中鉴定出491个差异表达基因(deg ),与亲代和挽救组相比,倍数变化> 1.5,统计学显著性设置为p < 0.05. (Fig. 5b和补充数据2;图中突出显示了一些已知在BC进展中起重要作用的deg)。然后进行基因本体(GO)途径富集分析,从功能上将DEGs分为三个主要类别:细胞成分(CC)(图。5c)、分子功能(MF)(补充图。8a),以及生物过程(BP)(补充图。8b).GO CC分析显示,T-47D FAAH KO细胞中的deg属于细胞形态学、细胞粘附、定向细胞迁移和细胞外基质(ECM)重组相关的类别,这与其更具间质性和侵袭性的表型一致(图。5c).京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路分析进一步确定了受FAAH敲除影响最大的信号通路中的“ECM-受体相互作用”和“黏着斑”(补充图。8c).支持GO和KEGG分析、基因组富集分析(GSEA)34还揭示了在T-47D FAAH KO细胞中上调的DEGs与高度侵袭性的信号显著相关,例如上皮-间质转化(EMT)的信号35转移到肺部36(补充图8d,e),基础和间叶性状37,MaSC群体38,而范不会转向预后不良的BC签名25(图。5d),这在临床上用于识别具有发展转移性疾病的更大风险的BC患者。所有这些数据表明,FAAH是癌细胞迁移和侵袭中关键细胞过程的抑制剂,因此也是转移的抑制剂。

图5:BC细胞中的FAAH调节改变了侵袭和转移相关基因的水平。
figure 5

a热图显示了FAAH调节的T-47D细胞的RNA-seq中差异表达基因(DEGs = 491)的倍数变化表达。在该分析中考虑的deg仅是那些在T-47D FAAH KO细胞中相对于亲代细胞显著去调控的deg,其在拯救细胞中也恢复了它们的原始水平。b火山图显示了与亲代/拯救细胞相比,T-47D FAAH KO细胞中的一些最高deg(红色下调,绿色上调)。蓝色虚线确定了log处的夹杂物临界值10错误发现率(FDR) ≥1.3(即FDR ≤0.05)和日志2折叠变化≥0.58(即折叠变化≥1.5)。一些相关的上调和下调基因分别以绿色和红色显示。c代表与亲代/挽救细胞相比,T-47D FAAH KO细胞中DEGs的基因本体(GO)细胞成分(CC)分析的条形图。d与亲代/挽救细胞相比,T-47D FAAH KO细胞中DEGs的基因组富集分析(GSEA)。e显示RT结果的条形图2FAAH调节的MDA-MB-231细胞中人类肿瘤转移的轮廓PCR阵列。BC转移相关的下调基因在FAAH过表达的MDA-MB-231细胞中的表达用log表示2倍数变化与亲代细胞。数据以平均值SEM表示n= 3个生物重复,由双尾学生分析t-测试。源数据以源数据文件。

为了证实FAAH和BC转移之间的分子联系,我们使用人类肿瘤转移的商业RT Profiler PCR阵列分析了MDA-MB-231亲代细胞和FAAH过表达的MDA-MB-231细胞中84个转移相关基因的mRNA表达(见方法)(图。5e和补充数据3).与亲代MDA-MB-231细胞相比,PCR阵列中包含的大多数基因(83%,84个中的70个)在FAAH过表达的MDA-MB-231细胞中出现下调(补充数据3).其中,那些在乳腺癌转移中起重要作用的基因如图2所示。5e.

总之,这些数据进一步支持FAAH通过抑制侵袭和转移相关基因的表达来降低BC细胞的侵袭性。

CXCR4-CXCL12轴参与FAAH介导的对乳腺癌进展的抑制

在T-47D和MDA-MB-231细胞中FAAH调节显著失调的所有候选基因中,选择趋化因子受体CXCR4进行功能验证,因为其在BC的肺特异性转移中的作用已被充分证实39。RNA-seq和PCR阵列数据显示CXCR4低FAAH表达细胞(T-47D FAAH KO和亲代MDA-MB-231细胞)的mRNA水平高于其FAAH表达对应物(分别为T-47D SCR/rescue和FAAH过表达MDA-MB-231细胞)(图。5).在对T-47D和MDA-MB-231亚系细胞膜中的CXCR4进行流式细胞分析后,这些观察结果在蛋白质水平得到了证实(图。6a).在小鼠和人类肿瘤中也观察到CXCR4/CXCL12和FAAH表达之间的反向关联。因此,FAAH MMTV新大学产生的乳腺肿瘤−/−小鼠表达较高的mRNA(补充图。9a)和蛋白质(图。6b)水平Cxcr4Cxcl12这与它们增强的攻击行为和转移率是一致的。此外,对来自公共DNA微阵列的1904个人类BC样本的研究15显示出一种负相关FAAHCXCR4/CXCL12人类肿瘤中的mRNA水平(图。6c),以及对王数据集中包含的286个人类公元前样本的分析26揭示了CXCR4通路的激活40在低FAAH表达的人BC肿瘤中(补充图。9b).

图6:CXC R4-CXC l12轴参与控制FAAH介导的对BC细胞侵袭表型的抑制。
figure 6

FAAH调节的T-47D和MDA-MB-231细胞系中细胞膜CXCR4的流式细胞仪检测的代表性直方图(a)和来自FAAH MMTV新大学的肿瘤+/+还有FAAH−/−老鼠(b). c散点图显示以下各项之间的负相关关系FAAHCXCR4或者CXCL12根据代谢数据集在BC样品中的mRNA表达15。通过对AMD3100治疗的Pearson’s r .分析计算相关关联(d, e)和CXCL12诱导的趋化性(e)对FAAH调制的T-47D的侵袭能力(d)和MDA-MB-231(e)细胞。细胞接种后,将AMD3100 (1微米)加入到上层隔室中。将CXCL12 (50纳米)加入到包含无血清培养基的Boyden室的下部隔室中。CXCL12在T-47D细胞中的趋化作用不能被检测,因为它们对无血清培养基无侵袭性。数据以平均值SEM表示n=分别用于T-47D和MDA-MB-231细胞的5个和7个生物重复,并通过具有后Tukey多重比较测试的单向ANOVA进行分析。源数据以源数据文件。

然后我们旨在确定T-47D和MDA-MB-231细胞中FAAH依赖性侵袭表型调节和CXCR4-CXCL12信号轴调节之间是否存在因果联系。用选择性拮抗剂AMD3100阻断CXCR4仅在没有FAAH表达的细胞(即,T-47D FAAH KO和亲代MDA-MB-231细胞)中防止细胞侵袭,表明这些细胞中CXCR4的上调(至少部分)是它们侵袭能力增强的原因(图。6d,e).此外,FAAH在MDA-MB-231细胞中的过度表达降低了它们向CXCL12侵袭的能力(图。6e).

这些发现支持CXCR4-CXCL12轴在FAAH介导的BC细胞原发性特征抑制中的关键作用。

FAAH通过降低anandamide的张力来抑制乳腺癌细胞的促侵袭能力

AEA是生物学上最相关的FAAH底物,因此,在FAAH调节后,BC细胞系显示出其细胞内AEA水平的显著变化(图。4c).因此,我们的目的是确定由FAAH驱动的AEA音是否是控制上述BC细胞原发特征的负责线索。蛋白质印迹分析显示,metAEA,AEA的非水解结构类似物,在T-47D细胞中上调CXCR4表达(图。7a),从而模仿FAAH基因消融的效果。这种效应至少部分是由CBRs的激活介导的,因为细胞与CB的共孵育部分阻止了这种效应1R-和CB2r-选择性拮抗剂SR141716 (SR1)和SR144528 (SR2)(图。7a).在同一细胞系中,metAEA在T-47D细胞中诱导EMT样表型(E-钙粘蛋白下调和波形蛋白上调),类似于敲除FAAH后发现的情况,这也部分被SR1和SR2阻止(补充图。10a).

图7: metAEA通过CBR介导的机制增强人BC细胞系的CXCR4介导的促侵袭能力。
figure 7

a单独用metAEA (1 nM)或与SR1或SR2 (1微米)组合处理24小时后,T-47D亲代细胞中CXCR4的代表性WB分析。在metAEA前1小时向细胞中加入拮抗剂。密度分析以紫色显示。n= 3次生物复制。T-47D的入侵(b)和MDA-MB-231(c)在单独的metAEA (1 nM)或与SR1、SR2或AMD3100 (1微米)组合的处理下,如在涂有基质胶的Boyden室中测定的。在metAEA前1小时将拮抗剂加入上室。数据以平均值SEM表示n= 5个生物重复,并使用单因素方差分析和后Tukey多重比较检验进行分析。d在用metAEA (0.1 mg/kg)单独或与SR1、SR2或AMD3100 (2.5 mg/kg)联合治疗的免疫妥协小鼠中,由亲代和FAAH过度表达的MDA-MB-231细胞引起的肺转移损伤。用IVIS系统监测转移损伤,并根据生物发光值分为四个等级。皮尔逊卡方检验用于统计分析。e高AEA水平和低AEA水平的BC患者总生存率的Kaplan-Meier曲线。Kaplan-Meier曲线通过对数秩检验进行统计学比较。fFAAH在BC细胞中的转移抑制机制示意图。左边,高FAAH表达决定了低anandamide (AEA)张力和鲁米那样表型。在右边,低FAAH表达允许更高的AEA水平,通过大麻素受体(CBR)作用,诱导CXCR4和CXCR4介导的前转移反应的表达。黄色星号代表激活的受体。源数据以源数据文件。

MetAEA也复制了FAAH敲除对T-47D细胞CXCR4依赖的侵袭能力的影响。因此,metAEA通过CBR激活增加了T-47D亲代细胞的侵袭(如CB的预防所证明的1r或CB2r阻断),并且这种效应通过用AMD3100阻断CXCR4而被阻止(图。7b).在相同的方向上,metAEA也以CBR-和CXC R4-依赖的方式挽救了FAAH过度表达的MDA-MB-231细胞所显示的侵袭性降低,这表明MDA-MB-231细胞中FAAH过度表达后内源性AEA的下调与其侵袭性降低有关(图。7c).最后,metAEA被证明在体内具有促转移作用:免疫缺陷小鼠注射嗜肺的、FAAH过度表达的MDA-MB-231细胞,随后用metAEA治疗,显示出与注射亲代(即FAAH低表达)细胞的小鼠相似的转移负担(图。7d).这种促进转移的作用被SR1的联合治疗完全阻止,被SR2或AMD3100的联合治疗部分阻止,因此表明metAEA在体内发挥其抑制转移的作用,至少部分是通过激活CBRs和CXCR4(图。7d).重要的是,当单独使用时,没有一种拮抗剂发挥抗肿瘤作用(补充图。10b).与所有上述数据一致,我们发现人类肿瘤样本中较高的AEA水平与患者较低的总体存活率显著相关(图。7e).总之,这些发现支持内源性AEA的存在,它通过CBR起作用,最终受FAAH活性控制,诱导BC细胞中的原癌和促转移表型。

讨论

在过去的二十年中,已经证明大麻素激动剂的使用在不同的癌症模型中发挥抗肿瘤作用,包括BC10。虽然这意味着肿瘤细胞中存在功能性内源性大麻素系统,但很少有研究探讨该系统在癌症的发生、增殖和进展中的作用。据报道,在不同的癌症模型中,内源性大麻素降解酶FAAH的异常表达与其非转化的对应物相比6然而,它对肿瘤发展的作用尚不清楚。在这里,我们旨在调查公元前FAAH的功能作用。

首先,我们证明FAAH在管腔BC中高表达,并且它在原发肿瘤和/或淋巴结转移中的下调是预后不良的标志。大约80%的BC患者现在被诊断为ER+,并且几乎所有这些患者都被要求进行5年的辅助内分泌治疗41。尽管这种治疗显著降低了死亡率,但长期复发(> 5年)仍然是一个主要问题3,因为肿瘤在最初诊断为内脏转移后20年内经常复发4,5。我们认为,评估肿瘤中的FAAH水平可能有助于识别那些可能受益于更积极的治疗以降低转移性复发风险的腔性BC患者。然而,FAAH作为一种有价值的预后标志物的实际翻译潜力,除了在更大的患者队列中验证外,还需要证明其表现优于目前使用的预后平台,如Mammaprint或Oncotype DX。

第二,我们表明FAAH在控制BC细胞的腔表型中起重要作用。在人类肿瘤和BC细胞系中,FAAH的表达与管腔特征如HR+状态和高分化等级密切相关,这与Jessani和cols先前的观察结果一致。他们只在腔BC细胞系MCF7和T-47D中检测到FAAH活性,而在基底样BC细胞系如MDA-MB-231中没有检测到42。此外,小鼠和鲁米诺BC细胞模型中的FAAH基因沉默促进了具有基底样特征的更具侵袭性和未分化肿瘤的表型转变,而基底样BC细胞中的FAAH过表达减弱了侵袭性行为。总之,这些结果表明FAAH不仅仅是一个标记物,也是一个侵袭性较低的腔样肿瘤表型的驱动因素,因此它有可能成为基底样BC患者分化治疗的候选研究对象。

第三,我们的发现指出了FAAH在抑制乳腺癌转移中的关键作用。因此,在MMTV-neu小鼠中FAAH基因失活增加了自发性肺转移率,而在嗜肺MDA-MB-231细胞中FAAH表达增加36足以抑制免疫缺陷小鼠尾静脉注射后肺转移瘤的形成。BC的器官性转移归因于早期获得特定的基因表达标记,该标记赋予癌细胞向选择性位点转移的能力43。不同于包括对宿主器官功能关键的基因的其他转移标记(例如,骨转移标记44编码改变骨组织环境以促进溶骨性骨损伤形成的蛋白质)、肺转移信号(LMS)36对肺微环境的特异性较低,而是促进癌细胞的侵袭性生长和侵袭性的一般特征,例如er状态,一种Rosetta型预后不良的标志23和基底样表型。我们的数据表明,FAAH通过阻断所有这些侵袭性特征,同时损害了BC进展和肺转移。

更具体地说,我们提供了LMS信号成员之一,趋化因子受体CXCR4在FAAH介导的抗转移表型中的功能性参与的证据。通过其配体CXCL12激活BC细胞中的CXCR4,促进癌细胞向富含CXCL12的环境的趋化性和迁移,该环境恰好代表BC转移的主要部位,即骨、淋巴结、肺和肝39,45,46。与此一致,CXCR4阻断显著削弱了BC向肺和淋巴结的转移47,48,49。我们的数据显示,在小鼠和人类肿瘤中,CXCR4和CXCL12表达与FAAH表达呈负相关,并且在BC细胞系中,FAAH负调节CXCR4表达和CXCR4依赖的侵袭能力。虽然FAAH对乳腺癌转移的调节可能依赖于多种信号途径,但这些发现强烈支持CXCR4-CXCL12信号在FAAH介导的抗转移行为中的参与,并证明了进一步研究FAAH-CXCR4轴在体内转移形成中的重要性。

识别FAAH作用的下游效应物仍然是理解这种蛋白在BC中的作用的一个重要目标。在这里,我们表明AEA类似物metAEA的治疗通过CBR介导的机制复制了FAAH沉默的一些体外(诱导CXCR4表达和CXCR4介导的细胞侵袭)和体内(诱导CXCR4依赖性肺转移)效应,这有力地支持了BC细胞中支持肿瘤进展并最终受FAAH控制的内源性AEA紧张的存在。为了支持我们的假设,几个小组先前已经在肿瘤样品中检测到比相应的非转化组织(神经胶质瘤、脑膜瘤、垂体腺瘤、前列腺癌、结肠癌和子宫内膜癌)更高水平的AEA6,并且在有转移的患者的血浆中比没有转移的患者的血浆中50.

我们意识到原发性AEA在BC中的存在可能与以前描述AEA(或AEA类似物)在BC细胞中抗肿瘤作用的研究不一致51,52,53,54。然而,这些研究中描述的抗肿瘤作用是由微摩尔浓度的化合物发挥的,这与体内达到的效果相差甚远。我们(目前的研究)和其他55已经证明,在BC细胞中,AEA以皮摩尔/克蛋白质的数量级存在,通过估计约20% (w/v)的细胞蛋白质含量,这指向纳摩尔范围的水平。因此,我们坚信,低纳摩尔浓度范围内的浓度更准确地反映了BC细胞中的内源性AEA紧张度,因此最适合得出关于BC中内源性大麻素系统的作用的结论。

总之,我们的发现表明FAAH是腔内BC的一个强有力的预后指标,也是腔样表型和BC转移的一个关键调节因子。因此,可以将FAAH作为直接或间接的靶点来开发治疗这种疾病的治疗策略。具体来说,我们的数据表明,BC患者将受益于癌细胞中FAAH表达和/或活性的上调,但由于目前基因治疗的技术限制,使FAAH上调更接近临床的更合理的方法是确定增加其表达或活性的明确的上游调节剂。最近,报道的第一个刺激FAAH的化合物从拟南芥,从而提供了下调细胞内AEA张力的工具56。未来的研究可能集中在晚期乳腺癌中FAAH控制的信号通路,这可能为设计治疗这种恶性疾病的策略和工具铺平道路。