用于增强疫苗接种的病毒抗原的内外组合

疫苗设计的一个主要挑战是刺激免疫反应的效力和持续时间。1,2对感染或疫苗接种的免疫反应是事件的时间序列，它取决于抗原成分对免疫系统的有序暴露，3,4以及淋巴结、免疫细胞、细胞因子等的协同作用。5,6因此，有效的疫苗有望利用对连续免疫激活的空间和时间控制。7

为了解决这一问题，具有可控物理化学性质和多级纳米结构的纳米和微米递送系统被设计用于递送多种疫苗成分。8,9此外，由于病原体是自然选择的完美载体，因此有模仿它们的结构或生理化学特性的趋势。10,11在以前复制活病原体的大小、形状、电荷和柔软度的尝试中，已经见证了抗原的淋巴结累积、抗原摄取和抗原交叉呈递的增加。12,13至于递送动力学，其被认为复制了多种抗原成分的自然传播，这可以以仿生方式决定随后免疫激活的暴露顺序。14

尽管如此，病原体的进化通常是为了逃避免疫系统，而不是激怒它。15,16,17在有包膜RNA病毒的情况下，基因组复制导致病原体相关分子模式的积累，这可以导致强烈的宿主抗病毒反应。18,19为了避免这种情况，免疫原性成分，如病毒基因和蛋白质(如核衣壳蛋白，NP)，被紧密结合并隐藏在内部。20,21随后，包埋的NP延迟暴露于免疫监视，导致I型干扰素(IFN-I)表达被抑制，以及抗病毒效果受阻。22因此，自然传播的精确复制可能不是最佳解决方案。作为初步试验，我们用H1N1流感病毒(A/Puerto Rico/8/1934)的表面抗原和NP处理骨髓来源的树突状细胞(BMDCs)23和新型冠状病毒(hCoV-19/中国/CAS-B001/2020)，24分别是。在存在表面抗原的情况下，较高剂量的NP导致IFN-α的表达上调，这表明了强大的抗病毒作用(补充图。1).

在这种情况下，我们预计将是NPs在内部和表面抗原在外部的自然包装，这延迟了NPs暴露于免疫监视。相反，病毒抗原的由内向外组装，使得核心抗原在表面抗原之前暴露(反向递送)，可以加强免疫反应。与自然传播的精确复制相比，由内向外策略可以提前触发更强的IFN-I介导的先天免疫反应，培养免疫刺激环境以增强免疫反应的效力和持续时间。为此，期望该递送系统为具有高装载效率的病毒抗原的有序和从内向外的组装提供多级着陆点，这可以在特定位置和正确时间提供可调的释放，从而控制IFN-I信号传导。此外，为了保持蛋白质的结构和免疫原性，还必须提供一种容易且温和的装载方法，以避免涉及高剪切应力或有机溶剂。

为了实现这一点，我们开发了一种多层明矾稳定的乳剂(MASE ),以利用表面和核心抗原的递送动力学。通过明矾和抗原在油/水(o/w)界面的共组装，核心抗原被捕获在由明矾和o/w界面形成的纳米笼内。随后，又沉积了一层明矾，进一步屏蔽了内部抗原，为外部抗原提供了吸附位点。因此，包埋的抗原仅在沉积的明矾分离后释放，从而构成顺序递送系统。在o/w界面上，逐层组装可以绕过多重包封程序和有机试剂的参与，确保蛋白质的表位完整性，并以容易和温和的方式连续装载表面抗原和NP。为了证明自然传播，表面抗原和NP连续组装在多层液滴(iMASE)的外部和内部。相比之下，由内向外的装配逆转了表面抗原和NP (rMASE)的递送，从而暴露了病毒的“软肋”(图2中描绘为毛虫)。1).因此，预期由内向外策略可培养表面和核心抗原与免疫系统的逆向相遇，这可强烈刺激抗病毒宿主免疫反应。以这种方式，IFN-I介导的先天免疫反应可被激活，以增强适应性免疫反应。

病毒抗原由内向外组装的示意图。与自然传播(iMASE，左)相比，反向递送(rMASE，右)允许NP优先遭遇免疫监视，因为隐藏的毛虫(病原体)被迫将其“软肋”暴露给捕食者(免疫系统)，提前激发IFN-I分泌。与递送的表面抗原一起，rMASE促进先天免疫反应以增强抗体分泌和针对病毒攻击的抗原特异性T细胞免疫反应

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定制多层明矾稳定的乳剂用于抗原的内外组装

在这里，首先测试了由内向外的策略来递送H1N1流感病毒的血凝素(HA)和NP(A/Puerto Rico/8/1934，补充表1).根据示意图制备rMASE(图。2a).通过调节连续相的pH值和类型，明矾和透明质酸在o/w界面上共同组装，形成明矾/透明质酸组装液滴(补充图。2).圆二色性(CD)分析显示，在与明矾共组装后，HA的二级结构保持不变(补充图。3a).随后，正如具有耗散监控的石英晶体微量天平(QCM-D)所证明的，另一层明矾通过与明矾/HA组装液滴的相互作用而附着(补充图。3b).优化外层明矾浓度后，在连续相中没有过量明矾，但有足够的明矾覆盖内部抗原，制备多层液滴(补充图。4a–c).与明矾/HA稳定的液滴不同，扫描电子显微镜(SEM)图像显示了增加的衬垫形态，受激发射损耗显微镜(STED)显示明矾/HA稳定的液滴上有额外的明矾层(红色)，从而将内部HA(绿色)截留在逐层纳米结构内(图。2b).此外，暴露了较大的表面积用于吸附NP。基于ζ电势和元素组成的变化，分别在内部和外部负载HA和NP来制备rMASE(图。2c和补充图。4d，e).

为由内向外策略定制rMASE。aHA和NP从内向外组装的rMASE准备示意图。rMASE的逐步形成。(I)明矾和HA在o/w界面上的共同组装；(ii)另一层明矾沉积以保护内部HA；(iii) NP吸附以构成HA和NP的顺序装载，最终获得rMASE。b共组装明矾/HA (i)和明矾沉积(ii)的SEM(比例尺:2 m)和STED(比例尺:1 m)图像。crMASE的ζ电势和结构照明显微镜(SIM)图像。HA、NP和明矾分别用Cy3(绿色)、Cy5(蓝色)和lumogallion(红色)标记。比例尺:1 m。数据显示为平均值±标准差(n= 3，来自3个独立的实验)。d验证由内向外策略的内部HA的彻底覆盖和NP的表面显示。用4% (v/v) FBS溶液处理液滴以避免非特异性相互作用，然后用抗h a抗体(绿色)和抗NP抗体(红色)的混合物处理，接着进行共聚焦成像。比例尺:5米。e液滴表面残余应力的XRD分析。残余应力的存在(σφ)反映了内外抗原的受力趋势。通过将每个数据点回归成直线来分析数据，并获得线性斜率M。测量和计算弹性模量和泊松比来计算K，而应力可以从σφ = 公里。残余应力(σφ)表明抗原倾向于(σφ> 0，压应力)或向后(σφ < 0, tensile stress) the o/w interface. fHA内部各种配位状态的DSC研究。热峰的右移表明抗原从液滴中逃逸的能量更大，这意味着释放趋势更加受阻

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为了测试内部抗原是否被完全屏蔽，用针对h a和NP的单克隆抗体的混合物处理液滴。图像显示明矾/HA稳定的液滴与抗HA抗体(绿色)牢固结合。随后，外层明矾的加入显示出荧光强度的明显降低，这表明内部HA的覆盖避免了抗原递送期间的预暴露。此外，在NP吸附后，单一荧光(红色)的强信号表明在rMASE表面上NP的密集显示(图。2d).以类似的方式，制备iMASE以将NP装载在液滴的内部，并将HA吸附在液滴的外部，这是通过与rMASE相比类似的大小和抗原装载效率但相反的抗原分布来确定的(补充图。5).因此，开发了多层明矾稳定的乳剂，用于NP和表面抗原的内外组装。通过o/w界面上的逐层程序，iMASE和rMASE以简单和适度的方式实现了HA和NP的连续加载，证明了H1N1流感病毒的天然和反向抗原分布(补充表2).

指示抗原的释放趋势

接下来，我们研究了连续加载是否会影响外部和内部抗原的释放动力学。为了验证释放趋势，通过X射线衍射(XRD)分析评估残余应力(图。2e).与它们吸附抗原的对应物(粉红色线)相比，共同组装的抗原和明矾显示出降低的拉伸应力。而外部明矾层的附着将残余应力从张应力改变为压应力，表明内部抗原更可能被截留在紧密结合的明矾和o/w界面之间形成的纳米笼内。此外，差示扫描量热法(DSC)中热峰的右移证明抗原从明矾/HA组装的液滴中逸出需要高的热能。这些结果表明，内部抗原具有阻碍释放的趋势(图。2f).

然后，将rMASE与10% (v/v)胎牛血清(FBS)溶液共孵育，以测试给药后的释放曲线。为了更好地模拟间质液，使用离心浓缩器(30 kDa MWCO)除去大于30 kDa的大分子。25,26如补充图所示。6a、b有限量的抗原从液滴中排出，表明抗原仅在细胞内化后释放。随着大分子在系统中，外面的NP在包裹的HA之前被释放(补充图。6c–e).此外，释放速率随着FBS浓度的增加而增加，表明抗原可能通过与流体大分子的配体交换而释放(补充图。6f，g).

表面和核心抗原的反向递送

为了进一步评估释放曲线，在BMDCs中评估rMASE的细胞内分布。正如透射电子显微镜(TEM)图像所示，液滴首先被膜包裹，以增加接触面积，引发吞噬作用(图。3a，I–ii).随着比表面积的增加，多层液滴刺激细胞摄取，并在6小时后达到最大内化(补充图。7a，b).随着细胞质中大分子蛋白质的增加，表面明矾逐渐脱落，同时释放出NP(图。3a，iii)。24小时后，明矾发生明显解离，表明内部抗原排出(图。3a，iv).

体外反向输送有效的IFN-I介导的免疫激活。a用透射电镜追踪rMASE的细胞内转移。箭头表示明矾的排出。比例尺:2 μmb抗原的细胞内释放通过高含量筛选显微镜进行监测。HA和NP分别用FITC(绿色)和Cy5(红色)标记。比例尺:20 m。释放曲线可以通过装载抗原的荧光衰减来评估。c处理后24小时树突状细胞的IFN-α mRNA表达水平。d处理后48小时树突状细胞分泌IFN-αe经处理的树突状细胞在48小时的CD40、CD80和CD86的表达。图中的所有数据均以三个独立实验的算术平均值±标准差表示。对于统计分析，使用Tukey多重比较校正进行单向方差分析。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001

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随后，使用高含量成像系统(CLS歌剧院，珀金埃尔默)监测抗原的细胞内释放。首先，依次装载HA (FITC标记的，绿色)和NP (Cy5标记的，红色)。液滴随后与BMDCs共孵育6小时，以实现最大吸收。与通过微小液滴的荧光富集相比，流体抗原的荧光强度太弱而无法检测。因此，可以通过比较负载抗原的荧光衰减来评估释放曲线。在rMASE的情况下，Cy5荧光强度的降低证明了NP的释放。12小时后，HA的荧光强度开始以基本恒定但较平缓的斜率下降，代表其随后以相对较慢的速率放电。此外，iMASE处理的细胞中的逆转趋势表明在NP之前先释放HA(图。3b和补充图。7c，d).为了进一步验证这一点，对NP特异性免疫球蛋白M (IgM)进行了评估。来自用rMASE免疫的小鼠的血清在第14天显示NP特异性IgM水平降低。然而，iMASE在第14天比第7天诱导了更高的滴度，这意味着内部抗原的释放因免疫识别而延迟(补充图。7e).因此，通过多层液滴的连续装载，由内向外的策略决定了病毒抗原的递送动力学。

为了探索免疫效果，在BMDCs中测试了由内向外策略。与iMASE相比，rMASE显著促进了IFN-α mRNA的表达，IFN-α细胞因子分泌增加了138%，表明ifn-і信号的强烈激活(图。3c，d).随后，rMASE处理的树突状细胞显示CD40、CD80和CD86的表达分别增加了174%、128%和180%(图。3e).此外，iMASE和rMASE均检测到有限的内毒素水平和细胞毒性，这表明DC激活的增加归因于在HA之前暴露于NP，而不是潜在的材料污染或细胞损伤(补充图。8).因此，简单地逆转HA和NP的递送可以促进IFN-I介导的免疫反应。

增强针对H1N1流感的体液和细胞免疫反应

我们推测rMASE可能提高对H1N1流感感染的免疫反应。给BALB/c小鼠肌肉注射一次补充表中所示的制剂3，并且使用体内成像系统随时间追踪抗原库。如补充图所示。9a与HA和NP共吸附的明矾(术语“明矾”)相比，观察到明显的抗原贮库，并持续超过3天。相反，HA和NP的流体混合物(术语“抗原”)在12小时内从注射部位被清除。随着抗原库的增加，DC明显被吸引到注射部位以获得更高的抗原摄取(补充图。9b–e).值得注意的是，iMASE和rMASE在抗原储存和DC内化方面表现出相似的趋势，表明病毒抗原的顺序释放发生在细胞内。

在肌肉内免疫BALB/c小鼠两次(相隔三周)后，研究rMASE诱导的抗原特异性免疫反应。值得注意的是，与明矾相比，rMASE诱导了显著更高的HA特异性IgG滴度(增加10倍，P < 0.001) and iMASE (3-fold increase, P < 0.001) after 28 d (Fig. 4a).此外，在49天后也观察到有效血清抗体的激发。为了测试交叉反应性，还对其他毒株进行了血清测试，包括A/California/07/2009 (H1N1)、A/Hong Kong/3039/2011 (H3N2)和A/Shanghai/4664 T/2013 (H7N9)。如图所示。4b与H1N1 (1934年)相比，iMASE治疗的小鼠在H1N1 (2009年)、H3N2 (2011年)和H7N9 (2013年)亚型中的抗体滴度分别下降了220%、340%和800%。至于rMASE，这种下降得到了缓解，H1N1 (2009年)、H3N2 (2011年)和H7N9 (2013年)亚型分别下降了110%、210%和350%，表明体液免疫反应增加。

针对H1N1流感病毒的有效适应性免疫反应。a血清透明质酸特异性IgG滴度。b对HA抗原的交叉反应性抗体反应，HA抗原分别来自A/California/07/2009 (H1N1)、A/Hong Kong/3039/2011 (H3N2)和A/Shanghai/ 4664 T/2013 (H7N9)。c在用表面抗原刺激后，对脾细胞中的IFN-γ斑点形成细胞进行ELISPOT分析(HA，A/Puerto Rico/8/1934)。d血清透明质酸特异性IgG1和IgG2a水平。e病毒攻击后体重减轻。对于H1N1疫苗接种，BALB/c小鼠(n= 6)以初免-加强方式(3周间隔)施用指定制剂，并在第35天用流感病毒(A/PR/8/34/1934 (H1N1))攻击，2次LD50/小鼠。f病毒攻击后的存活率。体重减少≥20%的小鼠被实施安乐死，并被视为死亡。gRT-qPCR检测肺部病毒载量。h肺部的病理变化。切片用H&E染色。箭头表示炎症细胞的血管周和间质浸润以及肺实变。图表中的所有数据都表示为三个独立实验的算术平均值±标准差。对于统计分析，使用Tukey多重比较校正进行单向方差分析。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001

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此外，HA和NP的反向递送促进了细胞免疫反应。与iMASE相比，rMASE使脾细胞中分泌IFN-γ的T细胞增加了162%P < 0.001, Fig. 4c).然而，在IL-4分泌细胞中没有观察到显著差异(补充图。10a).同时，rMASE引发了6倍多高的HA特异性IgG2a滴度(P < 0.001) than iMASE (Fig. 4d).随着IL-2、IL-12和TNF-α的有效分泌，细胞因子谱进一步证明了由内向外策略刺激了Th1-偏向性免疫反应(补充图。10b).此外，在rMASE处理的脾细胞中，分泌IFN-γ的T细胞表现出针对H1N1 (2009)、H3N2 (2011)和H7N9 (2013)亚型的交叉反应性增加，表明针对病毒突变的交叉保护作用增强(补充图。10c).

为了进一步测试小鼠的免疫保护作用，我们用H1N1病毒株A/PR/8/34/1934攻击了这些动物。攻击后21天监测动物的体重减轻和存活率。rMASE处理的小鼠在第10天的平均体重略有下降，但在不到7天的时间内迅速恢复到正常体重。抗原处理组和明矾处理组的所有小鼠在13天内体重下降≥20%。相比之下，rMASE处理组的平均体重下降约为攻击后10天原始体重的15.7%(图。4e).值得注意的是，rMASE治疗组的存活率为100%。相比之下，iMASE治疗组的存活率仅为50%，这表明HA和NP的反向递送增加了针对H1N1流感病毒的免疫保护(图。4f).此外，逆转录定量实时聚合酶链反应(RT-qPCR)分析显示，在第9天，rMASE免疫的小鼠在肺组织中的病毒RNA量明显低于iMASE免疫的小鼠(图。第四代移动通信技术).为了评估肺部炎症损伤，使用苏木精和伊红(H&E)染色进行病理学检查。如图所示。4h在rMASE免疫的小鼠中没有观察到明显的浸润。然而，iMASE处理的小鼠出现了血管周围和间质浸润。接下来，测试肺部的炎症细胞因子。与iMASE相比，rMASE显著降低了MCP-1、IL-8、IL-1β和IL-6的水平，表明炎症减轻(补充图。10d–g).总之，在HA之前递送NP激发了针对病毒感染的抗原特异性适应性免疫反应。

强大的IFN-I介导的免疫反应和淋巴结活化

增强针对新型冠状病毒主要突变株的长期免疫应答和中和能力仍然具有挑战性。在发现H1N1流感疫苗的适应性免疫反应和交叉反应性增加后，我们假设由内向外策略也可以提高新型冠状病毒疫苗的免疫效力和持续时间。这里，多层明矾稳定的乳剂屏蔽了o/w界面上的表面抗原(RBD ),并吸附了外部的核心抗原(rMASE ),允许在RBD之前释放NP(补充图。11a–c和补充表格4).通过连续加载病毒抗原，iMASE在NP之前获得了更高的RBD释放浓度(补充图。11d，e).

为了测试RBD和NP的由内向外装配是否也能激发IFN-I介导的免疫反应，评估了它们对转录组谱的影响。基因本体(GO)术语富集分析显示rMASE显著增加了IFN-I相关的信号传导途径(标准为P≤ 0.05;图。5a).此外，比较基因特征分析揭示了干扰素调节因子7(Irf7)在rMASE处理的DC中差异表达，触发一系列IFN刺激基因的激活(Jak1, Stat1, Stat2, Irf9，以及Isg15；图。5b).

提前激发IFN-1活化，以获得强有力的局部反应和淋巴结活化。aiMASE和rMASE差异表达基因的长期富集。聚类内差异表达基因的GO分析确定了与相应富集相关的最高富集GO项P价值观。b与iMASE和rMASE共培养后DCs的转录组分析。代表性热图显示了与IFN-I信号通路相关的差异表达基因。c注射部位的IFN-α浓度随时间的变化。d招募的树突状细胞中CD40表达的频率。eCCR-7在募集的树突状细胞中表达，表明其具有嗜LN性。f淋巴结内的DC亚群。g气泡图显示了CD40L、生发中心:滤泡T辅助细胞和GC B细胞在LN中的参与。hLN中ICOS和CXCR5免疫荧光染色的代表性图像。切片进行抗小鼠CD4抗体(绿色)和抗小鼠ICOS(红色)抗体染色。对其他切片进行抗小鼠CD4抗体(绿色)和抗小鼠CXCR5抗体(粉色)染色。比例尺:50 μmiLN内的记忆B细胞群。图表中的所有数据都表示为三个独立实验的算术平均值±标准差。使用Tukey多重比较校正进行单向和双向方差分析。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001

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肌肉注射后(补充表5)，rMASE显著促进IFN-α的分泌(P < 0.001) and IFN-β (P < 0.001) at the injection site compared with iMASE (Fig. 5c和补充图。12a).作为IFN-1介导的先天免疫反应的结果，较高水平的IL-2(P < 0.001, Supplementary Fig. 12b)和TNF-α(P < 0.001; Supplementary Fig. 12c)在给药后的早期阶段观察到分泌物，培养了更强的免疫原性微环境。27,28与此相应，募集的树突状细胞中CD40和CD86的表达明显增加，表明DC活化增强(图。5d和补充图。12d，e).值得注意的是，没有观察到明显的炎症或IL-6、IL-17A或MPC-1的异常水平，表明可接受的生物安全性和良好控制的免疫原性(补充图。13).因此，由内向外的策略刺激了IFN-I介导的途径，这为抗病毒状态的开始培养了免疫刺激环境。29,30

然后，探测引流淋巴结(LNs)的激活。31在注射部位，与iMASE相比，rMASE在给药后7天将募集的DC上的CCR-7表达增加了195%,这表明募集的DC具有向LNs迁移的高潜力(图。5e).32因此，rMASE显示较低升高的LN-驻留DCs比例(CD8α+CD11c+)，但迁移的DC数量有更明显的增加(CD103+CD11c+和CD11b+CD11c+)在LNs内(图5f和补充图。14a、b).这表明rMASE促进了有效的DCs从注射部位向LN的迁移，以实现抗原的更高LN累积，而不是抗原的直接递送。关于DC在LNs中的激活，CD40+与iMASE处理的小鼠相比，在施用rMASE后的第7天，树突状细胞增加了150%(补充图。14c，d).此外，显著更高的CD40L表达(P < 0.001) among the LN-residing CD3+T细胞表明树突状细胞和T细胞之间的相互作用增加。33因此，rMASE处理组表现出CXCR5的显著扩增+ICOS+CD3+t细胞和FAS+GL-7+B220+分别具有大约150%和200%高度的b细胞(图。5g和补充图。15a–d).同时，LN免疫荧光染色也显示了类似的趋势，表明生发中心(GC；图。5h).此外，我们还发现rMASE诱导了140%以上的CD27+B220+细胞，与iMASE相比，显示记忆B细胞增加(图。5i和补充图。15e).因此，由内向外策略在疫苗接种的早期阶段诱导了较高的IFN-I介导的免疫反应，这随后导致了LN的有效激活，从而产生了增强的适应性免疫反应。

激活对新型冠状病毒的长期免疫保护

接下来，评估RBD特异性体液反应(图。6a).rMASE佐剂制剂比明矾诱导显著更高的RBD特异性IgG滴度(增加16倍，P < 0.001) and iMASE (2-fold increase, P < 0.001) after 35 days, and this persisted for longer than 3 months. Then, antibody affinity to the RBD antigen was determined using bio-layer interferometry (BLI). As shown in Fig. 6b和补充表格6，rMASE的缔合速率常数(K开= 3.63 × 104女士−1)显著高于iMASE(K开= 1.06 × 104女士−1).此外，rMASE引起较低值的平衡解离常数(KD= 0.26±0.03纳米)与iMASE(KD= 22.4±4.7nM)，表明RBD和NP的反向递送可以增强针对病毒感染的抗体亲和力。随后研究了针对假病毒的中和活性。与iMASE相比，rMASE在第28天和第49天分别引发了高约180%和高约275%的中和滴度(NT90 )(图。6c)，这表明了针对病毒感染的有效结合能力。值得注意的是，在iMASE或rMASE中没有观察到NP特异性抗体分泌的差异，这意味着NP对增强的中和能力的作用有限(补充图。16a).IL-2、IL-12、TNF-α和颗粒酶B的细胞因子谱的升高进一步证实了NP的先前递送(补充图。16b).此外，中枢记忆T细胞(CD3+CD8+CD44高的CD62L高的)和效应记忆T细胞(CD3+CD8+CD44高的CD62L低的)对rMASE的反应显著增加了150%(P < 0.001) and 148% (P < 0.001), respectively (Supplementary Fig. 16c–e)，表明长期免疫反应增强。34

增强体液和细胞反应以持续保护抵抗新型冠状病毒病毒。a血清RBD特异性IgG滴度随时间的变化。箭头显示了接种疫苗的时间点。黄线表示明矾诱导的RBD特异性IgG滴度的最高水平。b用BLI测量抗体与RBD抗原的结合亲和力。给药后，从第28天收集的小鼠血清中纯化抗体。监测不同浓度RBD的结合信号，并拟合得到动力学参数。c第一次免疫后第28天和第49天测定新型冠状病毒假型病毒(小鼠血清样品的90%中和效价(NT90))。新型冠状病毒假病毒是通过将全长S蛋白(Wuhan-Hu-1)插入水泡性口炎病毒(VSV) G假型病毒(G *δG-VSV)中而开发的。d实验设计的示意图。BALB/c小鼠(n= 6)以两周的间隔服用指定的制剂。为了评估短期免疫保护作用，用8 × 108第23天Ad5-hACE2通过i.n .路线的pfu。对于长期评估，在第44天对小鼠进行转导。5 d后，用5×10-6的剂量攻击转导的小鼠5新型冠状病毒的TCID50(hCoV-19/China/CAS-B001/2020，GISAID No. EPI_ISL_514256-7)通过腹膜内途径，在收获肺组织以测试病毒载量和3天后的病理学之后。e肺部病毒滴度。通过RT-qPCR探测gRNA病毒从肺组织中滴定新型冠状病毒。f对采集的肺组织进行组织病理学分析。组织切片用he染色。黑色箭头表示感染相关症状，包括肺泡壁增厚、血管充血和炎性细胞浸润。比例尺:分别为625米(左)和100米(右)。g通过真实的新型冠状病毒突变体评估血清中和活性，通过针对活新型冠状病毒WT、Delta和Omicron的血清半最大中和滴度(NT50)来说明。在给药后第28天收集血清。该数字代表中和抗体滴度的倍数下降。图表中的所有数据都表示为三个独立实验的算术平均值±标准差。对于统计分析，使用Tukey多重比较校正进行单向方差分析。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001

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为了探索保护效力，使用表达Ad5-hACE2的腺病毒的鼻内转导构建了新型冠状病毒敏感的动物模型。5 d后，用5×10-6的剂量鼻内攻击转导的小鼠5新型冠状病毒的TCID50(图6d).35,36在高血清中和抗体(NAb)滴度的情况下，与iMASE相比，rMASE显著降低了肺中的病毒载量，与假手术组相比，降低了约1000倍(图。6e).在rMASE治疗组中没有观察到可检测的亚基因组RNA (sgRNA ),表明rMASE疫苗能够抑制肺组织中的病毒复制(补充图。16f).此外，假手术组的肺切片显示肺泡壁增厚、血管充血和炎性细胞浸润，这与病毒性肺炎一致。此外，iMASE接种的小鼠表现出中度血管充血和炎性细胞浸润。在rMASE的情况下，观察到较轻的病变，炎性细胞浸润明显较少(图。6f).此外，根据肺泡隔增厚、肺泡充血以及肺泡和气管中的炎性细胞浸润对肺组织病理学进行评分。如补充图所示。16g在对照动物中发现了高的肺损伤评分，并且与iMASE处理组相比，rMASE接种的动物中的肺损伤评分降低。特别是，所有六只对照动物(假)都表现出严重的肺泡充血。相比之下，rMASE疫苗组几乎没有肺泡充血的迹象。这些结果表明，rMASE可以培养保护性免疫反应，以减少新型冠状病毒诱导的感染和小鼠肺损伤。

为了评估rMASE针对主要变异体的功效，我们测试了其针对活野生型(WT)和相关变异体Delta (B.1.617.2)和Omicron (B.1.1.529)的中和能力。如图所示。6g与WT相比，iMASE在NAb滴度方面经历了230%的Delta下降和1710%的Omicron下降。在rMASE的情况下，针对Delta和Omicron变体的NAb滴度降低了大约2倍和8倍，这没有iMASE明显，表明针对变体感染的免疫保护增强。

总之，我们开发了一种多层明矾稳定的乳剂，用于病毒抗原的由内向外组装，这导致在释放表面抗原之前NP的浓度更高。通过这种方式，与天然包装(iMASE)相比，rMASE逆转了表面抗原和NP的递送，并刺激了IFN-I介导的先天免疫的增加。此外，预先使用IFN-I信号增强了针对甲型H1N1流感和新型冠状病毒病毒的适应性免疫反应。因此，在没有任何额外佐剂成分的情况下，简单地改变表面抗原和NP的递送顺序显著增加了针对包膜RNA病毒的免疫效力和持续时间。通过多层明矾稳定的乳剂，由内向外的策略可以提供一个容易和有效的平台来引发有效的疫苗效力和广泛的免疫保护。

此外，免疫激活的增加归因于核心和表面抗原的反向递送，而不是NP上的正电荷。为了测试它，RBD和鱼精蛋白，一种常用的阳离子蛋白，通过微波激射顺序加载。结果，鱼精蛋白和RBD的共同递送不能通过改变货物的释放顺序来增加免疫激活，这表明NP固有的正电荷几乎无助于增强免疫应答(补充图。17).此外，由内向外策略的佐剂效应不受NP和表面抗原的来源或序列的限制。通过用NP、新型冠状病毒S1蛋白或RBD单体作为表面抗原的顺序递送，也通过MASE引起类似的趋势。此外，以前发布的NPs来自大肠杆菌 (大肠杆菌)和真核细胞系(杆状病毒-昆虫细胞)也诱导了抗体分泌和T细胞介导的免疫反应的增加(补充图。18).

为了进一步证明功效，将rMASE与市售佐剂(AddaVax)进行了比较，后者是一种表面活性剂稳定的乳剂，其配方与MF59相似®.37如补充图所示。19，AddaVax铥-佐剂制剂未能引发相当的IgG滴度(P < 0.001) and cellular immune responses, indicating increased immune potentiation against the commercial emulsion adjuvant. Subsequently, rMASE was compared with SARS-CoV-2 RBD-mRNA@ lipid nanoparticle (LNP), which shared a similar antigen sequence with the protein RBD antigen employed in this manuscript and formulated with SM-102 as the ionizable lipid, 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) as the phosphate lipid, 1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000 (DMG-PEG2000) as the PEGylated lipid, along with the cholesterol.38如补充图所示。20与RBD编码的mRNA相比，rMASE诱导的针对WT的抗原特异性抗体滴度和中和抗体滴度略低。此外，rMASE对Delta (B.1.617.2)和Omicron (B.1.1.529)变异体表现出可比较的反应，并且在参与产生IFN-γ的T细胞中表现出相似的水平。有趣的是，rMASE引发了更高频率的中枢记忆T细胞(CD3+CD8+CD44高的CD62L高的; P < 0.001), suggesting the higher immune memory may be activated by the reversed delivery of the core antigens and surface antigens. By contracting the mRNA-based strategy, rMASE induced comparable immune responses, which were evidently higher than the natural exposure of the antigens (iMASE), indicating that the reversed delivery of antigens may offer an enhanced strategy for recombinant protein vaccinations.

值得注意的是，我们并不意味着由内向外的策略可以应用于所有的病毒疫苗。作为初步尝试，我们采用多层明矾稳定的乳剂来递送乙型肝炎病毒(HBV，一种DNA病毒)的表面抗原(HBsAg)和核心抗原(HBcAg)。有趣的是，这种由内向外的组合未能引发更高的免疫效力。相反，它是将核心抗原截留在内部，但将表面抗原展示在最外层的自然分布模式，这显著提高了抗原特异性IgG滴度，诱导了更高水平的IFN-γ+T细胞和增加的中枢记忆T细胞群体(CD44高的CD62L高的)在八国集团中+t和CD4+t细胞(补充图。21a–d).这可能是由于与HBcAg相比，HBsAg诱导IFN-α表达的能力更强(补充图。21e)，这可能随后加强适应性免疫参与。据推测，对于多组分疫苗的合理递送，免疫原性成分的预先递送可能导致增强的免疫效果。因此，在共同递送抗原之前，先递送佐剂，例如Toll样受体激动剂和STING激活剂，可以更好地增强免疫应答，从而增强疫苗接种。

总的来说，活病毒的精确复制可能不总是提供最佳解决方案。在针对H1N1和新型冠状病毒的疫苗的情况下，表面抗原和NPs(核心抗原)的反向递送被证明加强了抗病毒效果。除了对病原体的空间结构进行建模之外，鉴于免疫激活过程中的时空动力学，还必须对疫苗的递送动力学进行控制。